ISO 11053:2009

Vegetable fats and oils — Determination of cocoa butter equivalents in milk chocolate

ISO 11053:2009 specifies a procedure for the detection and quantification of cocoa butter equivalents (CBEs) and milk fat in milk chocolate by triacylglycerol profiling using high-resolution capillary gas-liquid chromatography, and subsequent data evaluation by simple and partial least-squares regression analysis. CBE admixtures can be detected at a minimum level of 0,5 g CBE/100 g milk chocolate and quantified at a level of 5 % mass fraction CBE addition to milk chocolate with a predicted error of 0,7 g CBE/100 g milk chocolate.

Corps gras d'origine végétale — Détermination des équivalents au beurre de cacao dans le chocolat au lait

L'ISO 11053:2009 spécifie une méthode de détection et de quantification des équivalents au beurre de cacao (EBC) et matière grasse du lait dans le chocolat au lait par établissement de profils de triacylglycérols en utilisant la chromatographie gaz-liquide sur colonne capillaire haute résolution ainsi que les évaluations subséquentes des données par analyse de régression simple ou partielle des moindres carrés. Les adjuvants d'EBC peuvent être détectés à un niveau minimal de 0,5 g d'EBC/100 g de chocolat au lait et évalués quantitativement à un niveau d'ajout de 5 % en fraction massique d'EBC au chocolat au lait, avec une erreur prévue de 0,7 g d'EBC/100 g de chocolat au lait.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 18-Aug-2009
• ICS: 67.190 - Chocolate
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 16-Jun-2020

Standards Content (Sample)

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 11053
Первое издание
2009-09-01


Растительные жиры и масла.
Определение эквивалентов масла
какао в молочном шоколаде
Vegetable fats and oils — Determination of cocoa butter equivalents in
milk chocolate



Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 11053:2009(R)
©
ISO 2009

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или вывести на экран, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на загрузку интегрированных шрифтов в компьютер, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.


ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ


©  ISO 2009
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по соответствующему адресу, указанному ниже, или комитета-члена ISO в стране
заявителя.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии

ii © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
1 Область применения .1
2 Термины и определения .1
3 Сущность метода.1
4 Реактивы, растворы и эталоны.2
5 Аппаратура и оборудование .4
6 Отбор проб.5
7 Приготовление образцов.5
7.1 Приготовление IRMM-801 для калибровки и проверки пригодности системы.5
7.2 Приготовление чистого молочного жира для проверки пригодности системы.5
7.3 Приготовление образца шоколада .5
8 Процедура.7
8.1 Построение калибровочной кривой для определения содержания PSB .7
8.2 Разделение отдельных TAGs в IRMM-801 методом HR-GLC.8
8.3 Разделение отдельных TAGs чистого MF методом HR-GLC .8
8.4 Разделение отдельных TAGs шоколадного жира методом HR-GLC.8
8.5 Идентификация.9
9 Вычисление.9
9.1 Количественное определение PSB и MF в шоколадном жире и шоколаде .9
9.2 Обнаружение CBE в шоколадном жире .11
9.3 Количественное определение CBE в шоколадном жире и шоколаде .13
10 Процедурные требования .14
10.1 Общие рассуждения.14
10.2 Пригодность системы .14
11 Прецизионность.15
11.1 Межлабораторное испытание.15
11.2 Повторяемость .15
11.3 Воспроизводимость .15
12 Протокол испытания.16
Приложение А (информативное) Результаты межлабораторного испытания .17
Приложение В (информативное) Пример хроматограмм.21
Библиография.24

© ISO 2009 – Все права сохраняются iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. ISO осуществляет тесное сотрудничество с международной
электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам стандартизации в области электротехники.
Проекты международных стандартов разрабатываются по правилам, указанным в Директивах ISO/IEC,
Часть 2.
Главная задача технических комитетов состоит в разработке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Обращается внимание на возможность патентования некоторых элементов данного международного
стандарта. ISO не несет ответственности за идентификацию какого-либо или всех таких патентных
прав.
ISO 11053 подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты, Подкомитетом SC 11,
Жиры и масла животные и растительные.


iv © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 4 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 11053:2009(R)

Растительные жиры и масла. Определение эквивалентов
масла какао в молочном шоколаде
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод для обнаружения и количественного
определения эквивалентов масла какао (CBEs) и молочного жира (MF) в молочном шоколаде
посредством анализа профиля триацилглицеролов (TAG) с использованием высокоэффективной
капиллярной газожидкостной хроматографии (HR-GLC) и последующей оценки данных на основе
анализа регрессии простых и частных наименьших квадратов. Примеси CBE могут быть обнаружены
при минимальном уровне 0,5 г CBE/100 г молочного шоколада и определены количественно при
уровне 5 % массовой доли добавки CBE к молочному шоколаду с прогнозируемой погрешностью 0,7 г
CBE/100 г молочного шоколада.
2 Термины и определения
Применительно к этому документу используются следующие термины и определения.
2.1
содержание молочного жира в молочном шоколаде
milk fat content of milk chocolate
массовая доля молочного жира в молочном шоколаде, определенная методом, установленным в
настоящем международном стандарте
ПРИМЕЧАНИЕ Массовая доля выражена в граммах на 100 г молочного шоколада.
2.2
эквиваленты масла какао
cocoa butter equivalents
растительные жиры и масла не какао, обнаруживаемые в молочном шоколаде методом, описанным в
этом международном стандарте
ПРИМЕЧАНИЕ Результат выражен качественно, т.е. CBEs присутствуют/CBEs не присутствуют (ДА/НЕТ).
2.3
содержание эквивалентов масла какао в молочном шоколаде
cocoa butter equivalent content of milk chocolate
массовая доля веществ, определенная методом, установленным в этом международном стандарте
ПРИМЕЧАНИЕ Массовая доля выражена в граммах на 100 г молочного шоколада.
3 Сущность метода
Испытательные образцы, т.е. шоколадные жиры, полученные из молочного шоколада методом
быстрого экстрагирования жира, разделяют посредством HR-GLC на фракции TAG в соответствии с их
молекулярной массой и степенью ненасыщенности. Отдельные фракции TAG, i.e. 1-пальмитоил-2-
стеароил-3-бутироил-глицерол (PSB), 1,3-дипальмитоил-2-олеоил-глицерол (POP), 1-пальмитоил-2-
олеоилl-3-стеароил-глицерол (POS), 1-пальмитоил-2,3-диолеоил-глицерол (POO), 1,3-дистеароил-2-
олеоил-глицерол (SOS) и 1-стеароилl-2,3-диолеоилl-глицерол (SOO), используются, чтобы:
© ISO 2009 – Все права сохраняются 1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
a) вычислить содержание MF в шоколадном жире (граммы MF на 100 г шоколадного жира);
b) определить присутствие/отсутствие CBEs в шоколадном жире, используя модель простой
линейной регрессии на основе трех TAGs, POP, POS, и SOS, с поправкой на вклад TAG,
обусловленный MF, и установить, показывает ли данный метод, что образец не является чистым
маслом какао (CB);
c) определить количество примеси CBE в шоколадном жире (граммы CBE на 100 г шоколадного
жира), используя модель регрессии частных наименьших квадратов (PLS) с шестью входными
переменными, т.е. с пятью TAGs, POP, POS, POO, SOS и SOO, нормированными к 100 %, и
определенным содержанием MF в шоколадном жире.
Чтобы обеспечить правильное этикетирование молочного шоколада, результаты, полученные для
шоколадного жира, преобразуют в граммы MF на 100 г шоколада и граммы CBE на 100 г шоколада,
для чего требуется точное определение общего содержания жира в шоколаде методом
[5]
экстрагирования Сокслета (на основе официального метода AOAC 963.15 ). Если метод обнаружения
подтверждает отсутствие CBEs в шоколадном жире, то нет необходимости в количественном
определении общего содержания жира.
4 Реактивы, растворы и эталоны
ПРИМЕЧАНИЕ Используются реактивы только признанного аналитического класса, если нет других указаний.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Имеется регламент для работы с опасными веществами. Должны
соблюдаться меры технической, организационной и индивидуальной безопасности.
1)
4.1 Аттестованный стандартный образец (IRMM-801) масла какао (см. Ссылку [6]) о калибровке
и проверке пригодности системы.
4.2 Чистый молочный жир, для проверки пригодности системы.
2)
4.3 1-Пальмитоил-2-стеароил-3-бутироил-глицерол (PSB) .
4.3.1 Общие положения
Для целей калибровки растворяют ~40 мг PSB в мерной колбе вместимостью 50 мл (5.9) с изооктаном,
получая исходный раствор ~ρ = 0,8 мг/мл. Тщательно перемешивают до полного растворения.
Из исходного раствора PSB готовят серию из пяти калибровочных растворов в пределах матрицы
(IRMM-801), отвешивая на аналитических весах (5.1) IRMM-801 (4.1) в мерные колбы вместимостью
25 мл (5.9) и добавляя соответствующие объемы исходного раствора PSB, как представлено в
Таблице 1. Дополняют до метки изооктаном.

1) Доступно для приобретения в Институте стандартных образцов и измерений (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/),
Бельгия. Эта информация дается для удобства пользователей настоящего международного стандарта и не
является поддержкой этого продукта со стороны ISO.
2) Доступно для приобретения в Лародане (http://www.larodan.se/), Швеция. Эта информация дается для
удобства пользователей настоящего международного стандарта и не является поддержкой этого продукта со
стороны ISO. Можно использовать аналогичные продукты, если есть данные, что они дают такие же результаты.
2 © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
Таблица 1 — Массы IRMM-801 и объемы исходного раствора PSB
для приготовления серии калибровочных растворов PSB в пределах матрицы
Концентрация Окончательная
IRMM-801 (4.1),
Объем, взятый из
PSB в концентрация
отвешенный в
Калибровочный исходного раствора PSB и
калибровочном IRMM-PSB в
мерную колбу
раствор добавленный в мерную
растворе растворе
вместимостью 25 мл
колбу вместимостью 25 мл
ρ i ρ
PSB IRMM-PSB
мг мл мг/мл мг/мл
1 ~250 4 0,128 ~10
2 ~250 3 0,096 ~10
3 ~250 2 0,064 ~10
4 ~250 1 0,032 ~10
5 ~250 0,5 0,016 ~10
4.3.2 Холодная инжекция на колонке (OCI)
Разбавляют каждый калибровочный раствор изооктаном, ϕ = 1 мл/5 мл, чтобы получить окончательную
концентрацию IRMM-PSB (ρ ) ~2 мг/мл в каждом растворе и концентрации PSB (ρ ) в
IRMM-PSB PSB
диапазоне от 0,025 6 мг/мл (калибровочный раствор 1) до 0,003 2 мг/мл (калибровочный раствор 5).
4.3.3 Инжекция с делением потока (например, отношение деления 1:10)
Разбавляют каждый калибровочный раствор изооктаном, ϕ = 1 мл/2 мл, чтобы получить окончательную
концентрацию IRMM-PSB (ρ ) ~5 мг/мл в каждом растворе и концентрации PSB (ρ ) в
IRMM-PSB PSB
диапазоне от 0,064 мг/мл (калибровочный раствор 1) до 0,008 мг/мл (калибровочный раствор 5).
ПРИМЕЧАНИЕ Окончательные концентрации PSB вычисляют, используя фактическую массу в исходном
стандартном растворе.
3)
4.4 α-Холестан , ρ = 100 мг/100 мл, используемый как внутренний раствор.
Растворяют ~50 мг α-холестана в 50 мл изооктана.
⎯ Для холодной инжекции на колонке: Разбавить 1:250 (ρ = 0,004 мг/мл).
⎯ Для инжекции с делением потока (например, отношение деления потока 1:10): Разбавить 1:100
(ρ = 0,01 мг/мл).
4.5 Растворитель жира, нехлорированные растворители (например, нефтяной эфир, n-гексан, n-
гептан, изооктан).
4.6 Соляная кислота, c(HCl) = 4 моль/л.

3) Можно получить в Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/), Бельгия.
© ISO 2009 – Все права сохраняются 3

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
5 Аппаратура и оборудование
5.1 Аналитические весы, считываемость до 0,1 мг.
5.2 Сушильный шкаф. Можно использовать сухой нагревательный блок.
4)
5.3 Фильтровальная бумага, диаметр 15 см [например, S&S 589/1 ].
5.4 Пищевая терка, кухонный блендер с двигателем над смесительной камерой для
предотвращения расплавления образцов.
5.5 Роторный испаритель. Можно использовать альтернативные процедуры испарения.
5.6 Испарительный блок, с подачей азота.
5.7 Эксикатор, герметический сосуд, содержащий осушающие вещества, используемый для
хранения гигроскопичных материалов.
5.8 Экстрактор Сокслета, со стандартными конусными соединениями, вместимостью сифона
~100 мл (экстракционная гильза 33 мм × 88 мм), колбой Эрленмейера вместимостью 250 мл и
регулируемым нагревательным кожухом (или аналогичным).
5.9 Мерные колбы, вместимостью 10 мл, 25 мл, 50 мл и 100 мл (или другие вместимость, если
[2]
необходимо), ISO 1042 класс A.
[1]
5.10 Пипетки, вместимостью от 1 мл до 10 мл (или другие вместимости, если необходимо), ISO 648
[4]
класс A или ISO 8655-2 .
5.11 Микрошприц, с максимальным объемом 10 мкл, градуированный до 0,1 мкл, или
автоматический дозатор.
5.12 Газовый хроматограф (GC), оснащенный системой холодной инжекции на колонке или
системой инжекции с делением потока и пламенно-ионизационным детектором (FID).
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Можно использовать альтернативные инжекционные системы [например, испаритель с
программируемой температурой (PTV) или инжектор с подвижной иглой], если они обеспечивают такие же
результаты, как в 10.2.
Разделение и измерение количества оказываются удовлетворительными, если соблюдаются
следующие условия:
GLC колонка: CB-TAP 25 м × 0,25 мм (внутренний диаметр), кварцевая капиллярная
колонка, покрытая термоустойчивой среднеполярной
фенилметилполисилоксановой неподвижной фазой с толщиной пленки
0,10 мкм
Программа сушильного100 °C поддерживается не менее 2 мин; 30 °C/мин до 270 °C
шкафа для OCI:поддерживается 1 мин; 2,5 °C/мин до 340 °C поддерживается 7 мин
Программа сушильного 200 °C поддерживается не менее 1 мин; 14 °C/мин до 270 °C
шкафа для деления поддерживается 1 мин; 2,5 °C/мин до 340 поддерживается 10 мин

4) Черная бумажная лента S&S 589/1 является примером подходящего продукта, имеющегося в продаже.
Информация дается для удобства пользователя и не является поддержкой продукта со стороны ISO. Можно
использовать аналогичные продукты, если есть данные, что они дают такие же результаты
4 © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
потока:
Детектор (FID): 360 °C
Газ-носитель для OCI: H (чистота W 99,999 %) с постоянной скоростью течения 3,5 мл/мин
2
(другим подходящим газом-носителем является гелий)
Газ-носитель для деления H (чистота W 99,999 %) с постоянной скоростью течения 25 мл/мин
2
потока: (другим подходящим газом-носителем является гелий)
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Колонки и альтернативные условия эксперимента, используемые в международном
совместном исследовании (см. Ссылку [7]), приведены в Таблице A 1. Рабочие условия можно изменять для
получения оптимального разделения.
5.13 Хроматографическая система данных.
6 Отбор проб
Отбор проб не является частью метода, установленного в этом международном стандарте.
[3]
Рекомендованный метод отбора проб дан в ISO 5555 . В лабораторию должна быть отправлена
репрезентативная проба. Она не должна быть повреждена или изменена во время транспортировки
или хранения.
7 Приготовление образцов
7.1 Приготовление IRMM-801 для калибровки и проверки пригодности системы
Перед вскрытием ампулы и использованием IRMM-801 (4.1) ампулу нагревают в сушильном шкафу
(5.2), до тех пор пока содержимое не расплавится. Когда получен прозрачный раствор, содержимое
перемешивают, многократно переворачивая ампулу не менее 20 с. Затем её открывают и переносят
содержимое в чистую склянку, которую можно герметично закупорить и хранить в холодном месте для
будущего использования.
7.2 Приготовление чистого молочного жира для проверки пригодности системы
Если нет чистого MF, его можно получить из пробы масла, растапливая и перенося слой жира через
складчатую фильтровальную бумагу (5.3) при 50 °C в сушильный шкаф (5.2).
7.3 Приготовление образца шоколада
7.3.1 Общие положения
Охлаждают приблизительно 200 г шоколада до твердого состояния и растирают до мелкозернистого
состояния, используя пищевую терку (5.4). Тщательно перемешивают и хранят в плотно закупоренной
бутылке в холодном месте.
7.3.2 Быстрая экстракция жира
Шоколадный жир выделяют из 5 г тертого шоколада (7.3.1) путем экстрагирования, применяя от двух
до трех порций по 10 мл подходящего растворителя жира (4.5). Центрифугируют и декантируют.
Объединяют экстракты, выпаривают (5.5) большую часть растворителя жира и, наконец, сушат в
потоке азота (5.6).
Шоколадный жир, полученный быстрой экстракцией, используется для окончательного анализа TAG
методом HR-GLC. Для обнаружения CBEs в шоколаде точное количества общего жира не требуется.
Если CBEs не обнаружены, вторая часть стандарта, т.е. количественное определение CBEs
© ISO 2009 – Все права сохраняются 5

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
относительно установленного предела 5 %, не нужна. Если CBEs обнаружены, количественное
определение должно быть выполнено с использованием того же профиля TAG, который
использовался для обнаружения CBE. Однако в этом случае определяют точное количество общего
жира в шоколаде по процедуре 7.3.3. Можно использовать альтернативные процедуры экстракции,
если они дают такие же результаты.
7.3.3 Определение содержания общего жира
Отделяют шоколадный жир и определяют общее содержание жира в образце молочного шоколада
[5]
(приготовленного по 7.3.2) экстракцией Сокслета (на основе официального метода AOAC 963.15 )
следующим образом.
Навеску (5.1) шоколада массой от 4 г до 5 г помещают в лабораторный стакан вместимостью от 300 мл
до 500 мл. Медленно добавляют при помешивании 45 мл кипящей воды для получения однородной
суспензии. Добавляют 55 мл HCl (4.6) и немного обезжиренной кипящей стружки или другое средство
против бурления и перемешивают. Закрывают часовым стеклом, медленно доводят раствор до
кипения и медленно кипятят в течение 15 мин. Промывают часовое стекло в 100 мл воды. Фильтруют
раствор через гофрированную фильтровальную бумагу (5.3) или аналогичную, промывая стакан водой
три раза. Продолжают промывание, пока последняя порция фильтрата не будет свободной от хлора.
Переносят фильтр с образцом в обезжиренную экстракционную гильзу и сушат 2 ч в небольшом
лабораторном стакане при 100 °C. Покрывают тампоном из стекловаты фильтровальную бумагу.
Добавляют немного стружки против бурления в колбу Эрленмейера вместимостью 250 мл и сушат в
течение 1 ч при 100 °C. Охлаждают стакан до комнатной температуры в эксикаторе (5.7), затем его
взвешивают (5.1). Помещают гильзу, содержащую высушенный образец в аппарат Сокслета (5.8), где
она поддерживается спиралью или стеклянными бусами. Промывают варочный стакан, сушильный
стакан и часовое стекло тремя порциями петролейного эфира по 50 мл и добавляют остаток промывки
в гильзу. Орошают вываренный образец в течение 4 ч, регулируя нагрев, так чтобы сифон экстрактора
переливался более 30 раз. Извлекают колбу и выпаривают растворитель. Сушат колбу при 102 °C до
получения постоянной массы (1,5 ч). Охлаждают в эксикаторе (5.7) до комнатной температуры, затем
взвешивают (5.1). Постоянная масса достигается, когда последующие периоды сушки по 1 ч
последовательно показывают потерю жира < 0,05 %. Параллельные определения должны
соответствовать друг другу в пределах 0,1 % жира.
Массовая доля, выраженная в процентах, общего жира в шоколаде, w , определяется
fat; choc
уравнением:
m ×100
fat
w = (1)
fat; choc
m
где
m масса, в граммах, взятого шоколада;
m масса, в граммах, общего жира, полученного из шоколада экстракцией по Сокслету (на
fat
[5]
основе официального метода AOAC 963.15 ).
Можно использовать альтернативные методы экстракции (например, ускоренная экстракция
растворителем, использование сверхкритического углекислого газа или СВЧ-диапазона), при условии
что они дают такие же результаты. Шоколадный жир, полученный экстракцией по Сокслету, не следует
использовать для анализа TAG посредством HR-GLC, поскольку в некоторых случаях могут
наблюдаться изменения в полученном профиле TAG.
Результаты записывают до двух десятичных знаков.
6 © ISO 2009 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
8 Процедура
8.1 Построение калибровочной кривой для определения содержания PSB
Готовят пять калибровочных растворов, содержащих различные концентрации PSB (4.3), но всегда
одну и ту же концентрацию α-холестана (4.4), а именно.
Для холодной инжекции на колонке (OCI) :
⎯ Калибровочный раствор 1 (Окончательные концентрации ρ = 0,012 8 мг/мл ρ
PSB 1 α-
= 0,002 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 1 (ρ = 0,025 6 мг/мл; 4.3) в
cholestane 1 PSB 1
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,004 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 2 (Окончательные концентрации ρ = 0,009 6 мг/мл; ρ
PSB 2 α-
= 0,002 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 2 (ρ = 0,019 2 мг/мл; 4.3) в
cholestane 2 PSB 2
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,004 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 3 (Окончательные концентрации ρ = 0,006 4 мг/мл; ρ
PSB 3 α-
= 0,002 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 3 (ρ = 0,012 8 мг/мл; 4.3) в
cholestane 3 PSB 3
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,004 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 4 Окончательные концентрации ρ = 0,003 2 мг/мл; ρ
PSB 4 α-
= 0,002 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 4 (ρ = 0,006 4 мг/мл; 4.3) в
cholestane 4 PSB 4
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,004 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 5 (Окончательные концентрации ρ = 0,001 6 мг/мл; ρ
PSB 5 α-
= 0,002 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 5 (ρ = 0,003 2 мг/мл; 4.3) в
cholestane 5 PSB 5
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,004 мг/мл; 4.4).
Инжектируют 0,5 мкл каждого калибровочного раствор в HR-GLC систему методом холодной инжекции
на колонке.
Для инжекции с делением потока:
⎯ Калибровочный раствор 1 (Окончательные концентрации ρ = 0,032 мг/мл; ρ
PSB 1 α-
= 0,005 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 1 (ρ = 0,064 мг/мл; 4.3) в
cholestane 1 PSB 1
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,01 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 2 (Окончательные концентрации ρ = 0,024 мг/мл; ρ
PSB 2 α-
= 0,005 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 2 (ρ = 0,048 мг/мл; 4.3) в
cholestane 2 PSB 2
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,01 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 3 (Окончательные концентрации ρ = 0,016 мг/мл; ρ
PSB 3 α-
= 0,005 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 3 (ρ = 0,032 мг/мл; 4.3) в
cholestane 3 PSB 3
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,01 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 4 (Окончательные концентрации ρ = 0,008 мг/мл; ρ
PSB 4 α-
= 0,005 mg/ml): Переносят 1 мл калибровочного раствора 4 (ρ = 0,016 мг/мл; 4.3) в
cholestane 4 PSB 4
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,01 мг/мл; 4.4).
⎯ Калибровочный раствор 5 (Окончательные концентрации ρ = 0,004 мг/мл; ρ
PSB 5 α-
= 0,005 мг/мл): Переносят 1 мл калибровочного раствора 5 (ρ = 0,008 mg/ml; 4.3) в
cholestane 5 PSB 5
пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (ρ = 0,01 мг/мл; 4.4).
Инжектируют 1 мкл окончательного испытательного раствора в HR-GLC систему методом инжекции с
делением потока.
Можно использовать альтернативные количества образцов и инжекторы, при условии что
применяемая система обнаружения дает линейную характеристику и соответствует критериям
пригодности системы (10.2).
© ISO 2009 – Все права сохраняются 7

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 11053:2009(R)
8.2 Разделение отдельных TAGs в IRMM-801 методом HR-GLC
Аттестованный стандартный образец масла какао IRMM-801 (4.1) следует нагревать в сушильном
шкафу (5.2) до полного расплавления. Пипетки (или аналогичные инструменты), используемые для
переноса образца во время операций взвешивания, должны быть доведены до температуры ~55 °C в
сушильном шкафу для избежания частичного расщепления жира при работе с образцами.
Для холодной инжекции на колонке (OCI): Навеску (5.1) массой ~0,1 г IRMM-801 (4.1) помещают в
мерную колбу вместимостью 10 мл (5.9) и разбавляют до метки изооктаном (4.5). Пипеткой (5.10)
емкостью 1 мл вводят полученный раствор в другую мерную колбу емкостью 50 мл (5.9) и разбавляют
до метки таким же растворителем (ρ = 0,2 мг/мл). Инжектируют 0,5 мкл окончательного испытательного
раствора в HR-GLC систему посредством холодной инжекции на колонке.
Для инжекции с делением потока: Навеску (5.1) массой ~0,1 г IRMM-801 (4.1) помещают в мерную
колбу вместимостью 10 мл (5.9) и разбавляют до метки изооктаном (4.5). Пипеткой (5.10) емкостью
1 мл вводят полученный раствор в другую мерную колбу емкостью 10 мл (5.9) и разбавляют до метки
таким же растворителем (ρ = 1 мг/мл). Инжектируют 1 мкл окончательного испытательного раствора в
HR-GLC систему посредством инжектирования с делением потока.
Можно использовать альтернативные растворители жира, количества образцов и инжекторы, при
условии что применяемая система обнаружения дает линейную характеристику и соответствует
критериям пригодности системы (10.2).
8.3 Разделение отдельных TAGs чистого MF методом HR-GLC
Для холодной инжекции на колонке (OCI): Навеску (5.1) массой ~0,1 г чистого MF (4.2) помещают в
мерную колбу вместимостью 50 мл (5.9) и разбавляют до метки изооктаном (4.5) (ρ = 1 мг/мл).
Переносят 1 мл этого раствора в пробирку и добавляют 1 мл раствора α-холестана (4.4) (в полученном
растворе ρ = 0,5 мг/мл). Инжектируют 0,5 мкл окончательного испытательного раствора в HR-GLC
систему посредством холодной инжекции на колонке.
Для инжекции с делением потока: Навеску (5.1) массой ~0,25 г чистого MF (4.2) помещают в
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11053
First edition
2009-09-01


Vegetable fats and oils — Determination
of cocoa butter equivalents in milk
chocolate
Corps gras d'origine végétale — Détermination des équivalents au
beurre de cacao dans le chocolat au lait




Reference number
ISO 11053:2009(E)
©
ISO 2009

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.


COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT


©  ISO 2009
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland

ii © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 1
4 Reagents, solutions and standards . 2
5 Apparatus and equipment . 3
6 Sampling. 4
7 Sample preparation . 4
7.1 Preparation of IRMM-801 for calibration purposes and system suitability tests. 4
7.2 Preparation of pure milk fat for system suitability tests . 4
7.3 Preparation of chocolate sample . 5
8 Procedure . 6
8.1 Construction of calibration curve for determination of PSB content . 6
8.2 Separation of individual TAGs of IRMM-801 by HR-GLC. 7
8.3 Separation of individual TAGs of pure MF by HR-GLC. 7
8.4 Separation of individual TAGs of chocolate fat by HR-GLC . 7
8.5 Identification. 8
9 Calculation. 8
9.1 PSB and MF quantification in chocolate fat and chocolate . 8
9.2 CBE detection in chocolate fat. 9
9.3 CBE quantification in chocolate fat and chocolate. 11
10 Procedural requirements . 13
10.1 General considerations. 13
10.2 System suitability . 13
11 Precision. 13
11.1 Interlaboratory test . 13
11.2 Repeatability. 13
11.3 Reproducibility. 14
12 Test report . 14
Annex A (informative) Results of interlaboratory test. 15
Annex B (informative) Example chromatograms . 19
Bibliography . 22

© ISO 2009 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11053 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.


iv © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11053:2009(E)

Vegetable fats and oils — Determination of cocoa butter
equivalents in milk chocolate
1 Scope
This International Standard specifies a procedure for the detection and quantification of cocoa butter
equivalents (CBEs) and milk fat (MF) in milk chocolate by triacylglycerol (TAG) profiling using high-resolution
capillary gas-liquid chromatography (HR-GLC), and subsequent data evaluation by simple and partial least-
squares regression analysis. CBE admixtures can be detected at a minimum level of 0,5 g CBE/100 g milk
chocolate and quantified at a level of 5 % mass fraction CBE addition to milk chocolate with a predicted error
of 0,7 g CBE/100 g milk chocolate.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
milk fat content of milk chocolate
mass fraction of milk fat in milk chocolate determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The mass fraction is expressed in grams per 100 g of milk chocolate.
2.2
cocoa butter equivalents
non-cocoa vegetable oils and fats detected in milk chocolate in accordance with the procedure prescribed in
this International Standard
NOTE The result is expressed qualitatively, i.e. CBEs present/CBEs not present (YES/NO).
2.3
cocoa butter equivalent content of milk chocolate
mass fraction of substances determined by the procedure specified in this International Standard
NOTE The mass fraction is expressed in grams per 100 g of milk chocolate.
3 Principle
Test samples, i.e. chocolate fats obtained from milk chocolate using a rapid fat extraction procedure, are
separated by HR-GLC into TAG fractions according to their relative molecular mass and degree of
unsaturation. Individual TAG fractions, i.e. 1-palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB), 1,3-dipalmitoyl-
2-oleoyl-glycerol (POP), 1-palmitoyl-2-oleoyl-3-stearoyl-glycerol (POS), 1-palmitoyl-2,3-dioleoyl-glycerol
(POO), 1,3-distearoyl-2-oleoyl-glycerol (SOS), and 1-stearoyl-2,3-dioleoyl-glycerol (SOO) are used:
a) to calculate the MF content in the chocolate fat (grams of MF per 100 g chocolate fat);
b) to determine the presence/absence of CBEs in chocolate fat using a simple linear regression model
based on the three TAGs, POP, POS, and SOS, corrected for the TAG contribution originating from MF,
and if this procedure indicates that the sample is not pure cocoa butter (CB);
© ISO 2009 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
c) to quantify the amount of the CBE admixture in chocolate fat (grams of CBE per 100 g chocolate fat)
using a partial least-squares (PLS) regression model with six input variables, i.e. the five TAGs, POP,
POS, POO, SOS, and SOO, normalized to 100 % and the determined MF content of the chocolate fat.
To ensure the correct labelling of milk chocolate, the results obtained relating to chocolate fat are converted
into grams of MF per 100 g chocolate and grams of CBE per 100 g chocolate, necessitating the accurate
determination of the total fat content of the chocolate using a Soxhlet extraction procedure (based on AOAC
[5]
Official Method 963.15 ). When the detection procedure proves the absence of CBEs in the chocolate fat, the
quantification and total fat content are not necessary.
4 Reagents, solutions and standards
NOTE Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of dangerous matter.
Technical, organizational and personal safety measures should be followed.
1)
4.1 Cocoa butter Certified Reference Material (IRMM-801) (see Reference [6]), for calibration purposes
and system suitability tests.
4.2 Pure milk fat, for system suitability tests.
2)
4.3 1-Palmitoyl-2-stearoyl-3-butyroyl-glycerol (PSB) .
4.3.1 General
For calibration purposes, dissolve ~40 mg of PSB in a 50 ml volumetric flask (5.9) with isooctane resulting in a
stock solution of ~ρ = 0,8 mg/ml. Mix thoroughly until complete dissolution.
From this PSB stock solution prepare a series of five calibration solutions in matrix (IRMM-801) by weighing
on an analytical balance (5.1) IRMM-801 (4.1) into 25 ml volumetric flasks (5.9) and adding the respective
volumes of the PSB stock solution as given in Table 1. Make up to the mark with isooctane.
Table 1 — Masses of IRMM-801 and volumes of PSB stock solution
for preparation of series of PSB calibration solutions in matrix
Concentration of
Final IRMM-PSB
PSB in
IRMM-801 (4.1) weighed Volume taken from PSB stock
concentration of
Calibration
calibration
into 25 ml solution and added to 25 ml
solution
solution
solution
volumetric flask volumetric flask
ρ
IRMM-PSB
ρ i
PSB
mg ml mg/ml mg/ml
1 ~250 4 0,128 ~10
2 ~250 3 0,096 ~10
3 ~250 2 0,064 ~10
4 ~250 1 0,032 ~10
5 ~250 0,5 0,016 ~10

1) Commercially available from the Institute for Reference Materials and Measurements (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/),
Belgium. This information is given for the convenience of users of this International Standard and does not constitute an
endorsement by ISO of this product.
2) Commercially available from Larodan (http://www.larodan.se/), Sweden. This information is given for the convenience
of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
4.3.2 Cold on-column (OCI) injection
Dilute each calibration solution with isooctane, ϕ = 1 ml/5 ml, to obtain a final IRMM-PSB concentration
(ρ ) of ~2 mg/ml in each solution and PSB concentrations (ρ ) ranging from 0,025 6 mg/ml
IRMM-PSB PSB
(calibration solution 1) to 0,003 2 mg/ml (calibration solution 5).
4.3.3 Split injection (e.g. split ratio of 1:10)
Dilute each calibration solution with isooctane, ϕ = 1 ml/2 ml, to obtain a final IRMM-PSB concentration
(ρ ) of ~5 mg/ml in each solution and PSB concentrations (ρ ) ranging from 0,064 mg/ml
IRMM-PSB PSB
(calibration solution 1) to 0,008 mg/ml (calibration solution 5).
NOTE The final PSB concentrations shall be calculated using the actual mass in the stock standard solution.
3)
4.4 α-Cholestane , ρ = 100 mg/100 ml, used as internal standard.
Dissolve ~50 mg α-cholestane in 50 ml of isooctane.
⎯ For cold on-column injection: Dilute 1:250 (ρ = 0,004 mg/ml).
⎯ For split injection (e.g. split ratio of 1:10): Dilute 1:100 (ρ = 0,01 mg/ml).
4.5 Fat solvent, non-chlorinated solvents (e.g. petroleum ether, n-hexane, n-heptane, isooctane).
4.6 Hydrochloric acid, c(HCl) = 4 mol/l.
5 Apparatus and equipment
5.1 Analytical balance, readable to the nearest 0,1 mg.
5.2 Drying oven. A dry heater block may be used.
4)
5.3 Filter paper, diameter 15 cm [e.g. S&S 589/1 ].
5.4 Food grater, a kitchen blender with a design featuring the motor above the mixing chamber to avoid
melting the samples.
5.5 Rotary evaporator. Alternative evaporation procedures may be used.
5.6 Evaporation block, with nitrogen supply.
5.7 Desiccator, sealable enclosure containing desiccants used for preserving moisture-sensitive items.
5.8 Soxhlet extractor, with standard taper joints, siphon capacity ~100 ml (33 mm × 88 mm extraction
thimble), 250 ml Erlenmeyer flask, and regulated heating mantle (or equivalent).
5.9 Volumetric flasks, of capacity 10 ml, 25 ml, 50 ml and 100 ml (or other capacities if needed),
[2]
ISO 1042 class A.
[1]
5.10 Pipettes, of capacities ranging from 1 ml to 10 ml (or other capacities if necessary), ISO 648 class A
[4]
or ISO 8655-2 .

3) May be obtained from Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/), Belgium.
4) S&S 589/1 black ribbon paper is an example of a suitable product commercially available. This information is given for
the convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO 2009 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
5.11 Microsyringe, with maximum volume 10 µl, graduated to 0,1 µl, or automatic sample injector.
5.12 Gas chromatograph (GC), fitted with a cold on-column or a split injection system and a flame
ionization detector (FID).
NOTE 1 Alternative injection systems [e.g. a programmed-temperature vaporizer (PTV) or a moving-needle injector]
may be used provided the same results are obtained as indicated in 10.2.
The separation and quantification have proven to be satisfactory if the following experimental conditions are
followed:
GLC column: CB-TAP 25 m × 0,25 mm i.d., fused silica coated with a medium polar
thermostable phenylmethylpolysiloxane stationary phase with a film
thickness of 0,10 µm
Oven programme for OCI: 100 °C held for at least 2 min; 30 °C/min to 270 °C held for 1 min;
2,5 °C/min to 340 °C held for 7 min
Oven programme for split: 200 °C held for at least 1 min; 14 °C/min to 270 °C held for 1 min;
2,5 °C/min to 340 °C held for 10 min
Detector (FID): 360 °C
Carrier gas for OCI: H (purity W 99,999 %) with a constant flow rate of 3,5 ml/min (another
2
suitable carrier gas is helium)
Carrier gas for split: H (purity W 99,999 %) with a constant flow rate of 2,5 ml/min (another
2
suitable carrier gas is helium)
NOTE 2 Columns and alternative experimental conditions, used in an international collaborative study (see
Reference [7]), are listed in Table A 1. Operating conditions may be changed to obtain optimum separation.
5.13 Chromatographic data system.
6 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[3]
is given in ISO 5555 . A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have
been damaged or changed during transport or storage.
7 Sample preparation
7.1 Preparation of IRMM-801 for calibration purposes and system suitability tests
Before opening and using the IRMM-801 (4.1), warm the ampoule in an oven (5.2) until the contents have
melted. When a clear solution is obtained, mix the contents by repeated inversion for not less than 20 s. Then
open and transfer the contents to a clean vial, which can be tightly sealed and preserved in a cool place for
future usage.
7.2 Preparation of pure milk fat for system suitability tests
If no pure MF is available, it can be obtained from a butter sample by melting and passing the fat layer through
a folded filter paper (5.3) at 50 °C in an oven (5.2).
4 © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
7.3 Preparation of chocolate sample
7.3.1 General
Chill approximately 200 g of chocolate until hard, and grate to a fine granular condition using a food grater
(5.4). Mix thoroughly and preserve in a tightly stoppered bottle in a cool place.
7.3.2 Rapid fat extraction
The chocolate fat is separated from 5 g grated chocolate (7.3.1) by extracting with two to three 10 ml portions
of a suitable fat solvent (4.5). Centrifuge and decant. Combine the extracts and evaporate (5.5) most of the fat
solvent and finally dry it under a stream of nitrogen (5.6).
The chocolate fat obtained by rapid fat extraction is used for the final TAG analysis by HR-GLC. For the
detection of CBEs in chocolate, the accurate amount of total fat in chocolate is not needed. When no CBEs
are detected, the second part of the standard, i.e. quantification of CBEs around the statutory limit of 5 %, is
not necessary. When CBEs are detected, the quantification part should be performed using the same TAG
profile as used for the CBE detection. However, in this case, determine the accurate amount of total fat in
chocolate using the procedure in 7.3.3. Alternative extraction procedures may be used provided that the same
results are obtained.
7.3.3 Determination of total fat content
Separate the chocolate fat and determine the total fat content in a sample of milk chocolate (prepared as
[5]
described in 7.3.2) by Soxhlet extraction (based on AOAC Official Method 963.15 ), as follows.
Weigh (5.1) 4 g to 5 g of chocolate into a 300 ml to 500 ml beaker. Add slowly, while stirring, 45 ml of boiling
water to obtain a homogeneous suspension. Add 55 ml of HCl (4.6) and a few defatted boiling chips, or other
antibumping agents, and stir. Cover with a watch glass, bring the solution slowly to the boil, and simmer for
15 min. Rinse the watch glass with 100 ml of water. Filter the solution through a medium fluted filter
paper (5.3), or equivalent, rinsing the beaker three times with water. Continue washing until the last portion of
filtrate is chlorine-free. Transfer the filter with the sample to a defatted extraction thimble and dry for 2 h in a
small beaker at 100 °C. Place a glass wool plug over the filter paper. Add a few defatted antibumping chips to
a 250 ml Erlenmeyer flask and dry for 1 h at 100 °C. Cool the flask to room temperature in a desiccator (5.7)
then weigh (5.1) it. Place the thimble containing the dried sample in the Soxhlet apparatus (5.8), supporting it
with a spiral or glass beads. Rinse the digestion beaker, drying beaker and watch glass with three 50 ml
portions of petroleum ether, and add the washings to the thimble. Reflux the digested sample for 4 h,
adjusting the heat so that the extractor siphons more than 30 times. Remove the flask and evaporate the
solvent. Dry the flask at 102 °C to constant mass (1,5 h). Cool in the desiccator (5.7) to room temperature,
then weigh (5.1). Constant mass is attained when successive 1 h drying periods show additional loss of
< 0,05 % fat. Duplicate determinations should agree to within 0,1 % fat.
The mass fraction, expressed as a percentage, of total fat in the chocolate, w , is given by:
fat; choc
m ×100
fat
w = (1)
fat; choc
m
where
m is the mass, in grams, of chocolate taken;
m is the mass, in grams, of the total fat obtained from the chocolate by Soxhlet extraction (based
fat
[5]
on AOAC Official Method 963.15 ).
Alternative extraction procedures may be used (e.g. by accelerated solvent extraction, by supercritical carbon
dioxide or by using microwaves) provided that the same results are obtained. The chocolate fat obtained by
Soxhlet extraction should not be used for TAG analysis by HR-GLC since changes in the obtained TAG profile
could be observed in some cases.
Report the result to two decimal places.
© ISO 2009 – All rights reserved 5

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
8 Procedure
8.1 Construction of calibration curve for determination of PSB content
Five calibration solutions containing different concentrations of PSB (4.3) but always the same concentration
of α-cholestane (4.4) are prepared as follows.
For cold on-column (OCI) injection:
⎯ Calibration solution 1 (Final ρ = 0,012 8 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 1 α-cholestane 1
calibration solution 1 (ρ = 0,025 6 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 1
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 2 (Final ρ = 0,009 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 2 α-cholestane 2
calibration solution 2 (ρ = 0,019 2 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 2
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 3 (Final ρ = 0,006 4 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 3 α-cholestane 3
calibration solution 3 (ρ = 0,012 8 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 3
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 4 (Final ρ = 0,003 2 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 4 α-cholestane 4
calibration solution 4 (ρ = 0,006 4 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 4
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 5 (Final ρ = 0,001 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 5 α-cholestane 5
calibration solution 5 (ρ = 0,003 2 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 5
(ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
Inject 0,5 µl of each calibration solution into the HR-GLC system using the cold on-column injection system.
For split injection:
⎯ Calibration solution 1 (Final ρ = 0,032 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 1 α-cholestane 1
calibration solution 1 (ρ = 0,064 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 1
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 2 (Final ρ = 0,024 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 2 α-cholestane 2
calibration solution 2 (ρ = 0,048 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 2
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 3 (Final ρ = 0,016 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 3 α-cholestane 3
calibration solution 3 (ρ = 0,032 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 3
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 4 (Final ρ = 0,008 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 4 α-cholestane 4
calibration solution 4 (ρ = 0,016 mg/ml; 4.3) in a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 4
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Calibration solution 5 (Final ρ = 0,004 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transfer 1 ml of
PSB 5 α-cholestane 5
calibration solution 5 (ρ = 0,008 mg/ml; 4.3) into a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution
PSB 5
(ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
Inject 1 µl of the final test solution into the HR-GLC system using the split injection system.
Alternative sample amounts and injectors may be used provided that the detection system employed gives a
linear response and conforms to the system suitability criteria (10.2).
6 © ISO 2009 – All rights reserved

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11053:2009(E)
8.2 Separation of individual TAGs of IRMM-801 by HR-GLC
The IRMM-801 (4.1) shall be warmed in a drying oven (5.2) until completely melted. Pipettes (or similar
equipment) used for transferring the sample during weighing operations should be brought to a temperature of
~55 °C in a drying oven to avoid partial fat fractionation during handling of samples.
For cold on-column (OCI) injection: Weigh (5.1) ~0,1 g of IRMM-801 (4.1) in a 10 ml volumetric flask (5.9)
and dilute to the mark with isooctane (4.5). Pipette (5.10) 1 ml of the resulting solution into another 50 ml
volumetric flask (5.9) and dilute to the mark with the same solvent (ρ = 0,2 mg/ml). Inject 0,5 µl of the final test
solution into the HR-GLC system using the cold on-column injection system.
For split injection: Weigh (5.1) ~0,1 g of IRMM-801 (4.1) in a 10 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the
mark with isooctane (4.5). Pipette (5.10) 1 ml of the resulting solution into another 10 ml volumetric flask and
dilute to the mark with the same solvent (ρ = 1 mg/ml). Inject 1 µl of the final test solution into the HR-GLC
system using the split injection system.
Alternative fat solvents, sample amounts and injectors may be used provided that the detection system
employed gives a linear response and conforms to the system suitability criteria (10.2).
8.3 Separation of individual TAGs of pure MF by HR-GLC
For cold on-column injection (OCI): Weigh (5.1) ~0,05 g of pure MF (4.2) in a 50 ml volumetric flask (5.9)
and dilute to the mark with isooctane (4.5) (ρ = 1 mg/ml). Transfer 1 ml of this solution to a test tube and add
1 ml of α-cholestane solution (4.4) (resulting test solution ρ = 0,5 mg/ml). Inject 0,5 µl of the final test solution
into the HR-GLC system using the cold on-column injection system.
For split injection: Weigh (5.1) ~0,25 g of pure MF (4.2) in a 50 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the
mark with isooctane (4.5) (ρ = 5 mg/ml). Transfer 1 ml of this solution to a test tube and add 1 ml of α-
cholestane solution (4.4) (resulting test solution ρ = 2,5 mg/ml). Inject 1 µl of the final test solution into the HR-
GLC system using the split injection system.
Alternative fat solvents, sample amounts and injectors may be used provided that the detection system
employed gives a linear response and conforms to the system suitability criteria (10.2).
8.4 Separation of individual TAGs of chocolate fat by HR-GLC
The test sample [chocolate fat extracted from milk chocolate by rapid fat extraction (7.3.2)] shall be warmed in
a drying oven (5.2) until completely melted. If the liquid sample contains some sediment, filter the sample
inside the oven to obtain a clear filtrate. Pipettes (or similar equipment) used for transferring the sample during
weighing operations should be brought to a temperature of ~55 °C in a drying oven in order to avoid partial fat
fractionation during handling of samples.
For cold on-column (OCI) injection: Weigh (5.1) ~0,1 g of chocolate fat (as obtained in 7.3.2) on an
analytical balance (5.1) in a 100 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the mark with isooctane (4.5)
(ρ = 1 mg/ml). Transfer 1 ml of this solution to a test tube and add 1 ml of α-cholestane solution (4.4) (resulting
test solution ρ = 0,5 mg/ml). Inject 0,5 µl of the final test solution into the HR-GLC system using the cold
on-column injection system.
For split injection: Weigh (5.1) ~0,5 g of chocolate fat (as obtained in 7.3.2) on an analytical balance (5.1) in
a 100 ml volumetric flask (5.9) and dilute to the mark with isooctane (4.5
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11053
Première édition
2009-09-01



Corps gras d'origine végétale —
Détermination des équivalents au beurre
de cacao dans le chocolat au lait
Vegetable fats and oils — Determination of cocoa butter equivalents in
milk chocolate




Numéro de référence
ISO 11053:2009(F)
©
ISO 2009

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.


DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT


©  ISO 2009
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

ii © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 1
4 Réactifs, solutions et étalons . 2
5 Appareillage et équipement. 3
6 Échantillonnage . 5
7 Préparation de l'échantillon. 5
7.1 Préparation de l'IRMM-801 pour les besoins d'étalonnage et les essais d'aptitude du
système. 5
7.2 Préparation de la matière grasse pure du lait pour les essais d'aptitude du système . 5
7.3 Préparation de l'échantillon de chocolat. 5
8 Mode opératoire . 6
8.1 Construction de la courbe d'étalonnage pour la détermination de la teneur en PSB . 6
8.2 Séparation des TAG individuels de l'IRMM-801 par CGL-HR. 7
8.3 Séparation des TAG individuels de MGL pure par CGL-HR. 8
8.4 Séparation des TAG individuels de la matière grasse du chocolat par CGL-HR. 8
8.5 Identification. 8
9 Calcul . 9
9.1 Quantification de PSB et MGL dans la matière grasse du chocolat et le chocolat . 9
9.2 Détection d'EBC dans la matière grasse du chocolat. 10
9.3 Quantification des EBC dans la matière grasse du chocolat et dans le chocolat. 12
10 Exigences de la méthode. 14
10.1 Considérations générales. 14
10.2 Aptitude à l'emploi du système. 14
11 Fidélité . 15
11.1 Essai interlaboratoires . 15
11.2 Répétabilité. 15
11.3 Reproductibilité. 15
12 Rapport d'essai . 15
Annexe A (informative) Résultats de l'essai interlaboratoires . 16
Annexe B (informative) Exemple de chromatogrammes. 20
Bibliographie . 23

© ISO 2009 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11053 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 11,
Corps gras d'origines animale et végétale.


iv © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 11053:2009(F)

Corps gras d'origine végétale — Détermination des équivalents
au beurre de cacao dans le chocolat au lait
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détection et de quantification des équivalents au
beurre de cacao (EBC) et matière grasse du lait (MGL) dans le chocolat au lait par établissement de profils de
triacylglycérols (TAG) en utilisant la chromatographie gaz-liquide sur colonne capillaire haute résolution
(CGL-HR) ainsi que les évaluations subséquentes des données par analyse de régression simple ou partielle
des moindres carrés. Les adjuvants d'EBC peuvent être détectés à un niveau minimal de 0,5 g d'EBC/100 g
de chocolat au lait et évalués quantitativement à un niveau d’ajout de 5 % en fraction massique d'EBC au
chocolat au lait, avec une erreur prévue de 0,7 g d'EBC/100 g de chocolat au lait.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en matière grasse du lait dans le chocolat au lait
fraction massique de matière grasse du lait dans le chocolat au lait, déterminée par la méthode spécifiée dans
la présente Norme internationale
NOTE La fraction massique est exprimée en grammes par 100 g de chocolat au lait.
2.2
équivalents au beurre de cacao
EBC
corps gras d'origine végétale, autres que le cacao, détectés dans le chocolat au lait conformément à la
méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
NOTE Le résultat est exprimé en terme qualitatif, c'est-à-dire EBC présents/EBC absents (OUI/NON).
2.3
teneur en équivalents au beurre de cacao du chocolat au lait
fraction massique des substances déterminée par la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
NOTE La fraction massique est exprimée en grammes par 100 g de chocolat au lait.
3 Principe
Les échantillons pour essai, c'est-à-dire la matière grasse du chocolat obtenue à partir du chocolat au lait en
utilisant une méthode d'extraction rapide de matière grasse, sont séparés par CGL-HR en fractions de TAG
selon leur masse moléculaire et leur degré d'insaturation. Les fractions individuelles de TAG,
c'est-à-dire 1-palmityl-2-stéaryl-3-butyrylglycérol (PSB), 1,3-dipalmityl-2-oléylglycérol (POP),
1-palmityl-2-oléyl-3-stéarylglycérol (POS), 1-palmityl-2,3-dioléylglycérol (POO), 1,3-distéaryl-2-oléylglycérol
(SOS) et 1-stéaryl-2,3-dioléylglycérol (SOO), sont utilisées:
© ISO 2009 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
a) pour calculer la teneur en MGL dans la matière grasse du chocolat (grammes de MGL par 100 g de
matière grasse du chocolat);
b) pour déterminer la présence/l'absence d'EBC dans la matière grasse du chocolat en utilisant un modèle
de régression linéaire simple fondé sur les trois TAG: POP, POS et SOS corrigées pour la contribution du
TAG provenant de la MGL, et si cette méthode indique que l'échantillon n'est pas du beurre de cacao
pur (BC);
c) pour quantifier la quantité d'adjuvant d'EBC dans la matière grasse du chocolat (grammes d'EBC par
100 g de matière grasse du chocolat) en utilisant un modèle de régression partielle des moindres carrés
à six variables d'entrée, c'est-à-dire les cinq TAG: POP, POS, POO, SOS et SOO normalisés à 100 % et
la teneur en MGL déterminée de la matière grasse du chocolat.
Afin de garantir l'étiquetage correct du chocolat au lait, les résultats obtenus pour la matière grasse du
chocolat sont convertis en grammes de MGL par 100 g de chocolat et grammes d'EBC par 100 g de chocolat,
ce qui nécessite la détermination exacte de la teneur totale en matière grasse du chocolat en utilisant une
[5]
méthode d'extraction de Soxhlet (fondée sur la méthode officielle 963.15 de l'AOAC ). Lorsque la méthode
de détection montre l'absence d'EBC dans la matière grasse du chocolat, la quantification et la teneur totale
en matière grasse ne sont pas nécessaires.
4 Réactifs, solutions et étalons
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
AVERTISSEMENT — L'attention est attirée sur les réglementations traitant de la manipulation des
substances dangereuses. Il convient de suivre les mesures de sécurité d'ordre technique,
organisationnel et personnel.
1)
4.1 Matériau de Référence Certifié du beurre de cacao (IRMM-801) (voir Référence [6]), pour les
besoins d'étalonnage et les essais d'aptitude du système.
4.2 Matière grasse du lait pure, pour les essais d'aptitude du système.
2)
4.3 1-palmityl-2-stéaryl-3-butyrylglycérol (PSB) .
4.3.1 Généralités
Pour les besoins d'étalonnage, dissoudre environ 40 mg de PSB dans une fiole jaugée de 50 ml (5.9) avec de
l'isooctane pour obtenir une solution mère d'environ ρ = 0,8 mg/ml. Mélanger soigneusement jusqu'à
dissolution complète.
À partir de cette solution mère de PSB, préparer une série de cinq solutions étalons dans la matrice
(IRMM-801) en pesant, sur une balance analytique (5.1) l'IRMM-801 (4.1) dans des fioles jaugées de 25 ml
(5.9) et en ajoutant les volumes respectifs de la solution mère de PSB comme indiqué dans le Tableau 1.
Compléter jusqu'au repère avec de l'isooctane.

1) Disponible auprès de l'Institut des matériaux de référence et des mesures (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/), Belgique.
Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que
l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif de ce produit.
2) Disponible auprès de Larodan (http://www.larodan.se/), Suède. Cette information est donnée à l'intention des
utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux
mêmes résultats.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
Tableau 1 — Masses d'IRMM-801 et volumes de solution mère de PSB pour la préparation
de la série des solutions étalons de PSB dans la matrice
Concentration
Concentration de
finale en
IRMM-801 (4.1) pesé Volume prélevé de solution
PSB dans la
IRMM-PSB
Solution étalon dans une fiole jaugée mère de PSB et ajouté dans
solution étalon
dans la solution
de 25 ml la fiole jaugée de 25 ml
ρ i
PSB
ρ
IRMM-PSB
mg ml mg/ml mg/ml
1 ~250 4 0,128 ~10
2 ~250 3 0,096 ~10
3 ~250 2 0,064 ~10
4 ~250 1 0,032 ~10
5 ~250 0,5 0,016 ~10
4.3.2 Injection en tête de colonne à froid (ITCF)
Diluer chaque solution étalon à ϕ = 1 ml/5 ml avec de l'isooctane pour obtenir une concentration finale en
IRMM-PSB (ρ ) d'environ 2 mg/ml dans chaque solution et des concentrations en PSB (ρ ) allant
IRMM-PSB PSB
de 0,025 6 mg/ml (solution étalon 1) à 0,003 2 mg/ml (solution étalon 5).
4.3.3 Injection avec division (par exemple rapport de division de 1:10)
Diluer chaque solution étalon à ϕ = 1 ml/2 ml avec de l'isooctane pour obtenir une concentration finale en
IRMM-PSB (ρ ) d'environ 5 mg/ml dans chaque solution et des concentrations en PSB (ρ ) allant
IRMM-PSB PSB
de 0,064 mg/ml (solution étalon 1) à 0,008 mg/ml (solution étalon 5).
NOTE Les concentrations finales en PSB doivent être calculées en utilisant la masse réelle dans la solution étalon
mère.
3)
4.4 α-Cholestane , ρ = 100 mg/100 ml, utilisé comme étalon interne.
Dissoudre environ 50 mg d'α-cholestane dans 50 ml d'isooctane.
⎯ Pour l'injection en tête de colonne à froid: Diluer à 1:250 (ρ = 0,004 mg/ml).
⎯ Pour l'injection avec division (par exemple rapport de division de 1:10): Diluer à 1:100 (ρ = 0,01 mg/ml).
4.5 Solvant de matière grasse, solvants non chlorés (par exemple éther de pétrole, n-hexane, n-heptane,
isooctane).
4.6 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 4 mol/l.
5 Appareillage et équipement
5.1 Balance analytique, lisible à 0,1 mg près.
5.2 Étuve. Un bloc de séchage à sec peut être utilisé.

3) Disponible auprès de Sigma-Aldrich (http://www.sigmaaldrich.com/), Belgique.
© ISO 2009 – Tous droits réservés 3

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
4)
5.3 Papier-filtre, de 15 cm de diamètre [par exemple S&S 589/1 ].
5.4 Râpe à aliments, mélangeur de cuisine avec une conception comportant le moteur au-dessus de la
chambre de mélange pour éviter la fusion des échantillons.
5.5 Évaporateur rotatif. D'autres méthodes d'évaporation peuvent être utilisées.
5.6 Bloc d'évaporation, avec alimentation en azote.
5.7 Dessiccateur, enceinte hermétique contenant des déshydratants, utilisée pour conserver les produits
sensibles à l'humidité.
5.8 Extracteur de Soxhlet, avec raccords coniques normalisés, capacité de siphon d'environ 100 ml
(cartouche pour extraction 33 mm × 88 mm), erlenmeyer de 250 ml et chauffe-ballon régulé (ou équivalent).
5.9 Fioles jaugées, d'une capacité de 10 ml, 25 ml, 50 ml et 100 ml (ou autres capacités si nécessaire),
[2]
ISO 1042 , classe A.
[1]
5.10 Pipettes, de capacités allant de 1 ml à 10 ml (ou autres capacités si nécessaire), ISO 648 , classe A
[4]
ou ISO 8655-2 .
5.11 Microseringue, d'un volume maximal de 10 µl, graduée à 0,1 µl, ou injecteur automatique d'échantillon.
5.12 Chromatographe en phase gazeuse (CG), équipé d'un injecteur en tête de colonne à froid ou d'un
système d'injection avec division et d'un détecteur à ionisation de flamme (DIF).
NOTE 1 D'autres systèmes d'injection [par exemple un vaporisateur à température programmée (PTV) ou un injecteur
à aiguille mobile] peuvent être utilisés à condition d'obtenir les mêmes résultats que ceux indiqués en 10.2.
La séparation et la quantification s'avèrent satisfaisantes si les conditions expérimentales suivantes sont
suivies:
Colonne de CGL: BC-TAP 25 m × 0,25 mm de diamètre intérieur, silice fondue enduite
d'une phase stationnaire thermostable moyennement polaire de type
phénylméthylpolysiloxane, d'épaisseur de film 0,10 µm
Programme d'étuve pour ITCF: 100 °C maintenus pendant au minimum 2 min; 30 °C/min jusqu'à
270 °C maintenus pendant 1 min; 2,5 °C/min jusqu'à 340 °C maintenus
pendant 7 min
Programme d'étuve pour diviseur: 200 °C maintenus pendant au minimum 1 min; 14 °C/min jusqu'à
270 °C maintenus pendant 1 min; 2,5 °C/min jusqu'à 340 °C maintenus
pendant 10 min
Détecteur (DIF): 360 °C
Gaz vecteur pour ITCF: H (pureté W 99,999 %) avec un débit constant de 3,5 ml/min (l'hélium

2
peut également être un gaz vecteur convenable)
Gaz vecteur pour diviseur: H (pureté W 99,999 %) avec un débit constant de 2,5 ml/min (l'hélium
2
peut également être un gaz vecteur convenable)
NOTE 2 Les colonnes et d'autres conditions expérimentales, utilisées dans une étude interlaboratoires
internationale (voir Référence [7]), sont énumérées dans le Tableau A.1. Les conditions de fonctionnement peuvent être
modifiées pour obtenir une séparation optimale.
5.13 Système de données chromatographiques.

4) Le papier ruban noir S&S 589/1 est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information
est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou
recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré
qu'ils conduisent aux mêmes résultats.
4 © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
6 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[3]
méthode d'échantillonnage recommandée est donnée dans l'ISO 5555 . Il convient d'envoyer au laboratoire
un échantillon représentatif. Il convient qu'il ne soit pas endommagé ou modifié pendant le transport ou le
stockage.
7 Préparation de l'échantillon
7.1 Préparation de l'IRMM-801 pour les besoins d'étalonnage et les essais d'aptitude du
système
Avant l'ouverture et l'utilisation de l'IRMM-801 (4.1), chauffer l'ampoule dans une étuve (5.2) jusqu'à fusion du
contenu. Après obtention d'une solution claire, mélanger le contenu par inversions répétées pendant au moins
20 s. Ouvrir et transférer ensuite le contenu dans une fiole propre, qui peut être hermétiquement scellée et
conservée dans un endroit frais pour utilisation ultérieure.
7.2 Préparation de la matière grasse pure du lait pour les essais d'aptitude du système
Si aucune MGL pure n'est disponible, elle peut être obtenue à partir d'un échantillon de beurre par fusion et
passage de la couche de matière grasse sur un papier-filtre plissé (5.3) dans une étuve (5.2) à 50 °C.
7.3 Préparation de l'échantillon de chocolat
7.3.1 Généralités
Refroidir environ 200 g de chocolat jusqu'à durcissement, et le râper jusqu'à l'état granulaire fin à l'aide d'une
râpe à aliments (5.4). Mélanger soigneusement et conserver dans une bouteille hermétiquement bouchée
dans un endroit frais.
7.3.2 Extraction rapide de matière grasse
La matière grasse du chocolat est extraite de 5 g de chocolat râpé (7.3.1) au moyen de deux à trois portions
de 10 ml d'un solvant approprié à l'extraction des matières grasses (4.5). Centrifuger et décanter. Combiner
les extraits, évaporer (5.5) la majeure partie du solvant, puis sécher sous azote (5.6).
La matière grasse du chocolat obtenue par l'extraction rapide de matière grasse est utilisée pour l'analyse
finale de TAG par CGL-HR. Pour la détection des EBC dans le chocolat, la quantité précise de matière grasse
totale dans le chocolat n'est pas nécessaire. Lorsque aucun EBC n'est détecté, la deuxième partie de la
norme, c'est-à-dire la quantification des EBC autour de la limite établie de 5 %, n'est pas nécessaire. Lorsque
des EBC sont détectés, il convient de réaliser la quantification en utilisant le même profil de TAG que celui
utilisé pour la détection des EBC. Cependant, dans ce cas, déterminer la quantité précise de matière grasse
totale dans le chocolat en utilisant la méthode en 7.3.3. D'autres méthodes d'extraction peuvent être utilisées
à condition d'obtenir les mêmes résultats.
7.3.3 Détermination de la teneur totale en matière grasse
Séparer la matière grasse du chocolat et déterminer la teneur totale en matière grasse dans un échantillon de
chocolat au lait (préparé tel que décrit en 7.3.2) par extraction de Soxhlet (fondée sur la méthode officielle
[5]
963.15 de l'AOAC ), comme suit.
Peser (5.1) 4 g à 5 g de chocolat dans un bécher de 300 ml à 500 ml. Ajouter lentement, tout en remuant,
45 ml d'eau bouillante pour obtenir une suspension homogène. Ajouter 55 ml de HCl (4.6) et quelques
régulateurs d'ébullition exempts de matière grasse, ou autres agents anti-projection, et remuer. Couvrir avec
un verre de montre, porter la solution lentement à ébullition, et laisser bouillir doucement pendant 15 min.
Rincer le verre de montre avec 100 ml d'eau. Filtrer la solution à l'aide d'un papier-filtre plissé moyen (5.3) ou
© ISO 2009 – Tous droits réservés 5

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
un équivalent, en rinçant le bécher trois fois avec de l'eau. Continuer le rinçage jusqu'à ce que la dernière
portion du filtrat soit exempte de chlore. Transférer le filtre avec l'échantillon dans une cartouche pour
extraction dégraissée et sécher pendant 2 h dans un petit bécher à 100 °C. Placer un bouchon de laine de
verre sur le papier-filtre. Ajouter quelques agents anti-projections exempts de matière grasse dans un
erlenmeyer de 250 ml et sécher pendant 1 h à 100 °C. Refroidir le flacon à la température ambiante dans un
dessiccateur (5.7) et le peser (5.1). Placer la cartouche contenant l'échantillon séché dans l'extracteur de
Soxhlet (5.8), en le soutenant avec une spirale ou des billes de verre. Rincer le bécher de digestion, le bécher
de séchage et le verre de montre avec trois portions de 50 ml d'éther de pétrole, et ajouter les rinçages à la
cartouche. Porter à ébullition à reflux l'échantillon digéré pendant 4 h, en ajustant la température pour que le
siphonage de l'extracteur soit supérieur à 30 fois. Retirer le flacon et évaporer le solvant. Sécher le flacon à
102 °C à masse constante (1,5 h). Refroidir dans le dessiccateur (5.7) à température ambiante, puis peser
(5.1). La masse constante est atteinte lorsque des périodes successives de séchage de 1 h indiquent une
perte supplémentaire de matière grasse inférieure à 0,05 %. Il convient que les déterminations doubles
s'inscrivent dans les limites de 0,1 % de matière grasse.
La fraction massique, exprimée sous forme de pourcentage, de matière grasse totale dans le chocolat,
w , est donnée par:
fat; choc
m ×100
fat
w = (1)
fat; choc
m
où
m est la masse, en grammes, de chocolat prélevée;
m est la masse, en grammes, de la matière grasse totale obtenue à partir du chocolat par
fat
[5]
extraction de Soxhlet (fondée sur la méthode officielle 963.15 de l'AOAC ).
D'autres méthodes d'extraction peuvent être utilisées (par exemple par extraction accélérée de solvant, par
dioxyde de carbone supercritique ou par micro-ondes) à condition d'obtenir les mêmes résultats. Il convient
de ne pas utiliser la matière grasse du chocolat obtenue par l'extraction de Soxhlet pour l'analyse de TAG par
CGL-HR, car il est possible d'observer dans certains cas des changements du profil de TAG obtenu.
Exprimer les résultats à deux décimales.
8 Mode opératoire
8.1 Construction de la courbe d'étalonnage pour la détermination de la teneur en PSB
Cinq solutions étalons contenant des concentrations différentes de PSB (4.3) mais à concentration constante
d'α-cholestane (4.4) sont préparées comme suit.
Pour l'injection en tête de colonne à froid (ITCF):
⎯ Solution étalon 1 (concentration finale ρ = 0,012 8 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 1 α-cholestane 1
1 ml de la solution étalon 1 (ρ = 0,025 6 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 1
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 2 (concentration finale ρ = 0,009 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 2 α-cholestane 2
1 ml de la solution étalon 2 (ρ = 0,019 2 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 2
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 3 (concentration finale ρ = 0,006 4 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 3 α-cholestane 3
1 ml de la solution étalon 3 (ρ = 0,012 8 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 3
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
6 © ISO 2009 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 11053:2009(F)
⎯ Solution étalon 4 (concentration finale ρ = 0,003 2 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 4 α-cholestane 4
1 ml de la solution étalon 4 (ρ = 0,006 4 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 4
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 5 (concentration finale ρ = 0,001 6 mg/ml; ρ = 0,002 mg/ml): Transférer
PSB 5 α-cholestane 5
1 ml de la solution étalon 5 (ρ = 0,003 2 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la
PSB 5
solution d'α-cholestane (ρ = 0,004 mg/ml; 4.4).
Injecter 0,5 µl de chaque solution étalon dans le système de CGL-HR en utilisant le système d'injection en
tête de colonne à froid.
Pour l'injection avec division:
⎯ Solution étalon 1 (concentration finale ρ = 0,032 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 1 α-cholestane 1
1 ml de la solution étalon 1 (ρ = 0,064 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 1
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 2 (concentration finale ρ = 0,024 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 2 α-cholestane 2
1 ml de la solution étalon 2 (ρ = 0,048 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 2
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 3 (concentration finale ρ = 0,016 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 3 α-cholestane 3
1 ml de la solution étalon 3 (ρ = 0,032 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 3
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 4 (concentration finale ρ = 0,008 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 4 α-cholestane 4
1 ml de la solution étalon 4 (ρ = 0,016 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 4
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
⎯ Solution étalon 5 (concentration finale ρ = 0,004 mg/ml; ρ = 0,005 mg/ml): Transférer
PSB 5 α-cholestane 5
1 ml de la solution étalon 5 (ρ = 0,008 mg/ml; 4.3) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de la solution
PSB 5
d'α-cholestane (ρ = 0,01 mg/ml; 4.4).
Injecter 1 µl de la solution finale pour essai dans le système de CGL-HR en utilisant le système d'injection
avec division.
D'autres quantités d'échantillons et d'autres injecteurs peuvent être utilisés à condition que le système de
détection employé donne une réponse linéaire et soit conforme aux critères d'aptitude du système (10.2).
8.2 Séparation des TAG individuels de l'IRMM-801 par CGL-HR
...