ISO 6341:2012
(Main)Water quality — Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Acute toxicity test
Water quality — Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Acute toxicity test
ISO 6341.2012 specifies a method for the determination of the acute toxicity to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). This method is applicable to: chemical substances which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as a stable suspension or dispersion under the conditions of the test; industrial or sewage effluents; treated or untreated waste water; aqueous extracts and leachates; fresh water (surface and ground water); eluates of fresh water sediment; pore water of fresh water sediment.
Qualité de l'eau — Détermination de l'inhibition de la mobilité de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Essai de toxicité aiguë
L'ISO 6341:2012 spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Cette méthode s'applique aux: a) substances chimiques solubles dans les conditions de l'essai ou pouvant être maintenues en suspension ou en dispersion stable dans les conditions de l'essai; b) effluents industriels ou domestiques; c) eaux usées traitées ou non; d) extraits aqueux et lixiviats; e) eaux douces (eaux de surface et eaux souterraines); f) éluats de sédiments d'eaux douces; g) eaux interstitielles de sédiments d'eau douce.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 6341
Fourth edition
2012-10-15
Water quality — Determination of the
inhibition of the mobility of Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea) —
Acute toxicity test
Qualité de l’eau — Détermination de l’inhibition de la mobilité de Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Essai de toxicité aiguë
Reference number
©
ISO 2012
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO’s
member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test environment . 2
6 Reagents, test organisms and media . 3
7 Apparatus and materials . 4
8 Treatment and preparation of samples . 5
8.1 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of water, effluent, or
aqueous extract samples to be tested . 5
8.2 Preparation of solutions of substances to be tested . 6
9 Procedure . 6
9.1 General . 6
9.2 Preliminary test . 7
9.3 Definitive test . 7
9.4 Check of the sensitivity of the Daphnia magna and conformity with the procedure . 7
9.5 Limit test . 8
10 Interpretation and validity of the results . 8
10.1 Estimation of the EC . 8
10.2 Validity criteria . 8
11 Expression of results . 8
12 Test report . 8
Annex A (informative) Preparation of the Elendt M4 medium.10
Annex B (informative) Example of graphical determination of the inhibition of mobility of Daphnia
magna by an effluent or stock solution of a substance at a concentration of 1 000 mg/l .13
Annex C (informative) General recommendations for stock culturing .16
Annex D (informative) Culturing of Daphnia magna for production of dormant eggs .17
Annex E (informative) Precision data .19
Annex F (informative) Dilution level D — Preparation of the dilution series for the determination of
the LID .20
Bibliography .22
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 6341 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological methods.
This fourth edition cancels and replaces the third edition (ISO 6341:1996), which has been technically revised.
It also incorporates the Technical Corrigendum ISO 6341:1996/Cor. 1:1998.
iv © ISO 2012 – All rights reserved
Introduction
This International Standard specifies a procedure for the determination of the acute toxicity of chemicals,
waters and waste waters to the water flea Daphnia magna Straus.
The evaluation of harmful effects on water quality has for several years involved the performance of biological
tests. Crustaceans are of interest from the ecotoxicological point of view because they are primary consumers
and a major component of the zooplankton in aquatic ecosystems.
The test specified in this International Standard involves the determination of the immobilization of the water
flea Daphnia magna Straus after 24 h or 48 h exposure (depending on the requirement of users or national
authorities) to the test sample under the conditions specified in this International Standard.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 6341:2012(E)
Water quality — Determination of the inhibition of the mobility
of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Acute
toxicity test
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this International
Standard be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the acute toxicity to Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea).
This method is applicable to:
— chemical substances which are soluble under the conditions of the test, or can be maintained as a stable
suspension or dispersion under the conditions of the test;
— industrial or sewage effluents;
— treated or untreated waste water;
— aqueous extracts and leachates;
— fresh water (surface and ground water);
— eluates of fresh water sediment;
— pore water of fresh water sediment.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are indispensable
for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition
of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16:1998, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 5814, Water quality — Determination of dissolved oxygen — Electrochemical probe method
ISO 10523, Water quality — Determination of pH
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
control batch
series of replicates containing control solution
[3]
[ISO 20665:2008, 3.3]
3.2
control solution
test medium without sample under test
3.3
immobilization
inability of the organisms to swim during the 15 s which follow gentle agitation of the test and control solutions,
even if they can still move their antennae
3.4
EC
concentration at which there is an effect on 50 % of the organisms in line with the test criterion
[1]
[ISO 15088:2007, 3.3]
3.5
neonate
newly born or newly hatched individual
NOTE In this International Standard, a neonate is a first-instar daphnid, <24 h old.
[3]
[ISO 20665:2008, 3.6]
3.6
test batch
series of replicates filled with the same test solution
[3]
[ISO 20665:2008, 3.8]
4 Principle
Determination of the initial concentration (i.e. the concentration present at the beginning of the test) which,
in 24 h or 48 h, immobilizes 50 % of exposed D. magna, under the conditions specified in this International
Standard. This concentration, known as the effective initial inhibitory concentration, is designated 24 h EC
or 48 h EC .
An indication of the lowest concentration tested which immobilizes all the D. magna and the highest concentration
tested which does not immobilize any of the D. magna is desirable and provides useful information in cases
where the EC cannot be determined.
The test is carried out in one or two stages:
— a preliminary test which determines the range of concentrations to be tested in the definitive toxicity test
and gives an approximate value of the 24 h EC or 48 h EC ;
50 50
— a definitive test, conducted when the approximate value given by the preliminary test is not sufficient,
which permits calculation of the 24 h EC or 48 h EC , and determines concentrations corresponding to
50 50
0 % and 100 % immobilization.
If the method specified in this International Standard is used for biotesting of chemical substances, a limit test
can be performed at 100 mg/l or at a lower concentration, at which the substance is soluble or is in stable
dispersion under the conditions of the test (see 9.5). If it provides useful information, a limit test may also be
performed at concentrations above 100 mg/l as long as the substance is soluble or in stable dispersion.
5 Test environment
The exposure of organisms as specified in this International Standard shall be carried out either in the dark or
under a 16 h + 8 h light + dark photoperiod, in a temperature-controlled room or incubator at (20 ± 2) °C in the
test containers.
2 © ISO 2012 – All rights reserved
The testing atmosphere shall be free from vapours or dusts toxic to D. magna. Photodegradable chemicals shall be
tested in the dark, or using minimal lighting with the specified photoperiod, or minimal red lighting, as appropriate.
The use of controls (3.1) also allows checking that the test is performed in an atmosphere free from toxic
dusts and vapours.
6 Reagents, test organisms and media
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
6.1 Test organisms. The test organisms are neonates of D. magna Straus (Cladocera, Crustacea), obtained
by acyclical parthenogenesis under specified breeding conditions (see Annex C).
The animals used for the test shall be less than 24 h old and should not be first brood progeny. The D. magna
shall be from a healthy stock, showing no signs of stress such as mortality >20 % in 2 d, presence of males,
ephippia, or discoloured animals, and there shall be no delay in the production of the first brood. Isolate gravid
females and collect newly released neonates within 24 h.
If the culture conditions differ significantly from test conditions, it is recommended that one generation be
acclimated under the test conditions for about one week to avoid stressing the parent animals and the offspring.
The age of the stock culture and the source (including clone, if possible) of the D. magna culture shall be indicated
in the test report, since the sensitivity of D. magna to toxicants can be affected by the source of the culture.
The D. magna may also derive from the hatching of ephippia obtained from laboratory cultures of the crustacean as
1)
described in Annex D or can be purchased from a specialized company. The neonates hatched from the ephippia
may be used directly as test organisms if they comply with all validity criteria given in this International Standard.
6.2 Pure water, conductivity below 10 µS/cm.
6.3 Dilution and culturing water.
6.3.1 General. Natural water (surface or ground water), reconstituted water or dechlorinated tap water are
acceptable as culturing and dilution water if D. magna survives in it for the duration of the culturing, acclimation
and testing without showing signs of stress. These waters may be used if they comply with all criteria and
conditions specified in this International Standard. Waters in the range pH 6 to pH 9, with hardness between
140 mg/l and 275 mg/l (as CaCO ) are recommended.
For stock culture of D. magna in the laboratory, the M4 medium (see Annex A) may also be used.
M4 medium (Annex A) should not be used as dilution water for samples containing bivalent metal ions. The EDTA
in this medium can reduce the bioavailability of such ions, resulting in a decrease in apparent toxicity. In addition,
for the same reason, M4 medium should not be used as the dilution water for samples of unknown composition.
NOTE If the test is performed for purposes necessitating the use of a dilution water with characteristics differing from
those described in the preceding three paragraphs, state the main characteristics of the synthetic dilution water used in
the test report.
As an example, the preparation of dilution water meeting the requirements is described below.
Dissolve known quantities of reagents in pure water (6.2) The dilution water prepared shall have a pH of
7,8 ± 0,5, a hardness of (225 ± 50) mg/l (expressed as CaCO ), a molar Ca + Mg ratio close to 4 + 1 and a
dissolved oxygen concentration above 7 mg/l.
Prepare the solutions specified in 6.3.2 to 6.3.5.
1) MicroBioTests Inc., Mariakerke, Belgium, is an example of a suitable supplier. This information is given for the
convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this supplier.
6.3.2 Calcium chloride solution. Dissolve 11,76 g of calcium chloride dihydrate (CaCl⋅2H O) in pure water
2 2
(6.2) and make up to 1 l with pure water (6.2).
6.3.3 Magnesium sulfate solution. Dissolve 4,93 g of magnesium sulfate heptahydrate (MgSO⋅7H O) in
4 2
pure water (6.2) and make up to 1 l with pure water (6.2).
6.3.4 Sodium bicarbonate solution. Dissolve 2,59 g of sodium bicarbonate (NaHCO ) in pure water (6.2)
and make up to 1 l with pure water (6.2).
6.3.5 Potassium chloride solution. Dissolve 0,23 g of potassium chloride (KCI) in pure water (6.2) and
make up to 1 l with pure water (6.2).
6.3.6 Mixing. Mix 25 ml of each of the four solutions (6.3.2 to 6.3.5) and make up to 1 l with pure water (6.2).
The dilution water shall be aerated until the dissolved oxygen concentration has reached saturation and the
pH has stabilized. If necessary, adjust the pH to 7,8 ± 0,5 by adding sodium hydroxide (NaOH) solution or
hydrochloric acid (HCI). The dilution water prepared in this way shall not be further aerated before use.
6.4 Reference substance. Potassium dichromate (K Cr O ) is recommended.
2 2 7
Since K Cr O is a carcinogenic substance, toxic via inhalation, the use of a ready-made solution with a
2 2 7
2)
defined concentration of K Cr O for the preparation of the stock solution of the reference substance can
2 2 7
reduce the risk of inhalation of the toxic dust in the laboratory.
6.5 Sodium hydroxide solution, e.g. [NaOH] = 1 mol/l.
6.6 Hydrochloric acid, e.g. [HCl] = 1 mol/l.
7 Apparatus and materials
Usual laboratory apparatus and in particular the following.
7.1 Temperature-controlled room or chamber.
7.2 Dissolved oxygen-measuring apparatus.
7.3 Culture vessels, of chemically inert material and of sufficient capacity, e.g. 2 l glass beakers.
7.4 Test containers, of chemically inert material and of sufficient capacity, e.g. glass test tubes or beakers.
7.5 Pipette for sampling the test organisms, with a sufficient diameter for capturing the animals while allowing
sampling of only a small volume of medium.
Micropipettes of inert plastic material with a bulb at the end are very suitable for the operations.
7.6 Sample collecting bottles, as specified in ISO 5667-16.
7.7 Sieves. Appropriate sieves (e.g. mesh 1,0 mm and 0,3 mm) to transfer the adult organisms to stock
culture and to separate the young from the adults.
2) Titrisol potassium dichromate solution is an example of a suitable product available commercially. This information
is given for the convenience of the users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
4 © ISO 2012 – All rights reserved
8 Treatment and preparation of samples
8.1 Special precautions for sampling, transportation, storage and treatment of water, efflu-
ent, or aqueous extract samples to be tested
Sampling, transportation and storage of the samples should be performed as specified in ISO 5667-16.
Carry out the toxicity test as soon as possible, preferably within 12 h of collection. If this time interval cannot
be met, cool the sample to 0 °C to 5 °C and test the sample within 24 h. If it is not possible to perform the test
within 72 h, the sample may be frozen as soon as possible after sampling and maintained deep-frozen (below
–18 °C) for testing within 2 months of collection (see ISO 5667-16:1998, Clause 5).
Immediately test the frozen samples after complete thawing, e.g. in a water bath at a maximum temperature of
30 °C. Do not use a microwave for thawing the samples.
At the time of testing, homogenize the sample to be analysed by shaking manually. High concentrations of
suspended inorganic or organic solids in a sample can be harmful to filter-feeding D. magna. Compensation for
this interference can be made by a sample treatment for turbidity. If necessary, allow to settle for a maximum
of 2 h in a container, and sample, e.g. by drawing off the required quantity of supernatant using a pipette,
maintaining the end of the pipette in the centre of the section of the test container and halfway between the
surface of the deposited substances and the surface of the liquid. If the raw sample of the decanted supernatant
is likely to interfere with the test (due to presence of residual suspended matter, protozoa, microorganisms,
etc.), centrifuge, for example, for 10 min at 5 000g or filter the raw or decanted sample. Test the residual toxicity
of the supernatant. The particular kind of filter to be used should be checked by a test with control medium run
through the filters.
NOTE Some filters and apparatus can add measurable toxicity, sometimes because of wetting agents added to the
filters. A filter paper can also absorb toxic substances and remove them from the sample filtrate.
The sample obtained by either of these methods is the sample submitted to testing.
Usually no aeration of sample or prepared test concentrations is necessary. If, and only if, the dissolved oxygen
is <40 % saturation, a pre-aerate of the sample or all test solutions for at most 20 min by appropriate methods,
e.g. aeration or stirring may be performed. Any supersaturation should be remedied.
Measure the pH (as specified in ISO 10523) and the dissolved oxygen concentration (as specified in ISO 5814)
and record these values in the test report.
Report any pre-aeration of test solutions or sample.
Tests shall be carried out without pH adjustment of the test sample.
The pH of test batches (3.6) is measured at the beginning and at the end of the test and reported.
However, in some cases, the final pH of a test solution may significantly differ from original pH of the test sample
due to the concentration range selected and as a result of the buffer capacity of the dilution water or test sample.
If toxic effects are observed at concentrations where the pH is not compatible with the survival of the organisms
(i.e. outside the pH 6,0 to pH 9,0 range), the test(s) can be repeated with pH adjustment of the test sample.
IMPORTANT — Adjustment of the pH can alter the nature of the sample.
If the pH is to be adjusted, the recommendation is to adjust to the pH of the dilution water (6.3) selected.
Choose the concentration of the hydrochloric acid (6.6) or the sodium hydroxide (6.5) solutions to restrict the
volume fraction added to not more than 5 %.
If, as a result of pH adjustment, there is an issue with suspended matter, separate the suspended matter from
the remaining sample as specified in ISO 5667-16. Any pH adjustment shall be included in the test report.
Adjust the temperature of the pretreated sample to the test temperature.
8.2 Preparation of solutions of substances to be tested
8.2.1 Preparation of stock solutions
Prepare the stock solution of the substance to be tested by dissolving a known quantity of substance in a
specified volume of dilution water (6.3) at the time of use. However, if the stock solution of the substance is
stable under certain conditions, it can be prepared in advance and stored under these conditions.
For substances sparingly soluble in the test medium, refer to the specifications given in ISO 5667-16.
As far as possible, the use of solvents, emulsifiers or dispersants should be avoided. However, such compounds
may be required in some cases in order to produce a suitably concentrated stock solution. Guidance for
suitable solvents, emulsifiers and dispersants is given in Reference [4]. Special considerations concerning test
[2]
design and data evaluation are necessary (ISO/TS 20281 ).
8.2.2 Preparation of test solutions
Prepare the test solution (see 9.1) by adding the stock solutions (8.2.1) to the dilution water (6.3) in specified quantities.
The test should comprise at least five concentrations of the sample to be tested. Select the dilutions within a
geometric series with a separation factor which depends on the nature of the sample to be analysed (chemical
substances, effluents, waters or extracts) and on the type of assay (range finding or definitive).
For the range finding test with chemical substances, the separation factor for the serial dilutions is usually 10
(one order of magnitude difference between two successive dilutions).
For treated or untreated waste water, fresh water, pore water or extracts, a separation factor of2 between
dilutions is usually performed (i.e. dilution of the previous dilution by half).
The preparation of the dilution series for lowest ineffective dilution (LID) determinations is described in Annex F.
Depending on the purpose of the test and the statistical requirements concerning the test results, other dilution
schemes with concentrations in geometric or logarithmic series can also be appropriate.
Dilution series for the definitive test on chemical substances are prepared with a separation factor not exceeding 3,2.
If steep concentration–response curves are expected, it is recommended that a separation factor not
exceeding 2,2 be used.
Each dilution is preferably carried out in four replicates with a control (3.1) also in four replicates.
Substances which are poorly soluble in water may be solubilized or dispersed directly in pure water or dilution
water by suitable means using ultrasonic devices or solvents of low toxicity to D. magna. Solvents should
be used only when the EC is greater than the solubility of the test substance. If a solvent is used, the
concentration of the solvent in the final test solution shall not exceed 0,1 ml/l, and two control solutions, one
with no solvent, the other with the maximum concentration of solvent, shall be included in the test. Consider
special requirements concerning test design for chemicals with solvents, e.g. additional solvent-control and
[2]
statistical evaluations according to ISO/TS 20281.
9 Procedure
9.1 General
Prepare a dilution series with the test solution (8.2.2) and the dilution water (6.3).
Combine increasing volumes of the test solution (8.2.2) with the dilution water (6.3), so as to obtain the desired
concentrations for the test and transfer to the test containers.
To obtain a test and solution temperature of (20 ± 2) °C, for
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 6341
Quatrième édition
2012-10-15
Qualité de l’eau — Détermination de
l’inhibition de la mobilité de Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea) —
Essai de toxicité aiguë
Water quality — Determination of the inhibition of the mobility of
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Acute toxicity test
Numéro de référence
©
ISO 2012
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord écrit
de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2012 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Environnement d’essai . 3
6 Réactifs, organismes et milieux d’essai . 3
7 Appareillage et matériel . 4
8 Traitement et préparation des échantillons . 5
8.1 Précautions particulières de prélèvement, de transport, de conservation et de traitement des
échantillons d’eau, d’effluents ou d’extraits aqueux à soumettre à essai . 5
8.2 Préparation des solutions de substances à soumettre à essai . 6
9 Mode opératoire . 7
9.1 Généralités . 7
9.2 Essai préliminaire . 8
9.3 Essai définitif . 8
9.4 Vérification de la sensibilité de Daphnia magna et de la conformité au mode opératoire . 8
9.5 Essai limite . 8
10 Interprétation et validité des résultats . 8
10.1 Estimation de la CE . 8
10.2 Critères de validité . 9
11 Expression des résultats . 9
12 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Préparation du milieu Elendt M4 . 11
Annexe B (informative) Exemple de détermination graphique de l’inhibition de la mobilité de Daphnia
magna par un effluent ou une solution mère d’une substance à une concentration de 1 000 mg/l 14
Annexe C (informative) Recommandations générales pour l’élevage .17
Annexe D (informative) Cultures de Daphnia magna pour la production des œufs de résistance .18
Annexe E (informative) Données de fidélité .21
Annexe F (informative) Niveau de dilution D — Préparation de la série de dilutions pour la
détermination de la plus faible dilution sans effet (LID) .22
Bibliographie .24
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 6341 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette quatrième édition annule et remplace la troisième édition (ISO 6341:1996), qui a fait l’objet d’une révision
technique. Elle incorpore également le Rectificatif technique ISO 6341:1996/Cor.1:1998.
iv © ISO 2012 – Tous droits réservés
Introduction
La présente Norme internationale spécifie un mode opératoire de détermination de la toxicité aiguë des
substances chimiques, eaux et eaux usées vis-à-vis de la puce d’eau Daphnia magna Straus.
L’évaluation des effets nocifs sur la qualité de l’eau s’appuie sur la réalisation d’essais biologiques depuis
plusieurs années. Les crustacés présentent un intérêt d’un point de vue écotoxicologique parce qu’ils sont des
consommateurs primaires et constituent un élément essentiel du zooplancton des écosystèmes aquatiques.
L’essai spécifié dans la présente Norme internationale concerne la détermination de l’inhibition de la mobilité
de Daphnia magna Straus après 24 h ou 48 h d’exposition (selon l’exigence des utilisateurs ou des autorités
nationales) à l’échantillon soumis à essai dans les conditions spécifiées dans la présente Norme internationale.
NORME INTERNATIONALE ISO 6341:2012(F)
Qualité de l’eau — Détermination de l’inhibition de la mobilité
de Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) — Essai de
toxicité aiguë
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de s’assurer de la conformité
à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais réalisés conformément à la présente Norme
internationale soient exécutés par un personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea).
Cette méthode s’applique aux:
— substances chimiques solubles dans les conditions de l’essai ou pouvant être maintenues en suspension
ou en dispersion stable dans les conditions de l’essai;
— effluents industriels ou domestiques;
— eaux usées traitées ou non;
— extraits aqueux et lixiviats;
— eaux douces (eaux de surface et eaux souterraines);
— éluats de sédiments d’eaux douces;
— eaux interstitielles de sédiments d’eau douce.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent document
et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 5667-16:1998, Qualité de l’eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais
biologiques des échantillons
ISO 5814, Qualité de l’eau — Dosage de l’oxygène dissous — Méthode électrochimique à la sonde
ISO 10523, Qualité de l’eau — Détermination du pH
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
lot témoin
série de répliques contenant la solution témoin
[3]
[ISO 20665:2008 , 3.3]
3.2
solution témoin
milieu d’essai ne contenant pas d’échantillon soumis à essai
3.3
immobilisation
incapacité des organismes à nager pendant les 15 s qui suivent une agitation légère des solutions d’essai et
de contrôle, même s’ils peuvent encore bouger leurs antennes
3.4
CE
concentration à laquelle un effet conforme au critère d’essai est observé sur 50 % des organismes
[1]
[ISO 15088:2007 , 3.3]
3.5
nouveau-né
individu qui vient de naître ou qui vient d’éclore
NOTE Dans la présente Norme internationale, un nouveau-né désigne une daphnie au premier stade de
développement larvaire, c’est-à-dire d’âge inférieur à 24 h.
[3]
[ISO 20665:2008 , 3.6]
3.6
lot d’essai
série de répliques contenant la même solution d’essai
[3]
[ISO 20665:2008 , 3.8]
4 Principe
Détermination de la concentration initiale (c’est-à-dire la concentration présente au début de l’essai) qui, en
24 h ou 48 h, immobilise 50 % des D. magna exposées, dans les conditions spécifiées dans la présente Norme
internationale. Cette concentration, connue comme la concentration inhibitrice initiale efficace, est désignée
par CE – 24 h ou CE – 48 h.
50 50
Une indication de la plus faible concentration soumise à essai qui immobilise toutes les D. magna et de la
concentration la plus élevée qui n’immobilise aucune D. magna est souhaitable et fournit des informations
utiles dans les cas où la CE ne peut pas être déterminée.
L’essai est réalisé en une ou deux étapes:
— un essai préliminaire qui détermine la gamme de concentrations à tester dans l’essai définitif de toxicité et
qui donne une valeur approximative de la CE – 24 h ou de la CE – 48 h;
50 50
— un essai définitif, réalisé lorsque la valeur approximative donnée par l’essai préliminaire est insuffisante,
qui permet de calculer la CE – 24 h ou la CE – 48 h et qui détermine les concentrations correspondant
50 50
à des pourcentages d’immobilisation de 0 % et de 100 %.
Si la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale est utilisée pour les essais biologiques des
substances chimiques, un essai limite peut être effectué à 100 mg/l ou à une concentration inférieure, à
laquelle la substance est soluble ou en dispersion stable dans les conditions de l’essai (voir 9.5). Un essai
limite peut également être réalisé à des concentrations supérieures à 100 mg/l, si cela donne des informations
utiles, tant que la substance est soluble ou en dispersion stable.
2 © ISO 2012 – Tous droits réservés
5 Environnement d’essai
L’exposition des organismes, telle que spécifiée dans la présente Norme internationale, doit être effectuée
dans l’obscurité ou en appliquant une photopériode de 16 h de lumière suivies de 8 h d’obscurité, dans une
pièce climatisée ou un incubateur à une température de (20 ± 2) °C dans les récipients d’essai.
L’atmosphère d’essai doit être exempte de vapeurs ou poussières toxiques vis-à-vis de D. magna. Les
substances chimiques photodégradables doivent être soumises à essai dans l’obscurité, ou avec un éclairage
minimal dans les conditions de photopériode spécifiées, ou avec un éclairage minimal de type lumière rouge,
selon le cas.
L’utilisation de témoins (3.1) permet également de vérifier que l’essai est réalisé dans une atmosphère exempte
de poussières et vapeurs toxiques.
6 Réactifs, organismes et milieux d’essai
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
6.1 Organismes d’essai. Les organismes d’essai sont des nouveau-nés de l’espèce D. magna Straus (Cladocera,
Crustacea), obtenus par parthénogenèse acyclique dans des conditions d’élevage spécifiées (voir Annexe C).
Les animaux utilisés pour l’essai doivent être âgés de moins de 24 h et il convient qu’ils ne soient pas issus
d’une première génération de descendants. Les D. magna doivent provenir d’une culture saine, ne montrant
aucun signe de stress tel qu’une mortalité supérieure à 20 % en deux jours, la présence de mâles, d’éphippies
ou d’animaux décolorés, et aucun retard ne doit être observé dans l’obtention de la première ponte. Isoler les
femelles gravides et recueillir les nouveau-nés qui viennent d’éclore dans les 24 h.
Si les conditions de culture diffèrent significativement des conditions d’essai, il est recommandé d’acclimater
une génération pendant environ une semaine dans les conditions d’essai afin d’éviter de soumettre les parents
et les descendants à un stress.
L’âge de la culture et l’origine (y compris le clone, si possible) de la culture de D. magna doivent être indiqués
dans le rapport d’essai car la sensibilité de D. magna aux substances toxiques peut être affectée par l’origine
de la culture.
Les D. magna peuvent également provenir de l’éclosion d’éphippies obtenues à partir de cultures de laboratoire
1)
de ce crustacé, comme décrit à l’Annexe D, ou peuvent être achetées auprès d’une entreprise spécialisée .
Les nouveau-nés éclos des éphippies peuvent être utilisés directement comme organismes d’essai s’ils
remplissent tous les critères de validité indiqués dans la présente Norme internationale.
6.2 Eau pure, de conductivité inférieure à 10 µS/cm.
6.3 Eau pour l’élevage et eau de dilution.
6.3.1 Généralités. Les eaux naturelles (eau de surface ou eau souterraine), l’eau reconstituée ou l’eau du
robinet déchlorée sont acceptables comme eau pour l’élevage et comme eau de dilution si les D. magna y
survivent pendant les temps de mise en culture, d’acclimatation et d’essai sans montrer de signes de stress.
Ces eaux peuvent être utilisées si elles remplissent tous les critères et toutes les conditions établis dans la
présente Norme internationale. Les eaux dont le pH est compris entre pH 6 et pH 9 et dont la dureté est
comprise entre 140 mg/l et 275 mg/l (en CaCO ) sont recommandées.
Pour l’élevage de D. magna en laboratoire, le milieu M4 (voir Annexe A) peut également être utilisé.
Il convient de ne pas utiliser le milieu M4 (Annexe A) comme eau de dilution pour les échantillons contenant
des ions métalliques bivalents. La présence d’EDTA dans ce milieu peut réduire la biodisponibilité des ions
1) MicroBioTests Inc., Mariakerke, Belgique, est un exemple de fournisseur approprié. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande le fournisseur
ainsi désigné.
métalliques bivalents, donnant lieu à une diminution de leur toxicité apparente. Et pour la même raison, il
convient de ne pas utiliser le milieu M4 comme eau de dilution pour des échantillons de composition inconnue.
NOTE Si l’essai est réalisé à des fins nécessitant l’utilisation d’une eau de dilution ayant des propriétés différentes de
celles décrites dans les trois alinéas précédents, indiquer les caractéristiques principales de l’eau de dilution synthétique
utilisée dans le rapport d’essai.
À titre d’exemple, la préparation d’une eau de dilution satisfaisant à ces exigences est décrite ci-dessous.
Dissoudre des quantités connues de réactifs dans de l’eau pure (6.2). L’eau de dilution ainsi préparée doit avoir
un pH de 7,8 ± 0,5, une dureté de (225 ± 50) mg/l (exprimée en CaCO ), un rapport molaire Ca + Mg proche
de 4 + 1 et une concentration en oxygène dissous supérieure à 7 mg/l.
Préparer les solutions spécifiées en 6.3.2 à 6.3.5.
6.3.2 Solution de chlorure de calcium. Dissoudre 11,76 g de chlorure de calcium dihydraté (CaCl , 2H O)
2 2
dans de l’eau pure (6.2) et compléter à 1 l avec de l’eau pure (6.2).
6.3.3 Solution de sulfate de magnésium. Dissoudre 4,93 g de sulfate de magnésium heptahydraté
(MgSO , 7H O) dans de l’eau pure (6.2) et compléter à 1 l avec de l’eau pure (6.2).
4 2
6.3.4 Solution de bicarbonate de sodium. Dissoudre 2,59 g de bicarbonate de sodium (NaHCO ) dans de
l’eau pure (6.2) et compléter à 1 l avec de l’eau pure (6.2).
6.3.5 Solution de chlorure de potassium. Dissoudre 0,23 g de chlorure de potassium (KCI) dans de l’eau
pure (6.2) et compléter à 1 l avec de l’eau pure (6.2).
6.3.6 Mélange. Mélanger 25 ml de chacune des quatre solutions (6.3.2 à 6.3.5) et compléter à 1 l avec de
l’eau pure (6.2).
L’eau de dilution doit être aérée jusqu’à ce que la concentration en oxygène dissous ait atteint la saturation et
jusqu’à stabilisation du pH. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,8 ± 0,5 en ajoutant une solution d’hydroxyde de
sodium (NaOH) ou de l’acide chlorhydrique (HCI). L’eau de dilution ainsi préparée ne doit pas être de nouveau
aérée avant utilisation.
6.4 Substance de référence. Le dichromate de potassium (K Cr O ) est recommandé.
2 2 7
Étant donné que le dichromate de potassium est une substance cancérigène dont l’inhalation peut s’avérer toxique,
2)
l’utilisation d’une solution disponible dans le commerce à concentration définie en K Cr O pour la préparation
2 2 7
de la solution mère de référence peut réduire le risque d’inhalation des poussières toxiques au laboratoire.
6.5 Solution d’hydroxyde de sodium, par exemple [NaOH] = 1 mol/l.
6.6 Acide chlorhydrique, par exemple [HCl] = 1 mol/l.
7 Appareillage et matériel
Appareillage courant de laboratoire et, en particulier, les éléments suivants.
7.1 Pièce ou enceinte climatisée.
7.2 Appareil de mesure de l’oxygène dissous.
2) Une solution de dichromate de potassium Titrisol est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou
recommande le produit ainsi désigné.
4 © ISO 2012 – Tous droits réservés
7.3 Récipients d’élevage, en matériau chimiquement inerte et de capacité suffisante, par exemple béchers
en verre de 2 l.
7.4 Récipients d’essai, en matériau chimiquement inerte et de capacité suffisante, par exemple tubes à
essai ou béchers en verre.
7.5 Pipette pour le prélèvement des organismes d’essai, de diamètre suffisant pour capturer les animaux
tout en ne prélevant qu’un volume faible du milieu.
Des micropipettes en matériau plastique inerte munies d’un bulbe à l’extrémité sont parfaitement adaptées à
ces opérations.
7.6 Flacons d’échantillonnage, tels que spécifiés dans l’ISO 5667-16.
7.7 Tamis. Des tamis adaptés (par exemple à mailles de 1,0 mm et 0,3 mm) pour transférer les organismes
adultes dans le cadre de l’élevage et pour séparer les jeunes des individus adultes.
8 Traitement et préparation des échantillons
8.1 Précautions particulières de prélèvement, de transport, de conservation et de traitement
des échantillons d’eau, d’effluents ou d’extraits aqueux à soumettre à essai
Il convient que l’échantillonnage, le transport et la conservation des échantillons soient réalisés comme spécifié
dans l’ISO 5667-16.
Effectuer l’essai de toxicité dès que possible, de préférence dans les 12 h qui suivent le prélèvement. Si ce
délai ne peut pas être respecté, refroidir l’échantillon à une température comprise entre 0 °C et 5 °C et réaliser
l’essai dans les 24 h. S’il est impossible de réaliser l’essai dans les 72 h, l’échantillon peut être congelé
immédiatement après le prélèvement et maintenu congelé (à une température inférieure à −18 °C) pour être
soumis à essai dans les deux mois qui suivent le prélèvement (voir l’ISO 5667-16:1998, Article 5).
Effectuer l’essai immédiatement après la décongélation complète des échantillons, par exemple dans un bain-
marie à une température maximale de 30 °C. Ne pas utiliser un four à micro-ondes pour décongeler les
échantillons.
Au moment de l’essai, homogénéiser l’échantillon à analyser en l’agitant manuellement. Des concentrations
élevées en solides organiques ou inorganiques en suspension dans l’échantillon peuvent nuire aux D. magna
qui se nourrissent par filtration. Il est possible d’atténuer cette perturbation en clarifiant l’échantillon. Si
nécessaire, laisser reposer pendant 2 h au maximum dans un récipient et prélever, par exemple à l’aide d’une
pipette, la quantité nécessaire de surnageant, en maintenant l’extrémité de la pipette au centre du récipient
d’essai et à mi-distance entre la surface des substances déposées et la surface du liquide. Si l’échantillon brut
du surnageant décanté est susceptible de perturber l’essai (en raison de la présence de matière résiduelle en
suspension, de protozoaires, de micro-organismes, etc.), centrifuger par exemple pendant 10 min à 5 000g ou
filtrer l’échantillon brut ou décanté. Tester la toxicité résiduelle du surnageant. Il convient de vérifier les types
de filtres à utiliser par un essai de filtration avec un milieu témoin.
NOTE Certains filtres et appareillages peuvent induire une toxicité supplémentaire mesurable, parfois en raison
d’agents mouillants ajoutés aux filtres. Un papier filtre peut également absorber les substances toxiques et les éliminer de
l’échantillon filtré.
L’échantillon obtenu par l’une de ces méthodes est l’échantillon soumis à essai.
Normalement, aucune aération de l’échantillon ou des concentrations d’essai préparées n’est nécessaire. Si,
et seulement si, l’oxygène dissous est inférieur à 40 % de la valeur de saturation, une aération préalable de
l’échantillon ou de toutes les solutions d’essai pendant un temps inférieur à 20 min et au moyen de méthodes
appropriées, par exemple aération ou agitation, peut être efectuée. Il convient de remédier à toute sursaturation.
Mesurer le pH (comme spécifié dans l’ISO 10523) et la concentration en oxygène dissous (comme spécifié
dans l’ISO 5814) et enregistrer ces valeurs dans le rapport d’essai.
Consigner toute aération préalable de l’échantillon ou des solutions d’essai dans le rapport d’essai.
Les essais doivent être effectués sans ajustement du pH de l’échantillon soumis à essai.
Le pH des lots d’essai (3.6) est mesuré au début et à la fin de l’essai et consigné dans le rapport d’essai.
Dans certains cas cependant, le pH final d’une solution d’essai peut être très différent du pH original de
l’échantillon soumis à essai, en raison de la gamme de concentrations sélectionnée et du pouvoir tampon de
l’eau de dilution ou de l’échantillon soumis à essai. Si des effets toxiques sont observés aux concentrations
où le pH n’est pas compatible avec la survie des organismes (c’est-à-dire en dehors de la plage de pH allant
de 6,0 à 9,0), l’(les) essai(s) peut(peuvent) être répété(s) en ajustant le pH de l’échantillon soumis à essai.
IMPORTANT — L’ajustement du pH peut dénaturer l’échantillon.
Si le pH doit être ajusté, il est recommandé de l’ajuster au pH de l’eau de dilution (6.3) sélectionnée. Choisir
la concentration des solutions d’acide chlorhydrique (6.6) ou d’hydroxyde de sodium (6.5) de manière que la
fraction volumique ajoutée ne dépasse pas 5 %.
Si l’ajustement du pH donne lieu à l’apparition de matières en suspension, séparer les matières en suspension
du reste de l’échantillon comme spécifié dans l’ISO 5667-16. Tout ajustement du pH doit être mentionné dans
le rapport d’essai.
Ajuster la température de l’échantillon préalablement traité à la température de l’essai.
8.2 Préparation des solutions de substances à soumettre à essai
8.2.1 Préparation des solutions mères
Préparer la solution mère de la substance à soumettre à essai en dissolvant une quantité connue de la
substance dans un volume spécifié d’eau de dilution (6.3) au moment de l’utilisation. Cependant, si la solution
mère de la substance est stable dans certaines conditions, elle peut être préparée à l’avance et conservée
dans les mêmes conditions.
Pour les substances peu solubles dans le milieu d’essai, se référer aux spécifications données dans
l’ISO 5667-16.
Autant que possible, il convient d’éviter l’utilisation de solvants, d’émulsifiants ou de dispersants. Toutefois, ces
composés peuvent être requis dans certains cas afin de produire une solution mère suffisamment concentrée.
Des lignes directrices concernant l’utilisation de solvants, d’émulsifiants et de dispersants adaptés sont
données dans la Référence [4]. La conception de l’essai et l’évaluation des données doivent faire l’objet de
[2]
considérations particulières (ISO/TS 20281 ).
8.2.2 Préparation des solutions d’essai
Préparer la solution d’essai (voir 9.1) en ajoutant les solutions mères (8.2.1) à l’eau de dilution (6.3) dans les
quantités spécifiées.
Il convient que l’essai comprenne au moins cinq concentrations de l’échantillon pour essai. Sélectionner les
dilutions dans une progression géométrique avec une raison déterminée en fonction de la nature de l’échantillon
à analyser (substances chimiques, effluents, eaux ou extraits aqueux) et du type d’essai (essai préliminaire ou
essai définitif).
Pour l’essai préliminaire concernant des substances chimiques, la raison pour les dilutions en série est
généralement de 10 (ordre de grandeur entre deux dilutions successives).
Pour les eaux usées traitées ou non, les eaux douces, les eaux interstitielles ou les extraits aqueux, on utilise
généralement un facteur de séparation de 2 entre dilutions (c’est-à-dire une dilution obtenue en divisant la
concentration précédente par 2).
6 © ISO 2012 – Tous droits réservés
La préparation de la série de dilutions permettant de déterminer la plus faible dilution sans effet (LID) est décrite
à l’Annexe F. Selon l’objectif recherché et les exigences statistiques relatives aux résultats d’essai, d’autres
schémas de dilution avec des concentrations choisies selon une progression géométrique ou logarithmique
peuvent également convenir.
Pour les substances chimiques, les gammes de dilution pour l’essai définitif sont préparées avec une raison
ne dépassant pas 3,2.
Si des courbes de concentration-réponse à forte pente sont attendues, il est recommandé d’utiliser une raison
inférieure à 2,2.
Quatre répliques sont réalisées par dilution ainsi que pour le lot témoin (3.1).
Les substances faiblement solubles dans l’eau peuvent être solubilisées ou dispersées directement dans
l’eau pure ou dans l’eau de dilution par des moyens adaptés, en utilisant des dispositifs à ultrasons ou des
solvants de faible toxicité vis-à-vis de D. magna. Il convient de n’utiliser les solvants que lorsque la CE est
supérieure à la solubilité de la substance d’essai. Si un solvant est utilisé, la concentration en solvant de la
solution d’essai au final ne doit pas dépasser 0,1 ml/l et deux solutions témoins, l’une sans solvant, l’autre avec
la concentration maximale en solvant, doivent être incluses dans l’essai. Prendre en compte les exigences
particulières relatives à la conception de l’essai pour les substances chimiques avec solvants, par exemple
[2]
témoin solvant supplémentaire et évaluations statistiques conformément à l’ISO/TS 20281 .
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Préparer une série de dilutions de la solution d’essai (8.2.2) avec l’eau de dilution (6.3).
Mélanger des volumes croissants de la solution d’essai (8.2.2) avec l’eau de dilution (6.3) afin d’obtenir les
concentrations voulues pour l’essai. Transférer les mélanges dans les récipients d’essai.
Pour obtenir une température des solutions et de l’essai de (20 ± 2) °C,
...
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 6341
Четвертое издание
2012-10-15
Качество воды. Определение
подавления подвижности Daphnia
magna Straus (Cladocera, Crustacea).
Тест на острую токсичность
Water quality – Determination of the inhibition of thew mobility of
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) – Acute toxity test
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
©
ISO 2012
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все меры
предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами – членами ISO. В
редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просим информировать Центральный секретариат
по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2012
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO по адресу ниже или членов ISO в стране регистрации пребывания.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2012– Все права сохраняются
Содержание Страница
Предисловие .iv
Введение .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода.2
5 Окружающие условия для теста.3
6 Реактивы, испытуемые организмы и среды .3
7 Аппаратура и материалы.5
8 Обработка и подготовка проб.6
8.1 Особые меры предосторожности при пробоотборе, транспортировании, хранении и
очистке воды, стоков и водных экстрактов для испытания.6
8.2 Приготовление растворов веществ, подлежащих испытаниям .7
9 Проведение испытания.8
9.1 Общие положения .8
9.2 Предварительное испытание .8
9.3 Определительное испытание .9
9.4 Проверка чувствительности дафний Daphnia magna и соответствия методу
испытаний.9
9.5 Предельное испытание.9
10 Интерпретация и достоверность результатов .9
10.1 Оценка EC .9
10.2 Критерии достоверности .10
11 Обработка результатов.10
12 Протокол испытания.10
Приложение А (информативное) Приготовление питательной среды Elendt M4 .12
Приложение В (информативное) Пример графического определения подавления
подвижности дафний Daphnia magna сточной водой или исходным раствором
вещества в концентрации 1 000 мг/л .15
Приложение С (информативное) Общие рекомендации для выращивания дафний.18
Приложение D (информативное) Выращивание Daphnia magna для производства
покоящихся яиц .19
Приложение Е (информативное) Показатели прецизионности.21
Приложение F (информативное) Уровень разведения D — Приготовление серии
разведений для определения LID .22
Библиография.24
© ISO 2012– Все права сохраняются iii
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией национальных
организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных стандартов
обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член, заинтересованный в
деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть представленным в этом
комитете. Международные правительственные и неправительственные организации, имеющие связи с
ISO, также принимают участие в работах. Что касается стандартизации в области электротехники, то
ISO работает в тесном сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC).
Проекты международных стандартов разрабатываются в соответствии с правилами Директив ISO/IEC,
Часть 2.
Основной задачей технических комитетов является подготовка международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам на
голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее
75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего международного стандарта могут быть
объектом патентных прав. Международная организация по стандартизации не может нести
ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных прав.
ISO 6341 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 147, Качество воды, Подкомитетом SC 5,
Биологические методы.
Настоящее четвертое издание отменяет и заменяет третье издание (ISO 6341:1996) после
технического пересмотра. Он также включил Техническую поправку ISO 6341:1996/Cor. 1:1998.
iv © ISO 2012– Все права сохраняются
Введение
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения острой токсичности
химических веществ, воды и сточных вод в отношении водяной блохи Daphnia magna Straus.
Оценивание вредных воздействий на качество воды в течение ряда лет включает выполнение
биологических тестов. Рачки представляют интерес с точки зрения экотоксикологии, поскольку
являются первичными потребителями и основным компонентом зоопланктона в водных экосистемах.
Тест, установленный в настоящем международном стандарте, включает определение иммобилизации
водяной блохи Daphnia magna Straus после 24 –часового или 48 –часового воздействия (в зависимости
от требования пользователей или органов государственной власти) на испытуемую пробу в условиях,
установленных в настоящем международном стандарте.
© ISO 2012– Все права сохраняются v
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 6341:2012(R)
Качество воды. Определение подавления подвижности
Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea). Тест на острую
токсичность
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Лица, использующие данный международный стандарт, должны быть
знакомы с обычной лабораторной практикой. Настоящий международный стандарт не ставит
целью решить все проблемы безопасности, связанные с ее использованием. Пользователь
данного международного стандарта сам несет ответственность за разработку соответствующей
техники безопасности и правил охраны здоровья, а также за обеспечение соответствия
условиям всех национальных регламентов.
ВНИМАНИЕ! — Крайне важно, чтобы испытания по настоящему международному стандарту
выполнялись соответствующим образом подготовленным персоналом.
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод определения острой токсичности в
отношении Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea).
Этот метод применим к:
⎯ химическим веществам, которые являются растворимыми в условиях испытания или могут
поддерживаться в состоянии стабильной суспензии или дисперсии в условиях теста;
⎯ промышленным или бытовым сточным водам;
⎯ очищенным и неочищенным сточным водам;
⎯ водным экстрактам и продуктам выщелачивания;
⎯ пресной воде (поверхностным и грунтовым водам);
⎯ элюатам из пресноводных отложений;
⎯ поровой воде пресноводных отложений.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные документы обязательны для применения данного документа. Для
датированных ссылок применяется только указанное издание. Для недатированных ссылок
применяется самое последнее издание указанного документа (включая все изменения).
ISO 5667-16:1998, Качество воды. Отбор проб. Часть 16. Руководство по биотестированию проб
ISO 5814, Качество воды. Определение растворенного кислорода. Электрохимический метод с
применением зонда
ISO 10523, Качество воды. Определение pH
© ISO 2012– Все права сохраняются 1
3 Термины и определения
В настоящем документе используются следующие термины и определения.
3.1
партия контролей
control batch
ряд повторных растворов, включая контрольный раствор
[3]
[ISO 20665:2008, 3.3]
3.2
контрольный раствор
control solution
испытательная среда без анализируемой пробы
3.3
иммобилизация
immobilization
неспособность организмов к плаванию в воде в течении 15 с после легкого перемешивания
испытательного и контрольного растворов, даже если они продолжают двигать своими усиками
3.4
EC
концентрация, при которой существует воздействие на 50 % организмов согласно критерию теста
[1]
[ISO 15088:2007, 3.3]
3.5
новорожденный
neonate
только что рожденный или вылупившийся субъект
ПРИМЕЧАНИЕ В настоящем международном стандарте новорожденной считается первая возрастная стадия
дафнии, первые 24 ч жизни.
[3]
[ISO 20665:2008, 3.6]
3.6
испытательная партия
test batch
ряд повторных растворов, наполняемых одним и тем же анализируемым раствором
[3]
[ISO 20665:2008, 3.8]
4 Сущность метода
Определение первоначальной концентрации (т.е. концентрации в начале теста), которая через 24 ч
или 48 ч, обездвиживает 50 % анализируемых дафний D. magna, в условиях, установленных в
настоящем международном стандарте. Эта концентрация, известная как эффективная начальная
ингибиторная концентрация, обозначается 24 ч EC или 48 ч EC .
50 50
В тех случаях, когда EC определить невозможно, желательно указать полученные в тесте самую
низкую концентрацию, которая иммобилизует все дафнии D. Magna, и самую высокую концентрацию,
которая не иммобилизует ни одну дафнию D. magna и представить полезную информацию.
Тест выполняется в одну или две стадии:
2 © ISO 2012– Все права сохраняются
⎯ предварительный тест, определяющий диапазон концентраций, который необходимо
проанализировать при определении токсичности, и дающий приблизительное значение 24 ч EC
или 48 ч EC ;
⎯ собственно тест, выполняемый, если значения, полученного в предварительном тесте
недостаточно, позволяющий вычислить 24 ч EC или 48 ч EC , и определяющий концентрации,
50 50
соответствующие 0 % и 100 % -ной иммобилизации.
Если метод, установленный в настоящем международном стандарте, используется для
биотестирования химических веществ, можно выполнить тест на предельное содержание при
концентрации 100 мг/л или при более низкой концентрации, при которой вещество растворяется или
является стабильной дисперсией в условиях испытания (см. 9.5). Если этот тест дает полезную
информацию, то его можно провести при концентрациях выше 100 мг/л при условии, что вещество
растворяется при этой концентрации или дает стабильную дисперсию.
5 Окружающие условия для теста
Воздействие на организмы в соответствии с данным международным стандартом должно
осуществляться либо в темноте, либо как при световом дне: 16 ч свет + 8 ч темнота, в помещении с
температурным контролем или в инкубаторе при температуре (20 ± 2) °C в испытательных емкостях.
Испытательная атмосфера не должна содержать пары или пыль, токсичные для D. magna.
Разлагаемые на свету химические вещества должны испытываться в темноте или при минимальном
освещении в течение установленного фотопериода, или минимальном освещении красным светом, в
зависимости от рассматриваемого случая.
Использование контролей (3.1) также позволяет проверить, что испытание выполняется в атмосфере,
не содержащей токсичной пыли и паров.
6 Реактивы, испытуемые организмы и среды
Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных установок.
6.1 Испытуемые организмы. Испытуемые организмы являются новорожденными D. magna Straus
(Cladocera, Crustacea), полученными при ациклическом партеногенезе в установленных условиях
размножения (см. Приложение C).
Особи, используемые для испытания, должны иметь возраст менее 24 ч, причем не следует брать
потомство первого поколения. Дафнии D. magna должны происходить от жизнеспособных особей, не
проявляющих признаков стресса, например, смертность >20 % в течение 2 дней, присутствие мужских
особей, эфипиумов, или бесцветных особей, а также не должно быть задержки в воспроизводстве
первого поколения. Отделяют оплодотворенные женские особи и собирают новорожденных,
появившихся в течение 24 ч.
Если условия среды выращивания значительно отличаются от условий испытания, рекомендуется
одно поколение акклиматизировать к условиям испытания в течение примерно одной недели, чтобы
избежать стресса родителей и потомства.
Возраст исходной культуры и источника (включая клон, если возможно) дафний D. magna должен быть
указан в протоколе испытания, поскольку на чувствительность дафний D. magna к токсическим
веществам может повлиять источник культуры.
Дафнии D. magna могут также быть получены при инкубировании эфипиумов, полученных из
лабораторных культур рачков, в соответствии с Приложением D, или их можно приобрести в
© ISO 2012– Все права сохраняются 3
специализированной компании. Новорожденные, появившиеся из эфипиумов, могут быть
использованы непосредственно как испытуемые организмы, если они соответствуют всем критериям
валидности, описанным в данном международном стандарте.
6.2 Чистая вода, проводимость ниже 10 мкСм/см.
6.3 Вода для разбавления и выращивания.
6.3.1 Общие положения. Природная вода (поверхностные или грунтовые воды), восстановленная
вода или дехлорированная водопроводная вода приемлемы в качестве воды для культурирования и
разбавления, если дафнии D. magna в ней выживают на продолжение культивирования,
акклиматизации и испытания, не проявляя признаков стресса. Такие воды можно использовать, если
они соответствуют всем критериям и условиям, установленным в данном международном стандарте.
Рекомендуется использовать воды в диапазоне от pH 6 до pH 9, с жесткостью от 140 мг/л до 275 мг/л
(в пересчете на CaCO ).
Для исходной культуры D. magna в лаборатории также можно использовать среду M4 (см.
Приложение A).
Среду M4 (Приложение A) не следует использовать в качестве воды для разбавления для проб,
содержащих двухвалентные ионы металлов. ЭДТА в этой среде может снизить биологическую
доступность таких ионов, что приведет к снижению кажущейся токсичности. Кроме того, по той же
причине, среду M4 не следует использовать как воду для разбавления для проб неизвестного состава.
ПРИМЕЧАНИЕ Если испытание выполняется с целью, требующей применения воды для разбавления,
характеристики которой отличаются от описанных в трех предыдущих абзацах, указывают основные
характеристики использованной искусственной воды для разбавления.
В качестве примера ниже описывается приготовление воды для разбавления, удовлетворяющей
требованиям.
Растворяют известные количества реактивов в чистой воде (6.2) Приготовленная вода для
разбавления должна иметь pH 7,8 ± 0,5, жесткость (225 ± 50) мг/л (в пересчете на CaCO ), молярное
соотношение Ca + Mg близкое к 4 + 1 и концентрацию растворенного кислорода выше 7 мг/л.
Готовят растворы, установленные в 6.3.2 - 6.3.5.
6.3.2 Раствор хлорида кальция. Растворяют 11,76 г дигидрата хлорида кальция (CaCl⋅2H O) в
2 2
чистой воде (6.2и доводят до 1 л чистой водой (6.2).
6.3.3 Раствор сульфата магния. Растворяют 4,93 г гептагидрата сульфата магния (MgSO⋅7H O) в
4 2
чистой воде (6.2) и доводят до 1 л чистой водой (6.2).
6.3.4 Раствор бикарбоната натрия. Растворяют 2,59 г бикарбоната натрия (NaHCO ) в чистой воде
(6.2) и доводят до 1 л чистой водой (6.2).
Компания MicroBioTests Inc., Mariakerke, Belgium, является примером подходящего поставщика. Эта
информация дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не указывает на
предпочтение со стороны ISO в отношении этого поставщика.
4 © ISO 2012– Все права сохраняются
6.3.5 Раствор хлорида калия. Растворяют 0,23 г хлорида калия (KCI) в чистой воде (6.2) и доводят
до 1 л чистой водой (6.2).
6.3.6 Перемешивание. Перемешивают 25 мл каждого из четырех растворов (6.3.2 - 6.3.5) и доводят
до 1 л чистой водой (6.2).
Вода для разбавления должна быть аэрирована, так чтобы довести концентрацию растворенного
кислорода до насыщения, а pH до стабилизации. При необходимости, регулируют pH до 7,8 ± 0,5
добавлением раствора гидроксида натрия (NaOH) или соляной кислоты (HCI). Воду для разбавления,
приготовленную таким образом, перед использованием больше аэрировать не требуется.
6.4 Стандартное вещество. Рекомендуется дихромат калия (K Cr O ).
2 2 7
Поскольку K Cr O является канцерогенным веществом, токсичным при вдыхании, применение
2 2 7
готового раствора с определенной концентрацией K Cr O для приготовления исходного раствора
2 2 7
стандартного вещества может снизить риск вдыхания токсичной пыли в лаборатории.
6.5 Раствор гидроксида натрия, например, [NaOH] = 1 моль/л.
6.6 Соляная кислота, например, [HCl] = 1 моль/л.
7 Аппаратура и материалы
Обычное лабораторное оборудование и, в частности. следующее.
7.1 Помещение с температурным контролем или камера.
7.2 Устройство для измерения растворенного кислорода.
7.3 Сосуды для культур, из химически инертного материала достаточной вместимости, например,
стеклянные химические стаканы вместимостью 2 л.
7.4 Испытательные емкости, из химически инертного материала достаточной вместимости,
например, стеклянные пробирки или химические стаканы.
7.5 Пипетка для отбора испытуемых организмов, достаточного диаметра для захвата особей,
позволяющим при этом отобрать только небольшой объем среды.
Микропипетки из инертной пластмассы с утолщением на конце очень хорошо подходят для подобных
операций.
7.6 Емкости для сбора проб, в соответствии с ISO 5667-16.
7.7 Сита. Подходящие сита (например, с размером ячейки 1,0 мм и 0,3 мм) для переноса взрослых
особей в исходную культуру и для отделения молодых от взрослых.
2 Раствор дихромата калия Titrisol является примером продукции, имеющейся в продаже. Эта информация
дается для удобства пользователей данного международного стандарта и не указывает на предпочтение со
стороны ISO в отношении этой продукции.
© ISO 2012– Все права сохраняются 5
8 Обработка и подготовка проб
8.1 Особые меры предосторожности при пробоотборе, транспортировании, хранении
и очистке воды, стоков и водных экстрактов для испытания
Отбор проб, транспортирование и хранение проб следует выполнять в соответствии с ISO 5667-16.
Тест на токсичность выполняют, по возможности, быстро, предпочтительно в течение 12 ч с момента
отбора проб. Если невозможно уложиться в указанный интервал, охлаждают пробу до температуры
0 °C - 5 °C и испытывают ее в течение 24 ч с момента пробоотбора. Если невозможно выполнить тест в
течение 72 ч, пробу можно заморозить практически сразу же после отбора и поддерживать в состоянии
глубокой заморозки (ниже –18 °C) для испытаний в течение 2 месяцев с момента отбора (см. ISO 5667-
16:1998, Раздел 5).
После полного оттаивания пробы испытывают немедленно, например, в водяной бане при
максимальной температуре 30 °C. Не допускается использовать микроволновую печь для
размораживания проб.
Во время испытания, гомогенизируют пробу для анализа встряхиванием вручную. Высокие
концентрации суспендированных неорганических и органических твердых веществ в пробе могут
повредить фильтрующим дафниям D. magna. Скомпенсировать такие влияния можно обработкой
пробы от мутности. При необходимости, дают отстояться в течение не более 2 ч в емкости, и отбирают
пробу, например, требуемое количество надосадочной жидкости пипеткой, держа конец пипетки в
центре сечения емкости и на середине расстояния от осадка до поверхности жидкости. Если
необработанная проба надосадочной жидкости может помешать тестированию (за счет присутствия
остаточного взвешенного вещества, простейших, микроорганизмов и т.д.), центрифугируют, например,
в течение 10 мин при 5 000g или фильтруют необработанную или декантированную пробу.
Определяют остаточную токсичность надосадочной жидкости. Фильтр конкретного типа следует перед
применением проверить испытанием с контрольной средой, пропущенной через фильтры.
ПРИМЕЧАНИЕ Некоторые фильтры и аппаратура могут внести вклад в измеряемую токсичность, иногда за
счет смачивающих веществ, добавляемых в фильтры. Фильтровальная бумага может также абсорбировать
токсичные вещества, извлекая их, таким образом, из фильтрата пробы.
Проба, полученная одним из этих методов, является пробой, предлагаемой для анализа.
Обычно не требуется аэрирования пробы или приготовления конкретных концентраций для анализа.
Если, и только в том случае, если растворенный кислород составит <40 % насыщения, предварительно
аэрируют пробу или все испытательные растворы в течение самое большее 20 мин подходящими
методами, например, можно выполнить аэрирование или перемешивание. Всякое пересыщение
следует исправлять.
Измеряют pH (в соответствии с ISO 10523) и концентрацию растворенного кислорода (в соответствии с
ISO 5814) и записывают эти значения в протокол испытания.
Сообщают о предварительном аэрировании испытательных растворов или пробы.
Тестирование необходимо выполнять без регулирования pH пробы.
pH испытуемых партий (3.6) измеряют в начале и в конце тестирования и вносят в протокол.
В то же время, в некоторых случаях, окончательный pH испытательного раствора может значительно
отличаться от первоначального pH испытуемой пробы за счет выбранного диапазона концентраций и в
результате буферной емкости воды для разбавления или пробы. Если наблюдается токсичное
воздействие при концентрациях, когда pH несовместим с выживанием организмов (т.e. вне диапазона
pH 6,0 - pH 9,0), тестирование можно повторить, отрегулировав pH пробы.
ВНИМАНИЕ! — Регулирование pH может изменить характер пробы.
6 © ISO 2012– Все права сохраняются
Если pH предполагается регулировать, рекомендуется регулировать pH выбранной воды для
разбавления (6.3). Выбирают концентрацию растворов соляной кислоты (6.6) или гидроксида натрия
(6.5) , чтобы ограничить добавляемую объемную долю до не более 5 %.
Если в результате регулирования pH возникнет вопрос с взвешенными частицами, отделяют
взвешенные частицы от остальной пробы в соответствии с ISO 5667-16. Регулирование pH
необходимо указать в протоколе испытания.
Регулируют температуру предварительно обработанной пробы до уровня испытательной температуры.
8.2 Приготовление растворов веществ, подлежащих испытаниям
8.2.1 Приготовление исходных растворов
Готовят исходный раствор вещества, подлежащего испытаниям, растворив известное количество
вещества в установленном объеме воды для разбавления (6.3) непосредственно перед применением.
Однако, если исходный раствор стабилен в определенных условиях, его можно готовить заранее и
хранить в этих условиях.
Для веществ умеренно растворимых в испытательной среде, см. технические условия по ISO 5667-16.
По мере возможностей, следует избегать применения растворителей, эмульгаторов или диспергаторов.
В то же время такие соединения могут потребоваться в некоторых случаях для получения исходного
раствора нужной концентрации. Руководство по подходящим растворителям, эмульгаторам или
диспергаторам дается в Ссылке [4]. Особое внимание необходимо уделить планированию испытания и
[2]
оцениванию данных (ISO/TS 20281 ).
8.2.2 Приготовление испытательных растворов
Готовят испытательный раствор (см. 9.1) добавлением исходных растворов (8.2.1) в воду для
разбавления (6.3) в установленных количествах.
Испытание должно включать не менее пяти концентраций пробы для испытания. Выбирают
разбавления в геометрическом ряду с коэффициентом разделения, который зависит от природы
анализируемой пробы (химические вещества, вода, стоки или экстракты) и от типа анализа
(нахождение диапазона или количественное определение).
Для нахождения диапазона концентраций при испытании химических веществ коэффициент
разделения для серийного разведения обычно составляет 10 (между двумя последовательными
разведениями разность составляет один порядок величины).
Для очищенных и неочищенных сточных вод, пресной воды, поровой воды или экстрактов обычно
используют коэффициент разделения равный 2 между разведениями (т.e. разбавление
предшествующего раствора наполовину).
Приготовление серии разведений для определений самого низкого неэффективного разбавления (LID)
описано в Приложении F. В зависимости от цели испытания и статистических требований, касающихся
результатов испытания, могут также использоваться другие схемы разбавления до концентраций в
геометрической прогрессии или логарифмическом ряду.
Серия разбавления для количественного определения на химических веществах готовят в
коэффициентом разделения не выше 3,2.
Если ожидается получение крутых кривых концентрация-отклик, то рекомендуется использовать
коэффициент разделения, не превышающий 2,2.
Каждое разбавление осуществляют предпочтительно в четырех повторах с контролем (3.1) также в
четырех повторах.
© ISO 2012– Все права сохраняются 7
Вещества, которые плохо растворимы в воде можно солюбилизировать или диспергировать
непосредственно в чистой воде подходящими средствами, используя ультразвуковые устройства или
растворители низкой токсичности в отношении дафний D. magna. Растворители следует использовать
только если EC выше, чем растворимость испытуемого вещества. Если используется растворитель,
концентрация растворителя в конечном испытательном растворе не должна превышать 0,1 мл/л, а в
испытание необходимо включить два раствора контролей, один без растворителя, а другой с
максимальной концентрацией растворителя. Учитывают конкретные требования, касающиеся
планирования испытания для химических веществ с растворителями, например, дополнительный
[2]
контроль раство
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
Loading comments...