ISO 13496:2000

Meat and meat products — Detection of colouring agents — Method using thin-layer chromatography

This International Standard specifies a thin-layer chromatographic method for the detection of synthetic, watersoluble colouring agents in meat and meat products. The following colouring agents can be detected with the method: Tartrazine Patent Blue V Quinoline Yellow Indigotine Sunset Yellow FCF Brilliant Black PN Amaranth Black 7984 Ponceau 4R Fast Green FCF Erythrosine Blue VRS Synonyms and identity numbers of these colouring agents are listed in annex A. The plant colours and plant extracts which have been observed not to interfere with this method are listed in Table B.1. Natural colours which in some cases have been shown to interfere with this method are listed in Table B.2.

Viande et produits à base de viande — Détection des agents colorants — Méthode par chromatographie en couche mince

La présente Norme internationale spécifie une méthode par chromatographie en couche mince de détection des agents colorants synthétiques solubles dans l'eau dans les viandes et produits à base de viande. Les agents colorants suivants peuvent être détectés avec cette méthode: tartrazine bleu Patente V jaune de quinoléine bleu indigo jaune-orange FCF noir brillant PN amarante noir 7984 ponceau 4R vert malachite FCF érythrosine bleu VRS La liste des synonymes et numéros d'identification de ces agents colorants se trouve dans l'annexe A. La liste des colorants végétaux et des extraits de plante dont on a constaté qu'ils ne créaient pas de perturbations se trouve dans le Tableau B.1. La liste des colorants naturels qui ont parfois créé des perturbations se trouve dans le Tableau B.2.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 01-Mar-2000
• Withdrawal Date: 01-Mar-2000
• ICS: 67.120.10 - Meat and meat products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 6 - Meat, poultry, fish, eggs and their products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 6 - Meat, poultry, fish, eggs and their products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 12-Aug-2021

Relations

• Revised: ISO 13496:2021 - Meat and meat products — Detection and determination of colouring agents
• Effective Date: 23-Apr-2020

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 13496
First edition
2000-03-01
Meat and meat products — Detection of
colouring agents — Method using thin-layer
chromatography
Viande et produits à base de viande — Détection des agents colorants —
Méthode par chromatographie en couche mince
Reference number
ISO 13496:2000(E)
©
ISO 2000

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13496:2000(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but shall not
be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In downloading this
file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat accepts no liability in this
area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation parameters
were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In the unlikely event
that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
© ISO 2000
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means, electronic
or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or ISO's member body
in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 734 10 79
E-mail [e-mail]
Web www.iso.ch
Printed in Switzerland
ii © ISO 2000 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13496:2000(E)
Contents Page
Foreword.iv
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Term and definition .1
4 Principle.2
5 Reagents.2
6 Apparatus .3
7 Sampling.4
8 Preparation of test sample.4
9 Procedure .4
10 Test report .6
Annex A (informative) Synonyms and identity numbers of synthetic, water-soluble colouring agents .7
Annex B (normative) Possible interference by colours .8
Annex C (informative) Absorbance spectra .9
Bibliography.11
© ISO 2000 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13496:2000(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (ISO
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 3.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
International Standard ISO 13496 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Agricultural food products,
Subcommittee SC 6, Meat and meat products.
Annex B forms a normative part of this International Standard. Annexes A and C are for information only.
iv © ISO 2000 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 13496:2000(E)
Meat and meat products — Detection of colouring
agents — Method using thin-layer chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a thin-layer chromatographic method for the detection of synthetic, water-
soluble colouring agents in meat and meat products.
The following colouring agents can be detected with the method:
Tartrazine Patent Blue V
Quinoline Yellow Indigotine
Sunset Yellow FCF Brilliant Black PN
Amaranth Black 7984
Ponceau 4R Fast Green FCF
Erythrosine Blue VRS
Synonyms and identity numbers of these colouring agents are listed in annex A.
The plant colours and plant extracts which have been observed not to interfere with this method are listed in
Table B.1. Natural colours which in some cases have been shown to interfere with this method are listed in
Table B.2.
2 Normative references
The following normative documents contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of
this International Standard. For dated references, subsequent amendments to, or revisions of, any of these
publications do not apply. However, parties to agreements based on this International Standard are encouraged to
investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative documents indicated below. For
undated references, the latest edition of the normative document referred to applies. Members of ISO and IEC
maintain registers of currently valid International Standards.
ISO 3696:1987, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods.
AOAC 46.1.08:1995, Official Methods of Analysis (AOAC International).
3 Term and definition
For the purposes of this International Standard, the following term and definition apply.
3.1
detection of colouring agents
detection of the presence or absence of colouring agents in accordance with the method specified in this
International Standard
© ISO 2000 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 13496:2000(E)
4Principle
The colouring agents are extracted from a test portion with hot water and adsorbed onto polyamide powder. The
extracted colouring agents are purified by column chromatography and the colours are eluted from the column. The
colouring agents are identified by thin-layer chromatography.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
5.1 Water, complying with at least grade 3 in accordance with ISO 3696.
5.2 Petroleum ether, boiling range 40 �Cto60 �C.
5.3 Methanol.
5.4 Ammonia, 25 % aqueous solution, � = 0,910 g/ml.
20
5.5 Acetic acid, 100 % mass fraction, � = 1,050 g/ml.
20
5.6 Trisodium citrate dihydrate.
5.7 Propan-1-ol.
5.8 Ethyl acetate.
5.9 2-Methyl-2-propanol.
5.10 Propionic acid.
5.11 Eluent solution for column chromatography.
Mix 95 volumes of methanol (5.3) with 5 volumes of ammonia solution (5.4).
5.12 Acetic acid, 50 % solution in methanol.
Mix 1 volume of acetic acid (5.5) with 1 volume of methanol (5.3).
5.13 Polyamide powder, of particle size 0,05 mm to 0,16 mm.
5.14 Sand, fine granular, hydrochloric acid-washed, neutralized and calcinated.
5.15 Standard reference colours.
The purities of the standard colours may vary so it is necessary to know the purity of the colours to be used as
standards. The purity shall be determined by the method AOAC 46.1.08.
NOTE Certified food colours may also be used as standards.
5.16 Standard reference solutions for thin-layer chromatography
Separately make solutions in water of each of the standard reference colours (5.15) with a standard colour content
of about 1 g/l.
Prepare solutions of indigotine on the day of use. Other solutions will keep for at least 3 months (solutions of
erythrosine for 1 month) when stored in the dark.
2 © ISO 2000 – All rights reserved

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 13496:2000(E)
5.17 Eluent for thin-layer chromatography: solution I
Weigh, to the nearest 0,1 g, 25 g of trisodium citrate dihydrate (5.6) into a 1 000 ml one-mark volumetric flask.
Dissolve in water, dilute to the mark with water and mix.
Mix 80 volumes of this citrate solution with 20 volumes of ammonia solution (5.4) and 12 volumes of methanol
(5.3).
To avoid or reduce interference from safflor or saffran, it is advisable to use chromatography solution II (5.18).
5.18 Eluent for thin-layer chromatography: solution II
Mix 6 volumes of propan-1-ol (5.7) with 1 volume of ethyl acetate (5.8) and 3 volumes of water.
5.19 Eluent for thin-layer chromatography: solution III
Mix 50 volumes of 2-methyl-2-propanol (5.9) with 12 volumes of propionic acid (5.10) and 38 volumes of water.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Mechanical or electrical homogenizing equipment, capable of homogenizing the laboratory sample.
Use a high-speed rotational cutter, or a mincer fitted with a plate with apertures not exceeding 4,0 mm in diameter.
6.2 Centrifuge tubes, of capacity 75 ml, made of glass.
6.3 Flat-bottomed flasks, of capacity 250 ml, with ground glass stoppers.
6.4 Round-bottomed flasks, of capacity 100 ml, with ground glass joint.
6.5 Centrifuge, operating at a radial acceleration of about 2 000 g .
n
6.6 Rotary evaporator.
6.7 Chromatographic column, of glass, with fritted filter and tap, of length about 20 cm, diameter about 30 mm,
filter pore size 40 �mto100�m (porosity grade P
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 13496
Première édition
2000-03-01
Viande et produits à base de viande —
Détection des agents colorants — Méthode
par chromatographie en couche mince
Meat and meat products — Detection of colouring agents — Method using
thin-layer chromatography
Numéro de référence
ISO 13496:2000(F)
©
ISO 2000

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 13496:2000(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier peut
être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence autorisant
l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées acceptent de fait la
responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute responsabilité en la
matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info du
fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir l'exploitation de
ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le
Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
© ISO 2000
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque
forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit de l’ISO à
l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 � CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax. + 41 22 734 10 79
E-mail [e-mail]
Web www.iso.ch
ImpriméenSuisse
ii © ISO 2000 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 13496:2000(F)
Sommaire Page
Avant-propos.iv
1 Domaine d’application .1
2 Références normatives .1
3 Terme et définition.1
4 Principe.2
5 Réactifs .2
6 Appareillage .3
7 Échantillonnage .4
8 Préparation de l'échantillon pour essai.4
9 Mode opératoire.4
10 Rapport d'essai .6
Annexe A (informative) Synonymes et numéros d'identification des agents colorants synthétiques,
solubles dans l'eau.7
Annexe B (normative) Perturbations possibles par les colorants.8
Annexe C (informative) Spectres d'absorbance.9
Bibliographie .11
© ISO 2000 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 13496:2000(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales, en
liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 3.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments de la présente Norme internationale peuvent faire
l’objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
La Norme internationale ISO 13496 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits agricoles
alimentaires, sous-comité SC 6, Viande et produits à base de viande.
L'annexe B constitue un élément normatif de la présente de Norme internationale. Les annexes A et C sont
données uniquement à titre d'information.
iv © ISO 2000 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 13496:2000(F)
Viande et produits à base de viande — Détection des
agents colorants — Méthode par chromatographie en
couche mince
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode par chromatographie en couche mince de détection des
agents colorants synthétiques solubles dans l'eau dans les viandes et produits à base de viande.
Les agents colorants suivants peuvent être détectés avec cette méthode:
tartrazine bleu Patente V
jaune de quinoléine bleu indigo
jaune-orange FCF noir brillant PN
amarante noir 7984
ponceau 4R vert malachite FCF
érythrosine bleu VRS
La liste des synonymes et numéros d'identification de ces agents colorants se trouve dans l'annexe A.
La liste des colorants végétaux et des extraits de plante dont on a constaté qu'ils ne créaient pas de perturbations
se trouve dans le Tableau B.1. La liste des colorants naturels qui ont parfois créé des perturbations se trouve dans
le Tableau B.2.
2 Références normatives
Les documents normatifs suivants contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui y est faite,
constituent des dispositions valables pour la présente Norme internationale. Pour les références datées, les
amendements ultérieurs ou les révisions de ces publications ne s’appliquent pas. Toutefois, les parties prenantes
aux accords fondés sur la présente Norme internationale sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les
éditions les plus récentes des documents normatifs indiqués ci-après. Pour les références non datées, la dernière
édition du document normatif en référence s’applique. Les membres de l'ISO et de la CEI possèdent le registre des
Normes internationales en vigueur.
ISO 3696:1987, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai.
AOAC 46.1.08:1995, Official Methods of Analysis (AOAC International).
3 Terme et définition
Pour les besoins de la présente Norme internationale, le terme et la définition suivants s'appliquent.
3.1
détection des agents colorants
détection de la présence ou de l'absence d'agents colorants conforme à la méthode spécifiée dans la présente
Norme internationale
© ISO 2000 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 13496:2000(F)
4Principe
Les agents colorants sont extraits d'une prise d'essai avec de l'eau chaude et adsorbés sur une poudre de
polyamide. Les agents colorants extraits sont purifiés par chromatographie sur colonne et les colorants sont élués
de la colonne. Les agents colorants sont identifiés par chromatographie en couche mince.
5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, d'au moins qualité 3 selon l’ISO 3696.
5.2 Éther de pétrole, intervalle d'ébullition 40 °C à 60 °C.
5.3 Méthanol.
5.4 Ammoniaque, solution aqueuse à 25 %, � =0,910g/ml.
20
5.5 Acide acétique, fraction massique 100 %, � =1,050g/ml.
20
5.6 Citrate trisodique dihydraté.
5.7 Propan-1-ol.
5.8 Acétate d'éthyle.
5.9 2-Méthyl-2-propanol.
5.10 Acide propionique.
5.11 Solution d'éluant pour chromatographie sur colonne.
Mélanger 95 volumes de méthanol (5.3) à 5 volumes d'ammoniaque (5.4).
5.12 Acide acétique, solution à 50 % dans du méthanol.
Mélanger 1 volume d'acide acétique (5.5) à 1 volume de méthanol (5.3).
5.13 Poudre de polyamide, taille des particules de 0,05 mm à 0,16 mm.
5.14 Sable, à grains fins, lavé à l'acide chlorhydrique, neutralisé et calciné.
5.15 Colorants étalons de référence.
La pureté des colorants étalons risque de varier; il est donc nécessaire de connaître la pureté des colorants à
utiliser comme étalons. La pureté doit être déterminée par la méthode AOAC 46.1.08.
NOTE Les colorants alimentaires certifiés peuvent aussi être utilisés comme étalons.
5.16 Solutions étalons de référence pour chromatographie en couche mince.
Constituer avec de l'eau des solutions séparées de chacun des colorants étalons de référence (5.15) à une
concentration de colorant étalon d'environ 1 g/l.
Préparer les solutions de bleu indigo le jour même de leur utilisation. D'autres solutions peuvent se conserver
pendant au moins 3 mois (les solutions d'érythrosine se conservent pendant 1 mois) lorsqu'elles sont stockées
dans le noir.
2 © ISO 2000 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 13496:2000(F)
5.17 Éluant pour chromatographie en couche mince: solution I.
Peser, à 0,1 g près, 25 g de citrate trisodique dihydraté (5.6) dans une fiole jaugée à un trait de 1 000 ml.
Dissoudre dans de l'eau, diluer avec de l'eau jusqu'au trait et mélanger.
Mélanger 80 volumes de cette solution de citrate à 20 volumes d'ammoniaque diluée (5.4) et à 12 volumes de
méthanol (5.3).
De manière à éviter ou à réduire les perturbations dues au saffleur ou au safran, il est recommandé d'utiliser la
solution chromatographique II (5.18).
5.18 Éluant pour chromatographie en couche mince: solution II.
Mélanger 6 volumes de propan-1-ol (5.7) à 1 volume d'acétate d’éthyle (5.8) et à 3 volumes d'eau.
5.19 Éluant pour chromatographie en couche mince: solution III.
Mélanger 50 volumes de 2-méthyl-2-propanol (5.9) à 12 volumes d'acide propionique (5.10) et à 38 volumes d'eau.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, notamment, les éléments suivants.
6.1 Équipement mécanique ou électrique capable d'homogénéiser l'échantillon pour laboratoire.
Ceci inclut une machine de découpe rotative à vitesse élevée et un hacheur équipé d'une plaque dont les
ouvertures ont un diamètre inférieur ou égal à 4,0 mm.
6.2 Tubes de centrifugeuse, en verre, d'une contenance de 75 ml.
6.3 Fioles à fond plat, d'une contenance de 250 ml, à bouchon en verre rodé.
6.4 Fioles à fond rond, d'une contenance de 100 ml, avec rodage.
6.5 Centrifugeuse, fonctionnant avec une accélération radiale d'environ 2 000 g .
n
6.6 Évaporateur rotatif.
6.7 Colonne de chromatographie, en verre, équipée d'un filtre fritté et d'un robinet, longueur environ 20 cm,
diamètre environ 30 mm, taille des pores du filtre de 40 μm à 100 μm (échelle de porosité P 100 selon
l’ISO 4793 [2]).
Mettre de la laine de verre dans la colonne et ajouter 1 g à 2 g de sable (5.14).
6.8 Récipient en plastique, d'un volume d'environ 10 ml, avec couvercle.
6.9 Plaques de chromatographie en
...