ISO 15302:2007

Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene — Reverse-phase high performance liquid chromatography method

ISO 15302:2007 specifies a method for the determination of benzo[a]pyrene in crude or refined edible oils and fats by reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) using fluorimetric detection in the range 0,1 µg/kg to 50 µg/kg.

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination du benzo[a]pyrène — Méthode par chromatographie liquide à haute performance à polarité de phase inversée

L'ISO 15302:2007 spécifie une méthode de détermination du benzo[a]pyrène dans les corps gras comestibles bruts ou raffinés par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à polarité de phase inversée à l'aide d'une détection fluorimétrique, dans la gamme de 0,1 µg/kg à 50 µg/kg.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 09-Dec-2007
• Withdrawal Date: 09-Dec-2007
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 29-Mar-2017

Relations

• Revised: ISO 15302:2017 - Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene — Reverse-phase high performance liquid chromatography method
• Effective Date: 19-Mar-2016
• Revises: ISO 15302:1998 - Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene content — Reverse-phase high-performance liquid chromatography method
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 15302
Второе издание
2007-12-15

Жиры и масла животные и
растительные. Определение
содержания бензо[a]пирена. Метод с
применением высокоэффективной
жидкостной хроматографии с обратной
фазой
Animal and vegetable fats and oils — Determination of benzo[a]pyrene
— Reverse-phase high performance liquid chromatography method



Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 15302:2007(R)
©
ISO 2007

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15302:2007(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или вывести на экран, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на загрузку интегрированных шрифтов в компьютер, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.


ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ


©  ISO 2007
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по соответствующему адресу, указанному ниже, или комитета-члена ISO в стране
заявителя.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии

ii © ISO 2007 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15302:2007(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в
этом комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие
связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO осуществляет тесное сотрудничество с
международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области
электротехники.
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Главная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Обращается внимание на возможность патентования некоторых элементов данного международного
стандарта. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех таких патентных
прав.
ISO 15302 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом
SC 11, Жиры и масла животные и растительные.
Это второе издание отменяет и заменяет первое издание (ISO 15302:1998).

© ISO 2007 – Все права сохраняются  iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 15302:2007(R)

Жиры и масла животные и растительные. Определение
содержания бензо[a]пирена. Метод с применением
высокоэффективной жидкостной хроматографии с
обратной фазой
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод для определения бензо[a]пирена в сырых
или очищенных пищевых маслах и жирах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с
обратной фазой (HPLC) с использованием люминесцентного детектирования в диапазоне от 1 мкг/кг до
50 мкг/кг.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы являются обязательными при применении данного
документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание документа. Для плавающих
ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного документа
(включая любые изменения).
ISO 661, Жиры и масла животные и растительные. Подготовка пробы для испытания
3 Термины и определения
Применительно к этому документу используются следующие термины и определения.
3.1
содержание бензо[a]пирена
benzo[a]pyrene content
массовая доля бензо[a]пирена в испытательном образце, определенная с использованием метода,
установленного в этом международном стандарте
ПРИМЕЧАНИЕ Это содержание выражается в микрограммах на килограмм.
4 Принцип
Испытательный образец растворяют в петролейном эфире и добавляют бензо[b]хризен в качестве
внутреннего эталона. Подходящее количество пробы адсорбируют на колонке с оксидом алюминия и
элюируют посредством петролейного эфира для удаления присутствующего бензо[a]пирена.
5 Реактивы
Использовать реактивы только признанной аналитической чистоты, если не установлено иначе. Если
используются аналитические растворители, которые здесь не рекомендованы, то проводится полный
холостой анализ и его результаты публикуются.
© ISO 2007 – Все права сохраняются 1

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 15302:2007(R)
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ. Обращается внимание на регламент, который устанавливает
процедуры обращения с опасными веществами. Пользователи должны понимать и соблюдать
технические, организационные и личные меры безопасности.
5.1 Вода, двукратно дистиллированная, отфильтрованная через фильтр с размером пор 45 мкм;
можно также использовать деионизированную воду, полученную путем очистки деминерализованных
водных систем.
5.2 Петролейный эфир (интервал температуры кипения от 40 °C до 60 °C), или гексан, повторно
дистиллированный через гранулы гидроксида калия (4 г/л).
5.3 Ацетонитрил, подходящий для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
5.4 Тетрогидрофуран, подходящий для HPLC.
5.5 Смесь ацетонитрила-тетрагидрофурана, приготовленная путем смешивания 90 мл
ацетонитрила (5.3) и 10 мл тетрагидрофурана (5.4).
5.6 Толуол, подходящий для HPLC.
5.7 Сульфат натрия, гранулированный, безводный.
5.8 Оксид алюминия с активностью класса 4, приготовленный из нейтрального оксида алюминия
1)
с высоким классом активности 1 , дезактивированный путем добавления 10 мл воды (5.1) к 90 г оксида
алюминия.
Из-за различия в активности различных марок оксида алюминия рекомендуется проверка для
подтверждения, что процедура дезактивации является подходящей для полного выделения
бензо[a]пирена из эталонного образца.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. РЕАКЦИЯ ДЕЗАКТИВАЦИИ ЯВЛЯЕТСЯ ЭКЗОТЕРМИЧЕСКОЙ, И ДАВЛЕНИЕ
МОЖЕТ РАСТИ.
Встряхивать контейнер в течение 15 мин и оставить на 24 ч для приведения содержимого в
равновесие. Хранить оксид алюминия в закрытом резервуаре при температуре окружающей среды.
2)
5.9 Бензо[a]пирен , чистотой 99,0 % по массе.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ − БЕНЗО[a]ПИРЕН ЯВЛЯЕТСЯ ИЗВЕСТНЫМ КАНЦЕРОГЕНОМ. ВСЮ
РАБОТУ ВЫПОЛНЯЙТЕ В ВЫТЯЖНОМ ШКАФУ И НАДЕВАЙТЕ ПЕРЧАТКИ, ЧТОБЫ
МИНИМИЗИРОВАТЬ ВОЗДЕЙСТВИЕ.
5.9.1 Исходный раствор бензо[a]пирена в толуоле, 0,5 мг/мл.
Отвесить с точностью до 0,1 мг около 12,5 мг бензо[a]пирена в 25-мл мерную колбу. Растворить его в
толуоле (5.6) и довести до метки этим растворителем.
Хранить раствор в темноте при 4 °C, где он будет устойчив как минимум 6 месяцев.

1) “Оксид алюминия 90 активный нейтральный” является примером подходящего продукта, имеющегося в
продаже. Эта информация дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не является
поддержкой этого продукта со стороны ISO. Можно использовать аналогичные продукты, если есть данные, что
они дают такие же результаты.
2) Подходящий стандартный образец имеется в центре Joint Research Centre of the European Commission,
Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM). Эта информация дается только для удобства
пользователей данного международного стандарта и не является поддержкой этого продукта со стороны ISO
2 © ISO 2007 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15302:2007(R)
5.9.2 Стандартные растворы бензо[a]пирена.
Приготовить два стандартных раствора, содержащих приблизительно 0,2 мкг/мл и 0,01 мкг/мл
бензо[a]пирена соответственно, разбавляя аликвоты исходного раствора (5.9.1) ацетонитрилом.
3)
5.10 Внутренний стандартный раствор бензо[b]хризена в ацетонитриле.
Приготовить исходный раствор, содержащий с точностью до нанограмм около 10 нг/мкл. Разбавить
этот раствор до увеличения в 10 раз в мерной колбе, чтобы получить внутренний стандартный раствор
с концентрацией приблизительно 1 нг/мкл.
3)
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот раствор можно также приготовить, растворяя бензо[b]хризен , 99,0 % по массе, в
ацетонитриле.
6 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.
6.1 Стеклянная колонка для хроматографического анализа длиной 300 мм и внутренним
диаметром 15 мм, оснащенная дисками из пористого стекла и политетрафторэтиленовой (PTFE)
крышкой.
6.2 Водяные бани, одна, поддерживаемая при (35 ± 2) °C, и другая при (65 ± 2) °C.
6.3 Мгновенный испаритель, можно использовать роторный испаритель с вакуумом и водяной
баней, установленный на 40 °C. Принимать меры для предотвращения перекрестного загрязнения.
Полностью очищать систему между измерениями.
6.4 Высокоэффективный жидкостный хроматограф, состоящий из HPLC насоса, инжекционного
клапана с 50-мкл пробоотборной петлей, обратнофазной колонки, электронного интегратора и
диаграммного самописца.
Если используется автоматический пробоотборник, пробоотборную петлю нужно промывать
ацетонитрилом между последовательными инжекциями.
6.5 Колонки для HPLC анализа
6.5.1 Обратнофазная защитная колонка, обеспечивающая растворение бензо[a]пирена из
совместных экстрактивных веществ, вместе с подходящей предколонкой [например, предколонка из
нержавеющей стали длиной 75 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, наполненная Lichrosorb RP-18
4)
(размер частиц 5 мкм)] .
6.5.2 HPLC обратнофазная колонка длиной 2
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 15302
Second edition
2007-12-15

Animal and vegetable fats and oils —
Determination of benzo[a]pyrene —
Reverse-phase high performance liquid
chromatography method
Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination du
benzo[a]pyrène — Méthode par chromatographie liquide à haute
performance à polarité de phase inversée




Reference number
ISO 15302:2007(E)
©
ISO 2007

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15302:2007(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.


COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT


©  ISO 2007
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland

ii © ISO 2007 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15302:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 15302 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 15302:1998).

© ISO 2007 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 15302:2007(E)

Animal and vegetable fats and oils — Determination of
benzo[a]pyrene — Reverse-phase high performance liquid
chromatography method
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of benzo[a]pyrene in crude or refined
edible oils and fats by reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) using fluorimetric
detection in the range 0,1 µg/kg to 50 µg/kg.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
benzo[a]pyrene content
mass fraction of benzo[a]pyrene in the test portion, as determined using the method specified in this
International Standard
NOTE The content is expressed in micrograms per kilogram.
4 Principle
A test portion is dissolved in light petroleum and benzo[b]chrysene is added as internal standard. A suitable
amount of sample is adsorbed on an alumina column, and eluted with light petroleum to remove any
benzo[a]pyrene present.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified. Where analytical grade solvents
other than the recommended ones are used, a full blank analysis shall be carried out and the results of this
blank analysis reported.
SAFETY PRECAUTIONS — Attention is drawn to regulations which specify handling procedures for
dangerous substances. Users should be aware of and comply with technical, organizational, and
personal safety measures.
© ISO 2007 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 15302:2007(E)
5.1 Water, double distilled, filtered through a membrane filter of pore size 0,45 µm; deionized water
obtained by purifying demineralized water systems may also be used.
5.2 Light petroleum (boiling point range 40 °C to 60 °C), or hexane, redistilled over potassium hydroxide
pellets (4 g/l).
5.3 Acetonitrile, suitable for HPLC.
5.4 Tetrahydrofuran, suitable for HPLC.
5.5 Acetonitrile-tetrahydrofuran mixture, prepared by mixing 90 ml acetonitrile (5.3) and 10 ml
tetrahydrofuran (5.4).
5.6 Toluene, suitable for HPLC.
5.7 Sodium sulfate, granular, anhydrous.
1)
5.8 Alumina activity grade 4, prepared from neutral aluminium oxide, activity grade super 1 , deactivated
by the addition of 10 ml water (5.1) to 90 g of alumina.
Due to the differences in activity of alumina of various brands, a check is recommended to confirm that the
deactivation procedure is appropriate for total benzo[a]pyrene recovery from a reference sample.
CAUTION — THE DEACTIVATION REACTION IS EXOTHERMIC AND PRESSURE MAY BUILD UP.
Shake the container for about 15 min and allow the contents to equilibrate for 24 h. Store the alumina in a
closed vessel at ambient temperature.
2)
5.9 Benzo[a]pyrene , of purity 99,0 % by mass.
CAUTION — BENZO[a]PYRENE IS A KNOWN CARCINOGEN. CARRY OUT ALL WORK WITH IT IN A
FUME HOOD, WEARING GLOVES TO MINIMIZE EXPOSURE.
5.9.1 Benzo[a]pyrene stock solution in toluene, 0,5 mg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, about 12,5 mg of benzo[a]pyrene in a 25 ml graduated flask. Dissolve it in
toluene (5.6) and make up to the mark with that solvent.
Store the solution in the dark at 4 °C where it is stable for at least 6 months.
5.9.2 Benzo[a]pyrene standard solutions.
Prepare two standard solutions containing approximately 0,2 µg/ml and 0,01 µg/ml of benzo[a]pyrene,
respectively by diluting aliquots of the stock solution (5.9.1) with acetonitrile.

1) “Aluminium oxide 90 active neutral” is an example of a suitable product available commercially. This information is
given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this
product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
2) A suitable reference material is available from the Joint Research Centre of the European Commission, Institute for
Reference Materials and Measurements (IRMM). This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2 © ISO 2007 – All rights reserved

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15302:2007(E)
3)
5.10 Benzo[b]chrysene internal standard solution in acetonitrile.
Prepare a stock solution containing, to the nearest nanogram, approximately 10 ng/µl. Dilute this solution by a
factor of 10 in a volumetric flask, to obtain an internal standard solution with a concentration of approximately
1 ng/µl.
3)
NOTE This solution may also be prepared by dissolving benzo[b]chrysene , 99,0 % by mass, in acetonitrile.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Glass column for chromatography, of length 300 mm and internal diameter 15 mm, fitted with
sintered glass discs, and polytetrafluoroethylene (PTFE) tap.
6.2 Water baths, one maintained at (35 ± 2) °C and another at (65 ± 2) °C.
6.3 Flash evaporator, a rotary evaporator with vacuum and a water bath set at 40 °C may be used. Care
should be taken to prevent cross contamination. Clean the system thoroughly between determinations.
6.4 High performance liquid chromatograph, consisting of an HPLC pump, injection valve with 50 µl
sample loop, reverse-phase column, electronic integrator and chart recorder.
If an autosampler is used, the sample loop shall be flushed with acetonitrile between consecutive injections.
6.5 Columns for HPLC analysis
6.5.1 Reverse-phase guard column, capable of resolving benzo[a]pyrene from co-extractives, together
with appropriate precolumn [e.g. stainless-steel precolumn of length 75 mm and internal diameter 4,6 mm,
4)
packed with Lichrosorb RP-18 (of particle size 5 µm)] .
6.5.2 HPLC reverse-phase column, of length 250 mm and internal diameter 4,6 mm (stainless steel), for
4)
polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) [e.g. Chromspher 5 PAH or Vydac 201 TP5] .
6.6 Fluorescence detector, with emission wavelength at 406 nm (slit 10 nm) and excitation wavelength at
384 nm (slit 10 nm). The detector shall be capable of the required performance to carry out the analysis.
6.7 Crimp-top minivials, of about 1 ml volume, with
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 15302
Deuxième édition
2007-12-15


Corps gras d'origines animale
et végétale — Détermination
du benzo[a]pyrène — Méthode
par chromatographie liquide à haute
performance à polarité de phase inversée
Animal and vegetable fats and oils — Determination
of benzo[a]pyrene — Reverse-phase high performance liquid
chromatography method




Numéro de référence
ISO 15302:2007(F)
©
ISO 2007

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 15302:2007(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.


DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT


©  ISO 2007
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Version française parue en 2009
Publié en Suisse

ii © ISO 2007 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 15302:2007(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 15302 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 15302:1998).


© ISO 2007 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 15302:2007(F)

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination
du benzo[a]pyrène — Méthode par chromatographie liquide
à haute performance à polarité de phase inversée
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination du benzo[a]pyrène dans les corps
gras comestibles bruts ou raffinés par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à polarité de
phase inversée à l'aide d'une détection fluorimétrique, dans la gamme de 0,1 µg/kg à 50 µg/kg.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non dates, la dernière édition du
document de référence (y compris les éventuels amendements) s'applique.
ISO 661, Corps gras d'origines animale et végétale — Préparation de l'échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
teneur en benzo[a]pyrène
fraction massique de benzo[a]pyrène dans la prise d'essai, déterminée par la méthode spécifiée dans la
présente Norme internationale
NOTE La teneur est exprimée en microgrammes par kilogramme.
4 Principe
Une prise d'essai est dissoute dans de l'éther de pétrole et du benzo[b]chrysène est ajouté en tant qu'étalon
interne. Une quantité appropriée d'échantillon est adsorbée sur une colonne d'alumine puis éluée avec de
l'éther de pétrole afin d'éliminer toute présence de benzo[a]pyrène.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf spécification contraire. Lors de
l'utilisation de solvants ayant une qualité analytique autre que celle recommandée, effectuer un essai à blanc
et consigner les résultats de cet essai.
PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ — L'attention est attirée sur les réglementations qui spécifient les
règles relatives à la manipulation des substances dangereuses. Il convient que les utilisateurs
connaissent les mesures de sécurité relatives au personnel, à la technique et à l'organisation, et qu'ils
s'y conforment.
© ISO 2007 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 15302:2007(F)
5.1 Eau, ayant fait l'objet d'une double distillation, filtrée à travers une membrane filtrante de 0,45 µm de
taille de pores. Il est également possible d'utiliser de l'eau déionisée obtenue à partir de systèmes de
déminéralisation d'eau.
5.2 Éther de pétrole (point d'ébullition se situant dans une plage de 40 °C à 60 °C), ou hexane, redistillé
sur des pastilles d'hydroxyde de potassium (4 g/l).
5.3 Acétonitrile, pour CLHP.
5.4 Tétrahydrofurane, pour CLHP.
5.5 Mélange acétonitrile-tétrahydrofurane, préparé en mélangeant 90 ml d'acétonitrile (5.3) et 10 ml de
tétrahydrofurane (5.4).
5.6 Toluène, pour CLHP.
5.7 Sulfate de sodium, anhydre, en grains.
5.8 Alumine, degré d'activité 4, préparée à partir d'oxyde d'aluminium neutre, degré d'activité supérieure
1)
à 1 , désactivée par l'ajout de 10 ml d'eau (5.1) à 90 g d'alumine.
Étant donné les différences d'activité des différentes marques d'alumine, il est recommandé d'effectuer un
contrôle afin de confirmer que le mode opératoire de désactivation est approprié à la récupération totale du
benzo[a]pyrène à partir d'un échantillon de référence.
ATTENTION — LA RÉACTION DE DÉSACTIVATION EST EXOTHERMIQUE ET IL PEUT Y AVOIR
ACCUMULATION DE PRESSION.
Agiter le conteneur pendant environ 15 min et laisser le contenu parvenir à l'équilibre pendant 24 h.
Conserver l'alumine dans un récipient fermé à température ambiante.
2)
5.9 Benzo[a]pyrène , pur à 99,0 % en masse.
ATTENTION — LE BENZO[a]PYRÈNE EST UN CARCINOGÈNE BIEN CONNU. L'UTILISER SOUS HOTTE
POUR TOUS LES TRAVAUX, EN PORTANT DES GANTS AFIN DE RÉDUIRE L'EXPOSITION AU
MINIMUM.
5.9.1 Solution mère de benzo[a]pyrène dans du toluène, 0,5 mg/ml.
Peser, à 0,1 mg près, environ 12,5 mg de benzo[a]pyrène dans une fiole jaugée de 25 ml. Le dissoudre dans
le toluène (5.6) et remplir jusqu'au trait avec ce solvant.
Conserver la solution dans l'obscurité à 4 °C où elle reste stable pendant au moins 6 mois.
5.9.2 Solutions étalons de benzo[a]pyrène.
Préparer deux solutions étalons contenant respectivement, environ 0,2 µg/ml et 0,01 µg/ml de benzo[a]pyrène,
en diluant les parties aliquotes de la solution mère (5.9.1) avec de l'acétonitrile.

1) «L'oxyde d'aluminium 90 activé neutre» est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette
information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO
approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est
démontré qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
2) Un matériau de référence approprié est disponible auprès du Centre commun de recherche (JRC) de la Commission
Européenne, Institut des matériaux et mesures de référence (IRMM). Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
2 © ISO 2007 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 15302:2007(F)
3)
5.10 Solution étalon interne de benzo[b]chrysène dans de l'acétonitrile.
Préparer une solution mère contenant, au nanogramme près, environ 10 ng/µl. Diluer la solution 10 fois dans
une fiole jaugée afin d'obtenir une solution étalon interne avec une concentration d'environ 1 ng/µl.
3)
NOTE Il est également possible de préparer cette solution en dissolvant 99,0 % en masse de benzo[b]chrysène ,
dans de l'acétonitrile.
6 Appareillage
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Colonne de chromatographie en verre, de 300 mm de longueur et de 15 mm de diamètre interne,
munie de disques en verre fritté et d'un robinet en polytétrafluoroéthylène (PTFE).
6.2 Bains-marie, l'un maintenu à (35 ± 2) °C et l'autre à (65 ± 2) °C.
6.3 Évaporateur rotatif, il est possible d'utiliser un évaporateur rotatif sous vide et un bain-marie réglé à
40 °C. Il convient de veiller à empêcher toute contamination croisée. Nettoyer soigneusement le système
entre les déterminations.
6.4 Chromatographie liquide à haute performance, comprenant une pompe CLHP, une vanne d'injection
avec une boucle d'échantillonnage de 50 µl, une colonne à polarité de phase inversée, un intégrateur
électronique et un enregistreur de diagramme.
Si un échantillonneur automatique est utilisé, la boucle d'échantillonnage doit être rincée à l'acétonitrile entre
les injections consécutives.
6.5 Colonnes d'analyse CLHP.
6.5.1 Colonne de garde à polarité de phase inversée, pouvant séparer le benzo[a]pyrène des co-extraits,
ainsi qu'une précolonne appropriée [par exemple, en acier inoxydable, de 75 mm de longueur et de 4,6 mm
4)
de diamètre intérieur, garnie de Lichrosorb RP-18 (granulométrie de 5 µm)] .
6.5.2 Colonne CLHP à polarité de phase inversée, de 250 mm de longueur et de 4,6 mm de diamètre
intérieur (acier inoxydable), pour hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) [par exemple, Chromspher
4)
5 PAH ou Vydac 201 TP5] .
6.6 Détecteur fluorimétrique, avec une longueur d'onde d'émission à 406 nm (fente de 10 nm) et une
longueur d'onde d'excitation à 384 nm (fen
...