ISO 21150:2015

Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli

ISO 21150:2015 gives general guidelines for the detection and identification of the specified microorganism Escherichia coli in cosmetic products. Microorganisms considered as specified in this International Standard might differ from country to country according to national practices or regulations. In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate microbiological risk analysis, so as to determine the types of cosmetic products to which this International Standard is applicable. Products considered to present a low microbiological (see ISO 29621) risk include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc. The method described in this International Standard is based on the detection of Escherichia coli in a non-selective liquid medium (enrichment broth), followed by isolation on a selective agar medium. Other methods may be appropriate, depending on the level of detection required. NOTE For the detection of Escherichia coli, subcultures can be performed on non-selective culture media followed by suitable identification steps (e.g. using identification kits). Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not be suited to some products in every detail (e.g. certain water-immiscible products). Other International Standards (ISO 18415) may be appropriate. Other methods (e.g. automated) can be substituted for the test presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been otherwise shown to be suitable.

Cosmétiques — Microbiologie — Détection d'Escherichia coli

ISO 21150:2015 donne des lignes directrices générales pour la détection et l'identification du microorganisme spécifié Escherichia coli dans les produits cosmétiques. Les microorganismes considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer d'un pays à l'autre suivant les pratiques ou les réglementations nationales. Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d'effectuer une analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques qui relèvent de la présente Norme internationale. Les produits considérés comme présentant un faible risque microbiologique (voir ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l'eau, les produits hydroalcooliques, ceux ayant des valeurs de pH extrêmes, etc. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est basée sur la détection d'Escherichia coli dans un milieu liquide non sélectif (bouillon d'enrichissement), suivie d'un isolement sur un milieu gélosé sélectif. D'autres méthodes peuvent être appropriées en fonction du niveau de détection exigé. NOTE Pour la détection d'Escherichia coli, il est possible de réaliser des subcultures sur des milieux de culture non sélectifs, puis de procéder aux étapes appropriées d'identification (par exemple en utilisant des kits d'identification). En raison de la grande variété de produits cosmétiques relevant de ce domaine d'application, il se peut que cette méthode ne soit pas adaptée en tous points à certains produits (par exemple aux produits non miscibles à l'eau). D'autres Normes internationales (ISO 18415) peuvent être appropriées. Il est possible de remplacer l'essai présenté ici par d'autres méthodes (par exemple des méthodes automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été par ailleurs indiquée comme adéquate.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 24-Nov-2015
• ICS: 07.100.40 - Cosmetics microbiology
• ICS: 07.100.99 - Other standards related to microbiology
• ICS: 71.100.70 - Cosmetics. Toiletries
• Technical Committee: ISO/TC 217 - Cosmetics
• Drafting Committee: ISO/TC 217/WG 1 - Microbiological standards and limits
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 22-May-2021

Relations

• Amended By: ISO 21150:2015/Amd 1:2022 - Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli — Amendment 1
• Effective Date: 27-Nov-2021
• Revises: ISO 21150:2006 - Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli
• Effective Date: 04-Nov-2015

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21150
Second edition
2015-12-01
Cosmetics — Microbiology —
Detection of Escherichia coli
Cosmétiques — Microbiologie — Détection d’Escherichia coli
Reference number
ISO 21150:2015(E)
ISO 2015
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ISO 21150:2015(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2015, Published in Switzerland

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ISO 21150:2015(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Diluents and culture media ....................................................................................................................................................................... 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution) ....................................... 3

5.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

5.2.2 Composition ......................................................................................................................................................................... 3

5.2.3 Preparation ........................................................................................................................................................................... 3

5.3 Culture media ........................................................................................................................................................................................... 3

5.3.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

5.3.2 Agar medium for the suitability test (see Clause 11) [soybean-casein

digest agar medium (SCDA) or tryptic soy agar (TSA)] ................................................................. 3

5.3.3 Enrichment broth ............................................................................................................................................................ 4

5.3.4 Selective agar medium for isolation of Escherichia coli ............................................................... 4

5.3.5 Selective agar medium for confirmation of Escherichia coli .................................................... 5

6 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 6

7 Strains of microorganisms ......................................................................................................................................................................... 6

8 Handling of cosmetic products and laboratory samples ............................................................................................ 6

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 General recommendation .............................................................................................................................................................. 6

9.2 Preparation of the initial suspension in the enrichment broth .................................................................... 6

9.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

9.2.2 Water-miscible products........................................................................................................................................... 7

9.2.3 Water-immiscible products .................................................................................................................................... 7

9.2.4 Filterable products ......................................................................................................................................................... 7

9.3 Incubation of the inoculated enrichment broth ......................................................................................................... 7

9.4 Detection and identification of Escherichia coli ....................................................................................................... 7

9.4.1 Isolation ................................................................................................................................................................................... 7

9.4.2 Identification of Escherichia coli ...................................................................................................................... 7

10 Expression of the results (detection of Escherichia coli) ............................................................................................ 8

11 Neutralization of the antimicrobial properties of the product ............................................................................ 8

11.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 8

11.2 Preparation of inoculum ................................................................................................................................................................. 8

11.3 Suitability of the detection method ....................................................................................................................................... 8

11.3.1 Procedure ............................................................................................................................................................................... 8

11.3.2 Interpretation of suitability test results ...................................................................................................... 9

12 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

Annex A (informative) Other enrichment broths .................................................................................................................................10

Annex B (informative) Neutralizers of antimicrobial activity of preservatives and

rinsing liquids ......................................................................................................................................................................................................13

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

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ISO 21150:2015(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity

assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical

Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information

The committee responsible for this document is ISO/TC 217, Cosmetics.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 21150:2006), which has been

technically revised.
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ISO 21150:2015(E)
Introduction

Microbiological examinations of cosmetic products are carried out according to an appropriate

microbiological risk analysis in order to ensure their quality and safety for consumers.

Microbiological risk analysis depends on several parameters such as the following:

— potential alteration of cosmetic products;
— pathogenicity of microorganisms;

— site of application of the cosmetic product (hair, skin, eyes, mucous membranes);

— type of users (adults, children under 3 years).

For cosmetics and other topical products, the detection of skin pathogens such as Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans may be relevant because they can cause skin

or eye infections. The detection of other kinds of microorganism might be of interest since these

microorganisms (including indicators of faecal contamination e.g. Escherichia coli) suggest hygienic

failure during the manufacturing process.
© ISO 2015 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21150:2015(E)
Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli
1 Scope

This International Standard gives general guidelines for the detection and identification of the specified

microorganism Escherichia coli in cosmetic products. Microorganisms considered as specified in this

International Standard might differ from country to country according to national practices or regulations.

In order to ensure product quality and safety for consumers, it is advisable to perform an appropriate

microbiological risk analysis, so as to determine the types of cosmetic products to which this

International Standard is applicable. Products considered to present a low microbiological (see

ISO 29621) risk include those with low water activity, hydro-alcoholic products, extreme pH values, etc.

The method described in this International Standard is based on the detection of Escherichia coli in

a non-selective liquid medium (enrichment broth), followed by isolation on a selective agar medium.

Other methods may be appropriate, depending on the level of detection required.

NOTE For the detection of Escherichia coli, subcultures can be performed on non-selective culture media

followed by suitable identification steps (e.g. using identification kits).

Because of the large variety of cosmetic products within this field of application, this method might not

be suited to some products in every detail (e.g. certain water-immiscible products). Other International

Standards (ISO 18415) may be appropriate. Other methods (e.g. automated) can be substituted for the

test presented here provided that their equivalence has been demonstrated or the method has been

otherwise shown to be suitable.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 21148:2005, Cosmetics — Microbiology — General instructions for microbiological examination

EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the

determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal

(including bacteriophages) activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
product
portion of an identified cosmetic product received in the laboratory for testing
3.2
sample

portion of the product (at least 1 g or 1 ml) that is used in the test to prepare the initial suspension

3.3
initial suspension

suspension (or solution) of the sample in a defined volume of an appropriate enrichment broth

© ISO 2015 – All rights reserved 1
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ISO 21150:2015(E)
3.4
sample dilution
dilution of the initial suspension
3.5
specified microorganism

aerobic mesophilic bacterium or yeast that is undesirable in a cosmetic product and is recognized as a

skin pathogen species that may be harmful for human health or as an indication of hygienic failure in

the manufacturing process
3.6
Escherichia coli
gram-negative rod, motile, smooth colonies

Note 1 to entry: The main characteristics for identification are catalase positive, oxidase negative, fermentation

of lactose, production of indole, growth on selective medium containing bile salts with characteristic colonies.

Note 2 to entry: Escherichia coli can be isolated from the moist environmental sources (air, water, soil) and is a

faecal contamination indicator.
3.7
enrichment broth

non-selective liquid medium containing suitable neutralizers and/or dispersing agents and

demonstrated to be suitable for the product under test
4 Principle

The first step of the procedure is to perform an enrichment by using a non-selective broth medium to

increase the number of microorganisms without the risk of inhibition by the selective ingredients that

are present in selective/differential growth media.

The second step of the test (isolation) of the test is performed on a selective medium followed by

identification tests.

The possible inhibition of microbial growth by the sample shall be neutralized to allow the detection

[1]

of viable microorganisms. In all cases and whatever the methodology, the neutralization of the

antimicrobial properties of the product shall be checked and demonstrated (see Clause 11).

5 Diluents and culture media
5.1 General

General instructions are given in ISO 21148. When water is mentioned in this International Standard,

use distilled water or purified water as specified in ISO 21148.

The enrichment broth is used to disperse the sample and to increase the initial microbial population. It

may contain neutralizers if the specimen to be tested has antimicrobial properties. The efficacy of the

neutralization shall be demonstrated (see Clause 11). Information relative to suitable neutralizers is

given in Annex B.

The enrichment broth (5.3.3.1) or any of the ones listed in Annex A is suitable for checking the presence

of Escherichia coli in accordance with this International Standard provided that they have been

demonstrated to be suitable in accordance with Clause 11.

Other diluents and culture media may be used if it has been demonstrated that they are suitable for use.

2 © ISO 2015 – All rights reserved
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ISO 21150:2015(E)
5.2 Diluent for the bacterial suspension (tryptone sodium chloride solution)
5.2.1 General

The diluent is used for the preparation of bacterial suspension used for the suitability test procedure

(see Clause 11).
5.2.2 Composition
— Tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
— Sodium chloride 8,5 g
— Water 1 000 ml
5.2.3 Preparation

Dissolve the components in water by mixing while heating. Dispense into suitable containers. Sterilize

in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,0 ± 0,2 when measured at room

temperature.
5.3 Culture media
5.3.1 General

Culture media may be prepared using the descriptions provided below or from dehydrated culture

media, according to the instructions from the manufacturer. The instructions provided by the supplier

of the media should be followed.

NOTE Ready-to-use media can be used when their composition and/or growth yields are comparable to

those of the formulae given herein.

5.3.2 Agar medium for the suitability test (see Clause 11) [soybean-casein digest agar medium

(SCDA) or tryptic soy agar (TSA)]
5.3.2.1 Composition
— pancreatic digest of casein 15,0 g
— papaic digest of soybean meal 5,0 g
— sodium chloride 5,0 g
— agar 15,0 g
— water 1 000 ml
5.3.2.2 Preparation

Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water by mixing while heating.

Dispense the medium into suitable containers. Sterilize in the autoclave at 121 °C for 15 min.

After sterilization and cooling down, the pH shall be equivalent to 7,3 ± 0,2 when measured at room

temperature.
© ISO 2015 – All rights reserved 3
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ISO 21150:2015(E)
5.3.3 Enrichment broth
5.3.3.1 Eugon LT 100 broth
5.3.3.1.1 General

This medium contains ingredients which neutralize inhibitory substances present in the sample:

lecithin and polysorbate 80 and dispersing agent: octoxynol 9.
5.3.3.1.2 Composition
— pancreatic digest of casein 15,0 g
— papaic digest of soybean meal 5,0 g
— L-cystine 0,7 g
— sodium chloride 4,0 g
— sodium sulfite 0,2 g
— glucose 5,5 g
— egg lecithin 1,0 g
— polysorbate 80 5,0 g
— octoxynol 9 1,0 g
— water 1 000 ml
5.3.3.1.3 Preparation
Dissolve the components, polysorbate 80, octoxynol 9 and egg
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 21150
Deuxième édition
2015-12-01
Cosmétiques — Microbiologie —
Détection d’Escherichia coli
Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli
Numéro de référence
ISO 21150:2015(F)
ISO 2015
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ISO 21150:2015(F)
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 21150:2015(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Diluants et milieux de culture ................................................................................................................................................................ 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de sodium) . 3

5.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

5.2.2 Composition ......................................................................................................................................................................... 3

5.2.3 Préparation ........................................................................................................................................................................... 3

5.3 Milieux de culture ................................................................................................................................................................................. 3

5.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

5.3.2 Milieu gélosé pour l’essai d’applicabilité (voir Article 11) [milieu gélosé à

l’hydrolysat de caséine et de soja (SCDA) ou gélose tryptone-soja (TSA)] .................... 3

5.3.3 Bouillon d’enrichissement ....................................................................................................................................... 4

5.3.4 Milieu gélosé sélectif pour l’isolement d’Escherichia coli .......................................................... 5

5.3.5 Milieu gélosé sélectif pour confirmation de la présence d’Escherichia coli ............... 5

6 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................................................................ 6

7 Souches de microorganismes .................................................................................................................................................................. 6

8 Manipulation des produits cosmétiques et des échantillons de laboratoire ........................................6

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 6

9.1 Recommandation générale ........................................................................................................................................................... 6

9.2 Préparation de la suspension initiale dans le bouillon d’enrichissement ........................................... 7

9.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 7

9.2.2 Produits miscibles à l’eau ......................................................................................................................................... 7

9.2.3 Produits non miscibles à l’eau .............................................................................................................................. 7

9.2.4 Produits filtrables ........................................................................................................................................................... 7

9.3 Incubation du bouillon d’enrichissement ensemencé .......................................................................................... 7

9.4 Détection et identification d’Escherichia coli ............................................................................................................. 7

9.4.1 Isolement ................................................................................................................................................................................ 7

9.4.2 Identification d’Escherichia coli ....................................................................................................................... 8

10 Expression des résultats (détection d’Escherichia coli) ............................................................................................... 8

11 Neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit ................................................................................ 8

11.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 8

11.2 Préparation de l’inoculum ............................................................................................................................................................. 8

11.3 Applicabilité de la méthode de détection......................................................................................................................... 9

11.3.1 Mode opératoire ............................................................................................................................................................... 9

11.3.2 Interprétation des résultats de l’essai d’applicabilité...................................................................... 9

12 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................10

Annexe A (informative) Autres bouillons d’enrichissement ....................................................................................................11

Annexe B (informative) Neutralisants de l’activité antimicrobienne des conservateurs et

liquides de rinçage ..........................................................................................................................................................................................14

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................15

© ISO 2015 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 21150:2015(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.

iso.org/directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer

un engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à

l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes

de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —

Informations supplémentaires.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 217, Cosmétiques.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 21150:2006), qui a fait l’objet d’une

révision technique.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés
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ISO 21150:2015(F)
Introduction

Les examens microbiologiques des produits cosmétiques sont réalisés selon une analyse de risque

microbiologique appropriée afin de garantir leur qualité et la sécurité des consommateurs.

L’analyse de risque microbiologique dépend de plusieurs paramètres tels que les suivants:

— l’altération potentielle des produits cosmétiques;
— le caractère pathogène des microorganismes;
— le site d’application du produit cosmétique (cheveux, peau, yeux, muqueuses);
— la catégorie d’utilisateurs (adultes, enfants de moins de 3 ans).

Pour les cosmétiques et les autres produits topiques, la détection d’agents pathogènes pour la peau, tels

que Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Candida albicans peut être justifiée parce qu’ils

peuvent causer des infections cutanées ou oculaires. La recherche d’autres sortes de microorganismes

peut aussi présenter un intérêt car ceux-ci (y compris des indicateurs de contamination fécale, par exemple

Escherichia coli) peuvent indiquer une défaillance de l’hygiène au cours du processus de fabrication.

© ISO 2015 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 21150:2015(F)
Cosmétiques — Microbiologie — Détection d’Escherichia
coli
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale donne des lignes directrices générales pour la détection et

l’identification du microorganisme spécifié Escherichia coli dans les produits cosmétiques. Les

microorganismes considérés comme spécifiés dans la présente Norme internationale peuvent différer

d’un pays à l’autre suivant les pratiques ou les réglementations nationales.

Pour garantir la qualité du produit et la sécurité des consommateurs, il est conseillé d’effectuer une

analyse appropriée du risque microbiologique afin de déterminer les types de produits cosmétiques

qui relèvent de la présente Norme internationale. Les produits considérés comme présentant un

faible risque microbiologique (voir ISO 29621) comprennent ceux ayant une faible activité de l’eau, les

produits hydroalcooliques, ceux ayant des valeurs de pH extrêmes, etc.

La méthode décrite dans la présente Norme internationale est basée sur la détection d’Escherichia coli

dans un milieu liquide non sélectif (bouillon d’enrichissement), suivie d’un isolement sur un milieu

gélosé sélectif. D’autres méthodes peuvent être appropriées en fonction du niveau de détection exigé.

NOTE Pour la détection d’Escherichia coli, il est possible de réaliser des subcultures sur des milieux de

culture non sélectifs, puis de procéder aux étapes appropriées d’identification (par exemple en utilisant des kits

d’identification).

En raison de la grande variété de produits cosmétiques relevant de ce domaine d’application, il se peut

que cette méthode ne soit pas adaptée en tous points à certains produits (par exemple aux produits

non miscibles à l’eau). D’autres Normes internationales (ISO 18415) peuvent être appropriées. Il

est possible de remplacer l’essai présenté ici par d’autres méthodes (par exemple des méthodes

automatisées) sous réserve que leur équivalence ait été démontrée ou que la méthode ait été par

ailleurs indiquée comme adéquate.
2 Références normatives

Les documents suivants, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent

document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée

s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y

compris les éventuels amendements).

ISO 21148:2005, Cosmétiques — Microbiologie — Instructions générales pour les examens microbiologiques

EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des microorganismes d’essai utilisés

pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et

virucide (bactériophages inclus)
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

3.1
produit
portion d’un produit cosmétique identifié reçue au laboratoire pour essais
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ISO 21150:2015(F)
3.2
échantillon

portion du produit (au moins 1 g ou 1 ml) utilisée lors de l’essai pour préparer la suspension initiale

(solution mère)
3.3
suspension initiale

suspension (ou solution) de l’échantillon dans un volume défini d’un bouillon d’enrichissement approprié

3.4
dilution de l’échantillon
dilution de la suspension initiale
3.5
microorganisme spécifié

bactérie aérobie mésophile ou levure qui est indésirable dans un produit cosmétique et qui est reconnue

comme étant une espèce pathogène pour la peau, susceptible d’être néfaste pour la santé humaine ou

considérée comme indication de défaillance de l’hygiène dans le processus de fabrication

3.6
Escherichia coli
bacille Gram négatif, mobile, formant des colonies lisses

Note 1 à l’article: Les principales caractéristiques pour l’identification sont les suivantes: catalase positive,

oxydase négative, fermentation du lactose, production d’indole, croissance sur milieu sélectif contenant des sels

biliaires en formant des colonies caractéristiques.

Note 2 à l’article: Escherichia coli peut être isolé à partir de sources environnementales humides (air, eau, sol) et

c’est un indicateur de contamination fécale.
3.7
bouillon d’enrichissement

milieu liquide non sélectif contenant des neutralisants et/ou des agents dispersants appropriés, dont il

a été démontré qu’il convient pour le produit soumis à essai
4 Principe

La première étape du mode opératoire est une phase d’enrichissement utilisant un bouillon non sélectif

afin d’augmenter le nombre de microorganismes sans risque d’inhibition par les ingrédients sélectifs

qui sont présents dans les milieux de culture sélectifs/différentiels.

La seconde étape de l’essai (isolement) est réalisée sur un milieu sélectif et elle est suivie d’essais

d’identification.

L’inhibition potentielle de la croissance microbienne par l’échantillon doit être neutralisée pour

[1]

permettre la détection des microorganismes viables . Dans tous les cas et quelle que soit la méthode

employée, la neutralisation des propriétés antimicrobiennes du produit doit être vérifiée et démontrée

(voir Article 11).
5 Diluants et milieux de culture
5.1 Généralités

Des instructions générales sont données dans l’ISO 21148. Lorsque la présente Norme internationale

mentionne l’emploi d’eau, il faut utiliser de l’eau distillée ou de l’eau purifiée comme spécifié dans

l’ISO 21148.

Le bouillon d’enrichissement est utilisé pour disperser l’échantillon et pour augmenter la population

microbienne initiale. Il peut contenir des neutralisants si l’échantillon à soumettre à essai possède

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des propriétés antimicrobiennes. L’efficacité de la neutralisation doit être démontrée (voir Article 11).

L’Annexe B fournit des informations relatives aux neutralisants appropriés.

Le bouillon d’enrichissement (5.3.3.1), ou l’un de ceux donnés dans l’Annexe A, peut être utilisé pour

vérifier la présence d’Escherichia coli conformément à la présente Norme internationale à condition

qu’il ait été démontré qu’il est approprié conformément à l’Article 11.

D’autres diluants et milieux de culture sont utilisables s’il a été démontré que leur emploi convient.

5.2 Diluant pour la suspension bactérienne (solution de tryptone et de chlorure de

sodium)
5.2.1 Généralités

Le diluant est utilisé pour préparer la suspension bactérienne utilisée pour le mode opératoire de l’essai

d’applicabilité (voir Article 11).
5.2.2 Composition
— tryptone, hydrolysat pancréatique de caséine 1,0 g
— chlorure de sodium 8,5 g
— eau 1 000 ml
5.2.3 Préparation

Dissoudre les composants dans l’eau en mélangeant tout en chauffant. Répartir dans des récipients

appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3 Milieux de culture
5.3.1 Généralités

Les milieux de culture peuvent être préparés suivant les modes opératoires ci-dessous ou à partir de

milieux de culture déshydratés conformément aux instructions du fabricant. Il convient de se conformer

aux instructions données par le fournisseur des milieux.

NOTE Il est possible d’utiliser des milieux prêts à l’emploi quand leur composition et/ou leurs performances

de croissance sont comparables à celles des formules indiquées ci-après.

5.3.2 Milieu gélosé pour l’essai d’applicabilité (voir Article 11) [milieu gélosé à l’hydrolysat de

caséine et de soja (SCDA) ou gélose tryptone-soja (TSA)]
5.3.2.1 Composition
— hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
— hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
— chlorure de sodium 5,0 g
— agar 15,0 g
— eau 1 000 ml
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5.3.2.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet déshydraté dans l’eau en mélangeant tout en chauffant.

Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,3 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3.3 Bouillon d’enrichissement
5.3.3.1 Bouillon Eugon LT 100
5.3.3.1.1 Généralités

Ce milieu contient des ingrédients qui neutralisent les substances inhibitrices présentes dans

l’échantillon, tels que la lécithine et le polysorbate 80 ainsi qu’un agent dispersant comme l’octoxynol 9.

5.3.3.1.2 Composition
— hydrolysat pancréatique de caséine 15,0 g
— hydrolysat papaïque de soja 5,0 g
— L-cystine 0,7 g
— chlorure de sodium 4,0 g
— sulfite de sodium 0,2 g
— glucose 5,5 g
— lécithine d’œuf 1,0 g
— polysorbate 80 5,0 g
— octoxynol 9 1,0 g
— eau 1 000 ml
5.3.3.1.3 Préparation

Dissoudre successivement dans l’eau bouillante le polysorbate 80, l’octoxynol 9 et la lécithine d’œuf

jusqu’à dissolution complète. Dissoudre les autres composants en mélangeant tout en chauffant.

Répartir le milieu dans des récipients appropriés. Stériliser à l’autoclave à 121 °C pendant 15 min.

Après stérilisation et refroidissement, le pH doit être de 7,0 ± 0,2, le mesurage étant effectué à

température ambiante.
5.3.3.2 Autr
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