ISO 16303:2013
(Main)Water quality — Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
Water quality — Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
ISO 16303:2013 specifies a method for the determination of toxicity to young Hyalella azteca in whole sediment based on survival and growth inhibition after 14 d and/or 28 d. The method is applicable to a) samples of contaminated whole freshwater sediment, b) chemical, industrial, or municipal sludge, or other solid wastes that may combine with freshwater sediments, and c) chemicals or preparations spiked into clean sediment. ISO 16303:2013 is applicable to the testing of sediment samples from the freshwater environment. Hyalella azteca can be used in the testing of brackish waters up to a maximum of 15 ?, with careful acclimation. ISO 16303:2013 is not applicable to the testing of sediment samples from the marine and estuarine environment with a salinity of > 15 ?. This method is a 14 d and/or 28 d survival-and-growth test applicable to the sediment sample types described above.
Qualité de l'eau — Détermination de la toxicité des sédiments d'eau douce vis-à-vis de Hyalella azteca
L'ISO 16303:2013 définit une méthode de détermination de la toxicité d'un sédiment entier vis-à-vis de jeunes amphipodes Hyalella azteca, fondée sur la survie et l'inhibition de la croissance après 14 jours et/ou 28 jours. La méthode s'applique a) aux échantillons de sédiments d'eau douce contaminés, b) aux boues chimiques, industrielles, urbaines, ou autres déchets solides pouvant se combiner à des sédiments d'eau douce, ou c) à des produits chimiques ou des préparations ajouté(e)s à un sédiment propre. L'ISO 16303:2013 est applicable aux échantillons de sédiments d'eau douce. L'amphipode Hyalella azteca peut être utilisé pour soumettre à essai les eaux saumâtres d'une salinité maximale de 15 ?, avec une acclimatation adéquate. Elle n'est pas applicable aux essais sur des échantillons de sédiments marins et estuariens présentant une salinité supérieure à 15 ?. La présente méthode consiste en un essai de survie et de croissance d'une durée de 14 jours et/ou 28 jours, applicable aux types d'échantillons de sédiments décrits ci-dessus.
Kakovost vode - Določevanje strupenosti sedimenta celinskih vod s Hyalella azteca (Crustacea)
General Information
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-marec-2014
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHVWUXSHQRVWLVHGLPHQWDFHOLQVNLKYRGV+\DOHOOD
D]WHFD &UXVWDFHD
Water quality - Determination of toxicity of fresh water sediments using Hyalella azteca
Qualité de l'eau - Détermination de la toxicité des sédiments d'eau douce vis-à-vis de
Hyalella azteca
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 16303:2013
ICS:
13.060.70 Preiskava bioloških lastnosti Examination of biological
vode properties of water
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16303
First edition
2013-12-01
Water quality — Determination of
toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des sédiments d’eau
douce vis-à-vis de Hyalella azteca
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test environment . 3
5.1 Facilities . 3
5.2 Lighting . 3
6 Reagents, test organisms, and materials . 3
6.1 Test organism . 3
6.2 Control sediment . 3
6.3 Overlying water . 4
6.4 Food . 5
6.5 Reference substance . 6
7 Apparatus . 6
8 Treatment and preparation of samples . 7
8.1 General . 7
8.2 Test sediment . 7
8.3 Preparation of sediment samples . 8
9 Test procedure . 8
9.1 Preparing the test containers . 8
9.2 Introducing the organisms . 9
9.3 Test conditions . 9
9.4 Renewal of overlying water.10
9.5 Test observations and measurements .10
10 Expression of results .10
10.1 Survival .10
10.2 Growth .11
10.3 Validity of the test .11
11 Analysis and interpretation of results .11
11.1 Data analysis .11
11.2 Non-contaminant factors .11
12 Reference substance .12
12.1 Water-only test .12
12.2 Whole sediment test.12
13 Test report .13
Annex A (informative) Description of Hyalella azteca.14
Annex B (informative) Culturing Hyalella azteca .18
Annex C (informative) Sources of Hyalella azteca .20
Annex D (normative) Procedure for preparing YCT .22
Annex E (informative) 42-day sediment reproduction test .23
Annex F (informative) 14-day water-only survival-and-growth test.24
Annex G (informative) Performance data .25
Bibliography .26
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
Introduction
Sediment in the aquatic environment serves as a reservoir for agricultural, industrial, and municipal
contaminants. Contaminated sediment adversely affects the benthic community directly and acts as
a source of contamination for the overlying water, often negatively impacting pelagic communities as
well. Sediment toxicity tests are used globally to determine and monitor the toxic effects of discrete
substances or complex mixtures that might be harmful to indigenous life in the aquatic and benthic
environments. This International Standard outlines procedures for conducting 14 d and/or 28 d tests
for sediment toxicity, using the fresh water amphipod Hyalella azteca. The biological end points for the
tests include mortality and growth.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16303:2013(E)
Water quality — Determination of toxicity of fresh water
sediments using Hyalella azteca
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of toxicity to young Hyalella azteca
in whole sediment based on survival and growth inhibition after 14 d and/or 28 d.
The method is applicable to
a) samples of contaminated whole fresh water sediment,
b) chemical, industrial, or municipal sludge, or other solid wastes that may combine with fresh water
sediments, and
c) chemicals or preparations spiked into clean sediment.
This International Standard is applicable to the testing of sediment samples from the fresh water
environment. Hyalella azteca can be used in the testing of brackish waters up to a maximum of 15 ‰,
with careful acclimation. This International Standard is not applicable to the testing of sediment samples
from the marine and estuarine environment with a salinity of > 15 ‰.
This method is a 14 d and/or 28 d survival-and-growth test applicable to the sediment sample types
described above.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 6059, Water quality — Determination of the sum of calcium and magnesium — EDTA titrimetric method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
mixture of materials that mimic the physical components of natural sediment
Note 1 to entry: See 6.2.1.
3.2
control sediment
sediment (natural or artificial) that is used to assess the performance of the test organisms and test
acceptability (i.e. clean)
Note 1 to entry: The results of control sediment testing are used for comparison to response of organisms in the
contaminated test sediment(s) and for evaluating test validity.
Note 2 to entry: Used routinely to assess the acceptability of a test (6.2).
3.3
test sediment
discrete portion of sediment (field collected or spiked) to be tested for possible effects on amphipods
due to contamination
3.4
spiked sediment
sediment to which a material has been added for testing
3.5
reference sediment
field collected near an area of concern with properties representing sediment conditions that closely
match those of the sample(s) of the test sediment except for the degree of contamination
Note 1 to entry: It is often selected from a site uninfluenced by the source(s) of contamination but within the
general vicinity of the sites where samples of test sediment are collected. Test results provide a site-specific basis
for evaluating toxicity.
3.6
intermittent renewal
tests in which test solutions or overlying water are renewed during the test, based on deterioration of
water quality
3.7
overlying water
water placed over the layer of sediment in the test container
Note 1 to entry: Also used to manipulate the sediment, if necessary (e.g. for preparing formulated sediment or
mixtures of spiked sediment).
3.8
growth
increase in dry weight of test organisms during the experiment and expressed as mean dry weight per
surviving amphipod
4 Principle
Young fresh water amphipods, Hyalella azteca, aged 2 d to 9 d and ranging in age by 1 d to 2 d, are exposed
in groups of 10 organisms to a contaminated sediment or a test-chemical spiked sediment for 14 d and/or
[1] [2] [3]
28 d. The end points for the test are percent mortality and growth inhibition assessed relative
to organisms exposed concurrently to control sediment. The test is performed in glass containers with
the ratio of sediment to water (volume:volume) being either 1:1,75 or 1:4 (e.g. 100 ml of sediment with
175 ml of overlying water or 100 ml of sediment with 400 ml of overlying water). Comparative testing
of the two recommended sediment-to-water ratios showed no significant difference in test results using
[4]
Hyalella azteca. One advantage of the 1:4 sediment-to-water ratio is greater overlying water volume
for chemical analysis. The exposure is primarily static unless renewal is triggered by deterioration of
water in the control treatment (e.g. shifting pH affecting the form of background ammonia).
2 © ISO 2013 – All rights reserved
A long-term test option (i.e. 42 d) for whole sediment toxicity testing using Hyalella azteca is described
in Annex E. End points of this long-term test include survival (Days 28, 35, and 42), growth (Days 28 and
42), and reproduction (number of young per female produced from Days 28 to 42).
A water-only method using Hyalella azteca is also described in Annex F. This method is a 14-day test of
survival and growth using young amphipods exposed to samples of industrial or sewage effluents, fresh
waters (e.g. receiving water), aqueous extracts, or chemical substances which are soluble or which can
be maintained as stable suspensions or dispersions under the conditions of the test.
5 Test environment
5.1 Facilities
The test facility shall be well ventilated, isolated from physical disturbances, and free from dust
and fumes. Tests shall be carried out in a temperature-controlled room or chamber that maintains a
temperature of (23 ± 2) °C in the test containers.
5.2 Lighting
All test containers shall receive direct, overhead illumination that provides normal laboratory lighting
(i.e. 100 lx to 1 000 lx) at the air/water interface. Illumination should be uniform and shall have a
day/night cycle (photoperiod) of 16 h of daylight and 8 h of darkness.
6 Reagents, test organisms, and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organism
Hyalella azteca is an epibenthic sediment-burrowing detritivore that lives in close contact with the
surficial 1 cm or 2 cm of fresh water sediments. They reside in temperate lakes, ponds, and slow-
[1] [2] [3]
flowing streams and are widely distributed on the North and South American continents. Young
Hyalella azteca are obtained from laboratory cultures maintained under the conditions of temperature,
photoperiod, and food identical to those in the test. The species identification should be confirmed
by qualified personnel experienced in identifying fresh water amphipods using the distinguishing
[2] [5]
taxonomic features described in Annex A and in previous publications.
6.1.1 Life stage and size
Amphipods used for the test shall be between the ages of 2 d and 9 d and shall not vary in age by more
than 2 d. A method for culturing Hyalella azteca and for obtaining known-age test organisms is provided
in Annex B. If growth is expressed as mean size at the end of the test, a mean length of organisms should
be determined at test initiation.
6.1.2 Source
All amphipods used in a test shall be derived from the same population and source. Sources of animals
to be used to establish cultures include government or private laboratories which are culturing Hyalella
[1] [2] [3]
azteca for sediment toxicity tests or a reputable biological supply company. A list of possible
sources of Hyalella azteca is provided in Annex C.
6.2 Control sediment
Each sediment toxicity test shall include a control with a minimum of five replicate test containers
containing control sediment. Responses of organisms exposed to control sediment during a test provide
measurements for determining test validity (see 10.3), evidence of the health and normal behaviour of
the test organisms, and a basis for interpreting data derived from the test sediments. Control sediment
is either natural sediment or artificial (i.e. formulated) sediment.
6.2.1 Natural sediment
Natural sediment taken from a fresh water or slightly brackish (< 15 ‰) collection site removed from
known sources of contaminants, and for which there is known control performance with Hyalella
azteca, can be used as the control sediment for a test or as a clean material for spiking a test chemical.
If sediment pore water has any measureable salinity, the testing laboratory shall follow a suitable
acclimation procedure to ready adult Hyalella azteca for use as brood organisms and to ensure salinity-
adapted young amphipods are used during testing.
6.2.2 Artificial sediment
The following artificial sediment can be used as a control for fresh water sediment tests or as a clean material
for spiking a test chemical. This recipe is based on the artificial sediment recommended in ISO 10872.
Mix the following components thoroughly in the given proportions.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
Dolomite (clay): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
Silica sand (mean particle size 0,063 mm): 30 %
Silica sand (0,1 mm to 0,4 mm): 40 %
Peat (decomposed peat from a raised bog, untreated; finely ground and < 1 mm sieved): 4 %
There are a number of acceptable approaches to preparing and conditioning artificial sediment. In general,
the following attributes should be considered when selecting a formulation for a control or test sediment.
a) should support the survival, growth, or reproduction of a variety of benthic organisms;
b) should provide consistent acceptable biological end points for a variety of species;
c) should comprise standard constituents that are readily available to test laboratories;
d) should be free from concentrations of contaminants that might cause adverse effects to test organisms.
Acceptable artificial sediment options are outlined in Environment Canada guidance on this subject,
[6]
including techniques for spiking test chemicals into sediment.
6.3 Overlying water
6.3.1 Natural fresh water
Natural fresh water includes an uncontaminated supply of groundwater or surface water. If the objective
of testing is to simulate field site conditions, natural water can be diluted with a high purity distilled
or deionized water until a desired hardness is achieved. Water taken from the site where sediment is
collected can also be used. Surface water should be filtered through a fine-mesh net (e.g. 30 µm) to
remove potential predators or competitors. Dechlorinated water is not recommended as overlying
water because its quality is often quite variable and it could contain unacceptably high concentrations
of chlorine, chloramines, fluoride, copper, lead, zinc, or other contaminants.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
6.3.2 Reconstituted water
If reconstituted fresh water is used as overlying water in Hyalella azteca tests, the following artificial
[7]
medium shall be prepared in deionized water:
CaCl 110,98 mg/l
NaHCO 84,01 mg/l
MgSO 30,09 mg/l
KCl 3,728 mg/l
NaBr 1,029 mg/l
The mixture is aerated for 24 h before use to adjust the dissolved oxygen (DO) and to stabilize pH. The
concentrations of salts can be adjusted to be of similar composition to a receiving water of interest.
However, the Ca:Br ratio shall be kept constant because these ions are essential for Hyalella azteca and
[8] + −
must be present together. Na and HCO are the most essential ions for Hyalella azteca survival, and
2+ + [7] [9]
Mg and K are needed for optimal growth and reproduction. Due to lack of confirmed influence,
ranges for alkalinity and hardness have not been defined. Standard use of the above reconstituted
water recipe in culturing and as testing water has confirmed acceptable alkalinity and hardness
levels for Hyalella azteca. Conductivity, pH, hardness, DO, and alkalinity are measured in each batch of
reconstituted water. A given batch of reconstituted water shall not be used for longer than 4 weeks.
6.3.3 Dissolved oxygen
The DO content of the water overlying the sediment is ideally to be 90 % to 100 % of the air-saturation
value at test initiation and throughout the test period. This level of DO is maintained by gentle aeration
using filtered, oil-free compressed air. The rate of aeration should not suspend the sediment (e.g. 2
bubbles/s to 3 bubbles/s).
6.4 Food
There are two food options for use in the Hyalella azteca test. Both commercial fish food and an inoculum
1)
of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow (YCT) have been proven suitable for Hyalella azteca
[1] [2] [3] [10] [11] [12]
under the defined test conditions.
There are also two options for the frequency of feeding. Test organisms are fed either once daily or three
times weekly (on non-consecutive days) throughout the test. An identical food ration is added to each
[11]
test chamber on each feeding occasion. The ration provided shall be adequate to enable acceptable
survival and growth of Hyalella azteca during the test period, but must not be excessive.
6.4.1 Option 1: Fish food
2)
Commercial fish food flakes (e.g. Tetrafin™, Tetramin™, or Nutrafin™) can be used as a food source for
test organisms during the test. Food can be ground and sieved so that flakes are uniform in size or can
be prepared as a slurry by mixing the fish flakes with clean water. Fish food flakes should be stored at
room temperature in a sealed container.
If daily feeding is chosen, 2,7 mg of fish flakes (dry weight) is added to each test container on the first day
of the test (the day the amphipods are placed in the test containers), as well as once per day thereafter
until the day the test ends. If the option of feeding three times per week is chosen, 6,3 mg of fish flakes
1) Cerophyll™ can be obtained from Ward’s Scientific as “Cereal Grass Media - Cerophyll”. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tetrafin™, Tetramin™, and Nutrafin™ are examples of fish food flakes available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of these products.
(dry weight) is added three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber
on non-consecutive days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both
rations provide approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred
[6]
because food is then always available.
3)
6.4.2 Option 2: Yeast/Cerophyll™ /trout chow (YCT)
A second food combination based on the U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA) and
[1] [2]
Environment Canada test methods is also recommended.
The formula for preparing YCT is given in Annex D. If daily feeding is chosen, an inoculum of 1,5 ml
3)
(equivalent to 2,7 mg food, dry weight) of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow is added
daily to each test chamber on the first day of the test (i.e. the day the amphipods are placed in the test
containers), as well as once per day thereafter until the day the test ends. If the option of feeding three
times per week is chosen, an inoculum of 3,5 ml YCT (equivalent to ~ 6,3 mg food, dry weight) is added
three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber on non-consecutive
days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both rations provide
approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred because food is
then always available.
YCT can be stored frozen. Thawed aliquots of unused YCT can be stored in darkness at (4 ± 3) °C but shall
be discarded after 14 d.
6.5 Reference substance
Cadmium chloride (CdCl ), copper sulphate (CuSO ), sodium chloride (NaCl), and potassium chloride
2 4
[1] [2] [3] [10]
(KCl) are all acceptable reference substances. Material Safety Data Sheets (MSDS) for these
substances should be consulted prior to use by laboratory personnel, as necessary.
7 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus is used for organism culturing and testing.
7.1 Temperature-controlled room, chamber, or water bath.
The system chosen shall maintain a temperature of (23 ± 2) °C in the test containers.
7.2 Measuring apparatus.
Use the apparatus and/or instruments for measuring DO, pH, hardness, conductivity, alkalinity,
ammonia, light intensity, and temperature as specified in ISO 10523, ISO 5814, and ISO 6059.
7.3 Test containers.
All containers and accessories such as sieves that might contact the organisms, control or test sediment,
and overlying water during sorting, handling, and testing shall be made of non-toxic materials (e.g.
4)
glass, stainless steel, Nalgene™ nylon, porcelain, polyethylene, polypropylene, fibre-glass) cleaned and
rinsed with distilled water, deionized water, dechlorinated laboratory water, reconstituted water, or
natural water from an uncontaminated source. Materials such as copper, zinc, brass, galvanized metal,
lead, and natural rubber shall not come in contact with this apparatus and equipment or with samples
of control, reference or test sediment, overlying water, or test containers. Before initiating a test, ensure
all test containers and associated labware are clean and free of all contaminants from previous use.
3) Cerophyll™ can be obtained from Ward’s Scientific as “Cereal Grass Media - Cerophyll”. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
4) Nalgene™ is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
6 © ISO 2013 – All rights reserved
Glass containers (beakers or wide-mouthed jars) with internal diameter of approximately 7 cm to 10 cm
and a volume of 300 ml to 1 000 ml are recommended for use as test vessels. Test container shall allow
a sediment depth of 1,5 cm to 2,5 cm, and a ratio of sediment to water (volume:volume) of 1:1,75 or 1:4.
Each test container may be covered with a glass or a plastic lid to reduce the possibility of contamination
of the contents, to reduce evaporation, and to minimize loss of volatiles from the sediment.
Prior to use, rinse the containers with the overlying water (6.3) or with deionized or distilled water.
7.4 Device, for delivering aeration of overlying water in each test container during testing, if necessary.
7.5 Pipette, for transferring Hyalella azteca, with a 5 mm to 6 mm diameter opening for capturing the
animals while allowing transfer of only a small volume of water.
7.6 Binocular magnifying glass/dissecting microscope, with a magnification of at least 7,5 X.
7.7 Sieve(s), e.g. 300 µm or 425 µm, to remove Hyalella azteca from sediment at the end of the test.
7.8 Drying oven, capable of drying test organisms at 60 °C to 90 °C for 24 h prior to weighing.
7.9 Desiccator, for holding dried test organisms at test end during weighing.
7.10 Balance, capable of measuring Hyalella azteca to the nearest 10 µg.
8 Treatment and preparation of samples
8.1 General
Field-collect sediment from reference, control, and test sites following established practices (see
ISO 5667-16 and References [1], [5], [10], [13], [14], [15], and [16]) or, if required, add a test chemical
[2] [5] [13] [15]
or preparation to a sample of control sediment. For site-specific investigations, similar
sediment collection and handling procedures are to be used for both test and reference sediments.
Sample containers are made of inert, non-toxic material and are new or thoroughly cleaned. Sample
containers are filled completely to exclude air and immediately sealed and labelled or coded. Store
collected sediment in a sealed container in darkness at (4 ± 2) °C until required for the toxicity test.
Drying, freezing, and cold storage all affect toxicity and bioavailability of chemicals in sediment. Initiate
sediment tests as soon as possible to maintain chemical integrity but preferably within 5 d and not
after 30 d unless chemical stability can be ensured. Analysis of known chemical contaminants may
be conducted on sediment samples from the field and results compared to analysis of sediment at the
beginning and end of the test to quantify any changes in chemical concentration or form.
8.2 Test sediment
Collect test sediment from the site to be evaluated using apparatus such as coring (e.g. box, Phleger)
or grab (e.g. Ekman, Ponar, Van Veen, Petersen, Shipek, Kajak-Brinkhurst) devices. Sediment is taken
from the middle of the sampler that has not been in contact with the apparatus. Typically, the top 2 cm
to 4 cm of sediment representing the oxic zone is collected and composited from sufficient samples
of the site to meet the needs of the test. Several litres (i.e. 5 l to 7 l) of sediment is normally required
to carry out a Hyalella azteca toxicity test; however, the amount of sediment required will depend on
the study objectives, study design, and the nature of the chemical analyses to be performed. To obtain
enough sediment, it is often necessary to combine subsamples retrieved using the sampling device. For
chemical analyses, transfer the sediment with a non-reactive, pre-cleaned scoop to an inert vessel and
mix the composited sample until colour and texture are uniform. Store the composited sample in a clean
brown glass container (if organics are suspected contaminants) or in a clean high-density polyethylene
or polycarbonate container (if metals are suspected contaminants). Fill containers to capacity and
transport to the laboratory at (4 ± 2) °C.
Apparatus should be cleaned between sites to prevent cross-contamination. Retain any solvent cleaning
wastes and return to the laboratory for disposal.
8.3 Preparation of sediment samples
Remove large debris (> 1 cm) and indigenous organisms by hand sorting using tweezers or similar
instruments. Wet sieving the sediment is not recommended because water-soluble contaminants and
fine non-settling clay particles could be lost. Each sediment sample is homogenized in the laboratory
[1] [2] [14] [15]
before use, unless study objectives dictate otherwise. Immediately following sample mixing,
subsamples of test material for chemical and physical analyses are removed and placed in labelled
containers and stored appropriately for physicochemical analyses.
Chemical and physical characterization of the sediment sample is needed for the interpretation of results.
Analyse a subsample of the test and reference sediment for the following: particle size distribution
[percentage gravel (> 2 mm), coarse and fine sand (≤ 2 mm to > 0,063 mm), and silt (≤ 0,063 mm
to > 0,004 mm) and clay (< 0,004 mm)], percent water content, total organic carbon (TOC), pore water
[1] [2] [3] [10]
pH, and pore water ammonia (total and unionized concentrations). Further characterization
could include total inorganic carbon, total volatile solids, biochemical oxygen demand, chemical oxygen
demand, cation exchange capacity, acid volatile sulphides, metals, synthetic organic compounds, oil and
[2]
grease, and petroleum hydrocarbons. Pore water can also be sampled and analysed for dissolved
contaminants. Samples of pore water can be obtained from control or reference sediment by in situ
[13] [14] [15]
methods (e.g. peepers) or ex situ methods (e.g. centrifugation or squeezing).
If the objective of the study is to spike a sediment with a chemical or preparation, procedures that
explain the steps involved in sediment spiking, homogenization, chemical equilibration, the use of a
chemical solvent, verification, and data analysis are available (see References [1], [2], [5], [13], and
[15]). However, for this International Standard, a sediment wet-spiking procedure is recommended over
dry-spiking approaches which can lead to losses of the test chemical. The sediment is spiked with the
test chemical or substance, either directly to the sediment or as a sediment:water slurry, prior to the
addition of the overlying water. A period of equilibration is required to allow time for test chemical
concentration to stabilize in the sediment pore water spaces. The duration of this equilibration period
is highly dependent on the nature of the test chemical and sediment type (e.g. equilibration period in a
sandy sediment would be less than in a sediment with a significant clay content; inorganic salts would
equilibrate in less time than a polar organic compound).
Information that is available on the properties of the chemical or substance to be tested is collected. This
includes concentration of major ingredients and impurities, water solubility, dissociation constants,
toxicity to humans and aquatic organisms, and biodegradability. Further information such as structural
formulae, nature and percentage of significant impurities, presence and amounts of additives, and
n-octanol:water partition coefficient is also obtained, if available. Three methods are available for spiking
[16] [17]
control sediment with chemicals: 1) wet sediment rolling technique, 2) wet slurry technique, or
[18] [19] [20]
3) sediment suspension technique. The method chosen is contingent on the study objectives
[5]
and the nature of the chemical or material being tested.
If the use of an organic solvent other than water is necessary to dissolve a test chemical and keep it
in solution, test concentration are spiked directly into the control sediment and the solvent carrier
evaporated before the addition of overlying water. A solvent-only control sediment shall be prepared
and tested concurrently with the test sediment treatments. The solvent-only control treatment shall
[5]
contain the highest concentration of solvent used in preparing the test sediment treatments.
9 Test procedure
9.1 Preparing the test containers
Mix each sediment sample thoroughly on the day preceding the test and add an aliquot of sediment to
each test container (e.g. 100 ml). Distribute test sediment in a uniform layer, which allows amphipods to
burrow (minimum 1,5 cm in depth). Prepare a minimum of five laboratory replicates for each treatment
or test sample and growth measurement period (i.e. Day 14 and Day 28), plus, if necessary, one or more
8 © ISO 2013 – All rights reserved
replicates per treatment for monitoring chemical characteristics of the sediment and the overlying
water during the test. Replicates set up for monitoring of chemistry shall receive amphipods, as in other
test replicates.
Smooth the sediment surface flat in each container and ensure there is minimal disturbance of the test
or control sediment during the addition of overlying water. One technique for minimizing the disruption
of sediment is pouring the water over a disc [polyethylene, nylon, or polytetrafluoroethylene (PTFE)
sheeting of 4 mm to 6 mm thickness] lying on the sediment surface that fits the inside diameter of the
[1] [3]
test container. Overlying water is added to each test container such that the sediment:water ratio
is 1:1,75 or 1:4. The disc is removed and rinsed with overlying water between replicates of a treatment.
A separate clean disc is used for each treatment. The water overlying the sediment in each test chamber
should be renewed on the day preceding the test, as well as throughout the test (9.4).
The treatments should be positioned for easy observation of amphipods. Preferably, the test treatments
should be placed in randomized order or in a random block design with one replicate treatment in each block.
9.2 Introducing the organisms
Initiate the toxicity test by placing 10 Hyalella azteca in each test container (i.e. 10 amphipods per
replicate of each treatment).
Select individual amphipods randomly from a known-age culture container (see B.3) using a pipette or
other suitable device and distribute them directly to the test vessels. Amphipods are placed below the
air/water interface in the overlying water. Alternatively, 10 amphipods may be counted into a transfer
chamber (e.g. 30 ml plastic cup) filled with overlying water and then recounted before their transfer into
the test containers. Transfer amphipods to the test chamber by gently pouring the water and amphipods
from the sorting dish. Use a disc as described in 9.1 to prevent disturbance of the sediment. Wash any
amphipods remaining in the dish into the test container using more overlying water. Increase the volume
in the test container to the appropriate level (water plus sediment), if necessary, remove the disc, and
place covers on the test containers, if using. Because replicate containers are used, amphipods should be
added at the same time to each set or block of test containers representing each treatment, following a
randomized block design.
Replace any amphipods that have not buried into the sediment within 1 h, unless they are observed to
repeatedly burrow into the sediment and immediately emerge in an avoidance response to the test substrate.
Amphipods displaying this avoidance behaviour during the initial hour of the test should not be replaced.
9.3 Test conditions
Test duration is 14 d and/or 28 d. The test can be terminated at 14 d; however, it may be continued
to 28 d. If the latter is chosen, an extra five replicates are prepared for each treatment prior to test
initiat
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16303
First edition
2013-12-01
Water quality — Determination of
toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des sédiments d’eau
douce vis-à-vis de Hyalella azteca
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form
or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test environment . 3
5.1 Facilities . 3
5.2 Lighting . 3
6 Reagents, test organisms, and materials . 3
6.1 Test organism . 3
6.2 Control sediment . 3
6.3 Overlying water . 4
6.4 Food . 5
6.5 Reference substance . 6
7 Apparatus . 6
8 Treatment and preparation of samples . 7
8.1 General . 7
8.2 Test sediment . 7
8.3 Preparation of sediment samples . 8
9 Test procedure . 8
9.1 Preparing the test containers . 8
9.2 Introducing the organisms . 9
9.3 Test conditions . 9
9.4 Renewal of overlying water.10
9.5 Test observations and measurements .10
10 Expression of results .10
10.1 Survival .10
10.2 Growth .11
10.3 Validity of the test .11
11 Analysis and interpretation of results .11
11.1 Data analysis .11
11.2 Non-contaminant factors .11
12 Reference substance .12
12.1 Water-only test .12
12.2 Whole sediment test.12
13 Test report .13
Annex A (informative) Description of Hyalella azteca.14
Annex B (informative) Culturing Hyalella azteca .18
Annex C (informative) Sources of Hyalella azteca .20
Annex D (normative) Procedure for preparing YCT .22
Annex E (informative) 42-day sediment reproduction test .23
Annex F (informative) 14-day water-only survival-and-growth test.24
Annex G (informative) Performance data .25
Bibliography .26
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical Barriers
to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,
Biological methods.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
Introduction
Sediment in the aquatic environment serves as a reservoir for agricultural, industrial, and municipal
contaminants. Contaminated sediment adversely affects the benthic community directly and acts as
a source of contamination for the overlying water, often negatively impacting pelagic communities as
well. Sediment toxicity tests are used globally to determine and monitor the toxic effects of discrete
substances or complex mixtures that might be harmful to indigenous life in the aquatic and benthic
environments. This International Standard outlines procedures for conducting 14 d and/or 28 d tests
for sediment toxicity, using the fresh water amphipod Hyalella azteca. The biological end points for the
tests include mortality and growth.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 16303:2013(E)
Water quality — Determination of toxicity of fresh water
sediments using Hyalella azteca
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if
any, associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and
health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of toxicity to young Hyalella azteca
in whole sediment based on survival and growth inhibition after 14 d and/or 28 d.
The method is applicable to
a) samples of contaminated whole fresh water sediment,
b) chemical, industrial, or municipal sludge, or other solid wastes that may combine with fresh water
sediments, and
c) chemicals or preparations spiked into clean sediment.
This International Standard is applicable to the testing of sediment samples from the fresh water
environment. Hyalella azteca can be used in the testing of brackish waters up to a maximum of 15 ‰,
with careful acclimation. This International Standard is not applicable to the testing of sediment samples
from the marine and estuarine environment with a salinity of > 15 ‰.
This method is a 14 d and/or 28 d survival-and-growth test applicable to the sediment sample types
described above.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 6059, Water quality — Determination of the sum of calcium and magnesium — EDTA titrimetric method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
artificial sediment
mixture of materials that mimic the physical components of natural sediment
Note 1 to entry: See 6.2.1.
3.2
control sediment
sediment (natural or artificial) that is used to assess the performance of the test organisms and test
acceptability (i.e. clean)
Note 1 to entry: The results of control sediment testing are used for comparison to response of organisms in the
contaminated test sediment(s) and for evaluating test validity.
Note 2 to entry: Used routinely to assess the acceptability of a test (6.2).
3.3
test sediment
discrete portion of sediment (field collected or spiked) to be tested for possible effects on amphipods
due to contamination
3.4
spiked sediment
sediment to which a material has been added for testing
3.5
reference sediment
field collected near an area of concern with properties representing sediment conditions that closely
match those of the sample(s) of the test sediment except for the degree of contamination
Note 1 to entry: It is often selected from a site uninfluenced by the source(s) of contamination but within the
general vicinity of the sites where samples of test sediment are collected. Test results provide a site-specific basis
for evaluating toxicity.
3.6
intermittent renewal
tests in which test solutions or overlying water are renewed during the test, based on deterioration of
water quality
3.7
overlying water
water placed over the layer of sediment in the test container
Note 1 to entry: Also used to manipulate the sediment, if necessary (e.g. for preparing formulated sediment or
mixtures of spiked sediment).
3.8
growth
increase in dry weight of test organisms during the experiment and expressed as mean dry weight per
surviving amphipod
4 Principle
Young fresh water amphipods, Hyalella azteca, aged 2 d to 9 d and ranging in age by 1 d to 2 d, are exposed
in groups of 10 organisms to a contaminated sediment or a test-chemical spiked sediment for 14 d and/or
[1] [2] [3]
28 d. The end points for the test are percent mortality and growth inhibition assessed relative
to organisms exposed concurrently to control sediment. The test is performed in glass containers with
the ratio of sediment to water (volume:volume) being either 1:1,75 or 1:4 (e.g. 100 ml of sediment with
175 ml of overlying water or 100 ml of sediment with 400 ml of overlying water). Comparative testing
of the two recommended sediment-to-water ratios showed no significant difference in test results using
[4]
Hyalella azteca. One advantage of the 1:4 sediment-to-water ratio is greater overlying water volume
for chemical analysis. The exposure is primarily static unless renewal is triggered by deterioration of
water in the control treatment (e.g. shifting pH affecting the form of background ammonia).
2 © ISO 2013 – All rights reserved
A long-term test option (i.e. 42 d) for whole sediment toxicity testing using Hyalella azteca is described
in Annex E. End points of this long-term test include survival (Days 28, 35, and 42), growth (Days 28 and
42), and reproduction (number of young per female produced from Days 28 to 42).
A water-only method using Hyalella azteca is also described in Annex F. This method is a 14-day test of
survival and growth using young amphipods exposed to samples of industrial or sewage effluents, fresh
waters (e.g. receiving water), aqueous extracts, or chemical substances which are soluble or which can
be maintained as stable suspensions or dispersions under the conditions of the test.
5 Test environment
5.1 Facilities
The test facility shall be well ventilated, isolated from physical disturbances, and free from dust
and fumes. Tests shall be carried out in a temperature-controlled room or chamber that maintains a
temperature of (23 ± 2) °C in the test containers.
5.2 Lighting
All test containers shall receive direct, overhead illumination that provides normal laboratory lighting
(i.e. 100 lx to 1 000 lx) at the air/water interface. Illumination should be uniform and shall have a
day/night cycle (photoperiod) of 16 h of daylight and 8 h of darkness.
6 Reagents, test organisms, and materials
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organism
Hyalella azteca is an epibenthic sediment-burrowing detritivore that lives in close contact with the
surficial 1 cm or 2 cm of fresh water sediments. They reside in temperate lakes, ponds, and slow-
[1] [2] [3]
flowing streams and are widely distributed on the North and South American continents. Young
Hyalella azteca are obtained from laboratory cultures maintained under the conditions of temperature,
photoperiod, and food identical to those in the test. The species identification should be confirmed
by qualified personnel experienced in identifying fresh water amphipods using the distinguishing
[2] [5]
taxonomic features described in Annex A and in previous publications.
6.1.1 Life stage and size
Amphipods used for the test shall be between the ages of 2 d and 9 d and shall not vary in age by more
than 2 d. A method for culturing Hyalella azteca and for obtaining known-age test organisms is provided
in Annex B. If growth is expressed as mean size at the end of the test, a mean length of organisms should
be determined at test initiation.
6.1.2 Source
All amphipods used in a test shall be derived from the same population and source. Sources of animals
to be used to establish cultures include government or private laboratories which are culturing Hyalella
[1] [2] [3]
azteca for sediment toxicity tests or a reputable biological supply company. A list of possible
sources of Hyalella azteca is provided in Annex C.
6.2 Control sediment
Each sediment toxicity test shall include a control with a minimum of five replicate test containers
containing control sediment. Responses of organisms exposed to control sediment during a test provide
measurements for determining test validity (see 10.3), evidence of the health and normal behaviour of
the test organisms, and a basis for interpreting data derived from the test sediments. Control sediment
is either natural sediment or artificial (i.e. formulated) sediment.
6.2.1 Natural sediment
Natural sediment taken from a fresh water or slightly brackish (< 15 ‰) collection site removed from
known sources of contaminants, and for which there is known control performance with Hyalella
azteca, can be used as the control sediment for a test or as a clean material for spiking a test chemical.
If sediment pore water has any measureable salinity, the testing laboratory shall follow a suitable
acclimation procedure to ready adult Hyalella azteca for use as brood organisms and to ensure salinity-
adapted young amphipods are used during testing.
6.2.2 Artificial sediment
The following artificial sediment can be used as a control for fresh water sediment tests or as a clean material
for spiking a test chemical. This recipe is based on the artificial sediment recommended in ISO 10872.
Mix the following components thoroughly in the given proportions.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
Dolomite (clay): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
Silica sand (mean particle size 0,063 mm): 30 %
Silica sand (0,1 mm to 0,4 mm): 40 %
Peat (decomposed peat from a raised bog, untreated; finely ground and < 1 mm sieved): 4 %
There are a number of acceptable approaches to preparing and conditioning artificial sediment. In general,
the following attributes should be considered when selecting a formulation for a control or test sediment.
a) should support the survival, growth, or reproduction of a variety of benthic organisms;
b) should provide consistent acceptable biological end points for a variety of species;
c) should comprise standard constituents that are readily available to test laboratories;
d) should be free from concentrations of contaminants that might cause adverse effects to test organisms.
Acceptable artificial sediment options are outlined in Environment Canada guidance on this subject,
[6]
including techniques for spiking test chemicals into sediment.
6.3 Overlying water
6.3.1 Natural fresh water
Natural fresh water includes an uncontaminated supply of groundwater or surface water. If the objective
of testing is to simulate field site conditions, natural water can be diluted with a high purity distilled
or deionized water until a desired hardness is achieved. Water taken from the site where sediment is
collected can also be used. Surface water should be filtered through a fine-mesh net (e.g. 30 µm) to
remove potential predators or competitors. Dechlorinated water is not recommended as overlying
water because its quality is often quite variable and it could contain unacceptably high concentrations
of chlorine, chloramines, fluoride, copper, lead, zinc, or other contaminants.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
6.3.2 Reconstituted water
If reconstituted fresh water is used as overlying water in Hyalella azteca tests, the following artificial
[7]
medium shall be prepared in deionized water:
CaCl 110,98 mg/l
NaHCO 84,01 mg/l
MgSO 30,09 mg/l
KCl 3,728 mg/l
NaBr 1,029 mg/l
The mixture is aerated for 24 h before use to adjust the dissolved oxygen (DO) and to stabilize pH. The
concentrations of salts can be adjusted to be of similar composition to a receiving water of interest.
However, the Ca:Br ratio shall be kept constant because these ions are essential for Hyalella azteca and
[8] + −
must be present together. Na and HCO are the most essential ions for Hyalella azteca survival, and
2+ + [7] [9]
Mg and K are needed for optimal growth and reproduction. Due to lack of confirmed influence,
ranges for alkalinity and hardness have not been defined. Standard use of the above reconstituted
water recipe in culturing and as testing water has confirmed acceptable alkalinity and hardness
levels for Hyalella azteca. Conductivity, pH, hardness, DO, and alkalinity are measured in each batch of
reconstituted water. A given batch of reconstituted water shall not be used for longer than 4 weeks.
6.3.3 Dissolved oxygen
The DO content of the water overlying the sediment is ideally to be 90 % to 100 % of the air-saturation
value at test initiation and throughout the test period. This level of DO is maintained by gentle aeration
using filtered, oil-free compressed air. The rate of aeration should not suspend the sediment (e.g. 2
bubbles/s to 3 bubbles/s).
6.4 Food
There are two food options for use in the Hyalella azteca test. Both commercial fish food and an inoculum
1)
of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow (YCT) have been proven suitable for Hyalella azteca
[1] [2] [3] [10] [11] [12]
under the defined test conditions.
There are also two options for the frequency of feeding. Test organisms are fed either once daily or three
times weekly (on non-consecutive days) throughout the test. An identical food ration is added to each
[11]
test chamber on each feeding occasion. The ration provided shall be adequate to enable acceptable
survival and growth of Hyalella azteca during the test period, but must not be excessive.
6.4.1 Option 1: Fish food
2)
Commercial fish food flakes (e.g. Tetrafin™, Tetramin™, or Nutrafin™) can be used as a food source for
test organisms during the test. Food can be ground and sieved so that flakes are uniform in size or can
be prepared as a slurry by mixing the fish flakes with clean water. Fish food flakes should be stored at
room temperature in a sealed container.
If daily feeding is chosen, 2,7 mg of fish flakes (dry weight) is added to each test container on the first day
of the test (the day the amphipods are placed in the test containers), as well as once per day thereafter
until the day the test ends. If the option of feeding three times per week is chosen, 6,3 mg of fish flakes
1) Cerophyll™ can be obtained from Ward’s Scientific as “Cereal Grass Media - Cerophyll”. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tetrafin™, Tetramin™, and Nutrafin™ are examples of fish food flakes available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
of these products.
(dry weight) is added three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber
on non-consecutive days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both
rations provide approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred
[6]
because food is then always available.
3)
6.4.2 Option 2: Yeast/Cerophyll™ /trout chow (YCT)
A second food combination based on the U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA) and
[1] [2]
Environment Canada test methods is also recommended.
The formula for preparing YCT is given in Annex D. If daily feeding is chosen, an inoculum of 1,5 ml
3)
(equivalent to 2,7 mg food, dry weight) of a mixture of yeast, Cerophyll™ , and trout chow is added
daily to each test chamber on the first day of the test (i.e. the day the amphipods are placed in the test
containers), as well as once per day thereafter until the day the test ends. If the option of feeding three
times per week is chosen, an inoculum of 3,5 ml YCT (equivalent to ~ 6,3 mg food, dry weight) is added
three times per week (starting on the first day of the test) to each test chamber on non-consecutive
days (e.g. on Mondays, Wednesdays, and Fridays), until the day the test ends. Both rations provide
approximately the same overall feeding rate; however, daily feeding might be preferred because food is
then always available.
YCT can be stored frozen. Thawed aliquots of unused YCT can be stored in darkness at (4 ± 3) °C but shall
be discarded after 14 d.
6.5 Reference substance
Cadmium chloride (CdCl ), copper sulphate (CuSO ), sodium chloride (NaCl), and potassium chloride
2 4
[1] [2] [3] [10]
(KCl) are all acceptable reference substances. Material Safety Data Sheets (MSDS) for these
substances should be consulted prior to use by laboratory personnel, as necessary.
7 Apparatus
Ordinary laboratory apparatus is used for organism culturing and testing.
7.1 Temperature-controlled room, chamber, or water bath.
The system chosen shall maintain a temperature of (23 ± 2) °C in the test containers.
7.2 Measuring apparatus.
Use the apparatus and/or instruments for measuring DO, pH, hardness, conductivity, alkalinity,
ammonia, light intensity, and temperature as specified in ISO 10523, ISO 5814, and ISO 6059.
7.3 Test containers.
All containers and accessories such as sieves that might contact the organisms, control or test sediment,
and overlying water during sorting, handling, and testing shall be made of non-toxic materials (e.g.
4)
glass, stainless steel, Nalgene™ nylon, porcelain, polyethylene, polypropylene, fibre-glass) cleaned and
rinsed with distilled water, deionized water, dechlorinated laboratory water, reconstituted water, or
natural water from an uncontaminated source. Materials such as copper, zinc, brass, galvanized metal,
lead, and natural rubber shall not come in contact with this apparatus and equipment or with samples
of control, reference or test sediment, overlying water, or test containers. Before initiating a test, ensure
all test containers and associated labware are clean and free of all contaminants from previous use.
3) Cerophyll™ can be obtained from Ward’s Scientific as “Cereal Grass Media - Cerophyll”. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
4) Nalgene™ is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
6 © ISO 2013 – All rights reserved
Glass containers (beakers or wide-mouthed jars) with internal diameter of approximately 7 cm to 10 cm
and a volume of 300 ml to 1 000 ml are recommended for use as test vessels. Test container shall allow
a sediment depth of 1,5 cm to 2,5 cm, and a ratio of sediment to water (volume:volume) of 1:1,75 or 1:4.
Each test container may be covered with a glass or a plastic lid to reduce the possibility of contamination
of the contents, to reduce evaporation, and to minimize loss of volatiles from the sediment.
Prior to use, rinse the containers with the overlying water (6.3) or with deionized or distilled water.
7.4 Device, for delivering aeration of overlying water in each test container during testing, if necessary.
7.5 Pipette, for transferring Hyalella azteca, with a 5 mm to 6 mm diameter opening for capturing the
animals while allowing transfer of only a small volume of water.
7.6 Binocular magnifying glass/dissecting microscope, with a magnification of at least 7,5 X.
7.7 Sieve(s), e.g. 300 µm or 425 µm, to remove Hyalella azteca from sediment at the end of the test.
7.8 Drying oven, capable of drying test organisms at 60 °C to 90 °C for 24 h prior to weighing.
7.9 Desiccator, for holding dried test organisms at test end during weighing.
7.10 Balance, capable of measuring Hyalella azteca to the nearest 10 µg.
8 Treatment and preparation of samples
8.1 General
Field-collect sediment from reference, control, and test sites following established practices (see
ISO 5667-16 and References [1], [5], [10], [13], [14], [15], and [16]) or, if required, add a test chemical
[2] [5] [13] [15]
or preparation to a sample of control sediment. For site-specific investigations, similar
sediment collection and handling procedures are to be used for both test and reference sediments.
Sample containers are made of inert, non-toxic material and are new or thoroughly cleaned. Sample
containers are filled completely to exclude air and immediately sealed and labelled or coded. Store
collected sediment in a sealed container in darkness at (4 ± 2) °C until required for the toxicity test.
Drying, freezing, and cold storage all affect toxicity and bioavailability of chemicals in sediment. Initiate
sediment tests as soon as possible to maintain chemical integrity but preferably within 5 d and not
after 30 d unless chemical stability can be ensured. Analysis of known chemical contaminants may
be conducted on sediment samples from the field and results compared to analysis of sediment at the
beginning and end of the test to quantify any changes in chemical concentration or form.
8.2 Test sediment
Collect test sediment from the site to be evaluated using apparatus such as coring (e.g. box, Phleger)
or grab (e.g. Ekman, Ponar, Van Veen, Petersen, Shipek, Kajak-Brinkhurst) devices. Sediment is taken
from the middle of the sampler that has not been in contact with the apparatus. Typically, the top 2 cm
to 4 cm of sediment representing the oxic zone is collected and composited from sufficient samples
of the site to meet the needs of the test. Several litres (i.e. 5 l to 7 l) of sediment is normally required
to carry out a Hyalella azteca toxicity test; however, the amount of sediment required will depend on
the study objectives, study design, and the nature of the chemical analyses to be performed. To obtain
enough sediment, it is often necessary to combine subsamples retrieved using the sampling device. For
chemical analyses, transfer the sediment with a non-reactive, pre-cleaned scoop to an inert vessel and
mix the composited sample until colour and texture are uniform. Store the composited sample in a clean
brown glass container (if organics are suspected contaminants) or in a clean high-density polyethylene
or polycarbonate container (if metals are suspected contaminants). Fill containers to capacity and
transport to the laboratory at (4 ± 2) °C.
Apparatus should be cleaned between sites to prevent cross-contamination. Retain any solvent cleaning
wastes and return to the laboratory for disposal.
8.3 Preparation of sediment samples
Remove large debris (> 1 cm) and indigenous organisms by hand sorting using tweezers or similar
instruments. Wet sieving the sediment is not recommended because water-soluble contaminants and
fine non-settling clay particles could be lost. Each sediment sample is homogenized in the laboratory
[1] [2] [14] [15]
before use, unless study objectives dictate otherwise. Immediately following sample mixing,
subsamples of test material for chemical and physical analyses are removed and placed in labelled
containers and stored appropriately for physicochemical analyses.
Chemical and physical characterization of the sediment sample is needed for the interpretation of results.
Analyse a subsample of the test and reference sediment for the following: particle size distribution
[percentage gravel (> 2 mm), coarse and fine sand (≤ 2 mm to > 0,063 mm), and silt (≤ 0,063 mm
to > 0,004 mm) and clay (< 0,004 mm)], percent water content, total organic carbon (TOC), pore water
[1] [2] [3] [10]
pH, and pore water ammonia (total and unionized concentrations). Further characterization
could include total inorganic carbon, total volatile solids, biochemical oxygen demand, chemical oxygen
demand, cation exchange capacity, acid volatile sulphides, metals, synthetic organic compounds, oil and
[2]
grease, and petroleum hydrocarbons. Pore water can also be sampled and analysed for dissolved
contaminants. Samples of pore water can be obtained from control or reference sediment by in situ
[13] [14] [15]
methods (e.g. peepers) or ex situ methods (e.g. centrifugation or squeezing).
If the objective of the study is to spike a sediment with a chemical or preparation, procedures that
explain the steps involved in sediment spiking, homogenization, chemical equilibration, the use of a
chemical solvent, verification, and data analysis are available (see References [1], [2], [5], [13], and
[15]). However, for this International Standard, a sediment wet-spiking procedure is recommended over
dry-spiking approaches which can lead to losses of the test chemical. The sediment is spiked with the
test chemical or substance, either directly to the sediment or as a sediment:water slurry, prior to the
addition of the overlying water. A period of equilibration is required to allow time for test chemical
concentration to stabilize in the sediment pore water spaces. The duration of this equilibration period
is highly dependent on the nature of the test chemical and sediment type (e.g. equilibration period in a
sandy sediment would be less than in a sediment with a significant clay content; inorganic salts would
equilibrate in less time than a polar organic compound).
Information that is available on the properties of the chemical or substance to be tested is collected. This
includes concentration of major ingredients and impurities, water solubility, dissociation constants,
toxicity to humans and aquatic organisms, and biodegradability. Further information such as structural
formulae, nature and percentage of significant impurities, presence and amounts of additives, and
n-octanol:water partition coefficient is also obtained, if available. Three methods are available for spiking
[16] [17]
control sediment with chemicals: 1) wet sediment rolling technique, 2) wet slurry technique, or
[18] [19] [20]
3) sediment suspension technique. The method chosen is contingent on the study objectives
[5]
and the nature of the chemical or material being tested.
If the use of an organic solvent other than water is necessary to dissolve a test chemical and keep it
in solution, test concentration are spiked directly into the control sediment and the solvent carrier
evaporated before the addition of overlying water. A solvent-only control sediment shall be prepared
and tested concurrently with the test sediment treatments. The solvent-only control treatment shall
[5]
contain the highest concentration of solvent used in preparing the test sediment treatments.
9 Test procedure
9.1 Preparing the test containers
Mix each sediment sample thoroughly on the day preceding the test and add an aliquot of sediment to
each test container (e.g. 100 ml). Distribute test sediment in a uniform layer, which allows amphipods to
burrow (minimum 1,5 cm in depth). Prepare a minimum of five laboratory replicates for each treatment
or test sample and growth measurement period (i.e. Day 14 and Day 28), plus, if necessary, one or more
8 © ISO 2013 – All rights reserved
replicates per treatment for monitoring chemical characteristics of the sediment and the overlying
water during the test. Replicates set up for monitoring of chemistry shall receive amphipods, as in other
test replicates.
Smooth the sediment surface flat in each container and ensure there is minimal disturbance of the test
or control sediment during the addition of overlying water. One technique for minimizing the disruption
of sediment is pouring the water over a disc [polyethylene, nylon, or polytetrafluoroethylene (PTFE)
sheeting of 4 mm to 6 mm thickness] lying on the sediment surface that fits the inside diameter of the
[1] [3]
test container. Overlying water is added to each test container such that the sediment:water ratio
is 1:1,75 or 1:4. The disc is removed and rinsed with overlying water between replicates of a treatment.
A separate clean disc is used for each treatment. The water overlying the sediment in each test chamber
should be renewed on the day preceding the test, as well as throughout the test (9.4).
The treatments should be positioned for easy observation of amphipods. Preferably, the test treatments
should be placed in randomized order or in a random block design with one replicate treatment in each block.
9.2 Introducing the organisms
Initiate the toxicity test by placing 10 Hyalella azteca in each test container (i.e. 10 amphipods per
replicate of each treatment).
Select individual amphipods randomly from a known-age culture container (see B.3) using a pipette or
other suitable device and distribute them directly to the test vessels. Amphipods are placed below the
air/water interface in the overlying water. Alternatively, 10 amphipods may be counted into a transfer
chamber (e.g. 30 ml plastic cup) filled with overlying water and then recounted before their transfer into
the test containers. Transfer amphipods to the test chamber by gently pouring the water and amphipods
from the sorting dish. Use a disc as described in 9.1 to prevent disturbance of the sediment. Wash any
amphipods remaining in the dish into the test container using more overlying water. Increase the volume
in the test container to the appropriate level (water plus sediment), if necessary, remove the disc, and
place covers on the test containers, if using. Because replicate containers are used, amphipods should be
added at the same time to each set or block of test containers representing each treatment, following a
randomized block design.
Replace any amphipods that have not buried into the sediment within 1 h, unless they are observed to
repeatedly burrow into the sediment and immediately emerge in an avoidance response to the test substrate.
Amphipods displaying this avoidance behaviour during the initial hour of the test should not be replaced.
9.3 Test conditions
Test duration is 14 d and/or 28 d. The test can be terminated at 14 d; however, it may be continued
to 28 d. If the latter is chosen, an extra five replicates are prepared for each treatment prior to test
initiation so that five replicates may be processed and survival and growth data collected at 14 d. The
remaining five replicates remain intact for a further 14 d, for end point determination at 28 d.
The test is to be conducted at a daily mean temperature of (23 ± 2) °C. The instantaneous temperature
[1]
must always be within ± 3 °C of 23 °C.
Solutions overlying sediments are aerated to maintain DO concentration ideally between 90 % and 100 %
saturation. Air should be delivered to the overlying water at a continuous, gentle rate as described in 6.3.3.
Lighting intensity is between 100 lx to 1 000 lx at the surface of the overlying water. Illumination should
be uniform and shall have a day/night cycle as outlined in 5.2.
Food is to be provided three times a week on non-consecutive days or daily throughout the test as
described in 6.4.
For testing of field-collected sediments, five replicate containers per treatment is optimum for a 14-day test
and 10 replicate containers per treatment is optimum for a 28-day test (i.e. five replicates for data collection
at 14 d and 5 replicates for data collection at 28 d); however, a minimum of three
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16303
Première édition
2013-12-01
Qualité de l’eau — Détermination de
la toxicité des sédiments d’eau douce
vis-à-vis de Hyalella azteca
Water quality — Determination of toxicity of fresh water sediments
using Hyalella azteca
Numéro de référence
©
ISO 2013
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Environnement d’essai . 3
5.1 Installation d’essai . 3
5.2 Éclairage . 3
6 Réactifs, organismes et matériaux d’essai . 3
6.1 Organisme d’essai . 3
6.2 Sédiment témoin . 4
6.3 Colonne d’eau . 5
6.4 Alimentation des organismes . 6
6.5 Substance de référence . 7
7 Matériel . 7
8 Traitement et préparation des échantillons. 8
8.1 Généralités . 8
8.2 Sédiment d’essai . 8
8.3 Préparation des échantillons de sédiments . 8
9 Mode opératoire. 9
9.1 Préparation des récipients d’essai . 9
9.2 Introduction des organismes .10
9.3 Conditions d’essai .10
9.4 Renouvellement de la colonne d’eau.11
9.5 Mesurages et observations d’essai .11
10 Expression des résultats.12
10.1 Survie .12
10.2 Croissance .12
10.3 Validité de l’essai .12
11 Analyse et interprétation des résultats .12
11.1 Analyse des données .12
11.2 Facteurs autres que les contaminants .13
12 Substance de référence .13
12.1 Essai uniquement en milieu aqueux.13
12.2 Essai sur sédiment entier .14
13 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Description d’Hyalella azteca .16
Annexe B (informative) Élevage de Hyalella azteca .19
Annexe C (informative) Sources d’Hyalella azteca .21
Annexe D (normative) Préparation de l’aliment LCT .23
Annexe E (informative) Essai de reproduction dans les sédiments d’une durée de 42 jours .25
Annexe F (informative) Essai de survie et de croissance en colonne d’eau d’une durée de 14 jours .
Annexe G (informative) Données de performance .27
Bibliographie .29
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues
(voir www.iso.org/brevets).
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, aussi bien que pour des informations au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de
l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC) voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité
SC 5, Méthodes biologiques.
Introduction
Dans l’environnement aquatique, le sédiment sert de réservoir pour les contaminants agricoles,
industriels et municipaux. Un sédiment contaminé affecte directement les organismes benthiques et agit
comme une source de contamination pour la colonne d’eau, impactant souvent de manière négative les
organismes pélagiques. Les essais de toxicité sur sédiments sont généralement utilisés pour déterminer
et contrôler les effets toxiques de substances distinctes ou de mélanges complexes pouvant s’avérer
nocifs pour la santé des populations indigènes dans les environnements aquatiques et benthiques. La
présente méthode décrit des modes opératoires pour réaliser des essais d’une durée de 14 jours et/ou
28 jours destinés à évaluer la toxicité des sédiments vis-à-vis de l’amphipode d’eau douce, Hyalella azteca.
Pour ces essais, les critères d’effets biologiques comprennent la mortalité et la croissance.
vi © ISO 2013 – Tous droits réservés
NORME INTERNATIONALE ISO 16303:2013(F)
Qualité de l’eau — Détermination de la toxicité des
sédiments d’eau douce vis-à-vis de Hyalella azteca
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les problèmes
de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur d’établir des
pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à la
réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente
Norme internationale soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale définit une méthode de détermination de la toxicité d’un sédiment
entier vis-à-vis de jeunes amphipodes Hyalella azteca, fondée sur la survie et l’inhibition de la croissance
après 14 jours et/ou 28 jours.
La méthode s’applique
a) aux échantillons de sédiments d’eau douce contaminés,
b) aux boues chimiques, industrielles, urbaines, ou autres déchets solides pouvant se combiner à des
sédiments d’eau douce, ou
c) à des produits chimiques ou des préparations ajouté(e)s à un sédiment propre.
La présente Norme internationale est applicable aux échantillons de sédiments d’eau douce. L’amphipode
Hyalella azteca peut être utilisé pour soumettre à essai les eaux saumâtres d’une salinité maximale de
15 ‰, avec une acclimatation adéquate. La présente Norme internationale n’est pas applicable aux essais
sur des échantillons de sédiments marins et estuariens présentant une salinité supérieure à 15 ‰.
La présente méthode consiste en un essai de survie et de croissance d’une durée de 14 jours et/ou
28 jours, applicable aux types d’échantillons de sédiments décrits ci-dessus.
2 Références normatives
Les documents suivants, en totalité ou en partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 5814, Qualité de l’eau — Dosage de l’oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 6059, Qualité de l’eau — Dosage de la somme du calcium et du magnésium — Méthode titrimétrique à l’EDTA
ISO 10523, Qualité de l’eau — Détermination du pH
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
sédiment artificiel
mélange de matériaux simulant les composants physiques d’un sédiment naturel
Note 1 à l’article: voir (6.2.1).
3.2
sédiment témoin
sédiment (naturel ou artificiel) utilisé pour évaluer le comportement des organismes d’essai et
l’acceptabilité des essais (c’est-à-dire, sédiment propre)
Note 1 à l’article: Les résultats des essais sur le sédiment témoin sont utilisés à des fins de comparaison avec les
réponses des organismes dans le(s) sédiment(s) d’essai contaminé(s) et d’évaluation de la validité des essais.
Note 2 à l’article: Les sédiments témoins sont utilisés de façon systématique pour évaluer l’acceptabilité d’un
essai (6.2).
3.3
sédiment pour essai
quantité distincte de sédiment (prélevé sur le terrain ou dopé) devant être soumise à essai dans le but
de déterminer les effets possibles de la contamination sur les amphipodes
3.4
sédiment dopé (enrichi)
sédiment auquel un matériau a été ajouté pour les essais
3.5
sédiment de référence
sédiment prélevé sur le terrain à proximité d’une zone étudiée, choisi pour ses propriétés qui
correspondent étroitement à celles du ou des échantillons du sédiment soumis à essai, à l’exception du
degré de contamination
Note 1 à l’article: Le sédiment de référence est souvent choisi dans un endroit non influencé par la source de
contamination, mais généralement à proximité des endroits où sont prélevés les échantillons de sédiment pour
essai. Les résultats de l’essai fournissent une base site-spécifique pour l’évaluation de la toxicité.
3.6
renouvellement intermittent
essais au cours desquels les solutions d’essai ou l’eau surnageante sont renouvelées en fonction de la
dégradation de la qualité de l’eau
3.7
colonne d’eau
eau recouvrant la couche de sédiment dans le récipient d’essai
Note 1 à l’article: Également utilisée pour traiter, au besoin, le sédiment (par exemple, pour préparer un sédiment
formulé ou des mélanges de sédiment dopé).
3.8
croissance
augmentation du poids sec des organismes d’essai au cours de l’expérience, exprimée en poids sec moyen
par amphipode survivant
4 Principe
Des jeunes amphipodes d’eau douce, Hyalella azteca, âgés de 2 jours à 9 jours, classés par tranche d’âge
(1 jour à 2 jours), sont exposés par groupes de 10 organismes à un sédiment contaminé ou à un sédiment
[1] [2] [3]
dopé par une substance chimique d’essai pendant 14 jours et/ou 28 jours. , , Les critères d’effets de
l’essai sont le taux de mortalité et l’inhibition de la croissance, évalués par rapport à ceux des organismes
exposés en parallèle à un sédiment témoin. L’essai est réalisé dans des récipients en verre, avec un
rapport sédiment/eau (volume à volume) de 1:1,75 ou de 1:4 (par exemple, 100 ml de sédiment avec
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
175 ml d’eau surnageante ou 100 ml de sédiment avec 400 ml d’eau surnageante). Des essais comparatifs
intégrant les deux ratios sédiment/eau recommandés n’ont montré aucune différence notable entre les
[4]
résultats d’essai sur H. azteca. Toutefois, le rapport sédiment/eau de 1:4 permet de disposer d’un plus
grand volume d’eau surnageante pour l’analyse chimique. L’exposition est essentiellement statique,
sauf si le témoin (par exemple variation du pH affectant la forme de l’ammoniaque résiduel) révèle une
dégradation de la qualité de l’eau qui nécessite le renouvellement de cette dernière.
Une option long terme (c’est-à-dire 42 jours) pour cet essai de toxicité vis-à-vis de Hyalella azteca est
décrite dans l’Annexe E. Les critères d’effets de cet essai à long terme comprennent la survie (jours 28,
35 et 42), la croissance (jours 28 et 42), et la reproduction (nombre de jeunes par femelle produits entre
le jour 28 et le jour 42).
L’Annexe F décrit également une méthode d’essai, utilisant Hyalella azteca, uniquement en milieu aqueux.
Cette méthode correspond à un essai d’une durée de 14 jours portant sur la survie et la croissance de jeunes
amphipodes exposés à des échantillons d’effluents industriels, d’effluents de stations d’épuration, d’eaux
douces (par exemple eau réceptrice), d’extraits aqueux ou de substances chimiques solubles ou pouvant
être maintenues sous forme de suspensions ou de dispersions stables dans les conditions de l’essai.
5 Environnement d’essai
5.1 Installation d’essai
L’installation d’essai doit être bien ventilée, protégée contre les perturbations physiques et être exempte
de poussière et de fumées. Les essais doivent être réalisés dans un local ou une enceinte thermostatée
qui maintient une température de (23 ± 2) °C dans les récipients d’essai.
5.2 Éclairage
Tous les récipients d’essai doivent recevoir un éclairage par le dessus correspondant à un éclairage normal
de laboratoire (c’est-à-dire de 100 lx à 1 000 lx) au niveau de l’interface air/eau. Il convient que l’éclairage
soit uniforme et qu’il assure un cycle jour/nuit (photopériode) de 16 h d’éclairement et de 8 h d’obscurité.
6 Réactifs, organismes et matériaux d’essai
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Organisme d’essai
Hyalella azteca est un organisme épibenthique détritivore et fouisseur qui vit en contact étroit avec la
surface (1 ou 2 premiers centimètres) des sédiments d’eau douce. Il est largement présent en Amérique
[1] [2] [3]
du Nord et du Sud: dans les lacs, les étangs et les cours d’eau à faible courant en région tempérée. , ,
Les jeunes Hyalella azteca proviennent d’élevages de laboratoire maintenus dans des conditions de
température, de photopériode et d’alimentation identiques à celles de l’essai. Il convient que l’identification
de l’espèce soit confirmée par un personnel qualifié expérimenté dans l’identification des amphipodes
d’eau douce à partir des caractéristiques taxonomiques distinctives décrites dans l’Annexe A et dans des
[2] [5]
publications antérieures. ,
6.1.1 Stade de développement et taille
Les amphipodes utilisés pour l’essai doivent être âgés de 2 jours à 9 jours et leur âge ne doit pas varier
de plus de 2 jours. L’Annexe B décrit une méthode d’élevage de l’amphipode Hyalella azteca et d’obtention
d’organismes d’essai d’âge connu. Si la croissance est exprimée en taille moyenne à la fin de l’essai, il
convient qu’une longueur moyenne des organismes soit déterminée au lancement de l’essai.
6.1.2 Source
Tous les amphipodes utilisés lors d’un essai doivent provenir de la même population et de la même
source. Les sources d’organismes à utiliser pour constituer des élevages comprennent des laboratoires
publics ou privés qui élèvent Hyalella azteca pour les essais de toxicité sur sédiments, ou un fournisseur
[1] [2] [3]
de réactifs biologiques reconnu. , , L’Annexe C fournit une liste de sources possibles de H. azteca.
6.2 Sédiment témoin
Chaque essai de toxicité sur sédiment doit inclure un témoin comportant un nombre minimal de cinq
récipients d’essai contenant le sédiment témoin. Les réponses des organismes exposés au sédiment
témoin fournissent des mesures permettant de déterminer la validité de l’essai (voir 10.3), des
indications relatives à l’état de santé et au comportement normal des organismes d’essai, ainsi qu’une
base pour l’interprétation des données obtenues sur les sédiments soumis à essai. Le sédiment témoin
est un sédiment naturel ou un sédiment artificiel (c’est-à-dire formulé).
6.2.1 Sédiment naturel
Un sédiment naturel, prélevé sur un site de collecte d’eau douce ou légèrement saumâtre (<15 ‰),
exempt de sources connues de contaminants et pour lequel le comportement des témoins pour H. azteca
est connu, peut être utilisé comme sédiment témoin pour un essai, ou comme matériau « propre » pour
être dopé avec une substance chimique soumise à essai. Si l’eau des pores du sédiment présente une
salinité significative, le laboratoire d’essai doit suivre une procédure d’acclimatation adaptée pour
obtenir des Hyalella adultes pouvant être utilisés comme reproducteurs et ainsi s’assurer que des jeunes
amphipodes, adaptés à la salinité, seront utilisés durant l’essai.
6.2.2 Sédiment artificiel
Le sédiment artificiel suivant peut être utilisé comme un sédiment témoin pour les essais sur sédiments
d’eau douce, ou comme un matériau «propre» pour le doper avec une substance chimique soumise à
essai. Cette préparation est fondée sur le sédiment artificiel recommandé dans l’ISO 10872.
Mélanger soigneusement les composants suivants selon les proportions indiquées:
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
Dolomite (Argile): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
Sable siliceux (granulométrie moyenne: 0,063 mm): 30 %
Sable siliceux (0,1 mm à 0,4 mm): 40 %
Tourbe (issue de tourbières hautes, décomposée, non traitée; finement broyée et passée 4 %
au tamis <1 mm):
Il existe plusieurs méthodes acceptables de préparation et de conditionnement du sédiment artificiel. En
règle générale, il convient de prendre en compte les paramètres suivants lors du choix d’une formulation
pour un sédiment témoin ou un sédiment d’essai.
a) assurer la survie, la croissance ou la reproduction d’une grande variété d’organismes benthiques;
b) fournir des résultats biologiques cohérents et acceptables pour une grande variété d’espèces;
c) être composé de constituants standards, facilement disponibles pour les laboratoires d’essai;
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
d) être exempts de concentrations en contaminants susceptibles d’avoir des effets néfastes sur les
organismes d’essai.
Des options de sédiments artificiels acceptables sont décrites dans le guide d’Environnement Canada
sur le sujet, comprenant également les techniques pour ajouter des substances chimiques d’essai dans
[6]
un sédiment.
6.3 Colonne d’eau
6.3.1 Eau douce naturelle
Une eau douce naturelle comprend une alimentation non contaminée d’eau souterraine ou une eau de
surface. Si les essais ont pour objectif de simuler les conditions du terrain, l’eau naturelle peut être diluée
avec de l’eau distillée ou déionisée ultrapure jusqu’à obtention de la dureté requise. Il est également
possible d’utiliser de l’eau provenant du site où le sédiment a été recueilli. Il convient de filtrer l’eau
de surface à travers un tamis à maille fine (par exemple 30 µm) pour éliminer des prédateurs ou des
« compétiteurs » potentiels. L’utilisation d’eau déchlorée comme eau destinée à recouvrir le sédiment
n’est pas recommandée car cette eau déchlorée est souvent de qualité très variable et elle peut contenir
des concentrations excessivement élevées en chlore, chloramines, fluorure, cuivre, plomb, zinc ou autres
contaminants.
6.3.2 Eau reconstituée
Si de l’eau douce reconstituée est utilisée pour la colonne d’eau lors des essais sur Hyalella azteca, le
[7]
milieu artificiel suivant doit être préparé dans de l’eau déionisée:
CaCl 110,98 mg/l
NaHCO 84,01 mg/l
MgSO 30,09 mg/l
KCl 3,728 mg/l
NaBr 1,029 mg/l
Avant utilisation, le mélange est aéré pendant 24 h pour ajuster l’oxygène dissous (OD) et stabiliser le
pH. Les concentrations en sels peuvent être ajustées afin d’obtenir une composition similaire à celle
d’une eau réceptrice étudiée. Toutefois le rapport Ca:Br doit être maintenu constant car ces ions sont
[8] + −
indispensables pour H. azteca et doivent être présents simultanément . Na et HCO sont les ions les
2+ +
plus importants pour la survie de H. azteca, tandis que les ions Mg et K sont nécessaires pour une
[7][9]
croissance et une reproduction optimales . En raison de leur influence non confirmée, les plages
de valeurs de l’alcalinité et de la dureté n’ont pas été définies. L’utilisation standard de la préparation
d’eau reconstituée mentionnée ci-dessus pour l’élevage des organismes et pour les essais a confirmé
des niveaux acceptables d’alcalinité et de dureté pour Hyalella Azteca. La conductivité, le pH, la dureté,
l’oxygène dissous et l’alcalinité sont mesurés dans chaque lot d’eau reconstituée. Aucun lot d’eau
reconstituée donné ne doit être utilisé pendant plus de 4 semaines.
6.3.3 Oxygène dissous
La teneur en oxygène dissous de l’eau recouvrant le sédiment doit être idéalement comprise entre 90 %
et 100 % de la valeur de saturation de l’air au début de l’essai, et pendant toute la durée de l’essai. Cette
teneur en oxygène dissous est maintenue par une aération modérée à l’aide d’air comprimé filtré et
exempt d’huile. Il convient que le débit d’aération ne provoque pas de mise en suspension du sédiment
(par exemple 2 à 3 bulles/s).
6.4 Alimentation des organismes
Il existe deux options pour l’apport de nourriture lors de l’essai sur Hyalella. Un aliment pour poissons
1)
du commerce et un mélange de levure, de Cerophyll™ et de granulés pour truites (LCT) se sont avérés
[1] [2] [3] [10] [11] [12]
être adéquats pour Hyalella azteca dans les conditions d’essai définies , , , , , .
Il existe également deux options pour la fréquence d’apport de nourriture. Les organismes d’essai sont
alimentés soit une fois par jour, soit trois fois par semaine (jours non consécutifs) pendant toute la durée
de l’essai. Une ration alimentaire identique est ajoutée à chaque récipient d’essai lors de chaque apport
[11]
de nourriture . La ration fournie doit être adéquate pour permettre une survie et une croissance
acceptables de H. azteca pendant la période d’essai, mais elle ne doit en aucun cas être excessive.
6.4.1 Option 1: Nourriture pour poissons
De la nourriture pour poissons du commerce, sous forme de flocons, (par exemple Tetrafin™, Tetramin™,
2)
)
ou Nutrafin™) peut être utilisée comme une source d’alimentation pour les organismes pendant toute
la durée de l’essai. La nourriture peut être broyée et passée au tamis afin d’obtenir des flocons de taille
homogène ou de pouvoir préparer une bouillie en mélangeant les flocons pour poissons avec de l’eau de
bonne qualité. Il convient de conserver la nourriture pour poissons, sous forme de flocons, à température
ambiante dans un récipient hermétique.
Si l’apport journalier de nourriture est l’option choisie, 2,7 mg de flocons pour poissons (poids sec) sont
ajoutés à chaque récipient d’essai, le premier jour de l’essai (le jour où les amphipodes sont placés dans
les récipients d’essai) et ensuite une fois par jour, jusqu’à la fin de l’essai. Si l’apport de nourriture trois
fois par semaine est l’option choisie, 6,3 mg de flocons pour poissons (poids sec) sont ajoutés, trois fois
par semaine (en commençant le premier jour de l’essai), à chaque récipient d’essai, selon des jours non
consécutifs (par exemple, les lundis, les mercredis et les vendredis), jusqu’au jour où l’essai prend fin. Les
deux rations fournissent approximativement le même taux d’alimentation; cependant, l’apport quotidien
[6]
de nourriture peut être une option préférentielle car la nourriture est disponible en permanence .
3)
6.4.2 Option 2: Mélange de levure/Cerophyll™ / Nourriture pour truite (LCT)
Une seconde combinaison d’aliments fondée sur les méthodes d’essai préconisées par l’USEPA et
[1] [2]
Environnement Canada , est également recommandée.
La formule de préparation du mélange LCT est donnée dans l’Annexe D. Si un apport quotidien de
nourriture est choisi, un volume de 1,5 ml (équivalent à 2,7 mg de nourriture, poids sec) d’un mélange
3)
de levure, de Cerophyll™ et de nourriture pour truite, est ajouté quotidiennement à chaque récipient
d’essai en commençant le premier jour de l’essai (c’est-à-dire le jour où les amphipodes sont placés
dans les récipients d’essai), et ensuite une fois par jour, jusqu’au jour où l’essai prend fin. Si l’apport de
nourriture trois fois par semaine est l’option choisie, un volume de 3,5 ml de mélange LCT (équivalent
à environ 6,3 mg de nourriture, poids sec) est ajouté trois fois par semaine (en commençant le
premier jour de l’essai), à chaque enceinte d’essai, selon des jours non consécutifs (par exemple, les
lundis, les mercredis et les vendredis), jusqu’au jour où l’essai prend fin. Les deux rations fournissent
approximativement le même taux d’alimentation; cependant, l’apport quotidien de nourriture peut être
une option préférentielle car la nourriture est disponible en permanence.
Le mélange LCT peut être congelé. Des aliquotes décongelées de mélange LCT non utilisées peuvent être
conservées à l’obscurité à (4 ± 3) °C, mais elles doivent être éliminées au bout de 14 jours.
1) Il est possible de se procurer du Cerophyll™ chez Ward’s Scientific sous la désignation « Cereal Grass Media
– Cerophyll ». Cette information est donnée à titre pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifie
nullement l’approbation de ce produit par l’ISO.
2) Tetrafin™, Tetramin™ et Nutrafin™ sont des exemples de flocons pour poissons disponibles dans le
commerce. Ces informations sont données à titre pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifient
nullement l’approbation de ces produits par l’ISO.
3) Il est possible de se procurer du Cerophyll™ auprès de Ward’s Scientific sous la désignation «Cereal Grass
Media – Cerophyll». Cette information est donnée à titre pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifie
nullement l’approbation de ce produit par l’ISO.
6 © ISO 2013 – Tous droits réservés
6.5 Substance de référence
Le chlorure de cadmium (CdCl ), le sulfate de cuivre (CuSO ), le chlorure de sodium (NaCl) et le chlorure
2 4
[1] [2] [3] [10]
de potassium (KCl) sont tous des substances de référence appropriées. , , , Si nécessaire, il
convient de consulter les fiches de données de sécurité (FDS) de ces substances avant leur utilisation
par le personnel de laboratoire.
7 Matériel
Du matériel courant de laboratoire est utilisé pour l’élevage des organismes et les essais.
7.1 Local, enceinte ou bain-marie thermostaté.
Le système choisi doit maintenir une température de (23 ± 2) °C dans les récipients d’essai.
7.2 Appareillage de mesure.
Appareils et/ou instruments pour mesurer l’oxygène dissous, le pH, la dureté, la conductivité, l’alcalinité,
l’ammoniaque, l’intensité lumineuse et la température, voir l’ISO 10523, l’ISO 5814 et l’ISO 6059.
7.3 Récipients d’essai.
Tous les récipients et accessoires (par exemple les tamis), susceptibles d’être en contact avec les
organismes, le sédiment témoin ou le sédiment d’essai et l’eau surnageante lors du tri, de la manipulation
4)
)
et des essais, doivent être en matériaux non toxiques (par exemple verre, acier inoxydable, Nalgene™
nylon, porcelaine, polyéthylène, polypropylène, fibre de verre) et ils doivent être nettoyés et rincés à
l’eau distillée, à l’eau déionisée, à l’eau de laboratoire déchlorée, à l’eau reconstituée, ou à l’eau naturelle
provenant d’une source non contaminée. Les matériaux tels que le cuivre, le zinc, le laiton, le métal
galvanisé, le plomb et le caoutchouc naturel ne doivent pas entrer en contact avec le matériel et
l’équipement mentionnés ci-dessus, avec les échantillons du sédiment témoin, du sédiment de référence
ou du sédiment d’essai, ou avec l’eau surnageante ou les récipients. Avant de lancer un essai, s’assurer
que tous les récipients d’essai et ustensiles de laboratoire associés sont propres et exempts de tous
contaminants issus d’une utilisation antérieure.
Comme récipients d’essai, il est recommandé d’utiliser des récipients en verre (béchers ou flacons à
large ouverture) d’un diamètre intérieur compris entre 7 cm et 10 cm environ et d’un volume compris
entre 300 ml et 1 l. Ceux-ci doivent permettre de disposer d’une profondeur de sédiment de 1,5 cm à
2,5 cm et un rapport sédiment/eau (volume:volume) de 1:1,75 ou de 1:4. Chaque récipient d’essai peut
être recouvert d’un couvercle en verre ou en plastique pour réduire la possibilité de contamination,
réduire l’évaporation et minimiser la perte de composants volatils présents dans le sédiment.
Avant utilisation, rincer les récipients avec de l’eau surnageante (6.3) ou avec de l’eau déionisée ou distillée.
7.4 Dispositif d’aération, de la colonne d’eau dans chaque récipient d’essai au cours des essais, si nécessaire.
7.5 Pipette, pour transférer Hyalella azteca, avec une ouverture de 5 mm à 6 mm de diamètre pour
capturer les animaux tout en ne permettant le transfert que d’un faible volume d’eau.
7.6 Loupe binoculaire/microscope de dissection, avec un grossissement d’au moins ×7,5.
7.7 Tamis, par exemple de maille de 300 µm ou 425 µm, pour récupérer les amphipodes Hyalella azteca
à partir du sédiment à la fin de l’essai.
4) Nalgene™ est un exemple de produit adapté disponible dans le commerce. Cette information est donnée à
titre pratique aux utilisateurs du présent document et ne signifie nullement l’approbation de ce produit par l’ISO.
7.8 Étuve, capable de sécher les organismes d’essai à une température comprise entre 60 °C et 90 °C
pendant 24 h avant la pesée.
7.9 Dessiccateur, pour garder les organismes d’essai déshydratés à la fin de l’essai pendant la pesée.
7.10 Balance, capable de peser Hyalella azteca à 10 µg près.
8 Traitement et préparation des échantillons
8.1 Généralités
Prélever les sédiments sur des sites de référence, témoin et à soumettre à essai selon des pratiques
établies, voir l’ISO 5667-16 et les Références [1],[5],[10],[13],[14],[15],[16] ou, si nécessaire, ajouter une
[2] [5] [13] [15]
substance chimique ou une préparation à un échantillon de sédiment témoin , , , . Pour les
études sites-spécifiques, il est nécessaire d’utiliser des modes opératoires similaires de collecte et de
manipulation des sédiments soumis à essai et des sédiments de référence. Les récipients de prélèvement
sont en matériau inerte non toxique; ils doivent être neufs ou soigneusement nettoyés. Les récipients
de prélèvement sont remplis à ras bord pour expulser l’air et aussitôt fermés hermétiquement et
étiquetés munis d’une étiquette ou d’un code. Conserver le sédiment recueilli dans un récipient fermé
hermétiquement, à l’obscurité à (4 ± 2) °C jusqu’au moment de son utilisation pour l’essai de toxicité.
Le séchage, la congélation et la conservation au froid affectent tous la toxicité et la biodisponibilité des
substances chimiques dans le sédiment. Lancer les essais dès que possible pour maintenir l’intégrité
chimique, mais de préférence dans les 5 jours et en aucun cas au-delà de 30 jours sauf si la stabilité
chimique peut être assurée. Une analyse de contaminants chimiques connus peut être effectuée sur des
échantillons de sédiment prélevés sur le terrain et les résultats comparés à l’analyse du sédiment au
début et à la fin de l’essai afin de quantifier toute variation de concentration ou de forme chimique.
8.2 Sédiment d’essai
Prélever le sédiment à soumettre à essai sur le site à évaluer au moyen d’appareils tels que des dispositifs
de carottage (par exemple carottier à boîte, carottier Phleger) ou des bennes (par exemple Ekman, Ponar,
Van Veen, Petersen, Shipek, Kajak-Brinkhurst). Le sédiment est prélevé au milieu de l’échantillon qui n’a
pas été en contact avec l’appareil d’échantillonnage. En règle générale, la partie supérieure (2 cm à 4 cm)
du sédiment représentant la zone oxique est collectée et fait l’objet d’un regroupement à partir d’un
nombre suffisant d’échantillons du site (échantillon composite) pour répondre aux besoins de l’essai.
Plusieurs litres (c’est-à-dire 5 l à 7 l) de sédiment sont normalement requis pour réaliser un essai de
toxicité sur Hyalella azteca; cependant, la quantité de sédiment nécessaire dépendra des objectifs de
l’étude, du plan d’étude et de la nature des analyses chimiques à réaliser. Pour obtenir une quantité
suffisante de sédiment, il est souvent nécessaire de combiner des sous-échantillons récupérés à l’aide
du dispositif de prélèvement. Pour les analyses chimiques, utiliser une pelle en matériau inerte et
préalablement nettoyée pour transférer le sédiment dans un récipient inerte et mélanger l’échantillon
composite jusqu’à ce que la couleur et la texture soient uniformes. Conserver l’échantillon composite
dans un récipient en verre fumé propre (si des composés organiques sont les contaminants suspectés)
ou dans un récipient propre en polycarbonate ou en polyéthylène haute densité (si des métaux sont les
contaminants suspectés). Remplir les récipients à la contenance et les envoyer au laboratoire (4 ± 2) °C.
Il convient que l’appareillage soit nettoyé entre les différents sites pour éviter tout risque de contamination
croisée. Récupérer les déchets de solvants de nettoyage et les envoyer au laboratoire en vue de leur élimination.
8.3 Préparation des échantillons de sédiments
Éliminer les gros débris (>1 cm) et les organismes indigènes en les triant manuellement à l’aide de
pinces ou d’un instrument similaire. Le tamisage du sédiment à cette fin n’est pas recommandé car il
pourrait entraîner une perte de contaminants solubles dans l’eau et de particules d’argile fines restées en
[1] [2] [14] [15]
suspension. Chaque échantillon de sédiment est homogénéisé au laboratoire avant utilisation , , , ,
sauf si les objectifs de l’étude imposent le contraire. Immédiatement après le mélange de l’échantillon, les
8 © ISO 2013 – Tous droits réservés
sous-échantillons de matériau d’essai destinés aux analyses chimiques et physiques sont prélevés, placés
dans des récipients étiquetés et conservés de manière appropriée en vue des analyses physico-chimiques.
La caractérisation chimique et physique de l’échantillon de sédiment est nécessaire pour l’interprétation
des résultats. Analyser un sous-échantillon du sédiment d’essai et du sédiment de référence pour
déterminer les éléments suivants: la distribution granulométrique (pourcentage de gravier (>2 mm),
sable grossier et fin (≤2 mm à > 0,063 mm), limon (≤0,063 à > 0,004 mm) et argile (<0,004 mm)), la teneur
en eau, le carbone organique total, le pH de l’eau interstitielle et la teneur en ammoniaque dans l’eau
[1] [2] [3] [10]
interstitielle (concentrations totale et non ionisée). , , , Une caractérisation complémentaire
pourrait comprendre le carbone inorganique total, les matières volatiles totales, la demande biochimique
en oxygène, la demande chimique en oxygène, la capacité d’échange cationique, les sulfures volatils
acides, les métaux, les composés organiques synthétiques, les huiles et les graisses, les hydrocarbures
[2]
pétroliers. L’eau interstitielle peut être également prélevée et analysée pour les contaminants dissous.
Les échantillons d’eau interstitielle peuvent être obtenus à partir du sédiment témoin ou du sédiment
de référence par des méthodes in situ (par exemple, peepers) ou des méthodes ex situ (par exemple,
[13] [14] [15]
centrifugation ou compression). , ,
Si l’étude a pour objectif de doper un sédiment avec une substance ou une préparation chimique,
il existe des modes opératoires explicitant les étapes de dopage du sédiment, d’homogénéisation,
d’équilibrage chimique, d’utilisation d’un solvant, de vérification et d’analyse des données, voir
Références [1],[2],[5],[13],[15]. Toutefois, la présente Norme internationale recommande un mode
opératoire de dopage humide plutôt qu’un mode opératoire de dopage à sec qui peut entraîner des pertes
de la substance chimique soumise à essai. Le sédiment est dopé avec le produit chimique ou la substance
d’essai, soit par ajout direct au sédiment soit sous la forme d’une boue sédiment/eau avant l’ajout de
la colonne d’eau. Une période d’équilibrage est nécessaire pour laisser le temps à la concentration du
produit chimique soumis à essai de se stabiliser dans l’eau des pores du sédiment. La durée de cette
période d’équilibrage dépend dans une large mesure de la nature du produit chimique soumis à essai
et du type de sédiment (par exemple, la période d’équilibrage dans le cas d’un sédiment sableux devrait
être plus courte que dans le cas d’un sédiment ayant une teneur élevée en argile; des sels inorganiques
devraient s’équilibrer plus vite qu’un composé organique polaire).
Les informations disponibles sur les propriétés du produit chimique ou de la substance à soumettre à
essai sont c
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 16303
Первое издание
2013-12-01
Качество воды. Определение
токсичности осаждений пресной воды
с использованием Hyalella azteca
Water quality —Determination of toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2013
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не задано иначе, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия офиса ISO по адресу, указанному ниже, или членов ISO в стране регистрации
пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.3
5 Испытательная среда.3
5.1 Оборудование .3
5.2 Освещение.3
6 Реактивы, испытательные организмы и материалы.3
6.1 Испытательный организм.3
6.2 Контрольный осадок .4
6.3 Вышележащая вода.5
6.4 Кормление .6
6.5 Стандартное вещество.7
7 Оборудование .7
8 Обработка и подготовка проб.8
8.1 Общие вопросы.8
8.2 Испытательный осадок.8
8.3 Подготовка проб осадков .9
9 Процедура испытания .10
9.1 Приготовление испытательных емкостей.10
9.2 Введение организмов .10
9.3 Условия испытания.11
9.4 Обновление вышележащей воды .11
9.5 Тестовые наблюдения и измерения.11
10 Выражение результатов .12
10.1 Выживание.12
10.2 Рост .12
10.3 Валидность теста.12
11 Анализ и интерпретация результатов.12
11.1 Анализ данных .12
11.2 Факторы, не относящиеся к загрязнению .13
12 Стандартное вещество.13
12.1 Тест только с водой .14
12.2 Испытание цельного осадка .14
13 Протокол испытания.14
Приложение А (информативное) Описание Hyalella azteca.16
Приложение В (информативное) Культивирование Hyalella azteca.18
Приложение С (информативное) Источники Hyalella azteca .20
Приложение D (нормативное) Процедура для приготовления комбинированных кормов YCT.22
Приложение Е (информативное) 42-дневное испытание осадка на размножение .23
Приложение F (информативное) 14-дневный тест только с водой на выживание и рост .24
Приложение G (информативное) Рабочие результаты .25
Библиография.26
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является Всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO
работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Процедуры, используемые для разработки настоящего документа, и процедуры, предназначенные для
его дальнейшего ведения, описаны в Директивах ISO/IEC, Часть 1. В частности, следует отметить
различные критерии одобрения для различных типов документов ISO. Проект данного документа был
разработан по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC, Часть 2 (см. www.iso.org/directives).
Обращается внимание на то, что некоторые элементы данного документа могут быть объектом
патентных прав. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо одного или всех таких
патентных прав. Детали любых патентных прав, установленные в процессе подготовки этого
документа, будут указаны во Введении и/или в списке патентных заявок, полученных ISO (см.
www.iso.org/patents).
Любое фирменное название, используемое в этом документе, указывается только как информация для
удобства пользователей и не является рекомендацией.
Для объяснения специфических терминов ISO и выражений, относящихся к оценке соответствия, а
также информации о соблюдении ISO принципов WTO относительно Технических барьеров в торговле
(TBT) см. следующую гиперссылку URL: Предисловие – Дополнительная информация
Настоящий документ разработан Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом
SC 5, Биологические методы.
iv © ISO 2013 – Все права сохраняются
Введение
Осаждение в водной среде служит резервуаром-отстойником для сельскохозяйственных,
промышленных и городских загрязнений. Загрязненные отложения оказывают непосредственное
вредное воздействие на донное сообщество и действуют как источник загрязнения для вышележащей
воды, часто также отрицательно влияя на пелагические сообщества. Испытания отложений на
токсичность проводятся в мировом масштабе для определения и мониторинга токсических
воздействий отдельных веществ или сложных смесей, которые могут быть вредными для
существования местных сообществ в водных или донных средах. В настоящем международном
стандарте описываются процедуры для проведения 14-дневных и/или 28-дневных
испытаний осаждений на токсичность с использованием бокоплавов отряда амфиподов Hyalella azteca.
Биологические конечные точки для испытаний включают смертность и рост.
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 16303:2013(R)
Качество воды. Определение токсичности осаждений
пресной воды с использованием Hyalella azteca
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Лица, использующие этот международный стандарт, должны быть
знакомы с нормальной лабораторной практикой. В настоящем международном стандарте не
предусматривается рассмотрение всех проблем безопасности, если таковые имеются,
связанных с его использованием. Пользователь сам должен установить надлежащие
нормативы по технике безопасности и защите здоровья и обеспечить их соответствие
условиям национального регулирования.
ВАЖНО — Абсолютно необходимо, чтобы испытания согласно этой части ISO 13165
проводились соответственно обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения токсичности для молодых
бокоплавов Hyalella azteca в цельном осадке на основе их выживания и замедления роста через
14 дней и/или 28 дней.
Метод применим
a) для проб загрязненного цельного отложения в пресной воде,
b) для химических, промышленных или городских шламов либо других твердых отходов, которые
можно объединить с пресноводными отложениями, и
c) для химикатов или препаратов, введенных в чистое отложение.
Настоящий международный стандарт применяется для испытания проб отложений в пресноводной
среде. Hyalella azteca можно использовать для тестирования в солоноватых водах вплоть до
максимальной солености 15 ‰ при тщательной акклимации. данный международный стандарт не
распространяется на испытания проб отложения в морской и речной устьевой среде с
соленостью > 15 %.
Этот метод представляет 14-дневное и/или 28-дневное испытание на выживание и рост, применяемое
для проб отложений, типы которых описаны выше.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы целиком или частично являются обязательными при
применении данного документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание
документа. Для плавающих ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного
ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 5814, Качество воды. Определение растворенного кислорода. Электрохимический метод с
применением зонда
ISO 6059, Качество воды. Определение суммарного содержания кальция и магния.
Титриметрический метод с применением ЭДТА
ISO 10523, Качество воды. Определение pH
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются условные обозначения, определения, единицы
и сокращения, определенные в ISO 80000-10, ISO/IEC Guide 98-3, и нижеследующие.
3.1
искусственный осадок
artificial sediment
смесь материалов, которые имитируют физические компоненты естественного отложения
Примечание 1 к статье: См. 6.2.1.
3.2
контрольный осадок
control sediment
проба отложения (естественного или искусственного), которая используется для оценки свойств
тестируемых организмов и приемлемости испытания (т.е. чистый осадок)
Примечание 1 к статье: Результаты испытаний контрольного осадка используются для сравнения с реакцией
организмов в загрязненных испытательных осадках и для оценивания валидности испытания.
Примечание 2 к статье: Контрольный осадок используется повседневно для оценки приемлемости испытания (6.2).
3.3
испытательный осадок
test sediment
отдельная порция отложения (собранного в естественных условиях или обогащенного), подлежащая
тестированию для оценки возможных воздействий на бокоплавы, обусловленных загрязнением
3.4
обогащенный осадок
spiked sediment
проба отложения, в которую для тестирования вводится какой-либо материал
3.5
стандартный осадок
reference sediment
проба отложения, собранная в естественных условиях в заданном участке, свойства которого
достаточно соответствуют свойствам проб(ы) испытательного осадка, кроме степени загрязнения
Примечание 1 к статье: Эту пробу часто отбирают на участке, который не подвержен источнику(ам) загрязнения,
но в непосредственной близости от участков, где отбирается испытательная проба. Поэтому результаты
испытания для определения токсичности являются специфичными для участка.
3.6
периодическое обновление
intermittent renewal
испытания, в ходе которых испытательные растворы или вышележащая вода обновляются из-за
ухудшения качества воды
3.7
вышележащая вода
overlying water
вода, расположенная над осадком в испытательной емкости
Примечание 1 к статье: Если необходимо, вышележащая вода также используется для различных процедур с
осадком (например, для приготовления заданного состава или смесей обогащенного осадка).
2 © ISO 2013 – Все права сохраняются
3.8
рост
growth
увеличение сухого веса тестируемых организмов в ходе эксперимента, выраженное как средний сухой
вес в расчете на выжившего бокоплава
4 Сущность метода
Молодые пресноводные бокоплавы, Hyalella azteca, в возрасте от 2 до 9 дней и с варьированием в
пределах от 1 до 2 дней, в группах по 10 организмов подвергаются воздействию загрязненного осадка
.[1] [2] [3
или испытательного осадка с введенной химической добавкой в течение 14 дней и/или 28 дней ] Конечными
точками тестирования являются процент смертности и замедление роста, которые оцениваются
относительно организмов, одновременно подвергаемых воздействию контрольного осадка. Испытание
проводят в стеклянных емкостях при отношении осадка к воде (объем:объем) 1:1,75 или 1:4 (например,.
100 мл осадка и 175 мл вышележащей воды или 100 мл осадка и 400 мл вышележащей воды).
Сравнительные испытания двух рекомендованных пропорций осадок-вода не показали никакой
[ ]
значительной разницы в результатах испытания с использованием Hyalella azteca. Единственное
преимущество соотношения осадка и воды 1:4 состоит в увеличении объема вышележащей воды для
химического анализа. Тестирующее воздействие в основном статическое, если только не применяется
обновление из-за ухудшения качества вышележащей воды контрольного осадка (например, смещение
pH, влияющее на форму фонового аммиака).
Долгосрочный вариант тестирования (т.е. 42 дня) для испытания на токсичность цельного осадка с
использованием Hyalella azteca описан в Приложении E. Конечные точки этого долгосрочного
тестирования включают выживание (28, 35 и 42 дня), рост (28 и 42 дня) и воспроизведение (число
молоди в расчете на женскую особь, полученное за период от 28 до 42 дней).
Метод с использованием только воздействия воды на Hyalella azteca также описан в Приложении F.
Этот метод представляет 14-дневное тестирование выживания и роста молодых бокоплавов,
подвергаемых воздействию проб промышленных или очищенных сточных вод, пресной воды
(например, из водоприемника), водных вытяжек или химических веществ, которые растворимы или
могут поддерживаться как устойчивые суспензии или дисперсии в условиях испытания.
5 Испытательная среда
5.1 Оборудование
Испытательное оборудование должно быть хорошо провентилировано, изолировано от физических
помех и очищено от пыли и газов. Тестирование проводится в термостатированном помещении или
камере, где поддерживается температура (23 ± 2) °C в испытательных емкостях.
5.2 Освещение
Все испытательные емкости должны получать прямое верхнее освещение, которое обеспечивает
нормальную освещенность лаборатории (т.е. 100 лк до 1 000 лк) на границе раздела воздух/вода.
Освещение должно быть равномерным и иметь цикл день/ночь (световой период), составляющий 16 ч
дневного света и 8 ч темноты.
6 Реактивы, испытательные организмы и материалы
Используются только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других установок.
6.1 Испытательный организм
Бокоплавы Hyalella azteca являются эпибентическими детритоядными организмами, которые зарываются в
пресноводное отложение и живут в тесном контакте с его поверхностным слоем на глубине 1 см или 2 см. Они
обитают в озерах, прудах и ручьях зон умеренного климата и широко распространены в Северной и Южной
.[1] [2] [3]
Америке Молодь Hyalella azteca получают из лабораторных культур, которые содержатся при
температурных условиях, световом периоде и кормлении, идентичных для условий испытания. Видовая
идентификация должна быть подтверждена квалифицированным персоналом, имеющим опыт в идентификации
пресноводных бокоплавов на основе различительных таксономических характеристик, описанных в Приложении A
.[2] [5]
и в предыдущих публикациях
.
6.1.1 Возраст и размер
Возраст бокоплавов, используемых для тестирования, должен быть от 2 до 9 дней и не различаться
более чем на 2 дня. Метод для культивирования Hyalella azteca и для получения испытательных
организмов известного возраста представлен в Приложении B. Если рост выражается как средний
размер в конце испытания, среднюю длину организмов следует определять в начале испытания.
6.1.2 Источник
Все бокоплавы, используемые для тестирования, должны быть получены из одной и той же популяции
и одного и того же источника. Источниками животных, которые используются для создания культур,
являются государственные или частные лаборатории, культивирующие Hyalella azteca для испытания
[] [] [ ]
1 2 3
токсичности отложений, или авторитетная биологическая компания-поставщик. Перечень
возможных источников Hyalella azteca приведен в Приложении C.
6.2 Контрольный осадок
Каждый тест токсичности отложения должен включать контроль с использованием как минимум пяти
дублированных испытательных емкостей, содержащих контрольный осадок. Отклики организмов на
воздействие контрольного осадка во время теста обеспечивают измерения для определения
валидности испытания (см. 10.3), подтверждение здоровья и нормального поведения испытательных
организмов и основание для интерпретации данных, полученных при испытании осадков. Контрольный
осадок может быть естественным или искусственным (т.е. приготовленным химическим способом)
отложением.
6.2.1 Естественный осадок
Естественный осадок, взятый из пресной воды или из слегка солоноватого (< 15 ‰) пробоотборного
участка, который удален от известных источников загрязнений и для которого известна процедура
контроля с использованием Hyalella azteca, может быть использован как контрольный осадок для теста
или как чистый материал для введения испытательного химиката. Если поровая вода с осадком имеет
измеримую соленость, испытательная лаборатория должна применять подходящую процедуру
акклимации, чтобы подготовить взрослых Hyalella azteca для использования в качестве организмов-
производителей и обеспечить использование молодых бокоплавов, адаптированных к солености, в
ходе испытания.
6.2.2 Искусственный осадок
Нижеприведенный искусственный осадок может быть использован в качестве контроля для испытаний
отложений пресной воды или как чистый материал для введения испытательного химиката. Этот
рецепт основан на искусственном осадке, рекомендованном в ISO 10872.
Следующие компоненты тщательно перемешивают в заданных пропорциях.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
Доломит (глина): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
4 © ISO 2013 – Все права сохраняются
Кварцевый песок (средний размер частиц 0,063 мм): 30 %
Кварцевый песок (0,1 мм до 0,4 мм): 40 %
Торф (разложившийся торф из верхового болота, необработанный; мелкоразмолотый 4 %
и просеянный через сито < 1 мм):
Существует несколько приемлемых подходов к приготовлению и кондиционированию искусственного
осадка. В общем, при выборе состава для контроля или испытательного осадка должны
рассматриваться следующие атрибуты:
a) поддерживание выживания, роста или воспроизведения разновидностей донных организмов;
b) обеспечение соответствующих приемлемых биологических конечных точек для разнообразных
видов;
c) включение стандартных составляющих, которые легко доступны для испытательных лабораторий;
d) отсутствие концентраций загрязнителей, которые могут оказывать вредное воздействие на
испытательные организмы.
Приемлемые варианты искусственных осадков описаны в руководящем документе по данному вопросу
Министерства окружающей среды Канады, где указаны методы для введения испытательных
[6]
химикатов в осадок.
.
6.3 Вышележащая вода
6.3.1 Естественная пресная вода
Естественная пресная вода включает подачу незагрязненной грунтовой или поверхностной воды. Если
целью испытания является имитация участка в полевых условиях, естественную воду можно
разбавлять дистиллированной или деионизированной водой высокой чистоты, пока не будет
достигнута требуемая жесткость. Вода, взятая с участка, где отбирают отложение, также может быть
использована. Поверхностную воду следует отфильтровать через мелкое сито (например, 30 мкм) для
удаления возможных хищников или конкурентов. Дехлорированная вода не рекомендуется, потому что
ее качество часто бывает весьма изменчивым и она может содержать недопустимо высокие
концентрации хлора, хлораминов, фторида, меди, свинца, цинка или других загрязняющих веществ.
6.3.2 Реконструированная вода
Если реконструированная пресная вода используется как вышележащая вода в тестировании Hyalella
[ ]
azteca, следующая искусственная среда должна быть приготовлена в деионизироованной воде:
CaCl 110,98 мл/л
NaHCO 84,01 мл/л
MgSO 30,09 мл/л
KCl 3,728 мл/л
NaBr 1,029 мл/л
Перед использованием смесь аэрируют в течение 24 ч, чтобы отрегулировать содержание
растворенного кислорода (DO) и стабилизировать pH. Концентрации солей можно отрегулировать
аналогично составу в заданном водоприемнике. Однако соотношение Ca:Br должно поддерживаться
постоянным, потому что эти ионы являются весьма важными для Hyalella azteca и должны
[ ] + −
присутствовать вместе. Ионы Na и HCO наиболее существенны для выживания Hyalella azteca, а
2+ + [ ] [ ]
7 9
Mg и K необходимы для оптимального роста и размножения. Диапазоны для щелочности и
жесткости не определяются ввиду отсутствия подтвержденных данных об их влиянии. Стандартное
использование вышеприведенного рецепта реконструированной воды в культивировании и в качестве
испытательной воды подтвердило приемлемые уровни щелочности и жесткости для Hyalella azteca.
Проводимость, pH, жесткость, DO и щелочность измеряются в каждой партии реконструированной
воды. Данная партия реконструированной воды не должна использоваться дольше 4 недель.
6.3.3 Растворенный кислород
Содержание растворенного кислорода (DO) в воде, расположенной над осадком, идеально должно
составлять от 90 % до 100 % величины насыщения воздухом в начале и на протяжении всего
испытания. Этот уровень DO поддерживается путем мягкой аэрации с использованием
отфильтрованного безмасляного сжатого воздуха. Скорость аэрации не должна приводить к
суспендированию осадка (например, 2 пузырька).
6.4 Кормление
Есть два варианта кормов, которые можно использовать в испытании Hyalella azteca. Доступный для
приобретения готовый рыбный корм, а также инокулят смеси дрожжей, Cerophyll™ и кормов для
форели (YCT), являются подходящими для Hyalella azteca при определенных испытательных
.[1] [2] [3] [10] [11] [12]
условиях
.
Также есть два варианта для частоты кормления. Испытательные организмы кормят или один раз в
день ежедневно, или три раза в неделю еженедельно (не каждый день подряд) на протяжении
испытания. Идентичный пищевой рацион добавляется в каждую испытательную камеру при каждом
[11]
кормлении. Предоставляемый рацион питания должен быть адекватным, чтобы обеспечивать
приемлемые выживание и рост Hyalella azteca в период испытания, но не должен быть избыточным.
6.4.1 Вариант 1: Рыбный корм
Имеющиеся в продаже готовые рыбные корма в виде хлопьев (например, Tetrafin™, Tetramin™ или
Nutrafin™) могут быть использованы как источник пищи для испытательных организмов во время
тестирования. Корм можно измельчать и просеивать через сито, чтобы хлопья были равномерными,
или приготовлять в виде суспензии, смешивая хлопья с чистой водой. Хлопьевидный рыбный корм
следует хранить при комнатной температуре в запечатанной емкости.
Если выбрано ежедневное кормление, то 2,7 мг хлопьев рыбного корма (сухой вес) добавляют в
каждую испытательную емкость в первый день испытания (в день, когда бокоплавов помещают в эти
испытательные емкости) и затем по одному разу каждый день до последнего дня испытания
включительно. Если выбрано трехразовое кормление в неделю, то 6,3 мг хлопьев рыбного корма
(сухой вес) добавляют три раза в неделю (начиная с первого дня испытания) в каждую испытательную
камеру не каждый день подряд (например, по воскресеньям, средам и пятницам) до последнего дня
испытания включительно. Оба рациона обеспечивают примерно одинаковую общую норму кормления;
однако ежедневное кормление, возможно, предпочтительнее, потому что в этом случае пища всегда в
[6]
наличии.
6.4.2 Вариант 2: Дрожжи, Cerophyll™ и корм для форелей (YCT)
В качестве второго варианта рекомендуется также кормовая смесь, основанная на методах испытания
Агентства США по защите окружающей среды (U.S. EPA) и Министерства окружающей среды Канады.
[ ] [ ]
1 2
.
Состав для приготовления YCT приведен в Приложении D. Если выбрано ежедневное кормление, то
3)
1,5 мл инокулята (эквивалент 2,7 мг рыбного корма, сухой вес) смеси дрожжей, Cerophyll™ и
форелевый корм добавляют в каждую испытательную емкость в первый день испытания (в день, когда
Cerophyll™ может быть получен от Ward's Scientific как "Cereal Grass Media - Cerophyll" (питательная среда из
зерновых культур). Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
Tetrafin™, Tetramin™ и Nutrafin™ являются примерами рыбных кормов в виде хлопьев, доступных для
приобретения. Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
Cerophyll™ может быть получен из Ward's Scientific как "Cereal Grass Media - Cerophyll" (питательная среда из
зерновых культур). Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
6 © ISO 2013 – Все права сохраняются
бокоплавов помещают в эти испытательные емкости) и затем по одному разу каждый день до
последнего дня испытания включительно. Если выбрано трехразовое кормление в неделю, то 3,5 мл
YCT (эквивалент ~ 6,3 мг рыбного корма, сухой вес) добавляют три раза в неделю (начиная с первого
дня испытания) в каждую испытательную камеру не каждый день подряд (например, по воскресеньям,
средам и пятницам) до последнего дня испытания включительно. Оба рациона обеспечивают
примерно одинаковую общую норму кормления; однако ежедневное кормление, возможно,
предпочтительнее, потому что в этом случае пища всегда в наличии.
YCT можно хранить в замороженном виде. Растаявшие аликвоты неиспользованных YCT можно
хранить в темноте при (4 ± 3) °C, но через 14 дней их следует выбросить.
6.5 Стандартное вещество
Хлорид кадмия (CdCl ), сульфат меди (CuSO ), хлорид натрия (NaCl) и хлорид калия (KCl) - все
2 4
[ ] [ ] [ ] [ ]
1 2 3 10
являются приемлемыми стандартными веществами. Перед их использованием лабораторный
персонал при необходимости может пользоваться Паспортом безопасности материалов (MSDS)
относительно этих веществ.
7 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование для культивирования организмов и испытания.
7.1 Термостатированное помещение, камера с регулированием температуры или водяная
баня
Выбранная система должна поддерживать в испытательных емкостях температуру (23 ± 2) °C.
7.2 Измерительные приборы
Используются приборы для измерения DO, pH, жесткости, проводимости, щелочности, аммиака,
интенсивности освещения и температуры согласно ISO 10523, ISO 5814 и ISO 6059.
7.3 Испытательные емкости
Все емкости и принадлежности, например сита, которые могут контактировать с организмами,
контрольным или испытательным осадком и вышележащей водой во время сортировки,
манипулирования и испытаний, должны быть изготовлены из нетоксичных материалов (например, из
)
стекла, нержавеющей стали, нейлона Nalgene™ , фарфора, полиэтилена, полипропилена,
стекловолокна), очищенных и промытых водой, дистиллированной, деионизироованной,
дехлорированной лабораторной, реконструированной или естественной из незагрязненного источника.
Такие материалы, как медь, цинк, латунь, оцинкованный металл, свинец и натуральный каучук не
должны вступать в контакт с этими приборами и оборудованием или с пробами контрольного,
стандартного или испытательного осадка, вышележащей водой или испытательными емкостями.
Перед началом испытания необходимо обеспечить, чтобы все испытательные емкости и
соответствующее лабораторное оборудование были чистыми и не имели никаких загрязнений от
предыдущего использования.
В качестве испытательных сосудов рекомендуются стеклянные емкости (лабораторные стаканы или
широкогорлые сосуды) с внутренним диаметром примерно от 7 см до 10 см и объемом от 300 мл до
1000 мл. Испытательная емкость должна быть пригодной для помещения осадка толщиной от 1,5 см
до 2,5 см и отношения осадка к воде (объем:объем) 1:1,75 или 1:4. Каждую испытательную емкость
можно закрыть стеклянной или пластиковой крышкой, чтобы уменьшить возможность загрязнения
содержимого, уменьшить испарение и минимизировать потерю летучих веществ из осадка.
Nalgene™ является примером подходящего продукта, доступного для приобретения. Эта информация дается
только для удобства пользователей данного документа и не является рекомендацией этого продукта от ISO.
Перед использованием емкости промывают вышележащей водой (6.3) или деионизироованной либо
дистиллированной водой.
7.4 Устройство, для проведения аэрации в каждой испытательной емкости во время испытания,
если необходимо.
7.5 Пипетка, для переноса Hyalella azteca, с диаметром отверстия от 5 мм до 6 мм, чтобы
улавливать животных, допуская при этом перенос только небольшого объема воды.
7.6 Бинокулярное увеличительное стекло или препаровальная лупа, с увеличением не менее
7,5 X.
7.7 Сито(а), например 300 мкм или 425 мкм, для извлечения Hyalella azteca из осадка в конце
испытания.
7.8 Сушильный шкаф, обеспечивающий сушку испытательных организмов при 60 °C до 90 °C в
течение 24 ч перед взвешиванием.
7.9 Эксикатор, для удерживания высушенных испытательных организмов в конце испытания во
время взвешивания.
7.10 Весы, обеспечивающие измерение Hyalella azteca с точностью до 10 мкг.
8 Обработка и подготовка проб
8.1 Общие вопросы
Отбирают осадок в полевых условиях на стандартном, контрольном и испытательном участках
согласно установленным инструкциям (см. ISO 5667-16 и Ссылки [1], [5], [10], [13], [14], [15] и [16]) или, если
.[2] [5] [13] [15]
требуется, добавляют тестовый химикат или препарат к пробе контрольного осадка. В
исследованиях, специфических для данного участка, для испытательных и стандартных осадков должны
использоваться аналогичные процедуры отбора проб отложений и обращения с ними. Емкости для
проб изготовляют из инертного, нетоксического материала, они должны быть новые или тщательно
очищенные. Емкости для проб полностью заполняют, чтобы исключить воздух, немедленно
запечатывают и маркируют или кодируют. Хранят запечатанные емкости с отобранными осадками в
темноте при (4 ± 2) °C, пока они не потребуются для испытания на токсичность. Сушка, замораживание
и холодное хранение - все это влияет на токсичность и биодоступность химикатов в осадке. Начинают
испытание осадков по возможности без промедления, чтобы сохранить химическую целостность, но
предпочтительно в течение 5 дней и не позднее 30 дней, если химическая стабильность не может быть
гарантирована. Можно провести анализ известных химических загрязнителей на пробах отложений,
отобранных в полевых условиях, и результаты сравнить с анализом осадков в начале и конце
испытания, чтобы определить количественно любые изменения химической концентрации или формы.
8.2 Испытательный осадок
Осадок для испытания отбирают на заданном участке с использованием такого оборудования, как
колонковые буры (например, керновый ящик, Phleger) или черпаковые устройства (например,. Ekman,
Ponar, Van Veen, Petersen, Shipek, Kajak-Brinkhurst). Осадок берут из середины пробоотборника,
которая не контактирует с оборудованием. Обычно собирают верхнюю часть осадка от 2 см до 4 см,
представляющую аэробную зону, и объединяют достаточное количество проб участка для
удовлетворения потребностей тестирования. Для проведения испытания Hyalella azteca на токсичность
обычно требуется несколько литров (т.е. от 5 л до 7 л) осадка; однако количество требуемого осадка
будет зависеть от целей и проектирования исследования, а также от характера химических анализов,
которые должны быть выполнены. Чтобы получить достаточное количество осадка, часто бывает
необходимо объединять подпробы, извлеченные с использованием пробоотборника. Для химических
анализов переносят осадок предварительно очищенным черпаком в инертную емкость и
перемешивают составленную пробу до тех пор, пока ее цвет и текстура не станут однородными.
Хранят смешанную пробу в чистой емкости из бутылочного стекла (если подозревается присутствие
8 © ISO 2013 – Все права сохраняются
органических загрязнителей) или в чистой емкости из полиэтилена высокой плотности или
поликарбоната (если предполагается присутствие металлических загрязнителей). Наполняют емкости
согласно их вместимости и отправляют в лабораторию при (4 ± 2) °C.
Оборудование, используемое на разных участках, следует очищать, чтобы предотвратить
перекрестное загрязнение. Отходы очистки растворителем следует сохранять и возвращать в
лаборатории для ликвидации.
8.3 Подготовка проб осадков
Большие обломки пород (> 1 см) и местные организмы удаляют вручную, используя щипцы, пинцеты
или аналогичные инструменты. Влажное просеивание осадка не рекомендуется, потому что могут быть
потеряны водорастворимые загрязнители и мелкие неоседающие глинистые частицы. Перед
[,[1] [2] [14] 15]
использованием каждую пробу отложения гомогенизируют в лаборатории если для объектов
исследования не требуются иные меры. Непосредственно после смешивания проб извлекают
подпробы испытательного материала для химического и физического анализов, помещают их в
маркированные емкости и хранят надлежащим образом для физико-химических исследований.
Химическое и физическое описание пробы отложения необходимо для интерпретации результатов.
Анализируют подпробу испытательного и стандартного осадков для определения:
гранулометрического состава [процент гравия (> 2 мм), крупнозернистого и мелкозернистого песка
(≤ 2 мм до > 0,063 мм), ила (≤ 0,063 мм до > 0,004 мм) и глины (< 0,004 мм)], процентного содержания
воды, общего содержания органического углерода (TOC), pH поровой воды, аммиака в поровой воде
[1] [2] [3] [10]
(общие и ионизированные концентрации). Дополнительное описание может включать общее
содержание неорганического углерода и летучих веществ, биохимическую и химическую потребность в
кислороде, катионообменную емкость, кислотные летучие сульфиды, металлы, синтетические
органические соединения, масло и смазки, нефтяные углеводороды.[2] Пробы поровой воды можно
также отбирать и анализировать для определения растворенных загрязнителей. Пробы поровой воды
могут быть получены из контрольного или стандартного осадка методами in situ (например, зонды) или
[13] [14] [15]
методами ex situ (например, центрифугирование или нагнетание).
.
Если целью исследования является введение в осадок химиката или препарата, то можно обратиться
к описанию процедур, которые объясняют шаги, включенные в обогащение осадка, гомогенизацию,
химическое равновесие, использование химического растворителя, верификацию и анализ данных (см.
Ссылки [1], [2], [5], [13] и [15]). Однако для настоящего международного стандарта рекомендуется
процедура влажного обогащения осадка, которая предпочитается методам сухого обогащения, так как
оно может привести к потерям испытательного химиката. Испытательный химикат или вещество
вводится в осадок или непосредственно, или путем использования комбинации осадок: водяная
суспензия перед добавлением вышележащей воды. Требуется период равновесия, чтобы дать время
для стабилизации концентрации тестового химиката в поровых пространствах воды в осадке.
Продолжительность этого равновесия в значительной степени зависит от природы тестового химиката
и типа осадка (например, период равновесия в песчаном осадке будет меньше, чем в осадке со
значительным содержанием глины; неорганические соли уравновешиваются за меньший период
времени, чем полярное органическое соединение).
Собирают имеющуюся информацию о свойствах химиката или вещества, подлежащего тестированию.
Она включает концентрацию основных ингредиентов и примесей, водорастворимость, константы
диссоциации, токсичность для человека и водных организмов и склонность к биологическому
разложению. Дополнительную информацию, такую как структурные формулы, характер и процентное
содержание значительных примесей, присутствие и количество добавок и коэффициент
распределения n-октанол:вода, также получают, если она имеется. Есть три способа для введения
химикатов в контрольный осадок: 1) влажный метод с использованием валковой мельницы,[16] 2) влажный метод
.[18] [19] [20]
с использованием суспензии,[17] или 3) метод суспендирования осадка Выбранный метод зависит от
.[5]
целей исследования и от характера тестируемого химиката или материала
.
Если для растворения тестируемого химиката и сохранения его в растворе необходимо использование
органического растворителя помимо воды, то тестируемую концентрацию вводят непосредственно в
контрольный осадок, и носитель растворителя испаряется перед добавлением вышележащей воды.
Контрольный осадок только с растворителем готовят и испытывают одновременно с обработками
испытательного осадка. Контрольный осадок только с растворителем должен содержать самую
высокую концентрацию растворителя, используемого в приготовлении образцов испытательного
[5]
осадка.
9 Процедура испытания
9.1 Приготовление испытательных емкостей
Тщательно перемешивают каждую пробу осадка в день, предшествующий испытанию, и добавляют
аликвоту осадка в каждую испытательную емкость (например, 100 мл). Распределяют испытательный
осадок в однородный слой, который позволяет бокоплавам зарываться в нем (минимум 1,5 см
глубиной). Готовят не менее пяти лабораторных дубликатов для каждой обработки или каждого
испытательного образца и периода измерения роста (т.е. на 14-й день и на 28-й день), добавляя при
необходимости один или более дубликатов на обработку для мониторинга химических свойств осадка
и вышележащей воды во время испытания. Дубликаты, установленные для мониторинга химических
свойств, должны обеспечиваться бокоплавами, как и другие тестовые дубликаты.
Выравнивают поверхность осадка, делая ее плоской в каждой емкости, и принимают меры для
обеспечения минимума нарушений испытательного или контрольного осадка во время добавления
вышележащей воды. Одним из способов для минимизации повреждения осадка является наливание
воды на диск [полиэтиленовый, нейлоновый или политетрафторэтиленовый (PTFE) защитный лист
толщиной от 4 мм до 6 мм], лежащий на поверхности осадка и соответствующий внутреннему диаметру
.[1] [3]
испытательной емкости Вышележащая вода добавляется в каждую испытательную емкость, так чтобы
соотношение осадок: вода было 1:1,75 или 1:4. Диск удаляют и промывают вышележащей водой для
всех дубликатов образца. Отдельный чистый диск используется для каждой обработки. Воду,
расположенную над осадком в каждой испытательной емкости, следует обновлять в день,
предшествующий испытанию, так же как и на протяжении всего испытания (9.4).
Образцы для обработки следует размещать таким образом, чтобы за бокоплавами было обеспечено
простое наблюдение. Предпочтительно, чтобы тестовые добавки помещались в случайном порядке
или в случайном распределении блоков с одной дубликатной добавкой в каждом блоке.
9.2 Введение организмов
Начинают испытание токсичности, помещая 10 особей Hyalella azteca в каждую испытательную
емкость (т.е. 10 бокоплавов в расчете на дубликат каждой обработки).
Отбирают отдельные бокоплавы произвольно из емкости с культурой известного возраста (см. B.3),
используя пипетку или другое подходящее устройство, и распределяют их непосредственно в
испытательных емкостях. Бокоплавы помещаются ниже границы раздела воздух/вода в вышележащей
воде. Альтернативно 10 бокоплавов можно отсчитать в передаточную камеру (например, 30-мл
пластиковую чашку), наполненную вышележащей водой, и затем пересчитать перед помещением в
испытательные емкости. Бокоплавы вместе с водой переносят в испытательную камеру путем
плавного переливания из сортировочной чашки. Используют диск, как описано в 9.1, для
предотвращения нарушения осадка. Смывают все оставшиеся в чашке бокоплавы в испытательную
емкость, используя больше вышележащей воды. Увеличивают объем в испытательной емкости до
подходящего уровня (вода плюс осадок), при необходимости убирают диск и закрывают
испытательные емкости крышками, если они применяются. Так как используются дубликатные емкости,
то бокоплавы следует добавлять в одно и то же время в каждый набор или блок испытательных
емкостей, представляющих каждую обработку согласно случайному распределению блоков.
Заменяют тех бокоплавов, которые не погрузились в осадок в течение 1 ч, если только не видно, что
они многократно зарываются в осадок и немедленно всплывают, для избежания реакции на
испытательный субстрат. Бокоплавов, показывающих эту реакцию избегания в течение первого часа
испытания, не следует заменять.
10 © ISO 2013 – Все права сохраняются
--
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 16303
Первое издание
2013-12-01
Качество воды. Определение
токсичности осаждений пресной воды
с использованием Hyalella azteca
Water quality —Determination of toxicity of fresh water sediments using
Hyalella azteca
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2013
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2013
Все права сохраняются. Если не задано иначе, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия офиса ISO по адресу, указанному ниже, или членов ISO в стране регистрации
пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2013 – Все права сохраняются
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.3
5 Испытательная среда.3
5.1 Оборудование .3
5.2 Освещение.3
6 Реактивы, испытательные организмы и материалы.3
6.1 Испытательный организм.3
6.2 Контрольный осадок .4
6.3 Вышележащая вода.5
6.4 Кормление .6
6.5 Стандартное вещество.7
7 Оборудование .7
8 Обработка и подготовка проб.8
8.1 Общие вопросы.8
8.2 Испытательный осадок.8
8.3 Подготовка проб осадков .9
9 Процедура испытания .10
9.1 Приготовление испытательных емкостей.10
9.2 Введение организмов .10
9.3 Условия испытания.11
9.4 Обновление вышележащей воды .11
9.5 Тестовые наблюдения и измерения.11
10 Выражение результатов .12
10.1 Выживание.12
10.2 Рост .12
10.3 Валидность теста.12
11 Анализ и интерпретация результатов.12
11.1 Анализ данных .12
11.2 Факторы, не относящиеся к загрязнению .13
12 Стандартное вещество.13
12.1 Тест только с водой .14
12.2 Испытание цельного осадка .14
13 Протокол испытания.14
Приложение А (информативное) Описание Hyalella azteca.16
Приложение В (информативное) Культивирование Hyalella azteca.18
Приложение С (информативное) Источники Hyalella azteca .20
Приложение D (нормативное) Процедура для приготовления комбинированных кормов YCT.22
Приложение Е (информативное) 42-дневное испытание осадка на размножение .23
Приложение F (информативное) 14-дневный тест только с водой на выживание и рост .24
Приложение G (информативное) Рабочие результаты .25
Библиография.26
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является Всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, ISO
работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Процедуры, используемые для разработки настоящего документа, и процедуры, предназначенные для
его дальнейшего ведения, описаны в Директивах ISO/IEC, Часть 1. В частности, следует отметить
различные критерии одобрения для различных типов документов ISO. Проект данного документа был
разработан по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC, Часть 2 (см. www.iso.org/directives).
Обращается внимание на то, что некоторые элементы данного документа могут быть объектом
патентных прав. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо одного или всех таких
патентных прав. Детали любых патентных прав, установленные в процессе подготовки этого
документа, будут указаны во Введении и/или в списке патентных заявок, полученных ISO (см.
www.iso.org/patents).
Любое фирменное название, используемое в этом документе, указывается только как информация для
удобства пользователей и не является рекомендацией.
Для объяснения специфических терминов ISO и выражений, относящихся к оценке соответствия, а
также информации о соблюдении ISO принципов WTO относительно Технических барьеров в торговле
(TBT) см. следующую гиперссылку URL: Предисловие – Дополнительная информация
Настоящий документ разработан Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом
SC 5, Биологические методы.
iv © ISO 2013 – Все права сохраняются
Введение
Осаждение в водной среде служит резервуаром-отстойником для сельскохозяйственных,
промышленных и городских загрязнений. Загрязненные отложения оказывают непосредственное
вредное воздействие на донное сообщество и действуют как источник загрязнения для вышележащей
воды, часто также отрицательно влияя на пелагические сообщества. Испытания отложений на
токсичность проводятся в мировом масштабе для определения и мониторинга токсических
воздействий отдельных веществ или сложных смесей, которые могут быть вредными для
существования местных сообществ в водных или донных средах. В настоящем международном
стандарте описываются процедуры для проведения 14-дневных и/или 28-дневных
испытаний осаждений на токсичность с использованием бокоплавов отряда амфиподов Hyalella azteca.
Биологические конечные точки для испытаний включают смертность и рост.
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 16303:2013(R)
Качество воды. Определение токсичности осаждений
пресной воды с использованием Hyalella azteca
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Лица, использующие этот международный стандарт, должны быть
знакомы с нормальной лабораторной практикой. В настоящем международном стандарте не
предусматривается рассмотрение всех проблем безопасности, если таковые имеются,
связанных с его использованием. Пользователь сам должен установить надлежащие
нормативы по технике безопасности и защите здоровья и обеспечить их соответствие
условиям национального регулирования.
ВАЖНО — Абсолютно необходимо, чтобы испытания согласно этой части ISO 13165
проводились соответственно обученным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения токсичности для молодых
бокоплавов Hyalella azteca в цельном осадке на основе их выживания и замедления роста через
14 дней и/или 28 дней.
Метод применим
a) для проб загрязненного цельного отложения в пресной воде,
b) для химических, промышленных или городских шламов либо других твердых отходов, которые
можно объединить с пресноводными отложениями, и
c) для химикатов или препаратов, введенных в чистое отложение.
Настоящий международный стандарт применяется для испытания проб отложений в пресноводной
среде. Hyalella azteca можно использовать для тестирования в солоноватых водах вплоть до
максимальной солености 15 ‰ при тщательной акклимации. данный международный стандарт не
распространяется на испытания проб отложения в морской и речной устьевой среде с
соленостью > 15 %.
Этот метод представляет 14-дневное и/или 28-дневное испытание на выживание и рост, применяемое
для проб отложений, типы которых описаны выше.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные нормативные документы целиком или частично являются обязательными при
применении данного документа. Для жестких ссылок применяется только цитированное издание
документа. Для плавающих ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного
ссылочного документа (включая любые изменения).
ISO 5814, Качество воды. Определение растворенного кислорода. Электрохимический метод с
применением зонда
ISO 6059, Качество воды. Определение суммарного содержания кальция и магния.
Титриметрический метод с применением ЭДТА
ISO 10523, Качество воды. Определение pH
3 Термины и определения
Применительно к настоящему документу используются условные обозначения, определения, единицы
и сокращения, определенные в ISO 80000-10, ISO/IEC Guide 98-3, и нижеследующие.
3.1
искусственный осадок
artificial sediment
смесь материалов, которые имитируют физические компоненты естественного отложения
Примечание 1 к статье: См. 6.2.1.
3.2
контрольный осадок
control sediment
проба отложения (естественного или искусственного), которая используется для оценки свойств
тестируемых организмов и приемлемости испытания (т.е. чистый осадок)
Примечание 1 к статье: Результаты испытаний контрольного осадка используются для сравнения с реакцией
организмов в загрязненных испытательных осадках и для оценивания валидности испытания.
Примечание 2 к статье: Контрольный осадок используется повседневно для оценки приемлемости испытания (6.2).
3.3
испытательный осадок
test sediment
отдельная порция отложения (собранного в естественных условиях или обогащенного), подлежащая
тестированию для оценки возможных воздействий на бокоплавы, обусловленных загрязнением
3.4
обогащенный осадок
spiked sediment
проба отложения, в которую для тестирования вводится какой-либо материал
3.5
стандартный осадок
reference sediment
проба отложения, собранная в естественных условиях в заданном участке, свойства которого
достаточно соответствуют свойствам проб(ы) испытательного осадка, кроме степени загрязнения
Примечание 1 к статье: Эту пробу часто отбирают на участке, который не подвержен источнику(ам) загрязнения,
но в непосредственной близости от участков, где отбирается испытательная проба. Поэтому результаты
испытания для определения токсичности являются специфичными для участка.
3.6
периодическое обновление
intermittent renewal
испытания, в ходе которых испытательные растворы или вышележащая вода обновляются из-за
ухудшения качества воды
3.7
вышележащая вода
overlying water
вода, расположенная над осадком в испытательной емкости
Примечание 1 к статье: Если необходимо, вышележащая вода также используется для различных процедур с
осадком (например, для приготовления заданного состава или смесей обогащенного осадка).
2 © ISO 2013 – Все права сохраняются
3.8
рост
growth
увеличение сухого веса тестируемых организмов в ходе эксперимента, выраженное как средний сухой
вес в расчете на выжившего бокоплава
4 Сущность метода
Молодые пресноводные бокоплавы, Hyalella azteca, в возрасте от 2 до 9 дней и с варьированием в
пределах от 1 до 2 дней, в группах по 10 организмов подвергаются воздействию загрязненного осадка
.[1] [2] [3
или испытательного осадка с введенной химической добавкой в течение 14 дней и/или 28 дней ] Конечными
точками тестирования являются процент смертности и замедление роста, которые оцениваются
относительно организмов, одновременно подвергаемых воздействию контрольного осадка. Испытание
проводят в стеклянных емкостях при отношении осадка к воде (объем:объем) 1:1,75 или 1:4 (например,.
100 мл осадка и 175 мл вышележащей воды или 100 мл осадка и 400 мл вышележащей воды).
Сравнительные испытания двух рекомендованных пропорций осадок-вода не показали никакой
[ ]
значительной разницы в результатах испытания с использованием Hyalella azteca. Единственное
преимущество соотношения осадка и воды 1:4 состоит в увеличении объема вышележащей воды для
химического анализа. Тестирующее воздействие в основном статическое, если только не применяется
обновление из-за ухудшения качества вышележащей воды контрольного осадка (например, смещение
pH, влияющее на форму фонового аммиака).
Долгосрочный вариант тестирования (т.е. 42 дня) для испытания на токсичность цельного осадка с
использованием Hyalella azteca описан в Приложении E. Конечные точки этого долгосрочного
тестирования включают выживание (28, 35 и 42 дня), рост (28 и 42 дня) и воспроизведение (число
молоди в расчете на женскую особь, полученное за период от 28 до 42 дней).
Метод с использованием только воздействия воды на Hyalella azteca также описан в Приложении F.
Этот метод представляет 14-дневное тестирование выживания и роста молодых бокоплавов,
подвергаемых воздействию проб промышленных или очищенных сточных вод, пресной воды
(например, из водоприемника), водных вытяжек или химических веществ, которые растворимы или
могут поддерживаться как устойчивые суспензии или дисперсии в условиях испытания.
5 Испытательная среда
5.1 Оборудование
Испытательное оборудование должно быть хорошо провентилировано, изолировано от физических
помех и очищено от пыли и газов. Тестирование проводится в термостатированном помещении или
камере, где поддерживается температура (23 ± 2) °C в испытательных емкостях.
5.2 Освещение
Все испытательные емкости должны получать прямое верхнее освещение, которое обеспечивает
нормальную освещенность лаборатории (т.е. 100 лк до 1 000 лк) на границе раздела воздух/вода.
Освещение должно быть равномерным и иметь цикл день/ночь (световой период), составляющий 16 ч
дневного света и 8 ч темноты.
6 Реактивы, испытательные организмы и материалы
Используются только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других установок.
6.1 Испытательный организм
Бокоплавы Hyalella azteca являются эпибентическими детритоядными организмами, которые зарываются в
пресноводное отложение и живут в тесном контакте с его поверхностным слоем на глубине 1 см или 2 см. Они
обитают в озерах, прудах и ручьях зон умеренного климата и широко распространены в Северной и Южной
.[1] [2] [3]
Америке Молодь Hyalella azteca получают из лабораторных культур, которые содержатся при
температурных условиях, световом периоде и кормлении, идентичных для условий испытания. Видовая
идентификация должна быть подтверждена квалифицированным персоналом, имеющим опыт в идентификации
пресноводных бокоплавов на основе различительных таксономических характеристик, описанных в Приложении A
.[2] [5]
и в предыдущих публикациях
.
6.1.1 Возраст и размер
Возраст бокоплавов, используемых для тестирования, должен быть от 2 до 9 дней и не различаться
более чем на 2 дня. Метод для культивирования Hyalella azteca и для получения испытательных
организмов известного возраста представлен в Приложении B. Если рост выражается как средний
размер в конце испытания, среднюю длину организмов следует определять в начале испытания.
6.1.2 Источник
Все бокоплавы, используемые для тестирования, должны быть получены из одной и той же популяции
и одного и того же источника. Источниками животных, которые используются для создания культур,
являются государственные или частные лаборатории, культивирующие Hyalella azteca для испытания
[] [] [ ]
1 2 3
токсичности отложений, или авторитетная биологическая компания-поставщик. Перечень
возможных источников Hyalella azteca приведен в Приложении C.
6.2 Контрольный осадок
Каждый тест токсичности отложения должен включать контроль с использованием как минимум пяти
дублированных испытательных емкостей, содержащих контрольный осадок. Отклики организмов на
воздействие контрольного осадка во время теста обеспечивают измерения для определения
валидности испытания (см. 10.3), подтверждение здоровья и нормального поведения испытательных
организмов и основание для интерпретации данных, полученных при испытании осадков. Контрольный
осадок может быть естественным или искусственным (т.е. приготовленным химическим способом)
отложением.
6.2.1 Естественный осадок
Естественный осадок, взятый из пресной воды или из слегка солоноватого (< 15 ‰) пробоотборного
участка, который удален от известных источников загрязнений и для которого известна процедура
контроля с использованием Hyalella azteca, может быть использован как контрольный осадок для теста
или как чистый материал для введения испытательного химиката. Если поровая вода с осадком имеет
измеримую соленость, испытательная лаборатория должна применять подходящую процедуру
акклимации, чтобы подготовить взрослых Hyalella azteca для использования в качестве организмов-
производителей и обеспечить использование молодых бокоплавов, адаптированных к солености, в
ходе испытания.
6.2.2 Искусственный осадок
Нижеприведенный искусственный осадок может быть использован в качестве контроля для испытаний
отложений пресной воды или как чистый материал для введения испытательного химиката. Этот
рецепт основан на искусственном осадке, рекомендованном в ISO 10872.
Следующие компоненты тщательно перемешивают в заданных пропорциях.
Al O : 20 %
2 3
CaCO : 1 %
Доломит (глина): 0,5 %
Fe O : 4,5 %
2 3
4 © ISO 2013 – Все права сохраняются
Кварцевый песок (средний размер частиц 0,063 мм): 30 %
Кварцевый песок (0,1 мм до 0,4 мм): 40 %
Торф (разложившийся торф из верхового болота, необработанный; мелкоразмолотый 4 %
и просеянный через сито < 1 мм):
Существует несколько приемлемых подходов к приготовлению и кондиционированию искусственного
осадка. В общем, при выборе состава для контроля или испытательного осадка должны
рассматриваться следующие атрибуты:
a) поддерживание выживания, роста или воспроизведения разновидностей донных организмов;
b) обеспечение соответствующих приемлемых биологических конечных точек для разнообразных
видов;
c) включение стандартных составляющих, которые легко доступны для испытательных лабораторий;
d) отсутствие концентраций загрязнителей, которые могут оказывать вредное воздействие на
испытательные организмы.
Приемлемые варианты искусственных осадков описаны в руководящем документе по данному вопросу
Министерства окружающей среды Канады, где указаны методы для введения испытательных
[6]
химикатов в осадок.
.
6.3 Вышележащая вода
6.3.1 Естественная пресная вода
Естественная пресная вода включает подачу незагрязненной грунтовой или поверхностной воды. Если
целью испытания является имитация участка в полевых условиях, естественную воду можно
разбавлять дистиллированной или деионизированной водой высокой чистоты, пока не будет
достигнута требуемая жесткость. Вода, взятая с участка, где отбирают отложение, также может быть
использована. Поверхностную воду следует отфильтровать через мелкое сито (например, 30 мкм) для
удаления возможных хищников или конкурентов. Дехлорированная вода не рекомендуется, потому что
ее качество часто бывает весьма изменчивым и она может содержать недопустимо высокие
концентрации хлора, хлораминов, фторида, меди, свинца, цинка или других загрязняющих веществ.
6.3.2 Реконструированная вода
Если реконструированная пресная вода используется как вышележащая вода в тестировании Hyalella
[ ]
azteca, следующая искусственная среда должна быть приготовлена в деионизироованной воде:
CaCl 110,98 мл/л
NaHCO 84,01 мл/л
MgSO 30,09 мл/л
KCl 3,728 мл/л
NaBr 1,029 мл/л
Перед использованием смесь аэрируют в течение 24 ч, чтобы отрегулировать содержание
растворенного кислорода (DO) и стабилизировать pH. Концентрации солей можно отрегулировать
аналогично составу в заданном водоприемнике. Однако соотношение Ca:Br должно поддерживаться
постоянным, потому что эти ионы являются весьма важными для Hyalella azteca и должны
[ ] + −
присутствовать вместе. Ионы Na и HCO наиболее существенны для выживания Hyalella azteca, а
2+ + [ ] [ ]
7 9
Mg и K необходимы для оптимального роста и размножения. Диапазоны для щелочности и
жесткости не определяются ввиду отсутствия подтвержденных данных об их влиянии. Стандартное
использование вышеприведенного рецепта реконструированной воды в культивировании и в качестве
испытательной воды подтвердило приемлемые уровни щелочности и жесткости для Hyalella azteca.
Проводимость, pH, жесткость, DO и щелочность измеряются в каждой партии реконструированной
воды. Данная партия реконструированной воды не должна использоваться дольше 4 недель.
6.3.3 Растворенный кислород
Содержание растворенного кислорода (DO) в воде, расположенной над осадком, идеально должно
составлять от 90 % до 100 % величины насыщения воздухом в начале и на протяжении всего
испытания. Этот уровень DO поддерживается путем мягкой аэрации с использованием
отфильтрованного безмасляного сжатого воздуха. Скорость аэрации не должна приводить к
суспендированию осадка (например, 2 пузырька).
6.4 Кормление
Есть два варианта кормов, которые можно использовать в испытании Hyalella azteca. Доступный для
приобретения готовый рыбный корм, а также инокулят смеси дрожжей, Cerophyll™ и кормов для
форели (YCT), являются подходящими для Hyalella azteca при определенных испытательных
.[1] [2] [3] [10] [11] [12]
условиях
.
Также есть два варианта для частоты кормления. Испытательные организмы кормят или один раз в
день ежедневно, или три раза в неделю еженедельно (не каждый день подряд) на протяжении
испытания. Идентичный пищевой рацион добавляется в каждую испытательную камеру при каждом
[11]
кормлении. Предоставляемый рацион питания должен быть адекватным, чтобы обеспечивать
приемлемые выживание и рост Hyalella azteca в период испытания, но не должен быть избыточным.
6.4.1 Вариант 1: Рыбный корм
Имеющиеся в продаже готовые рыбные корма в виде хлопьев (например, Tetrafin™, Tetramin™ или
Nutrafin™) могут быть использованы как источник пищи для испытательных организмов во время
тестирования. Корм можно измельчать и просеивать через сито, чтобы хлопья были равномерными,
или приготовлять в виде суспензии, смешивая хлопья с чистой водой. Хлопьевидный рыбный корм
следует хранить при комнатной температуре в запечатанной емкости.
Если выбрано ежедневное кормление, то 2,7 мг хлопьев рыбного корма (сухой вес) добавляют в
каждую испытательную емкость в первый день испытания (в день, когда бокоплавов помещают в эти
испытательные емкости) и затем по одному разу каждый день до последнего дня испытания
включительно. Если выбрано трехразовое кормление в неделю, то 6,3 мг хлопьев рыбного корма
(сухой вес) добавляют три раза в неделю (начиная с первого дня испытания) в каждую испытательную
камеру не каждый день подряд (например, по воскресеньям, средам и пятницам) до последнего дня
испытания включительно. Оба рациона обеспечивают примерно одинаковую общую норму кормления;
однако ежедневное кормление, возможно, предпочтительнее, потому что в этом случае пища всегда в
[6]
наличии.
6.4.2 Вариант 2: Дрожжи, Cerophyll™ и корм для форелей (YCT)
В качестве второго варианта рекомендуется также кормовая смесь, основанная на методах испытания
Агентства США по защите окружающей среды (U.S. EPA) и Министерства окружающей среды Канады.
[ ] [ ]
1 2
.
Состав для приготовления YCT приведен в Приложении D. Если выбрано ежедневное кормление, то
3)
1,5 мл инокулята (эквивалент 2,7 мг рыбного корма, сухой вес) смеси дрожжей, Cerophyll™ и
форелевый корм добавляют в каждую испытательную емкость в первый день испытания (в день, когда
Cerophyll™ может быть получен от Ward's Scientific как "Cereal Grass Media - Cerophyll" (питательная среда из
зерновых культур). Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
Tetrafin™, Tetramin™ и Nutrafin™ являются примерами рыбных кормов в виде хлопьев, доступных для
приобретения. Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
Cerophyll™ может быть получен из Ward's Scientific как "Cereal Grass Media - Cerophyll" (питательная среда из
зерновых культур). Эта информация дается только для удобства пользователей данного документа и не является
рекомендацией этого продукта от ISO.
6 © ISO 2013 – Все права сохраняются
бокоплавов помещают в эти испытательные емкости) и затем по одному разу каждый день до
последнего дня испытания включительно. Если выбрано трехразовое кормление в неделю, то 3,5 мл
YCT (эквивалент ~ 6,3 мг рыбного корма, сухой вес) добавляют три раза в неделю (начиная с первого
дня испытания) в каждую испытательную камеру не каждый день подряд (например, по воскресеньям,
средам и пятницам) до последнего дня испытания включительно. Оба рациона обеспечивают
примерно одинаковую общую норму кормления; однако ежедневное кормление, возможно,
предпочтительнее, потому что в этом случае пища всегда в наличии.
YCT можно хранить в замороженном виде. Растаявшие аликвоты неиспользованных YCT можно
хранить в темноте при (4 ± 3) °C, но через 14 дней их следует выбросить.
6.5 Стандартное вещество
Хлорид кадмия (CdCl ), сульфат меди (CuSO ), хлорид натрия (NaCl) и хлорид калия (KCl) - все
2 4
[ ] [ ] [ ] [ ]
1 2 3 10
являются приемлемыми стандартными веществами. Перед их использованием лабораторный
персонал при необходимости может пользоваться Паспортом безопасности материалов (MSDS)
относительно этих веществ.
7 Оборудование
Используется обычное лабораторное оборудование для культивирования организмов и испытания.
7.1 Термостатированное помещение, камера с регулированием температуры или водяная
баня
Выбранная система должна поддерживать в испытательных емкостях температуру (23 ± 2) °C.
7.2 Измерительные приборы
Используются приборы для измерения DO, pH, жесткости, проводимости, щелочности, аммиака,
интенсивности освещения и температуры согласно ISO 10523, ISO 5814 и ISO 6059.
7.3 Испытательные емкости
Все емкости и принадлежности, например сита, которые могут контактировать с организмами,
контрольным или испытательным осадком и вышележащей водой во время сортировки,
манипулирования и испытаний, должны быть изготовлены из нетоксичных материалов (например, из
)
стекла, нержавеющей стали, нейлона Nalgene™ , фарфора, полиэтилена, полипропилена,
стекловолокна), очищенных и промытых водой, дистиллированной, деионизироованной,
дехлорированной лабораторной, реконструированной или естественной из незагрязненного источника.
Такие материалы, как медь, цинк, латунь, оцинкованный металл, свинец и натуральный каучук не
должны вступать в контакт с этими приборами и оборудованием или с пробами контрольного,
стандартного или испытательного осадка, вышележащей водой или испытательными емкостями.
Перед началом испытания необходимо обеспечить, чтобы все испытательные емкости и
соответствующее лабораторное оборудование были чистыми и не имели никаких загрязнений от
предыдущего использования.
В качестве испытательных сосудов рекомендуются стеклянные емкости (лабораторные стаканы или
широкогорлые сосуды) с внутренним диаметром примерно от 7 см до 10 см и объемом от 300 мл до
1000 мл. Испытательная емкость должна быть пригодной для помещения осадка толщиной от 1,5 см
до 2,5 см и отношения осадка к воде (объем:объем) 1:1,75 или 1:4. Каждую испытательную емкость
можно закрыть стеклянной или пластиковой крышкой, чтобы уменьшить возможность загрязнения
содержимого, уменьшить испарение и минимизировать потерю летучих веществ из осадка.
Nalgene™ является примером подходящего продукта, доступного для приобретения. Эта информация дается
только для удобства пользователей данного документа и не является рекомендацией этого продукта от ISO.
Перед использованием емкости промывают вышележащей водой (6.3) или деионизироованной либо
дистиллированной водой.
7.4 Устройство, для проведения аэрации в каждой испытательной емкости во время испытания,
если необходимо.
7.5 Пипетка, для переноса Hyalella azteca, с диаметром отверстия от 5 мм до 6 мм, чтобы
улавливать животных, допуская при этом перенос только небольшого объема воды.
7.6 Бинокулярное увеличительное стекло или препаровальная лупа, с увеличением не менее
7,5 X.
7.7 Сито(а), например 300 мкм или 425 мкм, для извлечения Hyalella azteca из осадка в конце
испытания.
7.8 Сушильный шкаф, обеспечивающий сушку испытательных организмов при 60 °C до 90 °C в
течение 24 ч перед взвешиванием.
7.9 Эксикатор, для удерживания высушенных испытательных организмов в конце испытания во
время взвешивания.
7.10 Весы, обеспечивающие измерение Hyalella azteca с точностью до 10 мкг.
8 Обработка и подготовка проб
8.1 Общие вопросы
Отбирают осадок в полевых условиях на стандартном, контрольном и испытательном участках
согласно установленным инструкциям (см. ISO 5667-16 и Ссылки [1], [5], [10], [13], [14], [15] и [16]) или, если
.[2] [5] [13] [15]
требуется, добавляют тестовый химикат или препарат к пробе контрольного осадка. В
исследованиях, специфических для данного участка, для испытательных и стандартных осадков должны
использоваться аналогичные процедуры отбора проб отложений и обращения с ними. Емкости для
проб изготовляют из инертного, нетоксического материала, они должны быть новые или тщательно
очищенные. Емкости для проб полностью заполняют, чтобы исключить воздух, немедленно
запечатывают и маркируют или кодируют. Хранят запечатанные емкости с отобранными осадками в
темноте при (4 ± 2) °C, пока они не потребуются для испытания на токсичность. Сушка, замораживание
и холодное хранение - все это влияет на токсичность и биодоступность химикатов в осадке. Начинают
испытание осадков по возможности без промедления, чтобы сохранить химическую целостность, но
предпочтительно в течение 5 дней и не позднее 30 дней, если химическая стабильность не может быть
гарантирована. Можно провести анализ известных химических загрязнителей на пробах отложений,
отобранных в полевых условиях, и результаты сравнить с анализом осадков в начале и конце
испытания, чтобы определить количественно любые изменения химической концентрации или формы.
8.2 Испытательный осадок
Осадок для испытания отбирают на заданном участке с использованием такого оборудования, как
колонковые буры (например, керновый ящик, Phleger) или черпаковые устройства (например,. Ekman,
Ponar, Van Veen, Petersen, Shipek, Kajak-Brinkhurst). Осадок берут из середины пробоотборника,
которая не контактирует с оборудованием. Обычно собирают верхнюю часть осадка от 2 см до 4 см,
представляющую аэробную зону, и объединяют достаточное количество проб участка для
удовлетворения потребностей тестирования. Для проведения испытания Hyalella azteca на токсичность
обычно требуется несколько литров (т.е. от 5 л до 7 л) осадка; однако количество требуемого осадка
будет зависеть от целей и проектирования исследования, а также от характера химических анализов,
которые должны быть выполнены. Чтобы получить достаточное количество осадка, часто бывает
необходимо объединять подпробы, извлеченные с использованием пробоотборника. Для химических
анализов переносят осадок предварительно очищенным черпаком в инертную емкость и
перемешивают составленную пробу до тех пор, пока ее цвет и текстура не станут однородными.
Хранят смешанную пробу в чистой емкости из бутылочного стекла (если подозревается присутствие
8 © ISO 2013 – Все права сохраняются
органических загрязнителей) или в чистой емкости из полиэтилена высокой плотности или
поликарбоната (если предполагается присутствие металлических загрязнителей). Наполняют емкости
согласно их вместимости и отправляют в лабораторию при (4 ± 2) °C.
Оборудование, используемое на разных участках, следует очищать, чтобы предотвратить
перекрестное загрязнение. Отходы очистки растворителем следует сохранять и возвращать в
лаборатории для ликвидации.
8.3 Подготовка проб осадков
Большие обломки пород (> 1 см) и местные организмы удаляют вручную, используя щипцы, пинцеты
или аналогичные инструменты. Влажное просеивание осадка не рекомендуется, потому что могут быть
потеряны водорастворимые загрязнители и мелкие неоседающие глинистые частицы. Перед
[,[1] [2] [14] 15]
использованием каждую пробу отложения гомогенизируют в лаборатории если для объектов
исследования не требуются иные меры. Непосредственно после смешивания проб извлекают
подпробы испытательного материала для химического и физического анализов, помещают их в
маркированные емкости и хранят надлежащим образом для физико-химических исследований.
Химическое и физическое описание пробы отложения необходимо для интерпретации результатов.
Анализируют подпробу испытательного и стандартного осадков для определения:
гранулометрического состава [процент гравия (> 2 мм), крупнозернистого и мелкозернистого песка
(≤ 2 мм до > 0,063 мм), ила (≤ 0,063 мм до > 0,004 мм) и глины (< 0,004 мм)], процентного содержания
воды, общего содержания органического углерода (TOC), pH поровой воды, аммиака в поровой воде
[1] [2] [3] [10]
(общие и ионизированные концентрации). Дополнительное описание может включать общее
содержание неорганического углерода и летучих веществ, биохимическую и химическую потребность в
кислороде, катионообменную емкость, кислотные летучие сульфиды, металлы, синтетические
органические соединения, масло и смазки, нефтяные углеводороды.[2] Пробы поровой воды можно
также отбирать и анализировать для определения растворенных загрязнителей. Пробы поровой воды
могут быть получены из контрольного или стандартного осадка методами in situ (например, зонды) или
[13] [14] [15]
методами ex situ (например, центрифугирование или нагнетание).
.
Если целью исследования является введение в осадок химиката или препарата, то можно обратиться
к описанию процедур, которые объясняют шаги, включенные в обогащение осадка, гомогенизацию,
химическое равновесие, использование химического растворителя, верификацию и анализ данных (см.
Ссылки [1], [2], [5], [13] и [15]). Однако для настоящего международного стандарта рекомендуется
процедура влажного обогащения осадка, которая предпочитается методам сухого обогащения, так как
оно может привести к потерям испытательного химиката. Испытательный химикат или вещество
вводится в осадок или непосредственно, или путем использования комбинации осадок: водяная
суспензия перед добавлением вышележащей воды. Требуется период равновесия, чтобы дать время
для стабилизации концентрации тестового химиката в поровых пространствах воды в осадке.
Продолжительность этого равновесия в значительной степени зависит от природы тестового химиката
и типа осадка (например, период равновесия в песчаном осадке будет меньше, чем в осадке со
значительным содержанием глины; неорганические соли уравновешиваются за меньший период
времени, чем полярное органическое соединение).
Собирают имеющуюся информацию о свойствах химиката или вещества, подлежащего тестированию.
Она включает концентрацию основных ингредиентов и примесей, водорастворимость, константы
диссоциации, токсичность для человека и водных организмов и склонность к биологическому
разложению. Дополнительную информацию, такую как структурные формулы, характер и процентное
содержание значительных примесей, присутствие и количество добавок и коэффициент
распределения n-октанол:вода, также получают, если она имеется. Есть три способа для введения
химикатов в контрольный осадок: 1) влажный метод с использованием валковой мельницы,[16] 2) влажный метод
.[18] [19] [20]
с использованием суспензии,[17] или 3) метод суспендирования осадка Выбранный метод зависит от
.[5]
целей исследования и от характера тестируемого химиката или материала
.
Если для растворения тестируемого химиката и сохранения его в растворе необходимо использование
органического растворителя помимо воды, то тестируемую концентрацию вводят непосредственно в
контрольный осадок, и носитель растворителя испаряется перед добавлением вышележащей воды.
Контрольный осадок только с растворителем готовят и испытывают одновременно с обработками
испытательного осадка. Контрольный осадок только с растворителем должен содержать самую
высокую концентрацию растворителя, используемого в приготовлении образцов испытательного
[5]
осадка.
9 Процедура испытания
9.1 Приготовление испытательных емкостей
Тщательно перемешивают каждую пробу осадка в день, предшествующий испытанию, и добавляют
аликвоту осадка в каждую испытательную емкость (например, 100 мл). Распределяют испытательный
осадок в однородный слой, который позволяет бокоплавам зарываться в нем (минимум 1,5 см
глубиной). Готовят не менее пяти лабораторных дубликатов для каждой обработки или каждого
испытательного образца и периода измерения роста (т.е. на 14-й день и на 28-й день), добавляя при
необходимости один или более дубликатов на обработку для мониторинга химических свойств осадка
и вышележащей воды во время испытания. Дубликаты, установленные для мониторинга химических
свойств, должны обеспечиваться бокоплавами, как и другие тестовые дубликаты.
Выравнивают поверхность осадка, делая ее плоской в каждой емкости, и принимают меры для
обеспечения минимума нарушений испытательного или контрольного осадка во время добавления
вышележащей воды. Одним из способов для минимизации повреждения осадка является наливание
воды на диск [полиэтиленовый, нейлоновый или политетрафторэтиленовый (PTFE) защитный лист
толщиной от 4 мм до 6 мм], лежащий на поверхности осадка и соответствующий внутреннему диаметру
.[1] [3]
испытательной емкости Вышележащая вода добавляется в каждую испытательную емкость, так чтобы
соотношение осадок: вода было 1:1,75 или 1:4. Диск удаляют и промывают вышележащей водой для
всех дубликатов образца. Отдельный чистый диск используется для каждой обработки. Воду,
расположенную над осадком в каждой испытательной емкости, следует обновлять в день,
предшествующий испытанию, так же как и на протяжении всего испытания (9.4).
Образцы для обработки следует размещать таким образом, чтобы за бокоплавами было обеспечено
простое наблюдение. Предпочтительно, чтобы тестовые добавки помещались в случайном порядке
или в случайном распределении блоков с одной дубликатной добавкой в каждом блоке.
9.2 Введение организмов
Начинают испытание токсичности, помещая 10 особей Hyalella azteca в каждую испытательную
емкость (т.е. 10 бокоплавов в расчете на дубликат каждой обработки).
Отбирают отдельные бокоплавы произвольно из емкости с культурой известного возраста (см. B.3),
используя пипетку или другое подходящее устройство, и распределяют их непосредственно в
испытательных емкостях. Бокоплавы помещаются ниже границы раздела воздух/вода в вышележащей
воде. Альтернативно 10 бокоплавов можно отсчитать в передаточную камеру (например, 30-мл
пластиковую чашку), наполненную вышележащей водой, и затем пересчитать перед помещением в
испытательные емкости. Бокоплавы вместе с водой переносят в испытательную камеру путем
плавного переливания из сортировочной чашки. Используют диск, как описано в 9.1, для
предотвращения нарушения осадка. Смывают все оставшиеся в чашке бокоплавы в испытательную
емкость, используя больше вышележащей воды. Увеличивают объем в испытательной емкости до
подходящего уровня (вода плюс осадок), при необходимости убирают диск и закрывают
испытательные емкости крышками, если они применяются. Так как используются дубликатные емкости,
то бокоплавы следует добавлять в одно и то же время в каждый набор или блок испытательных
емкостей, представляющих каждую обработку согласно случайному распределению блоков.
Заменяют тех бокоплавов, которые не погрузились в осадок в течение 1 ч, если только не видно, что
они многократно зарываются в осадок и немедленно всплывают, для избежания реакции на
испытательный субстрат. Бокоплавов, показывающих эту реакцию избегания в течение первого часа
испытания, не следует заменять.
10 © ISO 2013 – Все права сохраняются
--
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...