Microbiology of the food chain — Methods for the detection of Anisakidae L3 larvae in fish and fishery products — Part 2: Artificial digestion method

This document specifies a method for the detection of Anisakidae L3 larvae commonly found in marine and anadromous fishes. The method is applicable to fresh fish and/or frozen fish, as well as lightly processed fish products, such as marinated, salted or smoked. It is also suitable for visceral organs as a confirmatory method for a visual inspection scheme. The artificial digestion method[4][5][6] is applicable to quantifying parasitic infections by estimating the number of parasites in the fish musculature and, when applied to fresh fish or lightly processed fish products (never frozen before processing), determining the viability of Anisakidae L3, which can be present. This method does not apply to determining the species or genotype of detected parasites. Final identification is made by morphological and/or molecular methods.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthodes de recherche des larves L3 d'Anisakidae dans les poissons et produits de la pêche — Partie 2: Méthode de digestion artificielle

Le présent document spécifie une méthode de détection des larves L3 d’Anisakidae qui se trouvent fréquemment dans les poissons marins et anadromes. La méthode s’applique aux poissons frais et/ou surgelés, ainsi qu’aux produits à base de poisson légèrement transformés, c’est-à-dire marinés, salés ou fumés. Cette méthode peut également servir de méthode de confirmation dans le cadre d’une inspection visuelle des organes viscéraux. La méthode de digestion artificielle[4][5][6] s’applique à la quantification des infestations parasitaires en estimant le nombre de parasites dans les tissus musculaires des poissons et, en cas d’utilisation sur des poissons frais ou des produits à base de poisson légèrement transformés (jamais congelés avant traitement), à la détermination de la viabilité des larves L3 d’Anisakidae, susceptibles d’être présentes. Cette méthode ne s’applique pas à la détermination des espèces ou du génotype des parasites détectés. Des méthodes morphologiques et/ou moléculaires permettent une identification définitive.

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Publication Date
20-Apr-2021
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
21-Apr-2021
Completion Date
21-Apr-2021
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ISO 23036-2:2021 - Microbiology of the food chain -- Methods for the detection of Anisakidae L3 larvae in fish and fishery products
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23036-2
First edition
2021-04
Microbiology of the food chain —
Methods for the detection of
Anisakidae L3 larvae in fish and
fishery products —
Part 2:
Artificial digestion method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthodes de recherche des
larves L3 d'Anisakidae dans les poissons et produits de la pêche —
Partie 2: Méthode de digestion artificielle
Reference number
ISO 23036-2:2021(E)
ISO 2021
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ISO 23036-2:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
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---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 23036-2:2021(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

4.2 Sample size ................................................................................................................................................................................................. 2

4.3 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 2

4.4 Digestion of the sample ................................................................................................................................................................... 2

4.5 Filtration of the digest fluid ......................................................................................................................................................... 2

4.6 V erification of findings ..................................................................................................................................................................... 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 3

6 Equipment and consumables .................................................................................................................................................................. 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 4

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Preparation of the sample ............................................................................................................................................................. 4

8.2 Preparation of the digest fluid ................................................................................................................................................... 4

8.3 Digestion of the sample in the glass beaker ................................................................................................................... 5

8.4 Filtration of the digest fluid ......................................................................................................................................................... 5

8.5 Microscopic examination ............................................................................................................................................................... 5

9 Expression of the results .............................................................................................................................................................................. 5

10 Performance characteristics of the method ............................................................................................................................. 6

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 6

12 Quality assurance ................................................................................................................................................................................................ 6

Annex A (informative) Sample collection ........................................................................................................................................................ 7

Annex B (informative) Example of a laboratory worksheet for recording data when testing

fish fillets with the artificial digestion method .................................................................................................................... 8

Bibliography ................................................................................................................................................................................................................................ 9

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---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23036-2:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical

Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in accordance with the Agreement on

technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 23036 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 23036-2:2021(E)
Introduction

Nematodes of the Anisakidae family have a complex life cycle involving a high number of hosts. Adult

stages of Anisakidae reside in the stomach of marine mammals, where they are embedded in the mucosa.

Unembryonated eggs produced by adult females are released with the faeces of marine mammals and

become embryonated in seawater, where first-stage larvae (L1) develop in the eggs. The larvae moult

to become free-swimming second-stage larvae (L2) and, if ingested by crustaceans, mature into third-

stage larvae (L3). This stage is infective to fish and squid, and larvae are transferred between fishes

through predation, maintaining the L3 stage. Some larvae migrate from the abdominal cavity into

muscle tissues. Humans are incidental hosts and can be infected after ingesting raw or undercooked

infected fish or cephalopods containing viable L3.

Nematodes of the family Anisakidae are the causative agents of human anisakidosis, a disease that is not

only a public health hazard affecting humans, but also represents an economic problem in fishery and

food safety (the term “anisakiasis”, designating the disease caused by members of the genus Anisakis,

is also sometimes used). Worldwide, marine and wild anadromous fishes are intermediate hosts of

Anisakidae, whereas marine mammals are the definitive hosts.

Visual inspection procedures for the detection of Anisakidae larvae in fish are employed to minimize

[1]][2]

the risk that contaminated fish will reach the consumer, thus preventing human anisakidosis.

The UV-press and the artificial digestion of the fish muscular tissue are the methods specifically

designed to detect nematode larvae in fish and to evaluate the infestation level of a batch, and have

[3]
been validated and tested in multicentre collaborative studies (see Clause 10).
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---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 23036-2:2021(E)
Microbiology of the food chain — Methods for the
detection of Anisakidae L3 larvae in fish and fishery
products —
Part 2:
Artificial digestion method
1 Scope

This document specifies a method for the detection of Anisakidae L3 larvae commonly found in marine

and anadromous fishes. The method is applicable to fresh fish and/or frozen fish, as well as lightly

processed fish products, such as marinated, salted or smoked. It is also suitable for visceral organs as a

confirmatory method for a visual inspection scheme.
[4][5][6]

The artificial digestion method is applicable to quantifying parasitic infections by estimating the

number of parasites in the fish musculature and, when applied to fresh fish or lightly processed fish

products (never frozen before processing), determining the viability of Anisakidae L3, which can be

present.

This method does not apply to determining the species or genotype of detected parasites. Final

identification is made by morphological and/or molecular methods.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
Anisakidae L3 larvae

third-stage larvae (L3) belonging to the Anisakidae family, in particular to Anisakis, Contracaecum and

Pseudoterranova genera

Note 1 to entry: For practical purposes, the genus Hysterothylacium belonging to Raphidascarididae family and

already classified as Anisakidae, can be also included.
© ISO 2021 – All rights reserved 1
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ISO 23036-2:2021(E)
3.2
artificial digestion method

method to detect Anisakidae larvae in fish muscle tissue by an enzymatic (pepsin-HCl) digestion step

to release larvae from muscle tissues followed by a filtration step and detection of larvae by microscopy

Note 1 to entry: If applied to fresh fish, it allows checking of the viability of larvae.

4 Principle
4.1 General

The artificial digestion method relies on the enzymatic degradation of muscle fibres in a fluid composed

of pepsin and hydrochloric acid followed by filtration and washing steps.

The procedure allows a differentiation between dead and viable anisakid larvae if the temperature of

the digestion solution does not exceed 37 °C (with the exception of Hysterothylacium sp. larvae, which

are killed at 37 °C), and assuming the fish was never frozen.

There are no internal quality controls that can be used while performing the method.

NOTE Alternative methods can be used for analysis, provided their equivalence with the methods described

in this document are demonstrated.
4.2 Sample size
For inspection of fishery produc
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23036-2
Première édition
2021-04
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthodes de recherche
des larves L3 d'Anisakidae dans les
poissons et produits de la pêche —
Partie 2:
Méthode de digestion artificielle
Microbiology of the food chain — Methods for the detection of
Anisakidae L3 larvae in fish and fishery products —
Part 2: Artificial digestion method
Numéro de référence
ISO 23036-2:2021(F)
ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 23036-2:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés
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ISO 23036-2:2021(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Taille de l’échantillon ......................................................................................................................................................................... 2

4.3 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 2

4.4 Digestion de l’échantillon .............................................................................................................................................................. 2

4.5 Filtration du liquide de digestion ........................................................................................................................................... 2

4.6 Vérification des constatations .................................................................................................................................................... 3

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 3

6 Équipement et consommables ............................................................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 4

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 4

8.2 Préparation du liquide de digestion ..................................................................................................................................... 4

8.3 Digestion de l’échantillon dans le bécher en verre .................................................................................................. 5

8.4 Filtration du liquide de digestion ........................................................................................................................................... 5

8.5 Examen microscopique ................................................................................................................................................................... 5

9 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 6

10 Caractéristiques de performance de la méthode ............................................................................................................... 6

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 6

12 Assurance qualité ................................................................................................................................................................................................ 6

Annexe A (informative) Prélèvement d’échantillons ........................................................................................................................... 7

Annexe B (informative) Exemple de fiche de laboratoire pour la consignation des données

lors de l’examen des filets de poisson à l’aide de la méthode de digestion artificielle ...............8

Bibliographie .............................................................................................................................................................................................................................. 9

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---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 23036-2:2021(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le Comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le Comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits

alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à

l’Accord sur la coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Une liste de toutes les parties de la série ISO 23036 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 23036-2:2021(F)
Introduction

Les nématodes de la famille des Anisakidae présentent un cycle de vie complexe impliquant un nombre

élevé d’hôtes. Au stade adulte, les Anisakidae pénètrent dans la muqueuse de l’estomac des mammifères

marins. Les œufs non embryonnés produits par les femelles adultes sont excrétés avec les fèces des

mammifères marins et sont embryonnés dans le milieu marin, où les larves de premier stade (L1)

se développent dans les œufs. Les larves muent pour se transformer en larves libres de deuxième

stade (L2), puis, si elles sont ingérées par des crustacés, en larves de troisième stade (L3). Ce stade est

infectieux pour les poissons et les calamars et les larves sont transférées d’un poisson à un autre par

le biais de la prédation, en restant au stade L3. Certaines larves migrent de la cavité abdominale vers

les tissus musculaires. Les humains sont des hôtes accidentels, susceptibles d’être infectés après avoir

ingéré du poisson ou des céphalopodes crus ou insuffisamment cuits contenant des larves L3 viables.

Les nématodes de la famille des Anisakidae sont les agents pathogènes de l’anisakidose humaine, une

maladie qui constitue non seulement une menace pour la santé publique, mais aussi un problème d’ordre

économique pour le secteur de la pêche et de sécurité des aliments (le terme anisakiase, qui désigne la

maladie provoquée par les membres du genre Anisakis, est également parfois utilisé). Dans le monde

entier, les poissons marins et anadromes sauvages constituent des hôtes intermédiaires d’Anisakidae,

tandis que les mammifères marins en sont les hôtes définitifs.

Des procédures d’inspection visuelle visant à détecter les larves d’Anisakidae dans les poissons sont

[1][2]

mises en œuvre afin de limiter le risque que des poissons contaminés atteignent le consommateur

et ainsi d’empêcher l’apparition de l’anisakidose humaine.

Le passage sous presse hydraulique suivi de l’observation sous lumière UV, ainsi que la digestion

artificielle des tissus musculaires de poissons sont les méthodes qui ont été spécialement conçues pour

détecter les larves de nématodes dans les poissons et évaluer le niveau d’infestation d’un lot, et qui ont

[3]

été validées et soumises à essai dans des études comparatives interlaboratoires (voir Article 10).

© ISO 2021 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 23036-2:2021(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthodes de
recherche des larves L3 d'Anisakidae dans les poissons et
produits de la pêche —
Partie 2:
Méthode de digestion artificielle
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de détection des larves L3 d’Anisakidae qui se trouvent

fréquemment dans les poissons marins et anadromes. La méthode s’applique aux poissons frais et/ou

surgelés, ainsi qu’aux produits à base de poisson légèrement transformés, c’est-à-dire marinés, salés ou

fumés. Cette méthode peut également servir de méthode de confirmation dans le cadre d’une inspection

visuelle des organes viscéraux.
[4][5][6]

La méthode de digestion artificielle s’applique à la quantification des infestations parasitaires

en estimant le nombre de parasites dans les tissus musculaires des poissons et, en cas d’utilisation sur

des poissons frais ou des produits à base de poisson légèrement transformés (jamais congelés avant

traitement), à la détermination de la viabilité des larves L3 d’Anisakidae, susceptibles d’être présentes.

Cette méthode ne s’applique pas à la détermination des espèces ou du génotype des parasites détectés.

Des méthodes morphologiques et/ou moléculaires permettent une identification définitive.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
3.1
larves L3 d’Anisakidae

larves de troisième stade (L3) appartenant à la famille des Anisakidae, et plus particulièrement aux

genres Anisakis, Contracaecum et Pseudoterranova

Note 1 à l'article: Pour des raisons pratiques, le genre Hysterothylacium qui appartient à la famille

des Raphidascarididae et est déjà classé parmi les Anisakidae, peut aussi être inclus.

© ISO 2021 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 23036-2:2021(F)
3.2
méthode de digestion artificielle

méthode de détection des larves d’Anisakidae dans les tissus musculaires des poissons par digestion

enzymatique (pepsine-HCl) permettant de libérer les larves des tissus, suivie d’une filtration et d’une

détection des larves par microscopie

Note 1 à l'article: Si appliquée à du poisson frais, elle permet de vérifier la viabilité des larves.

4 Principe
4.1 Généralités

La méthode de digestion artificielle repose sur la dégradation enzymatique des fibres musculaires dans

un liquide composé de pepsine et d’acide chlorhydrique, suivie par des étapes de filtration et de lavage.

Le mode opératoire permet de différencier les larves d’Anisakidae mortes et viables sous réserve

que la température de la solution de digestion ne dépasse pas 37 °C (à l’exception des larves de

Hysterothylacium sp., qui meurent à 37 °C) et que le poisson n’ait jamais été congelé.

Aucun contrôle qualité interne ne peut être effectué pendant la mise en œuvre de cette méthode.

NOTE D’autres méthodes peuvent être utilisées pour l’analyse, sous réserve que leur équivalence avec les

méthodes décrites dans le présent document soit démontrée.
4.2 Taille de l’échantillon

Dans le cadre de l’inspection de produits de pêche à des fins de santé publique, la taille de l’échantillon

doit être établie en fonction du risque, tel que déterminé par les autorités compétentes.

4.3 Préparation de l’échantillon

Afin d’accroître la surface d’action de la dégradation enzymatique, émietter délicatement les échantillons

en prenant soin de ne pas perturber les larves. Il est également possible d’utiliser un Homogénéiseur/

®1)
Stomacher , qui facilite la digestion, sans endommager les larves de nématodes.
Il convient d’éviter toute opération
...

FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 23036-2
ISO/TC 34/SC 9
Microbiology of the food chain —
Secretariat: AFNOR
Methods for the detection of
Voting begins on:
2020-12-29 Anisakidae L3 larvae in fish and
fishery products —
Voting terminates on:
2021-02-23
Part 2:
Artificial digestion method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthodes de recherche des
larves L3 d'Anisakidae dans les poissons et produits de la pêche —
Partie 2: Méthode de digestion artificielle
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO-
ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN-
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2020
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ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
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ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

4.2 Sample size ................................................................................................................................................................................................. 2

4.3 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 2

4.4 Digestion of the sample ................................................................................................................................................................... 2

4.5 Filtration of the digest fluid ......................................................................................................................................................... 2

4.6 V erification of findings ..................................................................................................................................................................... 2

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 3

6 Equipment and consumables .................................................................................................................................................................. 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 4

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Preparation of the sample ............................................................................................................................................................. 4

8.2 Preparation of the digest fluid ................................................................................................................................................... 4

8.3 Digestion of the sample in the glass beaker ................................................................................................................... 5

8.4 Filtration of the digest fluid ......................................................................................................................................................... 5

8.5 Microscopic examination ............................................................................................................................................................... 5

9 Expression of the results .............................................................................................................................................................................. 5

10 Performance characteristics of the method ............................................................................................................................. 6

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 6

12 Quality assurance ................................................................................................................................................................................................ 6

Annex A (informative) Sample collection ........................................................................................................................................................ 7

Annex B (informative) Example of a laboratory worksheet for recording data when testing

fish fillets with the artificial digestion method .................................................................................................................... 8

Bibliography ................................................................................................................................................................................................................................ 9

© ISO 2020 – All rights reserved iii
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ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/

iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical

Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in accordance with the Agreement on

technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
A list of all parts in the ISO 23036 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
Introduction

Nematodes of the Anisakidae family have a complex life cycle involving a high number of hosts. Adult

stages of Anisakidae reside in the stomach of marine mammals, where they are embedded in the mucosa.

Unembryonated eggs produced by adult females are released with the faeces of marine mammals and

become embryonated in seawater, where first-stage larvae (L1) develop in the eggs. The larvae moult

to become free-swimming second-stage larvae (L2) and, if ingested by crustaceans, mature into third-

stage larvae (L3). This stage is infective to fish and squid, and larvae are transferred between fishes

through predation, maintaining the L3 stage. Some larvae migrate from the abdominal cavity into

muscle tissues. Humans are incidental hosts and can be infected after ingesting raw or undercooked

infected fish or cephalopods containing viable L3.

Nematodes of the family Anisakidae are the causative agents of human anisakidosis, a disease that is not

only a public health hazard affecting humans, but also represents an economic problem in fishery and

food safety (the term “anisakiasis”, designating the disease caused by members of the genus Anisakis,

is also sometimes used). Worldwide, marine and wild anadromous fishes are intermediate hosts of

Anisakidae, whereas marine mammals are the definitive hosts.

Visual inspection procedures for the detection of Anisakidae larvae in fish are employed to minimize

[1],[2]

the risk that contaminated fish will reach the consumer, thus preventing human anisakidosis.

The UV-press and the artificial digestion of the fish muscular tissue are the methods specifically

designed to detect nematode larvae in fish and to evaluate the infestation level of a batch, and have

[3]
been validated and tested in multicentre collaborative studies (see Clause 11).
© ISO 2020 – All rights reserved v
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FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
Microbiology of the food chain — Methods for the
detection of Anisakidae L3 larvae in fish and fishery
products —
Part 2:
Artificial digestion method
1 Scope

This document specifies a method for the detection of Anisakidae L3 larvae commonly found in marine

and anadromous fishes. The method is applicable to fresh fish and/or frozen fish, as well as lightly

processed fish products, such as marinated, salted or smoked. It is also suitable for visceral organs as a

confirmatory method for a visual inspection scheme.
[4]—[6]

The artificial digestion method is applicable to quantifying parasitic infections by estimating the

number of parasites in the fish musculature and, when applied to fresh fish or lightly processed fish

products (never frozen before processing), determining the viability of Anisakidae L3, which can be

present.

This method does not apply to determining the species or genotype of detected parasites. Final

identification is made by morphological and/or molecular methods.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
Anisakidae L3 larvae

third-stage larvae (L3) belonging to the Anisakidae family, in particular to Anisakis, Contracaecum and

Pseudoterranova genera

Note 1 to entry: For practical purposes, the genus Hysterothylacium belonging to Raphidascarididae family and

already classified as Anisakidae, can be also included.
© ISO 2020 – All rights reserved 1
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ISO/FDIS 23036-2:2020(E)
3.2
artificial digestion method

method to detect Anisakidae larvae in fish muscle tissue by an enzymatic (pepsin-HCl) digestion step

to release larvae from muscle tissues followed by a filtration step and detection of larvae by microscopy

Note 1 to entry: If applied to fresh fish, it allows checking of the viability of larvae.

4 Principle
4.1 General

The artificial digestion method relies on the enzymatic degradation of muscle fibres in a fluid composed

of pepsin and hydrochloric acid followed by filtration and washing steps.
The procedure allows
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 23036-2
ISO/TC 34/SC 9
Microbiologie de la chaîne
Secrétariat: AFNOR
alimentaire — Méthodes de recherche
Début de vote:
2020-12-29 des larves L3 d'Anisakidae dans les
poissons et produits de la pêche —
Vote clos le:
2021-02-23
Partie 2:
Méthode de digestion artificielle
Microbiology of the food chain — Methods for the detection of
Anisakidae L3 larvae in fish and fishery products —
Part 2: Artificial digestion method
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
TION NATIONALE. ISO 2020
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ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2020

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Taille de l’échantillon ......................................................................................................................................................................... 2

4.3 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 2

4.4 Digestion de l’échantillon .............................................................................................................................................................. 2

4.5 Filtration du liquide de digestion ........................................................................................................................................... 2

4.6 Vérification des constatations .................................................................................................................................................... 2

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 3

6 Équipement et consommables ............................................................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 4

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 4

8.2 Préparation du liquide de digestion ..................................................................................................................................... 4

8.3 Digestion de l’échantillon dans le bécher en verre .................................................................................................. 5

8.4 Filtration du liquide de digestion ........................................................................................................................................... 5

8.5 Examen microscopique ................................................................................................................................................................... 5

9 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 6

10 Caractéristiques de performance de la méthode ............................................................................................................... 6

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 6

12 Assurance qualité ................................................................................................................................................................................................ 6

Annexe A (informative) Prélèvement d’échantillons ........................................................................................................................... 7

Annexe B (informative) Exemple de fiche de laboratoire pour la consignation des données

lors de l’examen des filets de poisson à l’aide de la méthode de digestion artificielle ...............8

Bibliographie .............................................................................................................................................................................................................................. 9

© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
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ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le Comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie, en collaboration avec le Comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits

alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à

l’Accord sur la coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).

Une liste de toutes les parties de la série ISO 23036 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
Introduction

Les nématodes de la famille des Anisakidae présentent un cycle de vie complexe impliquant un nombre

élevé d’hôtes. Au stade adulte, les Anisakidae pénètrent dans la muqueuse de l’estomac des mammifères

marins. Les œufs non embryonnés produits par les femelles adultes sont excrétés avec les fèces des

mammifères marins et sont embryonnés dans le milieu marin, où les larves de premier stade (L1)

se développent dans les œufs. Les larves muent pour se transformer en larves libres de deuxième

stade (L2), puis, si elles sont ingérées par des crustacés, en larves de troisième stade (L3). Ce stade est

infectieux pour les poissons et les calamars et les larves sont transférées d’un poisson à un autre par

le biais de la prédation, en restant au stade L3. Certaines larves migrent de la cavité abdominale vers

les tissus musculaires. Les humains sont des hôtes accidentels, susceptibles d’être infectés après avoir

ingéré du poisson ou des céphalopodes crus ou insuffisamment cuits contenant des larves L3 viables.

Les nématodes de la famille des Anisakidae sont les agents pathogènes de l’anisakidose humaine, une

maladie qui constitue non seulement une menace pour la santé publique, mais aussi un problème d’ordre

économique pour le secteur de la pêche et de sécurité des aliments (le terme anisakiase, qui désigne la

maladie provoquée par les membres du genre Anisakis, est également parfois utilisé). Dans le monde

entier, les poissons marins et anadromes sauvages constituent des hôtes intermédiaires d’Anisakidae,

tandis que les mammifères marins en sont les hôtes définitifs.

Des procédures d’inspection visuelle visant à détecter les larves d’Anisakidae dans les poissons sont

[1],[2]

mises en œuvre afin de limiter le risque que des poissons contaminés atteignent le consommateur

et ainsi d’empêcher l’apparition de l’anisakidose humaine.

Le passage sous presse hydraulique suivi de l’observation sous lumière UV, ainsi que la digestion

artificielle des tissus musculaires de poissons sont les méthodes qui ont été spécialement conçues pour

détecter les larves de nématodes dans les poissons et évaluer le niveau d’infestation d’un lot, et qui ont

[3]

été validées et soumises à essai dans des études comparatives interlaboratoires (voir Article 11).

© ISO 2020 – Tous droits réservés v
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PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthodes de
recherche des larves L3 d'Anisakidae dans les poissons et
produits de la pêche —
Partie 2:
Méthode de digestion artificielle
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de détection des larves L3 d’Anisakidae qui se trouvent

fréquemment dans les poissons marins et anadromes. La méthode s’applique aux poissons frais et/ou

surgelés, ainsi qu’aux produits à base de poisson légèrement transformés, c’est-à-dire marinés, salés ou

fumés. Cette méthode peut également servir de méthode de confirmation dans le cadre d’une inspection

visuelle des organes viscéraux.
[4],[6]

La méthode de digestion artificielle s’applique à la quantification des infestations parasitaires en

estimant le nombre de parasites dans les tissus musculaires des poissons et, en cas d’utilisation sur

des poissons frais ou des produits à base de poisson légèrement transformés (jamais congelés avant

traitement), à la détermination de la viabilité des larves L3 d’Anisakidae, susceptibles d’être présentes.

Cette méthode ne s’applique pas à la détermination des espèces ou du génotype des parasites détectés.

Des méthodes morphologiques et/ou moléculaires permettent une identification définitive.

2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
3.1
larves L3 d’Anisakidae

larves de troisième stade (L3) appartenant à la famille des Anisakidae, et plus particulièrement aux

genres Anisakis, Contracaecum et Pseudoterranova

Note 1 à l'article: Pour des raisons pratiques, le genre Hysterothylacium qui appartient à la famille

des Raphidascarididae et est déjà classé parmi les Anisakidae, peut aussi être inclus.

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ISO/FDIS 23036-2:2020(F)
3.2
méthode de digestion artificielle

méthode de détection des larves d’Anisakidae dans les tissus musculaires des poissons par digestion

enzymatique (pepsine-HCl) permettant de libérer les larves des tissus, suivie d’une filtration et d’une

détection des larves par microscopie

Note 1 à l'article: Si appliquée à du poisson frais, elle permet de vérifier la viabilité des larves.

4 Principe
4.1 Généralités

La méthode de digestion artificielle repose sur la dégradation enzymatique des fibres musculaires dans

un liquide composé de pepsine et d’acide chlorhydrique, suivie par des étapes de filtration et de lavage.

Le mode opératoire permet de différencier les larves d’Anisakidae mortes et viables sous réserve

que la température de la solution de digestion ne dépasse pas 37 °C (à l’exception des larves de

Hysterothylacium sp., qui meurent à 37 °C) et que le poisson n’ait jamais été congelé.

Aucun contrôle qualité interne ne peut être effectué pendant la mise en œuvre de cette méthode.

NOTE D’autres méthodes peuvent être utilisées pour l’analyse, sous réserve que leur équivalence avec les

méth
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.