Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 1: Hand-sorting and extraction of earthworms

This document specifies a method for sampling and handling earthworms from field soils as a prerequisite for using these animals as bioindicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). This document applies to all terrestrial biotopes in which earthworms occur. The sampling design of field studies in general is given in ISO 18400‑101 and guidance on the determination of effects of pollutants on earthworms in field situations is given in ISO 11268‑3. These aspects can vary according to the national requirements or the climatic/regional conditions of the site to be sampled (see also Annex C). This document is not applicable for semi-terrestrial soils and it can be difficult to use under extreme climatic or geographical conditions (e.g. in high mountains). Methods for some other soil organism groups, such as collembolans, are covered in other parts of ISO 23611.

Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 1: Tri manuel et extraction des vers de terre

Le présent document spécifie une méthode pour le prélèvement et la manipulation de vers de terre sur le terrain, comme prérequis à l'utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple, pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes). Le présent document est utilisé pour tous les biotopes terrestres abritant des vers de terre. La conception de l'échantillonnage pour les études sur le terrain est, de manière générale, décrite dans l'ISO 18400‑101 et les lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site des polluants vis-à-vis des vers de terre sont données dans l'ISO 11268‑3. Ces aspects peuvent varier en fonction des exigences nationales ou des conditions climatiques/régionales du site sur lequel l'échantillon doit être prélevé (voir également l'Annexe C). Le présent document ne s'applique pas aux sols semi-terrestres et il peut s'avérer difficile de l'appliquer dans des conditions climatiques ou géographiques extrêmes (en haute montagne, par exemple). Les méthodes pour quelques autres groupes d'organismes du sol, tels que les Collemboles, sont traitées dans d'autres parties de l'ISO 23611.

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Status
Published
Publication Date
23-May-2018
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
24-May-2018
Completion Date
24-May-2018
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ISO 23611-1:2018 - Soil quality -- Sampling of soil invertebrates
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23611-1
Second edition
2018-05
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 1:
Hand-sorting and extraction of
earthworms
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 1: Tri manuel et extraction des vers de terre
Reference number
ISO 23611-1:2018(E)
ISO 2018
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ISO 23611-1:2018(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 23611-1:2018(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Sampling of the earthworms ....................................................................................................................................................... 3

7.1.1 General...................................................................................................................................................................................... 3

7.1.2 Hand-sorting ....................................................................................................................................................................... 4

7.1.3 AITC extraction .................................................................................................................................................................. 5

7.2 Preservation .............................................................................................................................................................................................. 6

7.3 Determination of biomass ............................................................................................................................................................. 6

8 Data assessment.................................................................................................................................................................................................... 6

9 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 7

Annex A (informative) Other methods for sampling ........................................................................................................................... 8

Annex B (informative) Species determination in earthworms ................................................................................................. 9

Annex C (informative) The modified TSBF method ............................................................................................................................10

Annex D (normative) Determination of maximum water-holding capacity ............................................................11

Annex E (informative) Examples of earthworm monitoring programmes (including

presentation of their results) ...............................................................................................................................................................12

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................16

© ISO 2018 – All rights reserved iii
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ISO 23611-1:2018(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,

as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the

Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www .iso .org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,

Biological characterization.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 23611-1:2006), which has been technically

revised. The main changes are:

— the use of a new chemical extraction compound, AITC (allyl-isothiocyanate), instead of formalin;

— the addition of examples of earthworm monitoring programmes (including presentation of their

results) as an informative Annex E.
A list of all parts in the ISO 23611 series can be found on the ISO website.
iv © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 23611-1:2018(E)
Introduction

This document has been drawn up since there is a growing need for the standardization of terrestrial

zoological field methods. Such methods, mainly covering the sampling, extraction and handling of soil

invertebrates, are necessary for the following purposes:
[25][31][39]
— biological classification of soils including soil quality assessment ;
[11][14][33]
— terrestrial bio-indication and long-term monitoring ;
— evaluation of the effects of chemicals on soil animals (ISO 11268-3).

Data for these purposes are gained by standardized methods since they can form the basis for far-

reaching decisions (e.g. whether a given site should be remediated or not). In fact, the lack of such

standardised methods is one of the most important reasons why bio-classification and bio-assessment

in terrestrial (i.e. soil) habitats has so far relatively rarely been used in comparison to aquatic sites.

Since it is neither possible nor useful to standardize methods for all soil organisms, the most important

ones have been selected. In this document sampling of earthworms is described.

Originally, the methods described in this document were developed for taxonomical and ecological

studies, investigating the role of earthworms in various soil ecosystems. These animals are without

doubt the most important soil invertebrates in temperate regions and, to a lesser extent, in boreal and

[30][16][18]

tropical soils . Since Darwin (1881) (see Reference [8]), their influence on soil structure (e.g.

aeration, water holding capacity) and soil functions like litter decomposition and nutrient cycling is well-

[10]

known . Due to their often very high biomass they are also important in many terrestrial food-webs.

In the previous version of this document the chemical formalin was recommended as extraction fluid.

However, within the last years evidence increased that formalin does have critical properties, mainly

in terms of human toxicity. In December 2012, the Risk Assessment Committee (RAC) of the European

Chemicals Agency (ECHA) stated that there is sufficient scientific evidence to classify this chemical as

“probably carcinogenic for humans (Category Ib). In addition, negative effects on non-target organisms

(including soil microorganisms, mesofauna and plants) have been reported (e.g. see Reference [7]).

Therefore, this substance has been replaced.

Due to the growing reservations against the use of formalin, several alternatives have been studied. In

Reference [40] allyl isothiocyanate (AITC) was tested for its effectiveness as a chemical expellant for

sampling earthworms. AITC is a natural breakdown product of glucosinolates in many Cruciferae, i.e.

it is the component imparting the sharp taste of mustard. According to the European Chemical Agency

(ECHA), there is no concern regarding its use under outdoor conditions.

Over the last years, some studies have been performed in which the extraction efficiency of formalin

and AITC were compared at the same sites and dates. According to Reference [22] no differences

were found in numbers or biomass of earthworms extracted at crop sites when using either formalin

or AITC as extractant. In a recent unpublished review (see Reference [28]) no significant differences

were reported in earthworm numbers/biomass when comparing the efficiency of the two extraction

chemicals. Also, no interaction was found on the sampling sites between the extractant and the site,

indicating that no site-specific differences were observed in extraction efficiency of the extractants.

When plotting the correlation between worm numbers extracted with AITC versus formalin in a

Bland-Altman graph (a common way to compare a gold-standard method to an alternative method in

the medical sciences), no significant bias of the AITC method as compared to the formalin method was

found, indicating the similarity / exchangeability of the two methods.

Basic information on the ecology of earthworms and their use as bioindicators in the terrestrial

environment can be found in the references listed in the Bibliography.
© ISO 2018 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-1:2018(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 1:
Hand-sorting and extraction of earthworms
1 Scope

This document specifies a method for sampling and handling earthworms from field soils as a

prerequisite for using these animals as bioindicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for

organisms).

This document applies to all terrestrial biotopes in which earthworms occur. The sampling design

of field studies in general is given in ISO 18400-101 and guidance on the determination of effects of

pollutants on earthworms in field situations is given in ISO 11268-3. These aspects can vary according

to the national requirements or the climatic/regional conditions of the site to be sampled (see also

Annex C).

This document is not applicable for semi-terrestrial soils and it can be difficult to use under extreme

climatic or geographical conditions (e.g. in high mountains). Methods for some other soil organism

groups, such as collembolans, are covered in other parts of ISO 23611.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 10390, Soil quality — Determination of pH

ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary

analysis)

ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level

using barium chloride solution

ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by

sieving and sedimentation

ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis —

Gravimetric method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
© ISO 2018 – All rights reserved 1
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ISO 23611-1:2018(E)
3.1
earthworms

megadrile soil-inhabiting earthworms belonging to the order Oligochaeta (class Clitellata, phylum

Annelida)

Note 1 to entry: The length of adult individuals can vary from a few centimetres to more than 1 m.

EXAMPLE Species of the families Lumbricidae (Holarctic), Glossoscolecidae (Latin America), Eudrilidae

(Africa) or Megascolecidae [Asia, North America (Pacific Coast)].
3.2
peregrine species
earthworms occurring in many regions world-wide today, usually introduced by man

Note 1 to entry: Well-known examples of peregrine species are several lumbricid species like Aporrectodea

caliginosa (originally coming from Eurasia, but now living also in the Americas and Australia) or the pan-tropical

species Pontoscolex corethrurus (probably coming from Northern Brazil and/or the Guyanas).

Note 2 to entry: See Reference [18].
3.3
clitellum

ring or saddle shaped epidermal thickening only in mature worms which is near the anterior and

eventually forms the cocoon
4 Principle

Earthworms at a certain site are sampled from the soil by using a combination of two different methods:

— hand-sorting animals from a certain area (e.g. 0,25 m ) of varying depth, depending on land use (e.g.

at crop sites: 20 cm), soil properties and the scope of the sampling;
— extraction of worms from the soil by applying AITC.

The first method is known for about 100 years while the second method using the new extraction fluid

[7][22][40]

was proposed about 15 years ago . After extraction, the earthworms are fixed and transported

to the laboratory. There they are preserved in a way that they can be stored in a collection indefinitely

(e.g. for taxonomical purposes). In addition, the determination of the biomass of earthworms is

described. Finally, abundance and biomass values can be recalculated to area (usually 1 m ) or, more

rarely, volume parameters.

NOTE 1 Alternative methods can be useful under special circumstances (e.g. electrical extraction), but cannot

be recommended as a general procedure (see Annex A).

NOTE 2 The sampling of earthworms is often included in much broader monitoring programs, trying to cover

the whole soil fauna or parts of it (e.g. the macrofauna). The design of such programmes is not included in this

document.

NOTE 3 Some hints for the taxonomy of peregrine (occurring in many regions world-wide) earthworms,

mainly belonging to the family Lumbricidae, are given in Annex B.
5 Reagents

5.1 Allyl-isothiocyanate (AITC), synthetic grade (about 94 % to 97 % (volume fraction).

5.2 Isopropanol, 100 % (volume fraction).
5.3 Ethanol, 70 % (volume fraction).
2 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 23611-1:2018(E)

5.4 Formalin, formaldehyde solution 4 % (volume fraction), for storage purposes only.

5.5 Ethanol, 95 % (volume fraction), for storage purposes when using genetic methods such as

barcoding.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
6.1 Plastic vessels, capacities 250 ml and 500 ml, for storing the worms.
6.2 Rubber gloves.
6.3 Forceps.
2 2
6.4 Piece of thick plastic sheeting, 1 m to 2 m .
6.5 Spade or shovel.
6.6 Dissecting microscope, with low magnification (×10 to ×40).
6.7 Balance, weigh range from 0,01 g to 200 g.
6.8 Water-can, preferably 20 l, with water (20 l per sampling plot).
6.9 Watering can.
6.10 Pencil, notebook, water resistant marker, labels that go in the vessel.
6.11 Thermometer, e.g. for measuring air temperature.
6.12 Drying cabinet, for soil moisture determination.
7 Procedure
7.1 Sampling of the earthworms
7.1.1 General

Sampling of earthworms is done by a combination of two different methods: hand-sorting and AITC

extraction. Based on several comparative studies, the combination of a physical and a chemical method

is clearly recommended in the various reviews on earthworm ecology, independent from the type of

chemical expellant (e.g. References [9], [10] and [18]).

Sampling should be done at times of the year when the animals are not forced by the environmental

conditions (i.e. low soil moisture and/or high temperatures) into diapause (i.e. are not reacting to AITC).

In temperate regions, such unfavourable sampling times are winter and, in particular, midsummer

[18]

periods . Earthworms sampled from the same plot, but sampled under the two different methods,

should be stored in individual plastic vessels. After the end of the sampling process, the excavated and

examined soil is returned to the original sampling plot. In some cases, it is appropriate to use only one

of the two methods; e.g. when no deep-burrowing animals are occurring at a given site, AITC extraction

is not necessary. On the other hand, at sites where giant earthworms are living (parts of South America,

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ISO 23611-1:2018(E)
[26]

South East Asia and Australia), hand-sorting is not useful . A very similar method, known as modified

TSBF method, is particularly suitable for tropical regions (see Annex C).

NOTE Usually the earthworms are determined after preservation, but if the species spectrum of a sampling

[35]
site is well known, worms can also be determined alive (see also Annex B).

In case the collected earthworms are to be used for further analysis or testing, e.g. for biomarker

measurements or for use in bioassays, storage or incubation of the worms in a small portion of soil from

the sampling site is recommended. In the case of AITC extraction, rinsing the worms in tap water is

needed before incubation in soil.

For the interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for the field site

to be studied:
a) pH in accordance with ISO 10390;
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277;
c) water content in accordance with ISO 11465;
d) water holding capacity as specified in Annex D;
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260;
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
7.1.2 Hand-sorting

The size of the sample plot should be chosen according to the expected mean size and density of the

worms. A square of 50 cm × 50 cm is often sufficient in the Holarctic where most adult earthworms have

approximately a length between 1 cm and 20 cm. However, at places with a low density of earthworms

[e.g. soils with low pH (< 4,5) or which are anthropogenically used like crop sites], larger plots (i.e. 1 m )

are recommended (see ISO 11268-3). On the other hand, at sites with a high earthworm density (e.g.

2 [29]

many meadows in temperate regions), a smaller plot of 1/8 m is sufficient . Even smaller sample

2[41]

sizes (e.g. 1/16 m ) can lead to very low, and thus variable, individual worm numbers per sample,

which in turn leads to an increase in sample numbers (e.g. 16 replicates).

In any case, the soil is removed by means of a spade or shovel (6.5) up to a depth of 20 cm from this

plot (20 cm are suitable for many temperate sites, but the depth also depends on the site properties).

The excavated soil is spread out on a piece of plastic (6.4). This can be done in the field but, especially

in periods of bad weather, the whole procedure can also be performed in the laboratory or greenhouse.

Afterwards, the soil is searched cautiously for earthworms. Big earthworms are collected by hand

using rubber gloves (6.2) and small ones by using forceps (6.3). To avoid autotomy and further damage

of the worms, the animals should only be touched at the anterior part of the body. If worms are cut by

the spade used to dig out the soil, both parts are collected in order to measure the correct biomass,

whereas only front parts are counted when determining the number of individuals.

NOTE 1 With a naked eye, the front end of adult worms can be identified by the position of the clitellum: it is

always located closer to the head than to the tail.

The collected earthworms should immediately be fixed in 70 % ethanol (5.3) using the 250 ml or 500 ml

plastic vessels (6.1) for at least 0,5 h, but not longer than 24 h. In case the ethanol solution is diluted by

body fluids and/or contains soil particles, the ethanol solution shall be exchanged after 24 h to 48 h.

The vessels shall be labelled and observations (e.g. whether worms have been in a quiescence stage)

should be recorded in the notebook (6.10).
4 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 23611-1:2018(E)

An immediate fixation in 4 % formalin (volume fraction) (5.4) is possible, but not recommended due

to the fact that the handling of this compound should be minimised as much as possible (in particular

under field conditions).

NOTE 2 In order to avoid morphological changes (e.g. an inversion of the prostomium) due to immediate

fixation in ethanol, the individual worms can be put briefly (about one minute) into warm (e.g. 30 °C to 40 °C) tap

water. The earthworms relax in the water, and after that they can be transferred to ethanol.

7.1.3 AITC extraction

The same plot, from which the top soil has been removed for hand-sorting, is used for AITC extraction.

A sufficient amount of water shall be transported (5 l to 10 l per sampling plot) beforehand to the plots

using large water-cans (6.8). To prepare the AITC solution, an amount of 1 g of AITC is dissolved in

50 ml of isopropanol, and the resulting solution is made up with water to a total volume of 10 l. The

density of AITC is 1,013 kg/l; i.e. using a volume fraction, the concentration would be given as 98,7 ml/l.

The diluted AITC solution is carefully and evenly applied into the plot from which the top soil has been

removed for hand-sorting. The solution should be applied in several portions (usually 2 to 3) according

to the seepage capacity of the soil until 5 l to 10 l of AITC-solution have been added, depending on the

soil properties (in cases where the sampling plot is larger than 0,25 m , the amount of AITC-solution

shall be increased accordingly). During the application, the plot shall be observed in order to collect all

earthworms appearing on the soil surface of the sampling plot. The sampling is finished 30 min after

the application of the last watering can.

AITC readily decays in water, and also in the stock solution in isopropanol. Decay is enhanced by

sunlight and warmth. Thus, the final solution shall be prepared immediately before use.

Large earthworms should be collected by hand using rubber gloves (6.2) and small earthworms by

forceps (6.3). The repellent AITC produces rapid earthworm emergence from the soil. Worms should

only be collected when the largest (preferably whole) portion of the body becomes visible, otherwise

damage or retraction back into the soil occurs. To avoid autotomy and damage of the worms, the animals

should only be touched at the anterior part of the body, usually in front of the clitellum. The collected

earthworms should immediately be fixed in 70 % ethanol (volume fraction) (5.3) using the 250 ml or

500 ml plastic vessels (6.1) for at least 30 min but not longer than 24 h. The vessels shall be labelled and

any observations should be recorded in the notebook (6.10).

At sites where giant earthworms are occurring (South America, South East Asia, and Australia), and

where hand-sorting is not appropriate to get them, AITC-solution should be applied on an area of 4 m

(its amount shall be increased accordingly) Before doing so, herbs and litter shall be removed from the

soil surface. In all other respects, the sampling process is the same.

It is not necessary to perform the AITC extraction if no vertical burrowers (especially Lumbricus

terrestris or Aporrectodea longa) are living at a given site (e.g. in very acid soils). The occurrence of

these large worms is indicated by surface casts and collected litter at their burrow openings (diameter

approximately 0,5 cm) which are easily detectable before excavation of the soil used for hand-sorting.

Therefore, any decision about the use of AITC shall be taken on a case-by-case basis.

NOTE In soils with high clay content, the digging of the sampling pit can close tightly many earthworm burrows

at the bottom of the pit, thus preventing the infiltration of AITC and/or the emergence of deep burrowing worms. In

such conditions, the smeared burrow openings can be opened before the AITC application (e.g. using a knife).

WARNING — Appropriate precautions (i.e. gloves and protective clothing) shall be taken when

dealing with AITC to avoid danger from inhalation or skin exposure. According to the “Material

Safety Data Sheet” for AITC as published by producing companies, the compound is irritating

to the skin and to the eyes and toxic to aquatic organisms. It is legally notified in industrialised

countries for commercial (e.g. as a biofumigant) and scientific use.
© ISO 2018 – All rights reserved 5
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ISO 23611-1:2018(E)
7.2 Preservation
Two methods are possible.

a) After fixation, the animals can be kept in 4 % formalin (volume fraction) (5.4) for four days at

minimum, but preferably one or two weeks. Afterwards, the worms can be stored for an unlimited

period in 70 % ethanol (volume fraction) (5.3).

b) An alternative method is to fix the worms immediately after collection in a mixture of 70 % ethanol

(volume fraction) (5.3) and 4 % formalin (volume fraction) (5.4) in a ratio of 98 % to 2 %. This

preservation liquid is replaced by fresh preservation liquid on the day after sampling at the latest.

Preservation in pure ethanol should be avoided since the outer surface of the worms sometimes

becomes very soft, so that important features are not visible any more.

In the case that earthworm tissue shall be preserved for biochemical or genetical studies, preservation

[15]

in formalin is not recommended . Instead, the worms shall fixed and stored in ethanol (95 %).

7.3 Determination of biomass

Determination of biomass is performed using the preserved material. The animals are washed in water

for 5 min, quickly dried on a piece of paper and subsequently the mass is determined using a suitable

balance (6.7). Afterwards the worms are stored again in 70 % ethanol (volume fraction) (5.3) or in

the ethanol/formalin mixture. Due to the change of mass during preservation and the soil content in

the gut, the measurements can be corrected by using factors published in the literature to determine

[42]

the biomass of the animals. According to Reference the loss during fixation varies between 10 %

[43]

to 25 %, while the gut content is highly variable, but values around 20 % to 29 % are cited . The

[23]
loss of mass duri
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23611-1
Deuxième édition
2018-05
Qualité du sol — Prélèvement des
invertébrés du sol —
Partie 1:
Tri manuel et extraction des vers de
terre
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 1: Hand-sorting and extraction of earthworms
Numéro de référence
ISO 23611-1:2018(F)
ISO 2018
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ISO 23611-1:2018(F)
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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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ISO 23611-1:2018(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 3

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Prélèvement des vers de terre ................................................................................................................................................... 3

7.1.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 3

7.1.2 Tri manuel ............................................................................................................................................................................. 4

7.1.3 Extraction à l’AITC ........................................................................................................................................................... 5

7.2 Conservation ............................................................................................................................................................................................. 6

7.3 Détermination de la biomasse ................................................................................................................................................... 6

8 Évaluation des données ................................................................................................................................................................................. 7

9 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 7

Annexe A (informative) Autres méthodes de prélèvement ........................................................................................................... 8

Annexe B (informative) Détermination des espèces de vers de terre ............................................................................... 9

Annexe C (informative) Méthode TSBF modifiée ..................................................................................................................................10

Annexe D (normative) Détermination de la capacité de rétention d’eau maximale .......................................11

Annexe E (informative) Exemples de programmes de surveillance des vers de terre(avec

présentation des résultats correspondants)........................................................................................................................12

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................16

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Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Caractérisation biologique.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 23611-1:2006), qui a fait l’objet

d’une révision technique. Les principales modifications apportées sont les suivantes:

— utilisation d’un nouvel agent chimique d’extraction, l’AITC (isothiocyanate d’allyle) à la place du formol;

— ajout d’exemples de programmes de surveillance des vers de terre (avec présentation de leurs

résultats) sous la forme de l’Annexe E, informative.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 23611 se trouve sur le site Web de l’ISO.

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ISO 23611-1:2018(F)
Introduction

Le présent document a été rédigé pour répondre à un besoin croissant de normalisation de méthodes

d’analyse sur le terrain de la faune terrestre. Ces méthodes, traitant principalement du prélèvement,

de l’extraction et de la manipulation des invertébrés du sol, sont nécessaires pour les applications

suivantes:
[25][31][39]

— la classification biologique des sols, y compris l’évaluation de la qualité des sols ;

[11][14][33]
— la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme ;

— l’évaluation des effets de substances chimiques vis-à-vis des animaux du sol (ISO 11268-3).

Étant donné qu’elles peuvent être à la base de décisions importantes (par exemple, s’il convient

d’entreprendre ou non la dépollution d’un site particulier), les données relatives à ces applications sont

obtenues à l’aide de méthodes normalisées. En fait, l’absence de méthodes normalisées de ce type est

l’une des principales raisons pour lesquelles la bioclassification et la bio-évaluation ont été utilisées

relativement rarement, jusqu’à présent, dans des habitats terrestres (comme le sol) par rapport aux

sites aquatiques.

Étant donné qu’il n’est ni possible, ni utile de normaliser des méthodes pour tous les organismes du

sol, seuls les plus importants ont été sélectionnés. Le présent document décrit le prélèvement des vers

de terre.

À l’origine, les méthodes décrites dans le présent document ont été développées pour des études

taxonomiques ou écologiques, visant à élucider le rôle des vers de terre dans différents écosystèmes

terrestres. Ces animaux sont indubitablement les invertébrés du sol les plus importants dans les régions

[30][16][18]

tempérées et, à un degré moindre, dans les sols des régions tropicales et boréales. Depuis

Darwin (1881) (voir la Référence [8]), leur incidence sur la structure du sol (par exemple, l’aération, la

capacité de rétention d’eau) et sur les fonctions du sol, comme la décomposition de la litière et le cycle

[10]

des éléments nutritifs, est bien connue. En raison de leur biomasse souvent très élevée, ils jouent

également un rôle majeur dans un grand nombre de réseaux trophiques terrestres.

Dans la version précédente du présent document, le formol chimique était recommandé comme

fluide d’extraction. Cependant, au cours des dernières années, un faisceau grandissant de preuves a

confirmé que le formol possède des propriétés critiques, en particulier sur le plan de la toxicité pour

l’homme. En décembre 2012, le Comité d’évaluation des risques (CER) de l’Agence européenne des

produits chimiques (ECHA) a déclaré qu’il existait suffisamment de preuves scientifiques pour faire

entrer le formol dans la classe des produits chimiques «probablement cancérogènes pour l’homme

(catégorie Ib)». En outre, des effets négatifs ont été observés sur des organismes non cibles (y compris

les micro-organismes du sol, la mésofaune et les végétaux) (voir la Référence [7], par exemple). Cette

substance a donc été remplacée.

En raison des réserves grandissantes concernant l’utilisation du formol, plusieurs autres substances

ont été étudiées. Dans la Référence [40], l’isothiocyanate d’allyle (AITC) a été soumis à essai afin

d’évaluer son efficacité comme agent chimique d’expulsion pour le prélèvement des vers de terre. L’AITC

est un produit de décomposition naturel des glucosinolates de nombreuses Brassicacées, c’est-à-dire

des composants qui donnent son goût piquant à la moutarde. Selon l’Agence européenne des produits

chimiques (ECHA), son utilisation en extérieur ne pose aucun problème.

Au cours des dernières années, des études ont été réalisées dans le but de comparer l’efficacité

d’extraction du formol et de l’AITC sur les mêmes sites et aux mêmes dates. D’après la Référence [22],

aucune différence n’a été observée quant au nombre ou à la biomasse de vers de terre extrait(e) sur

des sites de culture selon que l’on utilisait du formol ou de l’AITC comme agent d’extraction. Dans une

récente étude non publiée (voir la Référence [28]), aucune différence significative du point de vue du

nombre/de la biomasse de vers de terre n’a été constatée lors de la comparaison de l’efficacité des

deux agents chimiques d’extraction. En outre, aucune interaction n’a été observée sur les différents

sites échantillonnés entre les agents d’extraction et le sol, ce qui indique qu’en matière d’efficacité des

agents d’extraction, aucune différence propre aux sites n’a été notée. Lorsque l’on trace une courbe de

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la corrélation entre le nombre de vers de terre extraits avec l’AITC et celui obtenu avec le formol dans

un graphique de Bland-Altman (un moyen courant pour comparer une méthode de référence et une

autre méthode dans les sciences médicales), aucun biais significatif de la méthode à l’AITC n’apparaît

par rapport à la méthode au formol, ce qui indique la similarité/l’interchangeabilité des deux méthodes.

Des informations de base sur l’écologie des vers de terre et leur utilisation en tant que bio-indicateurs

dans un environnement terrestre sont disponibles dans les références citées dans la bibliographie.

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NORME INTERNATIONALE ISO 23611-1:2018(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 1:
Tri manuel et extraction des vers de terre
1 Domaine d'application

Le présent document spécifie une méthode pour le prélèvement et la manipulation de vers de terre sur

le terrain, comme prérequis à l’utilisation de ces animaux en tant que bio-indicateurs (par exemple,

pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour des organismes).

Le présent document est utilisé pour tous les biotopes terrestres abritant des vers de terre. La

conception de l’échantillonnage pour les études sur le terrain est, de manière générale, décrite dans

l’ISO 18400-101 et les lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site des polluants

vis-à-vis des vers de terre sont données dans l’ISO 11268-3. Ces aspects peuvent varier en fonction des

exigences nationales ou des conditions climatiques/régionales du site sur lequel l’échantillon doit être

prélevé (voir également l’Annexe C).

Le présent document ne s’applique pas aux sols semi-terrestres et il peut s’avérer difficile de l’appliquer

dans des conditions climatiques ou géographiques extrêmes (en haute montagne, par exemple). Les

méthodes pour quelques autres groupes d’organismes du sol, tels que les Collemboles, sont traitées

dans d’autres parties de l’ISO 23611.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH

ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche

(analyse élémentaire)

ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de

saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum

ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des

sols — Méthode par tamisage et sédimentation

ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode

gravimétrique
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
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ISO 23611-1:2018(F)
3.1
vers de terre

vers de terre mégadriles vivant dans le sol appartenant à l’ordre des Oligochaeta (classe Clitellata,

phylum Annelida)

Note 1 à l'article: La longueur des individus adultes peut varier de quelques centimètres à plus de 1 m.

EXEMPLE Espèces des familles des Lumbricidae (Holarctiques), des Glossoscolecidae (Amérique latine), des

Eudrilidae (Afrique) ou des Megascolecidae [Asie, Amérique du Nord (Côte Pacifique)].

3.2
espèces pérégrines

vers de terre actuellement présents dans un grand nombre de régions du monde, généralement

introduits par l’homme

Note 1 à l'article: Des exemples bien connus d’espèces pérégrines sont des espèces de lombricidés telles que

Aporrectodea caliginosa (originaire d’Eurasie, mais vivant actuellement aussi aux Amériques et en Australie) ou

l’espèce pantropicale Pontoscolex corethrurus (probablement originaire du Nord du Brésil et/ou des Guyanes).

Note 2 à l'article: Voir la Référence [18].
3.3
clitellum

épaississement épidermique en forme d’anneau ou de selle uniquement présent chez les vers adultes et

situé près de leur partie antérieure, et qui évoluera éventuellement en cocon
4 Principe

Sur un site donné, les vers de terre sont prélevés dans le sol en combinant deux méthodes différentes:

— tri manuel des animaux sur une surface donnée (par exemple, 0,25 m ) de profondeur variable selon

l’utilisation du terrain (par exemple, sur les sites de culture: 20 cm), les propriétés du sol et le champ

d'application du prélèvement;
— extraction des vers du sol par application d’AITC.

La première méthode est connue depuis une centaine d’années environ, alors que la seconde méthode

[7][22][40]

mettant en œuvre le nouvel agent d’extraction a été proposée il y a environ 15 ans. Après

l’extraction, les vers de terre sont fixés, puis transportés jusqu’au laboratoire. Là, ils sont conservés

de manière à pouvoir être stockés indéfiniment dans une collection (à des fins taxonomiques, par

exemple). De plus, la détermination de la biomasse des vers de terre est décrite. Pour finir, les valeurs

d’abondance et de biomasse peuvent être recalculées et rapportées à une surface (généralement 1 m )

ou plus rarement à un volume.

NOTE 1 D’autres méthodes peuvent se révéler utiles dans certaines circonstances (par exemple, l’extraction

électrique), mais ne peuvent être recommandées en tant que mode opératoire général (voir l’Annexe A).

NOTE 2 Le prélèvement de vers de terre est souvent inclus dans des programmes de surveillance plus vastes

visant à couvrir la totalité ou une partie de la faune du sol (par exemple, la macrofaune). La conception de tels

programmes n’est pas comprise dans le présent document.

NOTE 3 Quelques indications sur la taxinomie des vers de terre pérégrins (répartis dans un grand nombre de

régions du monde), appartenant principalement à la famille des Lumbricidae, sont fournies dans l’Annexe B.

5 Réactifs

5.1 Isothiocyanate d’allyle (AITC), qualité synthétique [à environ 94 % à 97 % (fraction volumique)].

5.2 Isopropanol, à 100 % (fraction volumique).
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5.3 Éthanol, à 70 % (fraction volumique).

5.4 Formol, solution de formaldéhyde à 4 % (fraction volumique), à des fins de stockage uniquement.

5.5 Éthanol, à 95 % (fraction volumique), à des fins de stockage lorsque des méthodes génétiques

telles que le codage à barres sont utilisées.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et ce qui suit.

6.1 Récipients en plastique, de 250 ml et de 500 ml, pour le stockage des vers de terre.

6.2 Gants en caoutchouc.
6.3 Pinces.
2 2
6.4 Bâche en plastique épais, de 1 m à 2 m .
6.5 Bêche ou pelle.
6.6 Microscope à dissection, à faible grossissement (×10 à ×40).
6.7 Balance, pesant de 0,01 g à 200 g.

6.8 Bonbonne à eau, de préférence de 20 l de capacité, remplie d’eau (20 l par point d’échantillonnage).

6.9 Arrosoir.

6.10 Crayon, carnet de notes, marqueur indélébile, étiquettes, qui tiennent dans le récipient.

6.11 Thermomètre, pour mesurer la température de l’air, par exemple.
6.12 Enceinte de séchage, pour déterminer l’humidité du sol.
7 Mode opératoire
7.1 Prélèvement des vers de terre
7.1.1 Généralités

Le prélèvement des vers de terre est effectué en combinant deux méthodes différentes: le tri manuel

et l’extraction à l’AITC. Les différentes revues traitant de l’écologie des vers de terre, s’appuyant sur

plusieurs études comparatives, recommandent clairement la combinaison d’une méthode physique et

d’une méthode chimique, indépendamment de l’agent chimique d’expulsion (Références [9], [10] et [18]

par exemple).

Il convient de réaliser le prélèvement pendant les périodes de l’année où les animaux ne sont pas

contraints par les conditions environnementales (à savoir une faible humidité du sol et/ou des

températures élevées) à un métabolisme réduit (c’est-à-dire qu’ils ne réagissent pas à l’AITC). Dans

les régions tempérées, les périodes défavorables au prélèvement correspondent à l’hiver et surtout

[18]

au milieu de l’été. Il convient que les vers de terre issus d’un même point d’échantillonnage, mais

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prélevés selon les deux méthodes, soient stockés dans des récipients en plastique distincts. À la fin du

prélèvement, le sol excavé et examiné est remis sur le point d’échantillonnage d’origine. Dans certains

cas, il convient de n’utiliser que l’une des deux méthodes: par exemple, lorsqu’aucun animal fouisseur

profond n’est répertorié pour un site donné, l’extraction à l’AITC n’est pas nécessaire. Par ailleurs, dans

les sites où se trouvent des vers de terre géants (certaines régions d’Amérique du Sud, d’Asie du Sud-Est

[26]

et d’Australie), le tri manuel ne présente aucune utilité. Une méthode très similaire, connue sous le

nom de méthode TSBF modifiée, convient tout particulièrement aux régions tropicales (voir l’Annexe C).

NOTE La détermination des vers de terre intervient généralement après conservation, mais si le spectre des

espèces d’un site de prélèvement est bien connu, les vers de terre peuvent aussi être déterminés alors qu’ils sont

[35]
vivants (voir également l’Annexe B).

Si les vers de terre prélevés sont utilisés pour d’autres analyses ou d’autres essais, par exemple des

mesures de biomarqueurs ou des essais biologiques, le stockage ou l’incubation des vers dans une petite

portion de sol du site de prélèvement est recommandé(e). En cas d’extraction à l’AITC, il est nécessaire

de rincer les vers à l’eau du robinet avant l’incubation dans le sol.

Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour

le site à étudier:
a) le pH, conformément à l’ISO 10390;
b) la texture (sableuse, argileuse, limoneuse), conformément à l’ISO 11277;
c) la teneur en eau, conformément à l’ISO 11465;
d) la capacité de rétention d’eau, telle que spécifiée à l’Annexe D;
e) la capacité d’échange cationique, conformément à l’ISO 11260;
f) la teneur en carbone organique, conformément à l’ISO 10694.
7.1.2 Tri manuel

Il convient de choisir les dimensions du point d’échantillonnage selon la taille et la densité moyennes

attendues des vers de terre. Un carré de 50 cm × 50 cm suffit généralement dans les régions

holarctiques, où la longueur de la plupart des vers de terre adultes est comprise entre 1 cm et 20 cm

environ. Cependant, dans les régions à faible densité en vers de terre [par exemple, les sols à faible pH

(< 4,5) ou ceux cultivés par l’homme], des surfaces plus étendues (à savoir de 1 m ) sont recommandées

(voir l’ISO 11268-3). Par ailleurs, dans les zones à forte densité en vers de terre (par exemple, un grand

2 [29]

nombre de prairies dans les régions tempérées), une surface plus réduite de 1/8 m suffit. Des

2[41]

tailles d’échantillons encore plus réduites (par exemple, 1/16 m ) peuvent produire des nombres

très faibles, et donc variables, de vers de terre par échantillon, ce qui entraîne une augmentation du

nombre d’échantillons (par exemple, 16 réplicats).

Dans tous les cas, le sol est prélevé à l’aide d’une bêche ou d’une pelle (6.5) sur une profondeur pouvant

aller jusqu'à 20 cm pour chaque point d’échantillonnage (20 cm conviennent pour un grand nombre de

sites tempérés, mais la profondeur dépend également des propriétés du site). Le sol excavé est étalé

sur une bâche en plastique (6.4). Cette opération peut être effectuée sur le terrain mais, en particulier

dans les périodes de mauvais temps, la totalité du mode opératoire peut également être réalisée en

laboratoire ou sous serre. Le sol est ensuite examiné avec soin à la recherche de vers de terre. Les vers

de terre de grande taille sont recueillis à la main avec des gants en caoutchouc (6.2) et ceux de petite

taille à l’aide de pinces (6.3). Afin d’éviter l’autotomie des vers et pour ne pas les endommager davantage,

il convient de ne toucher les animaux que dans leur partie antérieure. Si des vers de terre sont coupés

par la bêche utilisée pour creuser le sol, les deux parties sont ramassées pour une mesure correcte de la

biomasse, tandis que seules les parties antérieures sont comptées lors de la détermination du nombre

d’individus.

NOTE 1 Il est possible d’identifier la partie antérieure des vers adultes à l’œil nu par la position du clitellum:

celui-ci est toujours situé plus près de la tête que de la queue.
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Il convient de fixer immédiatement les vers de terre recueillis dans de l’éthanol à 70 % (5.3), dans des

récipients en plastique (6.1) de 250 ml ou de 500 ml, pendant au moins 0,5 h, mais sans dépasser 24 h.

Si la solution d’éthanol est diluée par les fluides corporels et/ou contient des particules de sol, elle doit

être changée au bout de 24 h à 48 h. Les récipients doivent être étiquetés et il convient de consigner les

observations (par exemple, si les vers étaient ou non en quiescence) dans le carnet de notes (6.10).

La fixation immédiate dans le formol à 4 % (fraction volumique) (5.4) est possible, mais elle n’est pas

recommandée étant donné qu’il convient de réduire la manipulation de ce composé autant que possible,

en particulier en conditions de terrain.

NOTE 2 Afin d’éviter des modifications morphologiques (par exemple, une inversion du prostomium) dues à la

fixation immédiate dans l’éthanol, les vers de terre peuvent être placés brièvement (pendant environ une minute)

dans de l’eau du robinet chaude (30 °C à 40 °C, par exemple). Les vers de terre sont laissés au repos dans l’eau et

peuvent ensuite être transférés dans l’éthanol.
7.1.3 Extraction à l’AITC

Le même point d’échantillonnage que celui dans lequel l’horizon superficiel a été prélevé pour le tri

manuel est utilisé pour l’extraction à l’AITC. Une quantité suffisante d’eau (5 l à 10 l par point) doit

être transportée au préalable vers les sites à l’aide de grandes bonbonnes à eau (6.8). Pour préparer

la solution d’AITC, une quantité de 1 g d’AITC est dissoute dans 50 ml d’isopropanol et la solution ainsi

obtenue est complétée à 10 l avec de l’eau. La masse volumique de l’AITC est de 1,013 kg/l; autrement

dit, en utilisant une fraction volumique, la concentration est de 98,7 ml/l. La solution d’AITC diluée

est appliquée soigneusement et de manière homogène sur la surface du point d’échantillonnage dont

l’horizon superficiel a été prélevé pour le tri manuel. Il convient d’appliquer la solution en plusieurs

fois (généralement 2 à 3), selon la capacité d’infiltration du sol, jusqu’à ce que 5 l à 10 l de solution

d’AITC ait été ajoutés, en fonction des propriétés du sol (si le point d’échantillonnage couvre une surface

supérieure à 0,25 m , la quantité de solution d’AITC doit être augmentée en conséquence). Pendant

l’application, le point d’échantillonnage doit être observé afin de recueillir tous les vers de terre

apparaissant à la surface du sol du point d’échantillonnage. Le prélèvement se termine 30 min après

l’application du dernier arrosoir.

L’AITC se décompose facilement dans l’eau, c’est donc également le cas dans la solution mère

d’isopropanol. La décomposition est accélérée par le rayonnement solaire et la chaleur. La solution

finale doit donc être préparée immédiatement avant son utilisation.

Il convient de recueillir les vers de terre de grande taille à la main avec des gants en caoutchouc (6.2) et

ceux de petite taille à l’aide de pinces (6.3). L’AITC est répulsif et entraîne l’émergence rapide des vers

de terre du sol. Il convient de ne re
...

Questions, Comments and Discussion

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