Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes

ISO 23611-4:2007 specifies a method for sampling and handling free-living nematodes from terrestrial field soils as a prerequisite for using them as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). ISO 23611-4:2007 applies to all terrestrial biotopes in which nematodes occur. It is not applicable to aquatic nematodes because these nematodes do not pass through the filter.

Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol

L'ISO 23611-4:2007 spécifie une méthode pour échantillonner et manipuler les nématodes du sol en tant que condition préalable pour les utiliser comme bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes). L'ISO 23611-4:2007 s'applique à tous les biotopes terrestres dans lesquels des nématodes sont présents. Elle n'est pas applicable pour les nématodes aquatiques parce que ceux-ci ne traversent pas le filtre.

General Information

Status
Withdrawn
Publication Date
12-Nov-2007
Current Stage
9092 - International Standard to be revised
Start Date
21-Jan-2019
Completion Date
21-Jan-2019
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ISO 23611-4:2007 - Soil quality -- Sampling of soil invertebrates
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23611-4
First edition
2007-11-15
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 4:
Sampling, extraction and identification of
soil-inhabiting nematodes
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
Reference number
ISO 23611-4:2007(E)
ISO 2007
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ISO 23611-4:2007(E)
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Published in Switzerland
ii © ISO 2007 – All rights reserved
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ISO 23611-4:2007(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Scope ..................................................................................................................................................... 1

2 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

3 Principle................................................................................................................................................. 2

4 Reagents................................................................................................................................................ 3

5 Apparatus .............................................................................................................................................. 3

5.1 Sampling................................................................................................................................................ 4

5.2 Extraction .............................................................................................................................................. 4

5.3 Counting ................................................................................................................................................ 4

5.4 Fixation and preparation of mass slides............................................................................................ 5

5.5 Identification.......................................................................................................................................... 5

6 Procedure .............................................................................................................................................. 5

6.1 General................................................................................................................................................... 5

6.2 Sampling................................................................................................................................................ 5

6.3 Extraction .............................................................................................................................................. 6

6.4 Counting ................................................................................................................................................ 7

6.5 Fixation and preparation of mass slides............................................................................................ 7

6.6 Identification.......................................................................................................................................... 8

7 Data assessment................................................................................................................................... 8

8 Study report........................................................................................................................................... 9

Annex A (informative) Figures of equipment and methods for nematological research.......................... 10

Annex B (informative) Information about the availability of the Oostenbrink elutriator........................... 13

Annex C (informative) Information about the Baermann funnel/tray extraction method ......................... 15

Bibliography ..................................................................................................................................................... 17

© ISO 2007 – All rights reserved iii
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ISO 23611-4:2007(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 23611-4 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological

methods.

ISO 23611 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Sampling of soil invertebrates:

⎯ Part 1: Hand-sorting and formalin extraction of earthworms
⎯ Part 2: Sampling and extraction of micro-arthropods (Collembola and Acarina)
⎯ Part 3: Sampling and soil extraction of enchytraeids
⎯ Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes
iv © ISO 2007 – All rights reserved
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ISO 23611-4:2007(E)
Introduction

This part of ISO 23611 has been drawn up since there is a growing need for the standardization of terrestrial

zoological field methods. Such methods, mainly covering the sampling, extraction and handling of soil

invertebrates, are necessary for the following purposes:
[15],[17],[28]
⎯ biological classification of soils including soil quality assessment ;
[9],[10],[13],[24]
⎯ terrestrial bio-indication and long-term monitoring ;
⎯ evaluation of the effects of chemicals on soil animals (ISO 11268-3).

Data for these purposes are gained by standardized methods since they can form the basis for far-reaching

decisions (e.g. whether a given site should be remediated or not). In fact, the lack of such standardized

methods is one of the most important reasons why bio-classification and bio-assessment in terrestrial (i.e. soil)

habitats has so far been relatively rarely used in comparison to aquatic sites.

Nematodes are an important and major part of the soil fauna. Some authors estimate that this group is

probably the most dominant one of the multicellular organisms (Metazoa) on earth. Nematodes occur from the

Antarctic to the tropics and from deep sea sediments to mountain regions. They are active in every place with

sufficient water and organic material. The species diversity and functional variety are impressive. Nematodes

are commonly known as parasites of animals and plants, but the major part of the nematode fauna

participates in decomposition processes by feeding on bacteria and fungi.

Nematodes occur in high numbers [(5 000 to 100 000)/kg fresh soil] and with a high (20 to 100) species

diversity in almost every soil sample. Moreover, there is a broad ecological spectrum of feeding types and

food web relations among the nematodes such as bacterivores, fungivores, herbivores, predators and

[27],[28]

omnivores . These factors make the group highly suitable as indicators for ecological soil quality, but

standardization of methods is urgently needed for comparison and combination of results.

In the past 100 years, nematology has developed strongly from the viewpoint of agriculture, advisory sampling

and phytosanitary regulations because some terrestrial nematodes cause a lot of damage in crops. With

respect to methods, there are several “schools” in different parts of the world with their own history, practical

[14] [22],[23]

advantages and disadvantages. A comprehensive overview is given by Oostenbrink and Southey .

The more recently described methods (or variants) are often developed with special interest to certain

plant-parasitic species.
[4]

Since Bongers introduced the Maturity Index, the use of nematodes in bio-indication for soil quality has

increased rapidly. Nematodes are now used for ecological soil research and monitoring in several countries all

over the world. Monitoring activities make special demands on methodology, for instance, that a large number

of soil samples is processed on a routine basis against reasonable costs. Some of the methods originally

developed for advisory sampling in agriculture are very suitable for ecological research. They form the basis

for specific variants described in this document.
© ISO 2007 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-4:2007(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 4:
Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting
nematodes
1 Scope

This part of ISO 23611 specifies a method for sampling and handling free-living nematodes from terrestrial

field soils as a prerequisite for using them as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for

organisms).

This part of ISO 23611 applies to all terrestrial biotopes in which nematodes occur. The sampling design of

field studies in general is specified in ISO 10381-1.

This part of ISO 23611 is not applicable to aquatic nematodes because these nematodes do not pass through

the filter. Methods for some other soil organism groups such as earthworms, enchytraeids or collembolans are

covered in other parts of ISO 23611.

The nematodes that are characterized by the proposed procedure are all the free-living forms of nematodes

found in soil. They include non-plant-feeding nematodes as well as ectoparasitic plant-feeding nematodes and

free-living stage of endoparasitic nematodes. The quantification of obligate plant-feeding nematodes in roots

requires specific methods.

NOTE Basic information on the ecology of nematodes and their use as bio-indicators can be found in the

bibliography.

This part of ISO 23611 does not cover the pedological characterization of the site which is highly

recommendable when sampling soil invertebrates. ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277,

ISO 11461 and ISO 11465 are more suitable for measuring pH, particle size distribution, C/N ratio, organic

carbon content and water-holding capacity.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
nematode

small, non-segmented free-living worm (up to a few millimetres in length) belonging to the class Nematoda

NOTE Nematodes without a soil-inhabiting stage are not included in this context.
2.2
location

study area or plot that is characterized based on the composition of (among others) the nematode fauna

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ISO 23611-4:2007(E)
2.3
bulk-sample

composite soil sample made out of many small soil cores to get an impression of the average nematode

composition
2.4
soil sampler
tool to collect soil material in a quick and standardized way
2.5
Oostenbrink elutriator

metal funnel with an upward water flow to separate nematodes from larger soil particles

See Figure A.3.
2.6
mass slide

microscopic slide on which 300 to 400 nematodes are mounted for species identification

2.7
identification

determination of the species, genus or family of an individual based on morphological characteristics (mouth

parts, sexual organs, body ratios) with an identification key
2.8
colonizer – persister (cp) scale
[4],[5]
ecological classification of nematodes, proposed by Bongers

NOTE The principle is analogous to the r-K life strategies during succession, distinguished in fundamental ecology.

Non-plant-feeding nematode families are classified to one of the five cp-groups. This is also the basis for the calculation of

the Maturity Index.
3 Principle

Nematodes are collected in soil samples with a small cylindrical core (diameter: circa 2 cm; length: 10 cm) or

an auger (see Figure A.2). For monitoring purposes, the soil samples are combined in a bulk-sample from a

homogeneous area. The total number of samples to be taken depends on the investigated surface area and

its homogeneity (e.g. pedology, culture). The individual samples can be gathered in the field in a standard

plastic bag or plastic bucket. The combined bulk-sample is too large for direct examination and therefore it is

mixed and subsampled. In the field and during transport to the laboratory, the soil samples shall be protected

against strong fluctuations in temperature, water-loss and heavy mechanical disturbance. They can be stored

for at most four weeks at 4 °C.
[23]

NOTE 1 The sampling method described above is derived from “the Dutch Method” for determining the infestation

of a field with potato-cyst nematodes, and has been used for many years in several European countries.

1) Oostenbrink elutriator is the trade name of a product supplied by firm Eijkelkamp, Giesbeek, NL

(http://www.eijkelkamp.nl). This information is given for the convenience of users of this International Standard and does

not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products may be used if they can be shown to

lead to the same results.
2 © ISO 2007 – All rights reserved
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ISO 23611-4:2007(E)

The Oostenbrink funnel method is recommended for routine extractions of soil samples, for instance in a

monitoring network. The Oostenbrink method is not the most simple one that can be used under any

circumstance. However, it has several advantages: it is highly standardized and constant in extraction

efficiency. The Oostenbrink wet funnel method combines three basic means that can be used for the

separation of nematodes from soils: washing, sieving, active movement. Therefore, it obtains better results

than any one of the basic methods individually. Further advantages are given below:

⎯ relatively large soil samples of any soil type can be treated at once (100 g to 500 g);

⎯ clean nematode suspensions;
⎯ isolation of most living and active nematodes;

⎯ there are many years of experience with enormous amounts of routine soil extractions;

⎯ it is used in many places around the world.

After sampling, the nematodes are extracted from the soil using the Oostenbrink elutriator (model III) (see

Figure A.3 and Annex B). In this technique, an upward current of water separates the nematodes from soil

[1],[14],[19],[23]

particles and holds them in suspension while the heavier particles sink . This suspension of

nematodes and small particles passes through three sieves (mesh width: 45 µm). The catch is washed from

the sieves onto a cotton-wool filter (milk filter). The cotton-wool filter is mounted on a supporting sieve and is

placed in a dish with 100 ml of tap water. For three days, through their active downwards movement, the

nematodes separate themselves from the debris on the filter. Thus, the living nematodes actively crawl

through the filter in a dish with tap water.

After extraction, the nematodes are counted in 2 × 10 % of the 100 ml suspension, then concentrated,

preserved and mounted on mass slides. Finally, at least 150 individuals or a fixed percentage of the total

number in the sample is identified under the microscope.

Mature nematodes can be identified to species level. However, populations in the soil are often dominated by

juveniles and the genera level of taxonomy is a practical (but less sensitive) way of distinction.

[19]

Alternative extraction methods such as the Seinhorst elutriator or Baermann funnel (Annex C) can be

useful under special circumstances, but are not recommended as general procedures because the

Oostenbrink elutriator is robust, easy to operate and usually quantitatively superior to most other techniques.

As an alternative, centrifugation techniques are most suitable.

NOTE 2 This part of ISO 23611 is not applicable for aquatic nematodes because these nematodes do not pass through

the filter. Special centrifugation techniques are available for sediment samples.

NOTE 3 Determination with a light microscope is based on morphological characteristics. In some cases, it is not

possible to recognize the specimen on species level, e.g. juveniles. With a new technique based on DNA analysis,

juveniles can be identified to species level. This new technique is expected to become operational within several years.

4 Reagents
4.1 Formalin [formaldehyde solution, 6 % (volume fraction)].
4.2 Paraffin, with melting point near 60 °C.
5 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
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ISO 23611-4:2007(E)
5.1 Sampling
5.1.1 Soil sampler, of an open, closed or split-tube type.

EXAMPLE Grass plot sampler (diameter: 23 mm) or soil auger (Figures A.2 and A.3); commercially available.

5.1.2 Plastic bucket (collection of soil samples in the field).
5.1.3 Plastic container, for mixing of the bulk-sample.
5.1.4 Sieve, with 8 mm apertures.
5.1.5 Coated bags or plastic bags or glass vessels (transport and storage).
5.1.6 Permanent marker or pre-printed labels.
5.2 Extraction
5.2.1 Beaker, of capacity 100 ml to 250 ml.
5.2.2 Balance, able to weigh 1 kg to 25 kg, for weighing the total sample mass.
5.2.3 Oostenbrink elutriator (see also Annex B).
5.2.4 Three sieves, with 45 µm apertures and 30 cm diameters.
5.2.5 One sieve, with 250 µm apertures and a 10 cm diameter.
5.2.6 Plastic bowl, of capacity circa 2 l.
5.2.7 Clamping ring.
5.2.8 Extraction sieve, with 1 000 µm apertures and 16 cm diameter.
5.2.9 Milk- or cotton-wool filters.
5.2.10 Shallow trays (Petri dishes) or special extraction dishes.
5.2.11 Glass vessel, of capacity 100 ml, with a screw-cap.
5.3 Counting
5.3.1 Dissecting microscope, 10× to 50× magnification.
5.3.2 Small counting dish with grid or glass slide with grid.

NOTE Counting dishes in several sizes and different grids are available from the manufacturers of laboratory

equipment. They can also be made out of small plastic Petri dishes by scratching a grid on the bottom with a needle.

5.3.3 Simple hand counting device.
5.3.4 Aquarium pump, for mixing nematode suspensions.
5.3.5 Pipette (drop glass), with adjustable volume.
5.3.6 Handling needle.
5.3.7 Bottle, of volume 100 ml.
4 © ISO 2007 – All rights reserved
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ISO 23611-4:2007(E)
5.4 Fixation and preparation of mass slides
5.4.1 Water jet pump, for concentration of suspension.
5.4.2 Glass slides, 50 mm × 76 mm.
5.4.3 Cover glasses, 45 mm × 45 mm.
5.4.4 Electric heating plate.
5.4.5 Metal stamp, 40 mm × 40 mm, for paraffin seal on glass slides.
5.5 Identification
5.5.1 Microscope, magnification 400× to 1 000×.
5.5.2 Ocular micrometer indicator.
[3]
5.5.3 Identification keys .
5.5.4 Standard form, to list the identification results.
6 Procedure
6.1 General

For quality assurance, each sample shall be given a unique code from the moment it is taken in the field. This

code (label) shall stay with the sample during all the processing and analysis steps. Standard (electronic)

form(s) should be used to follow the routing of the samples and collection of analysis results. These basic data

may be combined in a spreadsheet or database file for further calculations and statistical testing.

6.2 Sampling

While the density and diversity of soil nematodes are the highest in the top 10 cm of the mineral soil, a grass

plot sampler (5.1.1) with a 10 cm or 15 cm long sampling-tube is appropriate for most biomonitoring purposes.

It is recommended to use a closed tube with a fixed length and diameter.

EXAMPLE 1 A grass plot sampler consists of a stainless steel gouge auger (available in different dimensions)

consisting of a steel auger pipe, a collecting bucket (5.1.2) and a stick with a steel handle. Because of the conical shape of

the pipe, the sample is easily pushed toward the collecting bucket when the next sample is taken. The sample depth is

constant and soil cores can be collected easily over a large area (see Figure A.1). This device can be used in many

situations.

EXAMPLE 2 Alternatively, a soil auger can be used as a simple, cheap and quick working device. Augers are

available in different diameters. Soil samples collected with an auger are less compressed. The disadvantage is that soil

material can be lost more easily (see Figure A.2).

EXAMPLE 3 When accurate separation of soil layers is required, a split-tube sampler can be used. This sampling

device needs more handling time and is less suited for large numbers of samples and large areas (see Figure A.2).

Samples from deeper layers can be taken with an auger to avoid excessive soil compression, or special

split-tube samplers (see Figure A.2). Organic or litter material can be included in the samples, but it increases

the numbers of nematodes found, sometimes considerably. Organic layers may be sampled independently. In

this case, a wider split-tube corer (5 cm to 10 cm) is preferred in order to separate the organic horizons from

the mineral material. Small amounts of litter can also be treated in an Oostenbrink elutriator (5.2.3) to

extract the nematodes. Extraction efficiency can be enhanced by soaking and blending the organic

[16],[18]
parts .
© ISO 2007 – All rights reserved 5
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ISO 23611-4:2007(E)

When a representative sample is required from a specific type of ecosystem, a typical area of at least 0,5 ha,

and preferably 1 ha, shall be selected. It is recommended to select an area which is (more or less)

homogeneous in terms of soil properties, vegetation and soil-use. The studied surface is reported as part of

the location information. As a rule of thumb, 100 soil cores shall be combined from 1 ha. For smaller areas

(e.g. 100 m ), circa 25 cores are sufficient to get an impression of the average nematode composition and to

collect enough soil material. A denser sampling pattern results in a higher accuracy in the estimation of

nematode abundance and species composition. However, there is a trade-off with the amount of subsample

that is finally analysed from the homogenized bulk soil sample. So, a very large bulk-sample does not give

more information because only a small part is analysed and homogenization cannot be completely perfect.

Three hundred samples with a grass plot sampler (diameter 23 mm) are recommended as a maximum for a

composite bulk-sample. In a biomonitoring programme, the sample density per surface area should preferably

be equal in all locations. The mass of the bulk-sample and the number of soil cores in it need to be known.

The sampling plan may be regular (grid), according to a pattern or random. For larger locations, it is most

practical to walk a zigzag pattern and take arbitrary samples along this route. In the case that a location

consists of different parcels, the number of soil samples shall be distributed over the parcels based on their

area. Samples from very atypical parts of the location such as ditches, tracks or pathways shall be avoided.

The collected bulk-sample is homogenized in a plastic container (5.1.3). This can be done in the field or

laboratory, depending on the most practical way of working and transport. Mixing starts with crumbling of the

cores through a 8 mm aperture sieve (5.1.4). Subsequently, the soil is gently mixed until the mass is uniform

in colour and consistency. Mixing and preparation of the sample can take more than an hour for bulk-samples

from clay soils or densely rooted top soils. However, this step is essential to all the analyses that are based on

it and should be given enough attention. Coarse organic material, roots and stones shall be removed. The

final choice for details of working shall be specified in the field sampling protocol, and again shall be uniform

for the entire biomonitoring programme.

When the bulk-sample is homogenized, circa one litre is taken out for further examination. This can be done

by several spoonfuls from different parts of the bulk to obtain a representative subsample. Put the sample in a

labelled plastic bag or glass vessel (5.1.5). At this point, more subsamples can be taken from the bulk for

other biotic and abiotic analyses. Soil samples for nematode analysis shall be stored at 4 °C prior to extraction.

The storage period should be kept as short as possible, four weeks at the maximum. This temperature may

not be optimal for all nematodes (e.g. Aphelenchoididae, Anguinidae; see Reference [39]). In any case, the

appropriate temperature shall be checked beforehand when sampling outside of the holarctic region (e.g. in

the tropics).
6.3 Extraction

Mix the soil (sub)sample from the field again before extraction and fill a beaker (5.2.1) with 100 ml to 250 ml of

soil. Weigh the sample in order to convert the results to a fresh-weight basis. In another sub-part of the same

soil sample, measure the soil humidity to express final density as a unit of soil dry-weight. Store the remaining

sample for abiotic analysis, unless material was collected separately in the field from the same bulk-sample.

Prepare the Oostenbrink elutriator (5.2.3). Put the sample in the top sieve and wash the soil in the elutriator.

Specific water flow speeds depend on the type of funnel used. A detailed description of the apparatus and the

way to use it is given in Reference [23] and Reference [1]. The latest version of the Oostenbrink funnel has

larger dimensions and is fully automated (see Figure A.5). It is suited for routine extraction of large numbers of

samples. The soil sample is washed into the funnel through the top sieve. When the funnel is filled by the

upward stream of water, the nematodes are separated from the heavier soil particles.

NOTE 1 If for whatever reason an Oostenbrink elutriator is not available, the Baermann funnel/tray method can be an

alternative. Details concerning its use are given in Annex C.

Unplug the funnel when the water has reached the edge and catch the water flow on a pile of three sieves

with 45 µm pore size (5.2.4). An additional top sieve (5.2.5) can be mounted on the three sieves (5.2.4) to

catch large nematodes that do not pass the final cotton-wool filter step. This sieve (5.2.5) shall be placed

directly in an extraction disk (shallow tray filled with water) (5.2.10) and stored in a cabinet for three days. At

higher ambient temperatures, the cabinet should be humidified and kept away from heat sources. The sieves

(5.2.4) are rinsed with a gentle stream of water which is caught in a plastic bowl (5.2.6). The suspension with

6 © ISO 2007 – All rights reserved
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ISO 23611-4:2007(E)

the nematodes can be set aside for 15 min to 30 min, during which time the nematodes settle to the bottom. It

has the advantage that the supernatant water in the plastic bowl can be poured out more quickly. Pour the

content of the bowl over a double filter [e.g. cotton-wool (milk)] (5.2.9), which is clipped onto an extraction

sieve (5.2.8) with a clamping ring (5.2.7). Place the ext
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23611-4
Première édition
2007-11-15
Qualité du sol — Prélèvement des
invertébrés du sol —
Partie 4:
Prélèvement, extraction et identification
des nématodes du sol
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting
nematodes
Numéro de référence
ISO 23611-4:2007(F)
ISO 2007
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ISO 23611-4:2007(F)
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit

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ISO copyright office
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ISO 23611-4:2007(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

3 Principe.................................................................................................................................................. 2

4 Réactifs .................................................................................................................................................. 3

5 Appareillage .......................................................................................................................................... 4

5.1 Échantillonnage .................................................................................................................................... 4

5.2 Extraction .............................................................................................................................................. 4

5.3 Comptage .............................................................................................................................................. 4

5.4 Fixation et préparation de lames d'ensemble.................................................................................... 5

5.5 Identification.......................................................................................................................................... 5

6 Mode opératoire .................................................................................................................................... 5

6.1 Généralités ............................................................................................................................................ 5

6.2 Échantillonnage .................................................................................................................................... 5

6.3 Extraction .............................................................................................................................................. 7

6.4 Comptage .............................................................................................................................................. 8

6.5 Fixation et préparation de lames d'ensemble.................................................................................... 8

6.6 Identification.......................................................................................................................................... 9

7 Analyse des données ........................................................................................................................... 9

8 Rapport d'étude................................................................................................................................... 10

Annexe A (informative) Figures du matériau et des méthodes pour la recherche nématologique......... 11

Annexe B (informative) Informations relatives à la disponibilité de l'élutriateur Oostenbrink ................ 14

Annexe C (informative) Informations relatives à la méthode d'extraction avec l'entonnoir/plateau

de Baermann ....................................................................................................................................... 16

Bibliographie .................................................................................................................................................... 18

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ISO 23611-4:2007(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 23611-4 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,

Méthodes biologiques.

L'ISO 23611 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Prélèvement

des invertébrés du sol:
⎯ Partie 1: Tri manuel et extraction au formol des vers de terre

⎯ Partie 2: Prélèvement et extraction des micro-arthropodes (Collembola et Acarina)

⎯ Partie 3: Prélèvement et extraction des enchytréides
⎯ Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
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ISO 23611-4:2007(F)
Introduction

La présente partie de l'ISO 23611 a été établie en raison du besoin croissant de normalisation des méthodes

de prélèvement et d'analyse des organismes du sol. Ces méthodes couvrent principalement l'échantillonnage,

l'extraction et la manipulation d'invertébrés dans le sol et sont nécessaires pour les applications suivantes:

[15], [17], [28]

⎯ la classification biologique des sols comprenant l'évaluation de qualité des sols ;

[9], [10], [13], [24]
⎯ la bio-indication et la surveillance terrestre à long terme ;

⎯ l'évaluation des effets des substances chimiques sur les animaux du sol (ISO 11268-3).

Les données utilisables pour la réalisation de ces objectifs sont obtenues par des méthodes normalisées étant

donné qu'elles peuvent être à la base de décisions à grande portée (par exemple la décision de

décontamination d'un site). En fait, l'absence de telles méthodes normalisées est l'une des principales raisons

pour lesquelles la classification biologique et l'évaluation biologique dans les habitats terrestres (c'est-à-dire

les sols) ont rarement été utilisées à ce jour comparés aux sites aquatiques.

Les nématodes constituent une partie importante de la faune du sol. Certains auteurs estiment que ce groupe

est probablement le plus important parmi les organismes pluricellulaires (métazoaires) sur terre. Les

nématodes sont présents de l'Antarctique aux tropiques et des sédiments en eau profonde aux régions

montagneuses. Ils sont actifs en tout lieu présentant suffisamment d'eau et de matières organiques. Leur

diversité spécifique et fonctionnelle est impressionnante. Les nématodes sont généralement connus en tant

que parasites des animaux et des plantes, mais la majeure partie de la nématofaune participe aux processus

de décomposition du fait du régime trophique de certains d'entre eux: bactérivores ou fongivores.

Les nématodes sont présents en grand nombre [(5 000 à 100 000)/kg de sol frais] et avec une diversité

spécifique élevée (20 à 100) dans pratiquement chaque échantillon de sol. De plus, ils présentent un spectre

écologique large de régimes trophiques et de places dans la chaîne alimentaire; il existe des nématodes

[27], [28]

bactérivores, fongivores, phytophages, prédateurs et omnivores . Ces facteurs rendent ce groupe

particulièrement adapté en tant qu'indicateur de la qualité écologique du sol, mais la normalisation des

méthodes est urgemment nécessaire pour la comparaison et l'analyse conjointe des résultats.

Au cours des 100 dernières années, la nématologie s'est fortement développée dans les domaines de

l'agriculture, l'échantillonnage en vue de produire des recommandations et les réglementations

phytosanitaires parce que certains nématodes phytoparasites causent des dégâts importants sur les cultures.

En ce qui concerne les méthodes, il existe plusieurs «écoles» dans différentes parties du monde avec leurs

propres histoires, avantages pratiques et inconvénients. Une vue d'ensemble est présentée par

[14] [22], [23]

Oostenbrink et Southey . Les méthodes (ou variantes) décrites plus récemment ont souvent été

développées avec un intérêt particulier pour certaines espèces de nématodes phytoparasites.

[4]

Depuis que Bongers a introduit l'indice de maturité, l'utilisation des nématodes dans la bio-indication pour la

qualité des sols s'est rapidement développée. Les nématodes sont désormais utilisés pour l'étude et la

surveillance écologique des sols dans plusieurs pays dans le monde entier. Les activités de surveillance

présentent certaines exigences méthodologiques. Par exemple, un grand nombre d'échantillons de sol sont

traités en routine pour un coût raisonnable. Certaines des méthodes initialement développées pour pouvoir

formuler des recommandations en agriculture sont particulièrement adaptées pour la recherche écologique.

Elles constituent la base de variantes spécifiques décrites dans ce document.
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NORME INTERNATIONALE ISO 23611-4:2007(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 4:
Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
1 Domaine d'application

La présente partie de l'ISO 23611 spécifie une méthode pour échantillonner et manipuler les nématodes du

sol en tant que condition préalable pour les utiliser comme bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la

qualité d'un sol en tant qu'habitat pour des organismes).

La présente partie de l'ISO 23611 s'applique à tous les biotopes terrestres dans lesquels des nématodes sont

présents. La procédure d'échantillonnage pour les études de terrain est spécifiée de façon générale dans

l'ISO 10381-1.

La présente partie de l'ISO 23611 n'est pas applicable pour les nématodes aquatiques parce que ceux-ci ne

traversent pas le filtre. Des méthodes pour certains autres groupes d'organismes tels que les vers de terre,

les enchytraeidae ou les collemboles sont couverts dans d'autres parties de l'ISO 23611.

Les nématodes qui sont caractérisés avec le mode opératoire proposé sont toutes les formes libres de

nématodes trouvées dans le sol. Ils comprennent les nématodes non phytophages ainsi que les nématodes

phytophages ectoparasitaires et les stades libres des nématodes phytophages endoparasitaires. La

quantification des nématodes strictement phytophages dans les racines requièrent des méthodes spécifiques.

NOTE Des informations de base sur l'écologie des nématodes et leur utilisation en tant que bio-indicateurs peuvent

être trouvées dans la bibliographie.

La présente partie de l'ISO 23611 ne couvre pas la caractérisation pédologique du site qui est

particulièrement recommandée lors du prélèvement d'invertébrés du sol. l'ISO 10390, l'ISO 10694,

l'ISO 11272, l'ISO 11274, l'ISO 11277, l'ISO 11461 et l'ISO 11465 sont plus appropriés pour mesurer le pH, la

granulométrie, le rapport C/N, la teneur en carbone organique et la capacité de rétention en eau.

2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

2.1
nématode

petit ver libre non segmenté (jusqu'à quelques millimètres de longueur) appartenant à la classe des nématodes

NOTE Les nématodes dont aucun stade n'habite dans le sol ne sont pas inclus dans ce cadre.

2.2
situation

zone ou point d'étude que l'on veut caractériser sur la base de la composition de la nématofaune (entre

autres)
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ISO 23611-4:2007(F)
2.3
échantillon composite

échantillon de sol constitué de nombreuses petites carottes de sol pour avoir un échantillon représentatif de la

nématofaune
2.4
outil de prélèvement de sol
gouge
tarière
outil utilisé pour collecter le sol d'une manière rapide et normalisée
2.5
élutriateur Oostenbrink

entonnoir en métal avec un flux d'eau de bas en haut permettant de séparer les nématodes des plus grosses

particules de sol
Voir la Figure A.3.
2.6
lame d'ensemble

lame microscopique sur laquelle 300 à 400 nématodes sont montés pour l'identification des espèces

2.7
identification

détermination de l'espèce, du genre ou de la famille d'un individu sur la base de caractéristiques

morphologiques (cavité buccale, organes sexuels, mensurations) avec une clé d'identification

2.8
échelle colonisateur – persistant (cp)
[4], [5]
classification écologique des nématodes, proposée par Bongers

NOTE Le principe est analogue aux stratégies démographiques r-K, largement acceptées en écologie fondamentale.

Les familles de nématodes non phytophages sont classées dans l'un des cinq groupes cp. C'est également la base du

calcul de l'indice de maturité.
3 Principe

Les échantillons de sol contenant les nématodes sont collectés avec une petite carotte cylindrique (diamètre:

environ 2 cm, longueur: 10 cm) ou une tarière (voir la Figure A.2). Pour les applications de surveillance les

échantillons de sol sont mélangés dans un échantillon composite, représentatif d'une zone homogène. Le

nombre total d'échantillons doit être déterminé en fonction de la surface étudiée et de son homogénéité (par

exemple: pédologie, cultures). Les échantillons individuels peuvent être collectés sur le terrain dans des sacs

en plastique ou des seaux en plastique. L'échantillon composite est trop volumineux pour un examen direct et,

en conséquence, celui-ci est mélangé et sous-échantillonné. Sur le terrain et durant le transport au laboratoire,

les échantillons de sol doivent être protégés contre les fortes fluctuations de température, la perte d'eau et les

perturbations mécaniques violentes. Ils peuvent être conservés pendant quatre semaines au maximum à 4 °C.

[23]

NOTE 1 La méthode d'échantillonnage décrite ci-dessus est dérivée de la «Dutch Method» pour déterminer

l'infestation par les nématodes à kystes de parcelles cultivées en pomme de terre et a été utilisée depuis longtemps dans

plusieurs pays européens.

1) L'élutriateur Oostenbrink est l'appellation commerciale d'un produit distribué par la société Eijkelkamp, Giesbeek,

Pays-Bas (http://www.eijkelkamp.nl). Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme

internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des

produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.

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ISO 23611-4:2007(F)

La méthode de l'entonnoir Oostenbrink est recommandée pour les extractions de routine d'échantillons de sol,

dans un réseau de surveillance, par exemple. La méthode Oostenbrink n'est pas la plus simple qui peut être

utilisée en toutes circonstances. Cependant, elle présente plusieurs avantages: elle est très normalisée et

présente une efficacité d'extraction constante. La méthode de l'entonnoir Oostenbrink combine trois moyens

de base qui peuvent être utilisés pour la séparation des nématodes des sols: le lavage, le tamisage et le

mouvement actif. Par conséquent, elle permet d'obtenir de meilleurs résultats que l'une des méthodes de

base individuellement. Les autres avantages sont donnés ci-dessous:

⎯ des échantillons de sol relativement importants, quelque soit le type de sol, peuvent être traités en une

fois (100 g à 500 g);
⎯ des suspensions de nématodes limpides;
⎯ l'isolement de la plupart des nématodes vivants et actifs;

⎯ il existe de nombreuses années d'expérience sur des nombres extrêmement élevés d'extractions de sol

en routine;
⎯ elle est utilisée dans de nombreux pays dans le monde entier.

Après l'échantillonnage, les nématodes sont extraits du sol en utilisant l'élutriateur Oostenbrink (modèle III)

(voir la Figure A.3 et l'Annexe B). Dans cette technique, un courant ascendant d'eau sépare les nématodes

des particules du sol et les maintient en suspension tandis que les particules plus lourdes décantent au

[1], [14], [19], [23]

fond . Cette suspension de nématodes et de petites particules traverse trois tamis (taille de

maille: 45 µm). Les particules retenues sur les tamis sont lavées et recueillies sur un filtre en ouate (filtre pour

lait). Le filtre en ouate est monté sur un tamis et le tout est placé dans une cuvette avec 100 ml d'eau

courante. Pendant trois jour, les nématodes se séparent des débris par leur mouvement actif vers le bas.

Ainsi, les nématodes vivants traversent activement le filtre et se retrouvent dans la cuvette contenant l'eau.

Après l'extraction, les nématodes sont comptés dans 2 × 10 % des 100 ml de suspension, puis concentrés,

fixés et montés sur des lames d'ensemble. Puis, au moins 150 individus ou un pourcentage fixe du nombre

total de nématodes dans l'échantillon sont identifiés au microscope.

Les nématodes adultes peuvent être identifiés au niveau de l'espèce. Cependant, les populations dans le sol

sont souvent dominées par des juvéniles et le genre est un seuil taxonomique pratique (mais moins sensible).

[19]

D'autres méthodes d'extraction telles que l'élutriateur Seinhorst ou l'entonnoir Baerman (voir l'Annexe C)

peuvent être utiles dans des cas particuliers, mais ne sont pas recommandées en tant que mode opératoire

général parce que l'élutriateur Oostenbrink est robuste, facile à utiliser et généralement quantitativement

supérieur à la plupart des autres techniques. En variante, les techniques de centrifugation sont les plus

adaptées.

NOTE 2 Cette partie de l'ISO 23611 n'est pas applicable pour les nématodes aquatiques parce que ceux-ci ne

traversent pas le filtre. Il existe des techniques de centrifugation spécifiques pour les échantillons de sédiments.

NOTE 3 La détermination au microscope optique est basée sur des caractères morphologiques. Dans certains cas, il

n'est pas possible de reconnaître un spécimen au niveau de l'espèce, par exemple des jeunes. Avec une nouvelle

technique basée sur l'analyse d'ADN, les individus jeunes peuvent également être identifiés au niveau de l'espèce. Dans

quelques années, cette nouvelle technique devrait être opérationnelle.
4 Réactifs
4.1 Formol [solution de formaldéhyde, 6 % (fraction volumique)].
4.2 Paraffine, avec un point de fusion proche de 60 °C.
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5 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire standard ainsi que ce qui suit.
5.1 Échantillonnage

5.1.1 Outil de prélèvement d'échantillon de sol, de type à tube ouvert, fermé ou divisé.

EXEMPLE Dispositif de prélèvement d'échantillon de sol (diamètre: 23 mm) ou une tarière (Figures A.2 et A.3);

disponibles dans le commerce.
5.1.2 Seau en plastique, pour la collecte d'échantillons de sol sur le terrain.
5.1.3 Récipient en plastique, pour le mélange de l'échantillon composite.
5.1.4 Tamis, de 8 mm de taille de pore.
5.1.5 Sacs en plastique ou récipients en verre (transport et stockage).
5.1.6 Marqueur permanent ou étiquettes préimprimées.
5.2 Extraction
5.2.1 Bécher, ayant une capacité de 100 ml à 250 ml.

5.2.2 Balance, pouvant peser de 1 kg à 25 kg, pour peser la masse d'échantillon totale.

5.2.3 Élutriateur Oostenbrink (voir également l'Annexe B).
5.2.4 Trois tamis, de 45 µm de taille de pore et de 30 cm de diamètre.
5.2.5 Un tamis, de 250 µm de taille de pore et de 10 cm de diamètre.
5.2.6 Bassine en plastique, d'environ 2 l de capacité.
5.2.7 Bague de fixation.
5.2.8 Tamis d'extraction, de 1 000 µm de taille de pore et de 16 cm de diamètre.
5.2.9 Filtres à lait ou en ouate.
5.2.10 Plateaux bas (boîtes de Petri) ou cuvettes d'extraction spéciales.
5.2.11 Flacon en verre, de 100 ml de capacité, avec bouchon à vis.
5.3 Comptage
5.3.1 Loupe binoculaire, avec un grossissement ×10 à ×50.
5.3.2 Plaque de comptage avec une grille.

NOTE Des plaques de comptage de différentes tailles et de différents pas de grille sont disponibles auprès des

fabricants de matériel de laboratoire. Elles peuvent également être préparées à partir de boîtes de Petri en gravant une

grille au fond à l'aide d'une aiguille.
5.3.3 Compteur à main.
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5.3.4 Pompe d'aquarium, pour mélanger les suspensions de nématodes.
5.3.5 Pipette (goutte à goutte en verre), avec volume réglable.
5.3.6 Aiguille permettant de manipuler les nématodes.
5.3.7 Flacon, ayant un volume de 100 ml.
5.4 Fixation et préparation de lames d'ensemble
5.4.1 Pompe à eau, pour concentrer les suspensions.
5.4.2 Lames en verre, de 50 mm × 76 mm.
5.4.3 Lamelles couvre-objet, de 45 mm × 45 mm.
5.4.4 Plaque chauffante électrique.

5.4.5 Poinçon en métal, 40 mm × 40 mm, pour le joint de paraffine sur les lames de verre.

5.5 Identification
5.5.1 Microscope, avec un grossissement ×400 à ×1 000.
5.5.2 Indicateur micrométrique oculaire.
[3]
5.5.3 Clés d'identification .
5.5.4 Formulaire normalisé, pour lister les résultats d'identification.
6 Mode opératoire
6.1 Généralités

Pour s'assurer de la qualité de l'analyse, chaque échantillon doit recevoir un code unique dès qu'il est prélevé

sur le terrain. Ce code (étiquette) doit rester avec l'échantillon durant toutes les étapes de traitement et

d'analyse. Il convient d'utiliser un ou plusieurs formulaires normalisés électroniques pour suivre

l'acheminement des échantillons et la collecte des résultats d'analyse. Ces données de base peuvent être

combinées dans un fichier de tableur ou de base de données pour les calculs et analyses statistiques

réalisées.
6.2 Échantillonnage

Étant donné que la densité et la diversité des nématodes du sol sont les plus élevées dans les 10 cm

supérieurs du sol minéral, un outil de prélèvement d'échantillon de sol (5.1.1) avec un tube de prélèvement de

10 cm ou 15 cm de longueur est approprié pour la plupart des applications de surveillance biologique. Il est

recommandé d'utiliser un tube fermé de longueur et de diamètre fixes.

EXEMPLE 1 Un outil de prélèvement d'échantillon de sol consiste en une tarière à gouge en acier inoxydable

(disponible dans différentes dimensions) constituée d'un tuyau de tarière en acier, d'un seau de collecte (5.1.2) et d'une

tige avec une poignée en acier. En raison de la forme conique du tuyau, l'échantillon est aisément poussé vers le seau de

collecte lorsque l'échantillon suivant est prélevé. La profondeur d'échantillonnage est constante et les carottes de sol

peuvent être aisément collectées dans une grande parcelle (voir la Figure A.1). Ce dispositif peut être utilisé dans de

nombreuses situations.
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ISO 23611-4:2007(F)

EXEMPLE 2 Une tarière pour les sols peut également être utilisée en tant qu‘outil simple, économique et rapide

d'utilisation. Des tarières sont disponibles dans différentes dimensions. Les échantillons de sol collectés avec une tarière

sont moins comprimés. L'inconvénient est que du sol risque d'être perdu plus aisément (voir la Figure A.2).

EXEMPLE 3 Lorsqu'une séparation précise des couches du sol est requise, un dispositif de prélèvement à tube divisé

peut être utilisé. Cet outil d'échantillonnage requiert plus de temps de manipulation et est moins adapté pour un grand

nombre d'échantillons et de grandes surfaces (voir la Figure A.2).

Des échantillons de couches plus profondes peuvent être prélevés avec une tarière pour éviter une

compression excessive du sol ou avec des dispositifs de prélèvement à tube divisé (voir la Figure A.2). De la

matière organique ou de la litière peuvent être incluse dans les échantillons, mais cela augmente les nombres

de nématodes observés, parfois considérablement. Il est préférable de prélever les couches organiques

indépendamment. Dans ce cas, un dispositif de carottage à tube divisé plus large (5 cm à 10 cm) est

préférable afin de séparer les horizons organiques du matériau minéral. De faibles quantités de litière peuvent

également être traitées dans un élutriateur Oostenbrink (5.2.3) pour extraire les nématodes. L'efficacité

[16], [18]

d'extraction peut être améliorée par trempage et mélange des fractions organiques .

Un échantillon représentatif d'un type spécifique d'écosystème requiert une surface d'au moins 0,5 ha et de

préférence de 1 ha. Il est recommandé de sélectionner une surface qui est (plus ou moins) homogène en termes

de propriétés du sol, de végétation et d'utilisation du sol. La surface étudiée est indiquée dans les informations

concernant la situation étudiée. En règle générale, 100 carottes de sol doivent être combinées pour 1 ha. Pour les

surfaces plus petites (par exemple 100 m ), environ 25 carottes sont suffisantes pour obtenir une estimation de la

composition de nématodes et collecter suffisamment de sol. Un profil d'échantillonnage plus dense conduit à une

meilleure estimation de l'abondance et de la composition spécifique de la nématofaune. Cependant, un

compromis est nécessaire avec la quantité du sous-échantillon qui est finalement analysé à partir de l'échantillon

composite homogénéisé. En effet, un échantillon brut très grand ne donne pas plus d'informations parce que

seule une petite partie est analysée et l'homogénéisation ne peut pas être parfaite. Un maximum de trois cents

échantillons obtenus avec un outil de prélèvement d'échantillons de sol (diamètre: 23 mm) sont recommandés

pour constituer un échantillon composite. Dans un programme de surveillance biologique, il convient que la

densité d'échantillon par unité de surface soit égale pour toutes les situations. La masse de l'échantillon

composite et le nombre de carottes de sol qui le composent doivent être connus.

Le plan d'échantillonnage peut être régulier (grille), selon un plan particulier ou aléatoire. Pour des situations très

grandes il est plus pratique de parcourir le site en zigzag et de prélever des échantillons arbitrairement le long de

ce chemin. Dans le cas où la situation est constituée de différentes parcelles, le nombre d'échantillons de sol par

parcelle doit être déterminé sur la base de leur superficie. Des échantillons provenant de parties atypiques de la

situation telles que des fossés, des pistes ou des chemins doivent être évités.

L'échantillon composite collecté est homogénéisé dans un récipient en plastique (5.1.3).

...

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