ISO 10273:1994
(Main)Microbiology — General guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
Microbiology — General guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
Gives general guidance on the detection of Yersinia enterocolitica presumed to be pathogenic to man. Applicable to products for human or animal consumption.
Microbiologie — Directives générales pour la recherche de Yersinia enterocolitica présumées pathogènes
La présente Norme internationale donne des directives générales concernant la recherche des Yersinia enterocolitica présumées pathogènes pour l'homme. La présente Norme internationale est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale.
General Information
Relations
Buy Standard
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
ISO
STANDARD 10273
First edition
1994-12-15
- General guidance for the
Microbiology
detection of presumptive pathogenic
Yersinia en terocolitica
Microbiologie - Directives g&Wales pour Ia recherche des Yersinia
enterocolitica pr&um6es pathogenes
Reference number
ISO 10273:1994(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10273:1994(E)
Contents
Page
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
1 Scope
. . .*.*. 1
2 Normative references . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Definitions . .
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 Principle . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
4.1 Enrichment in selective liquid media
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Plating out and identification
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3 Confirmation
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 Culture media and reagents
2
. . . . . . . . . . . . . .*.
5.1 General
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .~. 2
5.2 Enrichment media
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
5.3 Plating-out media
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
5.4 ldentification media and reagents
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .-.
5.5 Saline Solution
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
5.6 Potassium hydroxide in Saline Solution
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .“.
6 Apparatus and glassware
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 Sampling
.......... ....................................... ....... 3
8 Preparation of test Sample
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9 Procedure
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.1 Test Portion and initial suspensions
4
9.2 Enrichment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
......................................... 4
9.3 Plating out and identification .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.4 Confirmation
7
.................................. .............................
IO Expression of results
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
11 Test report . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0 ISO 1994
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronie or mechanrcal, including photocopying and
microfilm, without Permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-l 211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
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0 ISO
ISO 10273:1994(E)
Annexes
A Diagram of procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
B Composition and preparation of culture media and reagents . 9
. . .
Ill
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0 ISO
ISO 10273:1994(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national Standards bodies (ISO member bodies). The work
of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Esch member body interested in a subject for
which a technical committee has been established has the right to be
represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 10273 was prepared by Technical Committee
lSO/TC 34, Agrkultural food products, Subcommittee sc 9,
Microbiology.
Annexes A and B form an integral part of this International Standard.
---------------------- Page: 4 ----------------------
Q ISO
ISO 10273:1994(E)
Introduction
This International Standard is intended to provide general guidance for the
examination of products not dealt with by existing International Standards
and to be taken into account by organizations preparing microbiological
methods of test for application to foods or to animal feeding stuffs. Be-
cause of the large variety of products within this field of application, these
guidelines may not be appropriate in every detail for certain products, and
for some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to
apply the guidelines provided as far as possible and that deviations from
them will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken
of all information then available regarding the extent to which the guide-
lines have been followed and the reasons for deviation from them in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
groups of products, International Standards and/or national Standards may
already exist that do not comply with these guidelines. In cases where
International Standards already exist for the product to be tested, they
should be followed, but it is hoped that when such Standards are reviewed
they will be changed to comply with this International Standard so that
eventually the only remaining departures from these guidelines will be
those necessary for weil-established technical reasons.
V
---------------------- Page: 5 ----------------------
This page intentionally left blank
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INTERNATIONAL STANDARD 0 ISO ISO 10273:1994(E)
- General guidance for the detection of
Microbiology
presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica
biochemical properties meeting the pathogenicity cri-
1 Scope
teria described when the test is carried out in ac-
cordante with this International Standard.
This International Standard gives general guidance on
the detection of Yersinia enterocokka presumed to
3.2 detection of presumptive pathogenic Yersinia
be pathogenic to man.
enterocolitica: Determination of the presence or ab-
This International Standard is applicable to products sence of these bacteria in a predetermined quantity
for human or animal consumption.
of product, when the test is carried out in accordance
with this International Standard.
2 Normative references
4 Principle
The following Standards contain provisions which,
Detection of presumptive pathogenic Yersinia entero-
through reference in this text, constitute provisions
cokka by the following three successive Stages.
of this International Standard. At the time of publi-
cation, the editions indicated were valid. All Standards
are subject to revision, and Parties to agreements
4.1 Enrichment in selective liquid media
based on this International Standard are encouraged
to investigate the possibility of applying the most re-
Inoculation of the test Portion in two enrichment me-
.
.
cent editions of the Standards indicated below.
dja .
Members of IEC and ISO maintain registers of cur-
rently valid International Standards. - peptone, sorbitol and bile salts (PSB) broth, and
ISO 6887: 1983, Microbiology - General guidance for - irgasan,
ticarcillin and potassium chlorate (ITC)
the preparation of dilutions for microbiological exam-
broth.
ina tion.
Incubation at between 22 “C and 25 “C for 48 h for
the ITC broth and for 3 to 5 days for the PSB broth.
ISO 72 18:-‘1, Microbiology - General rules for
microbiological examina tions.
4.2 Plating out and identification
3 Definitions
Using the cultures obtained in 4.1, surface plating of
two solid selective culture media:
For the purposes of this International Standard, the
following definitions apply.
- agar with cefsulodin, irgasan and novobiocin (GIN),
and
3.1 presumptive pathogenic Yersinia entere-
colifica: Psychrotrophic bacteria forming character- - Salmone//a/Shigella agar, with sodium desoxy-
istic colonies on solid selective media and having the cholate and Calcium chloride (SSDC).
1) To be published. (Revision of ISO 7218:1985)
---------------------- Page: 7 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(E)
5.4.2 Reagent for detection of tryptophan
Incubation at 30 “C, followed by examination after
deaminase
24 h and, if necessary, after 48 h depending on the
medium, to check if any characteristic colonies of
See B.7.
Yersinia enterocolitka are present.
5.4.3 Kligler agar
4.3 Confirmation
See B.8.
testing for presumptive
On plated-out colonies,
Yersinia enterocokica followed by biochemical confir-
mation tests, tests of the appropriate pathogenicity
5.4.4 Reagent for detection of oxidase
criteria, and possibly serological tests.
See B.9.
5 Culture media and reagents
5.4.5 Decarboxylation media
5.1 General
5.4.5.1 Lysine decarboxylation medium
For current laboratory practice, see ISO 7218.
See B.lO.
In view of the large number of culture media and re-
agents, for the clarity of the text, their compositions
5.4.5.2 Ornithine decarboxylation medium
are given in annex B, which also includes details of
dispensing, storage, etc.
See B.ll.
5.2 Enrichment media
5.4.6 Media for fermentation of carbohydrates
(sucrose, rhamnose or salicin)
5.2.1 Peptone, sorbitol and bile salts (PSB) broth
See 8.12.
See B.I.
5.4.7 Simmons citrate medium
5.2.2 Irgasan, ticarcillin and potassium chlorate
(ITC) broth
See B.13.
See B.2.
5.4.8 Bile and aesculin agar
5.3 Plating-out media
See B.14.
5.3.1 Cefsulodin, irgasan and novobiocin (CIN)
5.4.9 Casein-soya agar
agar
See B.15.
See B.3.
5.4.10 Casein-soya agar for detection of
5.3.2 Salmonella/Shigella agar, with sodium
pyrazinamidase
desoxycholate and Calcium chloride (SSDC)
See B.16.
See B.4.
5.3.3 Nutrient agar
5.4.11 Ammonium iron(ll) sulfate Solution for
detection of pyrazinamidase
See 8.5.
See B.17.
5.4 Identification media and reagents
5.4.12 Casein-soya agar with magnesium and
oxalate
5.4.1 Urea tryptophan medium
See B.6. See B.18.
2
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0 ISO ISO 10273:1994(E)
3 Nickel/chromium is not suitable for the oxidase test (see
5.5 Saline solution
9.424).
See B.19.
6.12 pH-meter, accurate to within + 0,l pH units
-
at 25 “C.
5.6 Potassium hydroxide in Saline Solution
See B.20.
6.13 Lighting, appropriate for oblique illumination.
6 Apparatus and glassware
6.14 Magnifying glass or microscope
Ie alterna-
NOTE Disposable apparatus is an acceptab
fications.
tive to reu sable glassware, if it has suitable speci
6.15 Peristaltic blender (stomacher)
Usual microbiology laboratory equipment and, in par-
7 Sampling
ticular, the following.
lt is important that the laboratory receive a Sample
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
which is truly representative and has not been dam-
sterilization (autoclave)
aged or changed during transport or storage.
See ISO 7218.
Sampling is not part of the method specified in this
International Standard. If there is no specific Inter-
6.2 Incubator, capable of operating at 30 “C + - 1 “C
national Standard dealing with sampling of the product
or at 37 “C Zl: 1 “C.
concerned, it is recommended that the Parties con-
cerned come to an agreement on this subject.
6.3 Drying cabinet or oven, with Ventilation by
convection, capable of operating between
37 “C + 1 “C and 55 “C + 1 “C.
- -
8 Preparation of test Sample
6.4 Water baths or incubators, capable of operat-
Sample in accordance with the
Prepare the test
ing between 22 “C + 1 “C and 25 “C k 1 “C, possibly
specific International Standard appropriate to the
with a suitable agitation device.
product concerned. If there is no specific International
Standard available, it is recommended that the Parties
6.5 Water bath, capable of operating between
concerned come to an agreement on this subject.
45 “C + 0,5 “C and 50 “C + 0,5 “C.
-
-
9 Procedure
18 mm x 180 mm,
6.6 Test tubes, of dimensions
9 mm x 180 mm and 12 mm x 50 mm.
See the diagram in annex A.
6.7 Bottles and/or flasks, of suitable capacity.
9.1 Test Portion and initial suspensions
6.8 Petri dishes, made of glass or plastics, of di-
ameter 90 mm to 100 mm.
9.1.1 See ISO 6887 and any specific International
Standard appropriate to the product concerned.
6.9 Total-delivery pipettes, of nominal capacities
10 ml and 1 ml, with large opening and 0,l ml gradu-
9.1.2 In general, for preparing the initial Suspension,
ations.
place a quantity (x) of the test Portion (of known mass
or volume) in a known volume of the PSB broth
6.10 Rubber teats, or other microbiologically safe
(5.2.1), so as to obtain a test portion/enrichment me-
pipetting Systems.
dium dilution of I/lO (ratio by mass/volume or
volume/volume). Homogenize the Suspension using
6.11 Loop, of approximate diameter 3 mm, a
a peristaltic blender (6.15) for 120 s.
straight wire of platinum/iridium or nickellchro-
mium, and/or a glass rod (Pasteur pipettes).
9.1.3 Prepare the second initial Suspension in the
same way with the ITC broth (5.2.2), so as to obtain
NOTES
a test portion/enrichment medium dilution of 1 /IO0
(mass/volume or volume/volume ratio).
2 Sterile plastic disposable loops or needles may be used.
---------------------- Page: 9 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(E)
9.4 Confirmation
9.2 Enrichment
NOTE 4 Miniaturized biochemical identification kits, cur-
Incubate the two initial suspensions (9.1.2 and 9.1.3)
rently available commercially and permitting the identifi-
as follows:
cation of Yersinia enterocolit;ca, may be used.
a) PSB medium at 22 “C to 25 “C for 48 h to 72 h
with agitation, or for 5 days without agitation;
9.4.1 Selection of colonies for confirmation
b) ITC medium at 25 “C for 48 h.
For confirmation, take from each dish of each selec-
tive medium (see 9.3.1 to 9.3.3), five colonies con-
sidered to be typical or suspect.
9.3 Plating out and identification
If on one dish there are fewer than five typical or
of the enrichment media (9.2), pro-
After incubation
suspect colonies, take for confirmation all the typical
ceed as follows.
or suspect colonies.
Streak the selected colonies onto the surface of nu-
9.3.1 Using the PSB culture [9.2 a)], inoculate, by
trient agar plates (5.3.3), in a manner which will allow
means of a loop (6.1 l), the surface of a CIN agar plate
weil-isolated colonies to develop.
(5.3.1) and spread so as to obtain weil-separated col-
onies.
Incubate the inoculated plates at 30 “C for 24 h.
9.3.2 Using a sterile pipette (6.9), transfer 0,5 ml of Store the nutrient agars at between 0 “C and + 5 “C
the PSB culture [9.2a)] into 4,5 ml of potassium hy- for the supplementary biochemical confirmation and
droxide Solution (5.6) and mix. After 20 s, inoculate, pathogenicity tests.
by means of a loop (6.11), the surface of a CIN agar
Use pu re cultures for the biochemical confirmations
plate (5.3.1) to obtain weil-separated colonies.
and pat hogenicity tests.
9.3.3 Using the ITC culture [9.2 b)], inoculate, by
means of a loop (6.11), the surface of an SSDC agar
9.4.2 Presumptive tests
plate (5.3.2) to obtain weil-separated colonies.
By means of a wire or glass rod (6.1 l), inoculate the
media specified in 9.4.2.1 to 9.4.2.3 and perform the
9.3.4 Invert the dishes (9.3.1 to 9.3.3) and place
detection of oxidase as described in 9.4.2.4 with each
them in the incubator (6.2) set at 30 “C.
of the cultures obtained from the colonies selected in
9.4.1.
9.3.5 After incubation for 24 h, examine the dishes
with a magnifying glass (6.14) or oblique transillumi-
9.4.2.1 Detection of uresse
nation in Order to detect the presence of characteristic
colonies of Yersinia enferoco/jtica as follows.
Inoculate just below the surface of the liquid medium
(5.4.1).
a) On CIN agar, characteristic colonies of Yersinia
enteroco/jtica are small (6 1 mm) and smooth
Incubate at 30 “C for 24 h.
with a red centre and translucent rim, and, when
examined with oblique transillumination (6.13), are
A pink-violet colour indicates a positive urease re-
non-iridescent and finely granular.
action.
b) On SSDC agar, characteristic colonies of Yersinia
An orange-yellow colour indicates a negative urease
enterocoljtjca are small (< 1 mm) and grey with
reaction.
an indistinct rim, non-iridescent and very finely
granular when examined with oblique transillumi-
9.4.2.2 Detection of tryptophan deaminase
nation.
Add three drops of reagent (5.4.2) to the culture ob-
9.3.6 If the development of colonies is slow, if
tained in 9.4.2.1 for the detection of tryptophan
coloration is weak, or if there are no characteristic
deaminase.
colonies, continue incubation of the plates for up to
A brown colour indicates a positive reaction.
48 h, then re-examine.
4
---------------------- Page: 10 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(E)
- detection of oxidase: negative.
9.4.2.3 Kligler agar (5.4.3)
NOTES
Streak the slant surface (8.8.2) of the agar and stab
the butt to the bottom of the agar.
5 Some strains of Yersinia enterocolitica that are lactose-
positive have been isolated, particularly from dairy products.
Incubate at 30 “C for 24 h to 48 h.
In the current state of knowledge, they are generally non-
pathogenic.
Interpret the changes in the medium as follows.
6 Urease negative strains have been reported but none are
Butt
known to be pathogenic.
glucose positive (fermen-
yellow:
7 For the formation of gas from glucose, a few bubbles
tation of glucose)
may be produced. Although Yersinia is usually considered
glucose negative (no fer-
red or unchanged: to ferment carbohydrates without gas production, some
strains of Yersinia enterocolitica (such as Y. enterocolitica
mentation of glucose)
biovar 3) may produce one or two bubbles (weak gas pro-
black: formation of hydrogen sul-
duction).
fide
gas formation from
bubbles or Cracks:
9.4.3.1.2 Using a loop, wire or glass rod (6.11), in-
glucose
oculate the media specified in 9.4.3.2 to 9.4.3.5 with
Slant surface each of the cultures obtained from the colonies iso-
lated (9.4.1) on nutrient agar and selected in
yellow: lactose positive (utilization
9.4.3.1.1.
of lactose)
red or unchanged: lactose negative (no utiliz-
9.4.3.2 Lysine decarboxylation medium (5.4.5.1)
ation of lactose)
Inoculate just below the surface of the liquid medium.
9.4.2.4 Detection of oxidase
Incubate at 30 “C for 24 h.
Using the glass rod (6.11), take a Portion of each
A violet colour after incubation indicates a positive
characteristic colony Chosen (9.4.1) and streak it on a
reaction.
filter Paper moistened with the oxidase reagent
(5.4.4) or on a commercially available disc. DO not use
A yellow colour indicates a negative reaction.
a nickel/chromium loop or wire (see 6.11, note 3).
Consider the test to be negative when the colour of
9.4.3.3 Ornithine decarboxylation medium
the filter Paper has not changed to mauve, violet or
(5.4.5.2)
deep blue within 10 s.
Inoculate just below the surface of the liquid medium.
9.4.3 Biochemical confirmation tests
Incubate at 30 “C for 24 h.
A violet colour after incubation indicates a
positive
9.4.3.1 Selection of colonies and procedure
reaction.
A yellow colour indicates a negative reaction.
9.4.3.1 .l Continue the identification of colonies
having the following characteristics:
9.4.3.4 Media for the fermentation of sucrose
- detection of urease: positive,
and rhamnose (5.4.6)
- detection of tryptophan deaminase: negative,
Inoculate each medium just below the surface of the
- fermentation of glucose: positive,
Incubate at 30 “C for 24 h.
- no formation of gas from the glucose,
A yellow colour after incubation indicates a positive
- fermentation of lactose: negative,
reaction.
- no formation of H,S, A red colour indicates a negative reaction.
5
---------------------- Page: 11 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(E)
A black halo around the coloni
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10273
Première édition
1994-12-15
Microbiologie - Directives générales pour
la recherche des Yersinia enterocolitica
présumées pathogènes
Microbiology - General guidance for the detection of presumptive
pathogenic Yersinia enterocolitica
Numéro de référence
ISO 10273: 1994(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
Sommaire
Page
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 Domaine d’application
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Références normatives
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Définitions
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 Principe
......................... 1
4.1 Enrichissement en milieux sélectifs liquides
...................................................... 2
4.2 Isolement et identification
........................................................................... 2
4.3 Confirmation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
5 Milieux de culture et réactifs
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
5.1 Généralités
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Milieux d’enrichissement
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Milieux d’isolement
.......................................... 2
5.4 Milieux d’identification et réactifs
3
........................................................................
5.5 Solution saline
.......... 3
5.6 Solution d’hydroxyde de potassium en solution saline
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 Appareillage et verrerie
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 Échantillonnage
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
9 Mode opératoire
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
9.1 Prise d’essai et suspensions initiales
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.2 Enrichissement
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.3 Isolement et identification
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.4 Confirmation
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 Expression des résultats
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11 Rapport d’essai
0 60 1994
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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0 ISO
ISO 10273:1994(F)
Annexes
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
A Schéma du mode opératoire
B Composition et préparation des milieux de culture et des
9
réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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0 ISO
ISO 10273:1994(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10273 a été élaborée par le comité technique
ISOnC 34, Produits agricoles ahmentaires, sous-comité SC 9, Micro-
biologie.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme interna-
tionale.
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0 ISO
ISO 10273:1994(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernés par les Normes
internationales existant actuellement, et à prendre en considération par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques destinées
à être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments pour ani-
maux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce do-
maine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement à certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des métho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, ces
directives, et qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela est ab-
solument nécessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
normes nationales, qui ne concordent pas avec ces directives, existent
peut-être déjà. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà
pour le produit à essayer, elles devront être appliquées, mais il serait
souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient alignées
sur la présente Norme internationale, si bien que, finalement, les seules
divergences restantes seront celles qui sont nécessaires pour des raisons
techniques bien établies.
v ’
---------------------- Page: 5 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 6 ----------------------
NORME INTERNATIONALE 0 BO ISO 10273:1994(F)
- Directives générales pour la
Microbiologie
recherche des Yersinia enterocolitica présumées
pathogènes
3.1 Yersinia enferocolitica présumées pathogè-
1 Domaine d’application
nes: Bactéries psychrotrophes, formant des colonies
caractéristiques sur milieux sélectifs possédant les
La présente Norme internationale donne des directi-
propriétés biochimiques et répondant aux critères de
ves générales concernant la recherche des Yersinia
pathogénicité décrits lorsque l’essai est réalisé selon
enterocolitica présumées pathogènes pour l’homme.
la présente Norme internationale.
La présente Norme internationale est applicable aux
produits destinés à la consommation humaine ou à
3.2 recherche des Yersinia enterocolr’tica présu-
l’alimentation animale.
mées pathogènes: Détermination de la présence ou
de l’absence de ces bactéries dans une quantité dé-
terminée de produit, lorsque l’essai est réalisé selon
2 Références normatives
la présente Norme internationale.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente
4 Principe
Norme internationale. Au moment de la publication,
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
Recherche des Yersinia enterocolitica présumées
norme est sujette à révision et les parties prenantes
pathogènes selon les trois phases successives sui-
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
vantes.
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possèdent le registre des Normes internationales en 4.1 Enrichissement en milieux sélectifs
vigueur à un moment donné.
liquides
I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
Ensemencement de la prise d’essai dans deux milieux
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
d’enrichissement:
microbiologique.
- bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliai-
Règles générales pour
ISO 7218: -l), Microbiologie -
res (PSB), et
les examens microbiologiques.
- bouillon à I’irgasan, à la ticarcilline et au chlorate
de potassium (ITC).
3 Définitions
Incubation entre 22 “C et 25 “C pendant 48 h pour le
Pour les besoins de la présente Norme internationale, bouillon ITC et pendant 3 à 5 jours pour le bouillon
PSB.
les définitions suivantes s’appliquent.
1) À publier. (Révision de NS0 7218:1985)
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
5.3.2 Gélose Salmone/la/Shigella, au
4.2 Isolement et identification
désoxycholate de sodium et au chlorure de
ensemen- calcium (SSDC)
À partir des cultures obtenues en 4.1,
cement de deux milieux sélectifs solides:
Voir B.4.
- gélose à la cefsulodine, à I’irgasan et à la
novobiocine (CI N) et,
5.3.3 Gélose nutritive
- gélose SaImonella/Shigella, au désoxycholate de
Voir 8.5.
sodium et au chlorure de calcium (SSDC).
Incubation à 30 “C, puis examen après 24 h et, si né- 5.4 Milieux d’identification et réactifs
cessaire, après 48 h selon le milieu, pour contrôler s’il
y a présence de colonies caractéristiques de Yersinia
5.4.1 Milieu urée tryptophane
en terocolitica.
Voir B.6.
4.3 Confirmation
5.4.2 Réactif pour la recherche de la tryptophane
désaminase
Sur des colonies isolées, réalisation des essais
présomptifs de Yersinia enterocolitica, suivis des es-
Voir 8.7.
sais de confirmation biochimiques, et de critères de
pathogénicité et éventuellement sérologiques.
5.4.3 Gélose de Kligler
5 Milieux de culture et réactifs Voir 8.8.
5.4.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase
5.1 Généralités
Voir B.9.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
I’ISO 7218.
5.4.5 Milieux de décarboxylation
En raison du nombre important de milieux de culture
et de réactifs, il a été jugé préférable pour la clarté du
5.4.5.1 Milieu de décarboxylation de la lysine
texte, de donner leur composition et leur préparation
dans l’annexe B, qui inclut également des détails
Voir B.10.
concernant leur répartition, leur conservation, etc.
5.4.5.2 Milieu de décarboxylation de I’ornithine
5.2 Milieux d’enrichissement
Voir B.ll.
5.2.1 Bouillon à la peptone, au sorbitol et aux
5.4.6 Milieux pour la fermentation des glucides
sels biliaires (PSB)
(saccharose, rhamnose ou salicine)
Voir B.l .
Voir B.12.
5.2.2 Bouillon à I’irgasan, à la ticarcilline et au
5.4.7 Milieu au citrate de Simmons
chlorate de potassium (ITC)
Voir B.13.
Voir B.2.
5.4.8 Gélose à la bile et à I’esculine
5.3 Milieux d’isolement
Voir B. 14.
5.3.1 Gélose à la cefsulodine, à I’irgasan et à la
novobiocine (GIN) 5.4.9 Gélose caséine-soja
Voir B.15.
Voir B.3.
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ISO 10273:1994(F)
0 ISO
6.8 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-
5.4.10 Gélose caséine-soja pour la recherche de
que, d’un diamètre de 90 mm à 100 mm.
la pyrazinamidase
Voir B.16.
6.9 Pipettes à écoulement total, à large ouverture,
de capacités nominales de 10 ml et 1 ml, graduées
5.4.11 Solution de sulfate de fer(N) ammoniacal
en 0,l ml.
pour la réu Slation de la pyrazinamidase
61 . 0 Poires en caoutchouc, ou tout autre sys tème
Voir B. 17.
de pipettage microbiologiquement sûr.
5.4.12 Gél ose caséine-soja au magnésium et à
6.11 Anse bouclée, d’environ 3 mm de diamètre,
I’oxalate
fil droit, en platine iridié ou en nickel-chrome, et/ou
baguette de verre (pipettes Pasteur).
Voir B.18.
NOTES
5.5 Solution saline
2 Des anses stériles en plastique à usage unique peuvent
Voir B.19. être également utilisées.
3 Le nickel-chrome ne convient pas pour l’essai à
5.6 Solution d’hydroxyde de potassium en
l’oxydase (voir 9.424).
solution saline
6.12 pH-mètre, précis à + 0,l unité de pH à 25 “C.
Voir B.20.
6.13 Éclairage, approprié pour une transillumination
6 Appareillage et verrerie
oblique.
NOTE 1 Le matériel à usage unique est acceptable au
même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
6.14 Loupe ou microscope
sont similaires.
6.15 Homogénéisateur péristaltique (stomacher)
ratoire de microbiologie, et
Matériel courant de labo
en partic ulier ce qui suit.
7 Échantillonnage
6.1 Appareils, pour la stérilisation en chaleur sè-
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
che (four) ou en chaleur humide (autoclave)
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
Voir I’ISO 7218.
modifié lors du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
30 “C + 1 “C ou à
6.2 Étuve, réglable à
-
spécifiée dans la présente Norme internationale. S’il
37 “C + 1 “C.
n’y a pas de Norme internationale spécifique traitant
de l’échantillonnage du produit concerné, il est re-
6.3 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par
commandé que les parties concernées se mettent
37 “C + 1 “C et
convection, réglable entre -
d’accord à ce sujet.
55 “C + 1 “C.
-
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.4 Bains d’eau ou étuves, réglables entre
22 “C + 1 “C et 25 “C + - 1 “C, avec éventuellement
-
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
un système d’agitation approprié.
Norme internationale spécifique du produit concerné.
S’il n’y a pas de Norme internationale spécifique, il est
6.5 Bain d’eau, réglable entre 45 “C + 0,5 “C et
recommandé que les parties concernées se mettent
50 “C + 0,5 “C.
d’accord à ce sujet.
6.6 Tubes à essai, de 18 mm x 180 mm,
9 mm x 180 mm et 12 mm x 50 mm.
9 Mode opératoire
Voir le schéma en annexe A.
6.7 Fioles et/ou flacons, de capacité appropriée.
3
---------------------- Page: 9 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(F)
9.3.5 Après 24 h d’incubation, examiner les boîtes
9.1 Prise d’essai et suspensions initiales
à la loupe (6.14) ou en transillumination oblique afin
de rechercher la présence de colonies caractéris-
9.1.1 Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale
tiques de Yersinia enterocolitica:
concernant le produit à examiner.
a) Sur la gélose CIN, les colonies caractéristiques de
9.1.2 En général, pour préparer la première suspen-
Yersinia enterocohtica sont petites (< 1 mm), lis-
sion initiale, introduire une quantité (x) de prise d’essai
ses, à centre rouge, à bord translucide et, lors-
(masse ou volume) dans un volume connu de bouillon
qu’elles sont observées sous transillumination
PSB (5.2.1), de façon à obtenir un rapport prise
oblique (6.13), sont finement granuleuses et non
d’essai/milieu d’enrichissement de 1 /lO (rapport
irisées.
masse/volume ou volume/volume). Homogénéiser la
suspension en utilisant un homogénéisateur péristalti-
b) Sur gélose SSDC, les colonies caractéristiques de
que.
Yersinia enterocohtica sont petites (< 1 mm) et
grises avec un bord flou et lorsqu’elles sont ob-
9.1.3 Préparer la seconde suspension initiale, en
servées sous transillumination oblique, sont très
opérant de la même façon avec le bouillon ITC
finement granuleuses et non irisées.
(5.2.2), de façon à obtenir un rapport prise
d’essai/milieu d’enrichissement de 1 /lOO (rapport
9.3.6 Si le développement des colonies est lent, si
masse/volume ou volume/volume).
la coloration est faible ou s’il n’y a pas de colonie ca-
ractéristique, prolonger l’incubation des boîtes jusqu’à
48 h, puis les réexaminer.
9.2 Enrichissement
9.4 Confirmation
Incuber les deux susp ensions initiales (9.1.2 et 9.1.3)
de la façon suiva nte:
NOTE 4 Les galeries miniaturisées d’identification bio-
chimique, actuellement disponibles dans le commerce et
a) milieu PSB à 22 “C ou à 25 “C pendant 48 h à
permettant d’identifier les Yersinia enterocolitica, peuvent
72 h avec agitation ou pendant 5 jours sans agi-
être utilisées.
tation;
9.4.1 Choix des colonies pour les confirmations
b) milieu ITC à 25 “C pendant 48 h.
Pour les confirmations, prélever, à partir de chaque
9.3 Isolement et identification boîte de chacun des milieux sélectifs (voir 9.3.1 à
9.3.3), cinq colonies considérées comme typiques ou
Après incubation des milieux d’enrichissement (9.2),
suspectes.
procéder comme suit.
S’il se trouve une boîte avec moins de cinq colonies
typiques ou suspectes, retenir toutes les colonies ty-
9.3.1 À partir de la culture obtenue sur milieu
piques ou suspectes.
PSB Cg.2 a)] ensemencer à l’aide d’une anse (6.11) la
surface d’une boîte de gélose CIN (5.3.1) et étaler de
Ensemencer les colonies sélectionnées sur la surface
façon à obtenir des colonies bien séparées.
de boîtes de gélose nutritive (5.3.3), de façon à per-
mettre le développement de colonies bien isolées.
9.3.2 Avec une pipette stérile (6.9), transférer
Incuber les boîtes ainsi ensemencées à 30 “C pendant
0,5 ml de la culture obtenue sur milieu PSB [9.2a)]
24 h.
dans 4,5 ml de solution d’hydroxyde de potassium
(5.6) et agiter. Au bout de 20 s, ensemencer à l’aide
Conserver les géloses nutritives entre 0 “C et + 5 “C
d’une anse (6.11) la surface d’une boîte de gélose CIN
pour les essais de confirmation biochimique et de
(5.3.1) afin d’obtenir des colonies bien séparées.
pathogénicité.
9.3.3 À partir de la culture obtenue sur milieu
Utiliser des cultures pures pour les confirmations bio-
ITC [9.2 b)] ensemencer à l’aide d’une anse (6.11) la
chimiques et de pathogénicité.
surface d’une boîte de gélose SSDC (5.3.2) afin d’ob-
tenir des colonies bien séparées.
9.4.2 Tests présomptifs
À l’aide d’un fil droit ou d’une baguette de verre
9.3.4 Retourner les boîtes (9.3.1 à 9.3.3) et les pla-
(6.1 l), inoculer les milieux spécifiés en 9.4.2.1 à
cer dans l’étuve (6.2) réglée à 30 “C.
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0 ISO ISO 10273:1994(F)
tenues (9.4.1) et ensemencer par stries sur le papier-
9.4.2.3 et réaliser la recherche de l’oxydase décrite
en 9.4.2.4 avec chacune des cultures obtenues à filtre humecté de réactif (5.4.4) ou sur un disque
disponible dans le commerce. II ne faut pas utiliser
partir des colonies retenues en 9.4.1.
d’anse ni de fil en nickel chrome (voir 6.11, note 3).
9.4.2.1 Milieu de I’uréase
Considérer l’essai comme négatif si la couleur n’a pas
viré au mauve, violet ou bleu intense dans les
10 s.
Ensemencer le milieu liquide (5.4.1) juste au-dessous
de la surface.
9.4.3 Essais de confirmation biochimique
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
9.4.3.1 Sélection des colonies et mode opératoire
Une couleur rose-violette indique une réaction uréase
positive.
9.4.3.1.1 Poursuivre l’identification des colonies
Une couleur jaune orangé indique une réaction uréase présentant les caractéristiques suivantes:
négative.
- Recherche de I’uréase: positif,
9.4.2.2 Recherche de la tryptophane désaminase
- Recherche de la tryptophane désaminase: négatif,
Ajouter à la culture obtenue en 9.4.2.1, trois gouttes
- Fermentation du glucose: positif,
du réactif (5.4.2) pour la recherche de la tryptophane
désaminase.
- pas de formation de gaz à partir du glucose,
Une couleur brune indique une réaction positive.
- Fermentation du lactose: négatif,
9.4.2.3 Gélose de Kligler (5.4.3)
- pas de formation de H,S,
Ensemencer en stries la pente (B.8.2) de la gélose et - Recherche de l’oxydase: négatif.
le culot par piqûre jusqu’au fond de la gélose.
NOTES
Incuber à 30 “C pendant 24 h à 48 h.
5 Certaines souches de Yersinia enterocolitica lactose po-
sitif ont été isolées en particulier dans les produits laitiers.
du milieu de la façon
Interpréter les modifications
Elles ne sont en général pas pathogènes en l’état actuel de
suivante.
nos connaissances.
Culot
6 Des souches uréase négative ont été trouvées, mais
aucune n’est connue pour être pathogène.
glucose positif (fermen-
jaune:
tation du glucose)
7 Pour la formation de gaz à partir du glucose, quelques
rouge ou inchangé: glucose négatif (pas de
bulles peuvent être produites. Bien que Yersinia soit habi-
fermentation du glu-
tuellement considérée comme fermentant les glucides sans
cose) production de gaz, quelques souches de Yersinia entero-
colitica (comme Y. enterocolitica biovar 3) peuvent produire
formation de sulfure
noir:
une ou deux bulles (faible production de gaz).
d’hydrogène
formation de gaz à partir
bulles ou fissures:
9.4.3.1.2 À l’aide de l’anse bouclée, du fil droit ou
du glucose
d’une baguette de verre (6.11), ensemencer les mi-
Pente de la gélose lieux spécifiés en 9.4.3.2 à 9.4.3.5 avec chacune des
cultures obtenues à partir des colonies isolées (9.4.1)
lactose positif (utilisation
jaune:
sur gélose nutritive et sélectionnées en 9.4.3.1 .l .
du lactose)
lactose négatif (pas
rouge ou inchangée:
9.4.3.2 Milieu de décarboxylation de la lysine
d’utilisation du lactose)
(5.4.5.1)
9.4.2.4 Recherche de l’oxydase
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
surface.
À l’aide de la baguette de verre (6.1 l), prendre une
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
fraction de chacune des colonies caractéristiques re-
5
---------------------- Page: 11 ----------------------
0 60
ISO 10273:1994(F)
- /
9 Les Y. en terocolitica biovar 5 ont été trouvées négatives
Une couleur violette après incubation indique une ré-
pour I’orni thine décarboxylase.
action positive.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
9.4.4.1.2 À l’aide de l’anse bouclée, du fil droit ou
d’une baguette de verre (6.11) ensemencer les mi-
9.4.3.3 Milieu de décarboxylation de I’ornithine
lieux spécifiés de 9.4.4.2 à 9.4.4.4 avec chacune des
(5.4.5.2)
cultures obtenues à partir des colonies isolées (9.4.1)
sur gélose nutritive et sélectionnées en 9.4.4.1 .l .
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
surface.
9.4.4.2 Milieu pour la fermentation de la salicine
(5.4.6)
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
Une couleur violette après incubation indique une ré-
surface.
action positive.
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
Une couleur jaune après incubation indique une réac-
9.4.3.4 Milieu pour la fermentation du
tion positive.
saccharose et du rhamnose (5.4.6)
Une couleur rouge indique une réaction négative.
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
surface.
9.4.4.3 Milieu pour la recherche de I’esculine
(5.4.8)
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Une couleur jaune après incubation indique une réac-
Ensemencer en stries la pente (B.14.2) de la gélose.
tion positive.
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Une coloration rouge indique une réaction négative.
Une auréole noire autour des colonies indique une
réaction positive.
9.$.3.5 Milieu de Simmons pour l’hydrolyse du
citrate (5.4.7)
9.4.4.4 Milieu pour la recherche de la
Ensemencer en stries la pente (B.13.2) de la gélose.
pyrazinamidase (5.4.10)
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Ensemencer une grande superficie de la pente de la
gélose (B. 16.2).
La réaction est positive lorsque le milieu vire au bleu.
Incuber à 30 “C pendant 48 h.
9.4.4 Essais présomptifs de la pathogénicité
Ajouter 1 ml de la solution de sulfate de fer(ll) am-
9.4.4.1 Sélection des colonies et mode opératoire
moniacal à 1 % (5.4.11).
L’apparition d’une couleur rose-marron indique une
9.4.4.1.1 Retenir seulement les colonies qui sont:
réaction positive.
- Recherche de la lysine décarboxylase: négatif,
9.4.4.5 Recherche de l’exigence en calcium à
- Recherche de I’ornithine décarboxylase: positif,
37 “C
- Fermentation du rhamnose: négatif,
NOTE 10 Des repiquages à 37 “C peuvent conduire à la
perte de ce caractère.
- Fermentation du saccharose: positif,
9.4.4.5.1 Mettre en suspension dans une solution
- Hydrolyse du citrate: négatif.
saline (5.5) une fraction de chacune des colonies iso-
lées sur gélose nutritive (9.4.1) de façon à obtenir une
NOTES
suspension d’environ 1 O3 bactéries par millilitre.
8 De rares souches de Yersinia enterocolitica présumées
Ensemencer par étalement, 0,l ml de chaque sus-
pathogènes, saccharose négatives ont été isolées chez le
porc. pension sur
---------------------- Page: 12 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(F)
- deux boîtes de gélose caséine-soja (5.4.9) (boîtes
témoins), et
Tableau 1
Essai
Réaction
- deux boîtes de gélose caséine-soja au magnésium
et à I’oxalate (5.4.12).
Urée (9.4.2.1)
+
-
Incuber respectivement une boîte de chaque milieu Tryptophane désaminase (9.4.2.2)
pendant 48 h, à 25 “C et à 37 “C.
Glucose (9.4.2.3)
+
Formation de gaz à partir du glucose
-
9.4.4.5.2 La réaction est considérée comme positive
(9.4.2.3)
si, à 25 “C, les colonies ont une taille homogène et
-
Lactose (9.4.2.3)
si, à 37 “C, et en présence de magnésium et d’oxa-
-
Sulfure d’hydrogène (9.4.2.3)
late, on observe une inhibition de la culture; c’est-à-
-
dire une culture dissociée en petites colonies Oxydase (9.4.2.4)
d’environ 0,l mm de diamètre et en grandes colonies
-
Lysine décarboxylase (9.4.3.2)
de 0,5 mm à 1 mm de diamètre (avec une proportion
Ornithine décarboxylase (9.4.3.3)
+
de petites colonies supérieure à 20 %).
Saccharose (9.4.3.4)
+
Les colonies inhibées sont calcium dépendantes et -
Rhamnose (9.4.3.4)
présumées pathogènes.
-
Citrate (9.4.3.5)
-
Salicine (9.4.4.2)
/+”
9.4.5 Interprétation des essais biochimiques et
-
Esculine (9.4.4.3) /+”
de pathogénicité
-
Pyrazinamidase (9.4.4.4)
Les souches de Yersinia enterocoljtica présumées
Dépendance vis-a-vis du calcium à 37 “C
+
pathogènes donnent en général les réactions indi-
(9.4.4.5)
quées dans le tableau 1.
1) Le biotype 1 a (Américain) est salicine positif et
D’un point de vue épidémiologique, il est inté-
NOTE 11
esculine positif.
ressant de mettre en évidence les antigènes somatiques
Le biotype 1 e (Européen) est esculine positiflnégatif.
de Yersinia enterocolitica. Les souches présumées patho-
gènes, sérotypées en utilisant des antiséra appropriés, ap-
partiennent le plus fréquemment aux groupes 0:3, 0:8, 0:9,
11 Rapport d’essai
0:5, 27 et 0:13.
Le rapport d’essai doit indiquer la méthode utilisée, la
10 Expression des résultats
température d’incubation retenue et les résultats ob-
tenus. II doit, en outre, mentionner tous les détails
Selon les résultats de l’interprétation, indiquer la pré-
opératoires non prévus dans la présente Norme
sence ou l’absence de Yersinia enterocolitica présu-
internationale ou facultatifs, ainsi que les incidents
mée pathogène dans une prise d’essai de x g de
éventuels susceptibles d’avoir agi sur les résultats.
produit.
Le rapport d’essai doit donner tous les rensei-
gnements nécessaires à l’identification complète de
l’échantillon.
---------------------- Page: 13 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
Annexe A
(normative)
Schéma du mode opératoire
Prise d’essai (X g ou x ml)
Dilution I/I0 AIO0
Bouillon PSB (52.1)
Bouillon ITC (5.22)
ENRICHISSEMENT
Incubation de 22 “C h 25 “C Incubation h 25 “C pendant 48 h
pendant 2 h 3 jours sous
agitation ou 5 jours sans
. .
““yon m
Traitement alcalin (45 ml KOH)
pendant 20 s seulement
Gélose CIN (53.1) Gélose CIN (5.3.1)
Gélose SSDC (5.32)
Incubation h 30 “C Incubation h 30 “C
Incubation h 30 “C
pendant 24 h \ pendarZ4h ApendantZlhd48h
ISOLEMENT
5 colonies caract&istiques (sur chaque botte)
Isolement g dos e nutritive (5.3 .3)
Incubation
h 30 “C pendant 24 h
Tests présomptifs (9.42)
IDENTIFICATION
(urr?e; tryptophane; Kligler; oxydase)
BIOCHIMIQUE
Confirmation biochimique (9.4.3)
(lysine; ornithine; saccharose; rhamnose; citrate)
Essais prr%omptifs de pathogénicite (9.4.4)
ESSAIS DE
(salicine; esculine; pyrazinamidase)
PATHOGÉNCCITÉ
Interprétation (9.4.5)
---------------------- Page: 14 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
Annexe B
(normative)
Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs
B.1 Bouillon à la peptone, au sorbitol et B.2 Bouillon à I’irgasan, à la ticarcilline
aux sels biliaires (PSB) et au
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10273
Première édition
1994-12-15
Microbiologie - Directives générales pour
la recherche des Yersinia enterocolitica
présumées pathogènes
Microbiology - General guidance for the detection of presumptive
pathogenic Yersinia enterocolitica
Numéro de référence
ISO 10273: 1994(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
Sommaire
Page
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1 Domaine d’application
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Références normatives
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3 Définitions
1
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4 Principe
......................... 1
4.1 Enrichissement en milieux sélectifs liquides
...................................................... 2
4.2 Isolement et identification
........................................................................... 2
4.3 Confirmation
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
5 Milieux de culture et réactifs
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
5.1 Généralités
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Milieux d’enrichissement
2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.3 Milieux d’isolement
.......................................... 2
5.4 Milieux d’identification et réactifs
3
........................................................................
5.5 Solution saline
.......... 3
5.6 Solution d’hydroxyde de potassium en solution saline
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6 Appareillage et verrerie
3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7 Échantillonnage
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
9 Mode opératoire
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
9.1 Prise d’essai et suspensions initiales
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.2 Enrichissement
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.3 Isolement et identification
4
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9.4 Confirmation
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 Expression des résultats
7
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
11 Rapport d’essai
0 60 1994
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case Postale 56 l CH-1 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
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0 ISO
ISO 10273:1994(F)
Annexes
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
A Schéma du mode opératoire
B Composition et préparation des milieux de culture et des
9
réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
---------------------- Page: 3 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernemen-
tales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO colla-
bore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI)
en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 10273 a été élaborée par le comité technique
ISOnC 34, Produits agricoles ahmentaires, sous-comité SC 9, Micro-
biologie.
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente Norme interna-
tionale.
---------------------- Page: 4 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(F)
Introduction
La présente Norme internationale se propose de fournir des directives
générales pour l’examen de produits non concernés par les Normes
internationales existant actuellement, et à prendre en considération par les
organismes élaborant des méthodes d’essais microbiologiques destinées
à être appliquées à des produits alimentaires ou à des aliments pour ani-
maux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce do-
maine d’application, il est possible que ces directives, dans tous leurs
détails, ne conviennent pas exactement à certains produits et que, pour
certains autres produits, il puisse être nécessaire d’employer des métho-
des différentes. Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous
les efforts seront faits pour appliquer, chaque fois qu’il sera possible, ces
directives, et qu’on n’aura recours à des dérogations que si cela est ab-
solument nécessaire pour des raisons techniques.
Lorsque la présente Norme internationale sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure les directives auront été suivies et les raisons pour
lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de produits parti-
culiers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut pas être immédiate et,
pour certains groupes de produits, des Normes internationales et/ou des
normes nationales, qui ne concordent pas avec ces directives, existent
peut-être déjà. Dans le cas où des Normes internationales existent déjà
pour le produit à essayer, elles devront être appliquées, mais il serait
souhaitable que, lorsqu’elles viendront en révision, elles soient alignées
sur la présente Norme internationale, si bien que, finalement, les seules
divergences restantes seront celles qui sont nécessaires pour des raisons
techniques bien établies.
v ’
---------------------- Page: 5 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 6 ----------------------
NORME INTERNATIONALE 0 BO ISO 10273:1994(F)
- Directives générales pour la
Microbiologie
recherche des Yersinia enterocolitica présumées
pathogènes
3.1 Yersinia enferocolitica présumées pathogè-
1 Domaine d’application
nes: Bactéries psychrotrophes, formant des colonies
caractéristiques sur milieux sélectifs possédant les
La présente Norme internationale donne des directi-
propriétés biochimiques et répondant aux critères de
ves générales concernant la recherche des Yersinia
pathogénicité décrits lorsque l’essai est réalisé selon
enterocolitica présumées pathogènes pour l’homme.
la présente Norme internationale.
La présente Norme internationale est applicable aux
produits destinés à la consommation humaine ou à
3.2 recherche des Yersinia enterocolr’tica présu-
l’alimentation animale.
mées pathogènes: Détermination de la présence ou
de l’absence de ces bactéries dans une quantité dé-
terminée de produit, lorsque l’essai est réalisé selon
2 Références normatives
la présente Norme internationale.
Les normes suivantes contiennent des dispositions
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente
4 Principe
Norme internationale. Au moment de la publication,
les éditions indiquées étaient en vigueur. Toute
Recherche des Yersinia enterocolitica présumées
norme est sujette à révision et les parties prenantes
pathogènes selon les trois phases successives sui-
des accords fondés sur la présente Norme internatio-
vantes.
nale sont invitées à rechercher la possibilité d’appli-
quer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO
possèdent le registre des Normes internationales en 4.1 Enrichissement en milieux sélectifs
vigueur à un moment donné.
liquides
I SO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
Ensemencement de la prise d’essai dans deux milieux
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
d’enrichissement:
microbiologique.
- bouillon à la peptone, au sorbitol et aux sels biliai-
Règles générales pour
ISO 7218: -l), Microbiologie -
res (PSB), et
les examens microbiologiques.
- bouillon à I’irgasan, à la ticarcilline et au chlorate
de potassium (ITC).
3 Définitions
Incubation entre 22 “C et 25 “C pendant 48 h pour le
Pour les besoins de la présente Norme internationale, bouillon ITC et pendant 3 à 5 jours pour le bouillon
PSB.
les définitions suivantes s’appliquent.
1) À publier. (Révision de NS0 7218:1985)
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
5.3.2 Gélose Salmone/la/Shigella, au
4.2 Isolement et identification
désoxycholate de sodium et au chlorure de
ensemen- calcium (SSDC)
À partir des cultures obtenues en 4.1,
cement de deux milieux sélectifs solides:
Voir B.4.
- gélose à la cefsulodine, à I’irgasan et à la
novobiocine (CI N) et,
5.3.3 Gélose nutritive
- gélose SaImonella/Shigella, au désoxycholate de
Voir 8.5.
sodium et au chlorure de calcium (SSDC).
Incubation à 30 “C, puis examen après 24 h et, si né- 5.4 Milieux d’identification et réactifs
cessaire, après 48 h selon le milieu, pour contrôler s’il
y a présence de colonies caractéristiques de Yersinia
5.4.1 Milieu urée tryptophane
en terocolitica.
Voir B.6.
4.3 Confirmation
5.4.2 Réactif pour la recherche de la tryptophane
désaminase
Sur des colonies isolées, réalisation des essais
présomptifs de Yersinia enterocolitica, suivis des es-
Voir 8.7.
sais de confirmation biochimiques, et de critères de
pathogénicité et éventuellement sérologiques.
5.4.3 Gélose de Kligler
5 Milieux de culture et réactifs Voir 8.8.
5.4.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase
5.1 Généralités
Voir B.9.
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir
I’ISO 7218.
5.4.5 Milieux de décarboxylation
En raison du nombre important de milieux de culture
et de réactifs, il a été jugé préférable pour la clarté du
5.4.5.1 Milieu de décarboxylation de la lysine
texte, de donner leur composition et leur préparation
dans l’annexe B, qui inclut également des détails
Voir B.10.
concernant leur répartition, leur conservation, etc.
5.4.5.2 Milieu de décarboxylation de I’ornithine
5.2 Milieux d’enrichissement
Voir B.ll.
5.2.1 Bouillon à la peptone, au sorbitol et aux
5.4.6 Milieux pour la fermentation des glucides
sels biliaires (PSB)
(saccharose, rhamnose ou salicine)
Voir B.l .
Voir B.12.
5.2.2 Bouillon à I’irgasan, à la ticarcilline et au
5.4.7 Milieu au citrate de Simmons
chlorate de potassium (ITC)
Voir B.13.
Voir B.2.
5.4.8 Gélose à la bile et à I’esculine
5.3 Milieux d’isolement
Voir B. 14.
5.3.1 Gélose à la cefsulodine, à I’irgasan et à la
novobiocine (GIN) 5.4.9 Gélose caséine-soja
Voir B.15.
Voir B.3.
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 10273:1994(F)
0 ISO
6.8 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-
5.4.10 Gélose caséine-soja pour la recherche de
que, d’un diamètre de 90 mm à 100 mm.
la pyrazinamidase
Voir B.16.
6.9 Pipettes à écoulement total, à large ouverture,
de capacités nominales de 10 ml et 1 ml, graduées
5.4.11 Solution de sulfate de fer(N) ammoniacal
en 0,l ml.
pour la réu Slation de la pyrazinamidase
61 . 0 Poires en caoutchouc, ou tout autre sys tème
Voir B. 17.
de pipettage microbiologiquement sûr.
5.4.12 Gél ose caséine-soja au magnésium et à
6.11 Anse bouclée, d’environ 3 mm de diamètre,
I’oxalate
fil droit, en platine iridié ou en nickel-chrome, et/ou
baguette de verre (pipettes Pasteur).
Voir B.18.
NOTES
5.5 Solution saline
2 Des anses stériles en plastique à usage unique peuvent
Voir B.19. être également utilisées.
3 Le nickel-chrome ne convient pas pour l’essai à
5.6 Solution d’hydroxyde de potassium en
l’oxydase (voir 9.424).
solution saline
6.12 pH-mètre, précis à + 0,l unité de pH à 25 “C.
Voir B.20.
6.13 Éclairage, approprié pour une transillumination
6 Appareillage et verrerie
oblique.
NOTE 1 Le matériel à usage unique est acceptable au
même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
6.14 Loupe ou microscope
sont similaires.
6.15 Homogénéisateur péristaltique (stomacher)
ratoire de microbiologie, et
Matériel courant de labo
en partic ulier ce qui suit.
7 Échantillonnage
6.1 Appareils, pour la stérilisation en chaleur sè-
II est important que le laboratoire reçoive un échan-
che (four) ou en chaleur humide (autoclave)
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
Voir I’ISO 7218.
modifié lors du transport et de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
30 “C + 1 “C ou à
6.2 Étuve, réglable à
-
spécifiée dans la présente Norme internationale. S’il
37 “C + 1 “C.
n’y a pas de Norme internationale spécifique traitant
de l’échantillonnage du produit concerné, il est re-
6.3 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par
commandé que les parties concernées se mettent
37 “C + 1 “C et
convection, réglable entre -
d’accord à ce sujet.
55 “C + 1 “C.
-
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.4 Bains d’eau ou étuves, réglables entre
22 “C + 1 “C et 25 “C + - 1 “C, avec éventuellement
-
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
un système d’agitation approprié.
Norme internationale spécifique du produit concerné.
S’il n’y a pas de Norme internationale spécifique, il est
6.5 Bain d’eau, réglable entre 45 “C + 0,5 “C et
recommandé que les parties concernées se mettent
50 “C + 0,5 “C.
d’accord à ce sujet.
6.6 Tubes à essai, de 18 mm x 180 mm,
9 mm x 180 mm et 12 mm x 50 mm.
9 Mode opératoire
Voir le schéma en annexe A.
6.7 Fioles et/ou flacons, de capacité appropriée.
3
---------------------- Page: 9 ----------------------
0 ISO
ISO 10273:1994(F)
9.3.5 Après 24 h d’incubation, examiner les boîtes
9.1 Prise d’essai et suspensions initiales
à la loupe (6.14) ou en transillumination oblique afin
de rechercher la présence de colonies caractéris-
9.1.1 Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale
tiques de Yersinia enterocolitica:
concernant le produit à examiner.
a) Sur la gélose CIN, les colonies caractéristiques de
9.1.2 En général, pour préparer la première suspen-
Yersinia enterocohtica sont petites (< 1 mm), lis-
sion initiale, introduire une quantité (x) de prise d’essai
ses, à centre rouge, à bord translucide et, lors-
(masse ou volume) dans un volume connu de bouillon
qu’elles sont observées sous transillumination
PSB (5.2.1), de façon à obtenir un rapport prise
oblique (6.13), sont finement granuleuses et non
d’essai/milieu d’enrichissement de 1 /lO (rapport
irisées.
masse/volume ou volume/volume). Homogénéiser la
suspension en utilisant un homogénéisateur péristalti-
b) Sur gélose SSDC, les colonies caractéristiques de
que.
Yersinia enterocohtica sont petites (< 1 mm) et
grises avec un bord flou et lorsqu’elles sont ob-
9.1.3 Préparer la seconde suspension initiale, en
servées sous transillumination oblique, sont très
opérant de la même façon avec le bouillon ITC
finement granuleuses et non irisées.
(5.2.2), de façon à obtenir un rapport prise
d’essai/milieu d’enrichissement de 1 /lOO (rapport
9.3.6 Si le développement des colonies est lent, si
masse/volume ou volume/volume).
la coloration est faible ou s’il n’y a pas de colonie ca-
ractéristique, prolonger l’incubation des boîtes jusqu’à
48 h, puis les réexaminer.
9.2 Enrichissement
9.4 Confirmation
Incuber les deux susp ensions initiales (9.1.2 et 9.1.3)
de la façon suiva nte:
NOTE 4 Les galeries miniaturisées d’identification bio-
chimique, actuellement disponibles dans le commerce et
a) milieu PSB à 22 “C ou à 25 “C pendant 48 h à
permettant d’identifier les Yersinia enterocolitica, peuvent
72 h avec agitation ou pendant 5 jours sans agi-
être utilisées.
tation;
9.4.1 Choix des colonies pour les confirmations
b) milieu ITC à 25 “C pendant 48 h.
Pour les confirmations, prélever, à partir de chaque
9.3 Isolement et identification boîte de chacun des milieux sélectifs (voir 9.3.1 à
9.3.3), cinq colonies considérées comme typiques ou
Après incubation des milieux d’enrichissement (9.2),
suspectes.
procéder comme suit.
S’il se trouve une boîte avec moins de cinq colonies
typiques ou suspectes, retenir toutes les colonies ty-
9.3.1 À partir de la culture obtenue sur milieu
piques ou suspectes.
PSB Cg.2 a)] ensemencer à l’aide d’une anse (6.11) la
surface d’une boîte de gélose CIN (5.3.1) et étaler de
Ensemencer les colonies sélectionnées sur la surface
façon à obtenir des colonies bien séparées.
de boîtes de gélose nutritive (5.3.3), de façon à per-
mettre le développement de colonies bien isolées.
9.3.2 Avec une pipette stérile (6.9), transférer
Incuber les boîtes ainsi ensemencées à 30 “C pendant
0,5 ml de la culture obtenue sur milieu PSB [9.2a)]
24 h.
dans 4,5 ml de solution d’hydroxyde de potassium
(5.6) et agiter. Au bout de 20 s, ensemencer à l’aide
Conserver les géloses nutritives entre 0 “C et + 5 “C
d’une anse (6.11) la surface d’une boîte de gélose CIN
pour les essais de confirmation biochimique et de
(5.3.1) afin d’obtenir des colonies bien séparées.
pathogénicité.
9.3.3 À partir de la culture obtenue sur milieu
Utiliser des cultures pures pour les confirmations bio-
ITC [9.2 b)] ensemencer à l’aide d’une anse (6.11) la
chimiques et de pathogénicité.
surface d’une boîte de gélose SSDC (5.3.2) afin d’ob-
tenir des colonies bien séparées.
9.4.2 Tests présomptifs
À l’aide d’un fil droit ou d’une baguette de verre
9.3.4 Retourner les boîtes (9.3.1 à 9.3.3) et les pla-
(6.1 l), inoculer les milieux spécifiés en 9.4.2.1 à
cer dans l’étuve (6.2) réglée à 30 “C.
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0 ISO ISO 10273:1994(F)
tenues (9.4.1) et ensemencer par stries sur le papier-
9.4.2.3 et réaliser la recherche de l’oxydase décrite
en 9.4.2.4 avec chacune des cultures obtenues à filtre humecté de réactif (5.4.4) ou sur un disque
disponible dans le commerce. II ne faut pas utiliser
partir des colonies retenues en 9.4.1.
d’anse ni de fil en nickel chrome (voir 6.11, note 3).
9.4.2.1 Milieu de I’uréase
Considérer l’essai comme négatif si la couleur n’a pas
viré au mauve, violet ou bleu intense dans les
10 s.
Ensemencer le milieu liquide (5.4.1) juste au-dessous
de la surface.
9.4.3 Essais de confirmation biochimique
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
9.4.3.1 Sélection des colonies et mode opératoire
Une couleur rose-violette indique une réaction uréase
positive.
9.4.3.1.1 Poursuivre l’identification des colonies
Une couleur jaune orangé indique une réaction uréase présentant les caractéristiques suivantes:
négative.
- Recherche de I’uréase: positif,
9.4.2.2 Recherche de la tryptophane désaminase
- Recherche de la tryptophane désaminase: négatif,
Ajouter à la culture obtenue en 9.4.2.1, trois gouttes
- Fermentation du glucose: positif,
du réactif (5.4.2) pour la recherche de la tryptophane
désaminase.
- pas de formation de gaz à partir du glucose,
Une couleur brune indique une réaction positive.
- Fermentation du lactose: négatif,
9.4.2.3 Gélose de Kligler (5.4.3)
- pas de formation de H,S,
Ensemencer en stries la pente (B.8.2) de la gélose et - Recherche de l’oxydase: négatif.
le culot par piqûre jusqu’au fond de la gélose.
NOTES
Incuber à 30 “C pendant 24 h à 48 h.
5 Certaines souches de Yersinia enterocolitica lactose po-
sitif ont été isolées en particulier dans les produits laitiers.
du milieu de la façon
Interpréter les modifications
Elles ne sont en général pas pathogènes en l’état actuel de
suivante.
nos connaissances.
Culot
6 Des souches uréase négative ont été trouvées, mais
aucune n’est connue pour être pathogène.
glucose positif (fermen-
jaune:
tation du glucose)
7 Pour la formation de gaz à partir du glucose, quelques
rouge ou inchangé: glucose négatif (pas de
bulles peuvent être produites. Bien que Yersinia soit habi-
fermentation du glu-
tuellement considérée comme fermentant les glucides sans
cose) production de gaz, quelques souches de Yersinia entero-
colitica (comme Y. enterocolitica biovar 3) peuvent produire
formation de sulfure
noir:
une ou deux bulles (faible production de gaz).
d’hydrogène
formation de gaz à partir
bulles ou fissures:
9.4.3.1.2 À l’aide de l’anse bouclée, du fil droit ou
du glucose
d’une baguette de verre (6.11), ensemencer les mi-
Pente de la gélose lieux spécifiés en 9.4.3.2 à 9.4.3.5 avec chacune des
cultures obtenues à partir des colonies isolées (9.4.1)
lactose positif (utilisation
jaune:
sur gélose nutritive et sélectionnées en 9.4.3.1 .l .
du lactose)
lactose négatif (pas
rouge ou inchangée:
9.4.3.2 Milieu de décarboxylation de la lysine
d’utilisation du lactose)
(5.4.5.1)
9.4.2.4 Recherche de l’oxydase
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
surface.
À l’aide de la baguette de verre (6.1 l), prendre une
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
fraction de chacune des colonies caractéristiques re-
5
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0 60
ISO 10273:1994(F)
- /
9 Les Y. en terocolitica biovar 5 ont été trouvées négatives
Une couleur violette après incubation indique une ré-
pour I’orni thine décarboxylase.
action positive.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
9.4.4.1.2 À l’aide de l’anse bouclée, du fil droit ou
d’une baguette de verre (6.11) ensemencer les mi-
9.4.3.3 Milieu de décarboxylation de I’ornithine
lieux spécifiés de 9.4.4.2 à 9.4.4.4 avec chacune des
(5.4.5.2)
cultures obtenues à partir des colonies isolées (9.4.1)
sur gélose nutritive et sélectionnées en 9.4.4.1 .l .
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
surface.
9.4.4.2 Milieu pour la fermentation de la salicine
(5.4.6)
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
Une couleur violette après incubation indique une ré-
surface.
action positive.
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Une couleur jaune indique une réaction négative.
Une couleur jaune après incubation indique une réac-
9.4.3.4 Milieu pour la fermentation du
tion positive.
saccharose et du rhamnose (5.4.6)
Une couleur rouge indique une réaction négative.
Ensemencer le milieu liquide juste au-dessous de la
surface.
9.4.4.3 Milieu pour la recherche de I’esculine
(5.4.8)
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Une couleur jaune après incubation indique une réac-
Ensemencer en stries la pente (B.14.2) de la gélose.
tion positive.
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Une coloration rouge indique une réaction négative.
Une auréole noire autour des colonies indique une
réaction positive.
9.$.3.5 Milieu de Simmons pour l’hydrolyse du
citrate (5.4.7)
9.4.4.4 Milieu pour la recherche de la
Ensemencer en stries la pente (B.13.2) de la gélose.
pyrazinamidase (5.4.10)
Incuber à 30 “C pendant 24 h.
Ensemencer une grande superficie de la pente de la
gélose (B. 16.2).
La réaction est positive lorsque le milieu vire au bleu.
Incuber à 30 “C pendant 48 h.
9.4.4 Essais présomptifs de la pathogénicité
Ajouter 1 ml de la solution de sulfate de fer(ll) am-
9.4.4.1 Sélection des colonies et mode opératoire
moniacal à 1 % (5.4.11).
L’apparition d’une couleur rose-marron indique une
9.4.4.1.1 Retenir seulement les colonies qui sont:
réaction positive.
- Recherche de la lysine décarboxylase: négatif,
9.4.4.5 Recherche de l’exigence en calcium à
- Recherche de I’ornithine décarboxylase: positif,
37 “C
- Fermentation du rhamnose: négatif,
NOTE 10 Des repiquages à 37 “C peuvent conduire à la
perte de ce caractère.
- Fermentation du saccharose: positif,
9.4.4.5.1 Mettre en suspension dans une solution
- Hydrolyse du citrate: négatif.
saline (5.5) une fraction de chacune des colonies iso-
lées sur gélose nutritive (9.4.1) de façon à obtenir une
NOTES
suspension d’environ 1 O3 bactéries par millilitre.
8 De rares souches de Yersinia enterocolitica présumées
Ensemencer par étalement, 0,l ml de chaque sus-
pathogènes, saccharose négatives ont été isolées chez le
porc. pension sur
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0 ISO
ISO 10273:1994(F)
- deux boîtes de gélose caséine-soja (5.4.9) (boîtes
témoins), et
Tableau 1
Essai
Réaction
- deux boîtes de gélose caséine-soja au magnésium
et à I’oxalate (5.4.12).
Urée (9.4.2.1)
+
-
Incuber respectivement une boîte de chaque milieu Tryptophane désaminase (9.4.2.2)
pendant 48 h, à 25 “C et à 37 “C.
Glucose (9.4.2.3)
+
Formation de gaz à partir du glucose
-
9.4.4.5.2 La réaction est considérée comme positive
(9.4.2.3)
si, à 25 “C, les colonies ont une taille homogène et
-
Lactose (9.4.2.3)
si, à 37 “C, et en présence de magnésium et d’oxa-
-
Sulfure d’hydrogène (9.4.2.3)
late, on observe une inhibition de la culture; c’est-à-
-
dire une culture dissociée en petites colonies Oxydase (9.4.2.4)
d’environ 0,l mm de diamètre et en grandes colonies
-
Lysine décarboxylase (9.4.3.2)
de 0,5 mm à 1 mm de diamètre (avec une proportion
Ornithine décarboxylase (9.4.3.3)
+
de petites colonies supérieure à 20 %).
Saccharose (9.4.3.4)
+
Les colonies inhibées sont calcium dépendantes et -
Rhamnose (9.4.3.4)
présumées pathogènes.
-
Citrate (9.4.3.5)
-
Salicine (9.4.4.2)
/+”
9.4.5 Interprétation des essais biochimiques et
-
Esculine (9.4.4.3) /+”
de pathogénicité
-
Pyrazinamidase (9.4.4.4)
Les souches de Yersinia enterocoljtica présumées
Dépendance vis-a-vis du calcium à 37 “C
+
pathogènes donnent en général les réactions indi-
(9.4.4.5)
quées dans le tableau 1.
1) Le biotype 1 a (Américain) est salicine positif et
D’un point de vue épidémiologique, il est inté-
NOTE 11
esculine positif.
ressant de mettre en évidence les antigènes somatiques
Le biotype 1 e (Européen) est esculine positiflnégatif.
de Yersinia enterocolitica. Les souches présumées patho-
gènes, sérotypées en utilisant des antiséra appropriés, ap-
partiennent le plus fréquemment aux groupes 0:3, 0:8, 0:9,
11 Rapport d’essai
0:5, 27 et 0:13.
Le rapport d’essai doit indiquer la méthode utilisée, la
10 Expression des résultats
température d’incubation retenue et les résultats ob-
tenus. II doit, en outre, mentionner tous les détails
Selon les résultats de l’interprétation, indiquer la pré-
opératoires non prévus dans la présente Norme
sence ou l’absence de Yersinia enterocolitica présu-
internationale ou facultatifs, ainsi que les incidents
mée pathogène dans une prise d’essai de x g de
éventuels susceptibles d’avoir agi sur les résultats.
produit.
Le rapport d’essai doit donner tous les rensei-
gnements nécessaires à l’identification complète de
l’échantillon.
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ISO 10273:1994(F)
Annexe A
(normative)
Schéma du mode opératoire
Prise d’essai (X g ou x ml)
Dilution I/I0 AIO0
Bouillon PSB (52.1)
Bouillon ITC (5.22)
ENRICHISSEMENT
Incubation de 22 “C h 25 “C Incubation h 25 “C pendant 48 h
pendant 2 h 3 jours sous
agitation ou 5 jours sans
. .
““yon m
Traitement alcalin (45 ml KOH)
pendant 20 s seulement
Gélose CIN (53.1) Gélose CIN (5.3.1)
Gélose SSDC (5.32)
Incubation h 30 “C Incubation h 30 “C
Incubation h 30 “C
pendant 24 h \ pendarZ4h ApendantZlhd48h
ISOLEMENT
5 colonies caract&istiques (sur chaque botte)
Isolement g dos e nutritive (5.3 .3)
Incubation
h 30 “C pendant 24 h
Tests présomptifs (9.42)
IDENTIFICATION
(urr?e; tryptophane; Kligler; oxydase)
BIOCHIMIQUE
Confirmation biochimique (9.4.3)
(lysine; ornithine; saccharose; rhamnose; citrate)
Essais prr%omptifs de pathogénicite (9.4.4)
ESSAIS DE
(salicine; esculine; pyrazinamidase)
PATHOGÉNCCITÉ
Interprétation (9.4.5)
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ISO 10273:1994(F)
Annexe B
(normative)
Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs
B.1 Bouillon à la peptone, au sorbitol et B.2 Bouillon à I’irgasan, à la ticarcilline
aux sels biliaires (PSB) et au
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.