ISO 14240-2:1997
(Main)Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method
Soil quality — Determination of soil microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method
Gives a method for the determination of microbial biomass of soils by measurement of total extractable organic biomass material mainly from freshly killed microorganisms. It is also applicable to the estimation of microbial nitrogen and ninhydrin-reactive nitrogen in soil.
Qualité du sol — Détermination de la biomasse microbienne du sol — Partie 2: Méthode par fumigation-extraction
La présente partie de l'ISO 14240 prescrit une méthode pour l'estimation de la biomasse microbienne des sols par mesurage de la matière extractible totale de biomasse organique, essentiellement à partir de microorganismes venant d'être tués. La méthode est également applicable à l'estimation de l'azote microbien et de l'azote microbien réagissant à la ninhydrine dans les sols; toutefois, seul le mesurage du carbone organique extractible est décrit dans le cadre de la présente partie de l'ISO 14240. La méthode par fumigation-extraction (FE) est applicable aux sols aérobies et anaérobies (saturés, irrigués) dans toute la gamme des pH du sol. La biomasse peut également être mesurée dans des sols contenant des substrats en décomposition active et dans des sols sursaturés de solution de sulfate de potassium. NOTE -- La fumigation au chloroforme affecte également la faune du sol. La contribution du carbone de ces organismes est généralement faible (
Kakovost tal – Določanje talne mikrobne biomase – 2. del: Ekstrakcijska metoda z zaplinjanjem
General Information
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
IS0
STANDARD
14240-2
First edition
1997-01-I 5
Soil quality - Determination of soil
microbial biomass -
Part 2:
Fumigation-extraction method
Qualit6 du sol - Dktermination de la biomasse microbienne du sol -
Partie 2: Mkthode d/extraction par fumigation
Reference number
IS0 14240-2: 1997(E)
---------------------- Page: 1 ----------------------
0 IS0
IS0 14240=2:1997(E)
Foreword
IS0 (the llnternational Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard IS0 14240-2 was prepared by Technical Committee ISOmC 190, Soil quality, Subcommittee
SC 4, Biological methods.
Determination of soil microbial”
IS0 14240 consists of the following parts, under the general title Soil quality -
biomass:
- Part 1: Substrate-induced respiration method
Part 2: Fumigation-extraction method
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Internet central @ iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Printed in Switzerland
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
0 IS0 IS0 14240=2:1997(E)
Introduction
Soil consists of both living and nonliving components which exist in a complex and heterogeneous environment. Soil
microflora is responsible for the degradation of organic matter, stability of aggregates and most nutrient cycling
which occurs in soils. The purpose of determining the microbial biomass of soils is to allow assessment of the
continued maintenance of soil fertility, the potential ability to degrade added organic materials, and the effects of
added materials on the natural microbial population.
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This page intentionally left blank
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INTERNATIONAL STANDARD o IS0 IS0 14240-2: 1997(E)
Determination of soil microbial biomass -
Soil quality -
Part 2:
Fumigation-extraction method
1 Scope
This part of IS0 14240 specifies a method for the estimation of microbial biomass of soils by measurement of total
extractable organic biomass material mainly from freshly killed microorganisms. The method is also applicable to
the estimation of microbial nitrogen and microbial ninhydrin-reactive nitrogen in soil, but this part of IS0 14240
describes only the measurement of extractable organic carbon. The fumigation-extraction (FE) method is applicable
to aerobic and anaerobic (water-logged, paddy) soils over the whole range of soil pH. Biomass can be also
measured in soils containing actively decomposing substrates and soils supersaturated with potassium sulfate
solution.
NOTE - Chloroform fumigation also affects soil fauna. The contribution of carbon from these organisms is generally small
(< 5 %) and can usually be neglected.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
IS0 14240. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of IS0 14240 are encouraged to investigate the possibility of applying fhe
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
IS0 10381-6:1993, Soil quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratorym
IS0 10694:1995, Soil quality - Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis).
IS0 11465:1993, Soil quality - Determination of dry matter and water content on a mass basis - Gravimetric
method.
3 Definition
For the purposes of this part of IS0 14240, the following definition applies.
3.1 soil microbial biomass
mass of intact microbial cells in a given soil
NOTE - This parameter can be estimated from the measurement of the carbon or nitrogen content of these cells or by the
measurement of their ability to mineralize an added carbon source. Dead cells and cell fragments may be detected when
carbon or nitrogen analysis is used but only intact cells will be detected when respiration is measured.
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0 IS0
IS0 14240-2: 1997(E)
4 Principle
Through fumigation of the soil sample, intact microbial cells are lysed and the microbial organic matter released.
Soil samples are fumigated with
Nonliving soil organic matter is not seriously affected by such fumigation.
chloroform for 24 h. The organic carbon extracted using 05 mol/l potassium sulfate is determined in fumigated and
unfumigated samples, and the difference in extracted organic carbon is used to determine microbial biomass
carbon. The method is usually termed fumigation-extraction (FE).
5 Materials and reagents
5.6 Soils
Guidance for the collection, handling and storage of soil (IS0 10381-6) shall be followed, as far as applicable. Sieve
the soil samples at approximately 40 % water-holding capacity (WHC) if homogeneous samples are required.
Determine the soil WHC in accordance with annex A.
The water content of samples shall be higher than 30 % WHC to ensure uniform chloroform distribution and
effective fumigation. Take care to avoid smearing and compaction of wet soil in this method. Samples of
waterlogged soils do not have to be dried prior to analysis.
5.2 Reagents
Reagents of recognized analytical grade shall be used, including:
5.2.1 Silicone grease (medium viscosity).
5.2.2 Ethanol-free chloroform.
of light, ethanol-free chloroform degrades rapidly to form phosgene is
WARNING - In the presence
odourless and highly toxic.
5.2.3 Potassium sulfate solution, c(K,SO,) = 05 mol/l (p = 87,135 g/l)=
5.2.4 Soda lime.
6 Apparatus
6.1 Room, or incubator, capable of being maintained at (25 * 2) “C.
6.2 Implosion-protected desiccator.
6.3 Filter paper ’).
6.4 Glass beakers.
6.5 Petri dishes.
6.6 Polyethylene bottles, of capacity 250 ml.
1) Whatman No. 42, Schleicher & Schijll 595 l/2, Machery & Nagel 261 G l/4, are examples of suitable products available
commercially. This information is given for the convenience of users of this part of IS0 14240 and does not constitute an
endorsement by IS0 of these products.
2
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0 IS0
IS0 14240-2: 1997(E)
6.7 Vacuum line (water-pump or electric pump).
6.8 Horizontal or overhead shaker.
6.9 Freezer, operation at (-15 to -20) “C.
6.10 Antibumping granules.
7 Fumigation and extraction
7.1 Fumigation.
Line the desiccator (6.2) with moist filter paper (6.3) for fumigation of the soil samples.
Weigh at least three samples of moist soil (5.1), each containing a mass equivalent to 25 to 50 g of oven-dry soil,
into glass beakers (6.4) or Petri dishes (6.5) and place them in the desiccator with a beaker containing 25 ml of
ethanol-free chloroform (5.2.2) and a few antibumping granules (6.10), and a beaker with soda lime (5.2.4).
Evacuate the desiccator until the chloroform has boiled vigorously for approximately 2 min. Close the vacuum tap
on the desiccator and incubate in the dark (6.1) at (25 t 2) “C for 22 h to 24 h.
If there is insufficient soil available, use smaller samples provided the ratio of soil mass to volume of extractant is
kept the same (1:4). In soils containing more than 20 % organic material (as determined according to IS0 10694),
increase the ratio soil:extract above I:4 (to a maximum of I:30 for soils containing 95 % organic matter, e.g. L-layer)
in order to obtain sufficient extracted matter. Record the mass of soil used.
After fumigation is completed, remove the beaker containing the chloroform and the filter paper from the
desiccators. Remove the chloroform vapour from the soil by repeated evacuation (6 times for 2 min each) in the
desiccator. The samples are ready for extraction.
Place three unfumigated, moist control samples (50 g dry mass) into polyethylene bottles (6.6) and immediately
extract with 200 ml of the potassium sulfate (5.2.3), as indicated in 7.2.
7.2 Extraction
To extract organic carbon, transfer the soil quantitatively to polyethylene bottles (6.6), add 200 ml of potassium
sulfate (5.2.3), shake the bottles on a horizontal shaker (6.8) at 200 r/min for 30 min or an overhead shaker at
60 r/min for 45 min and filter the extracts through a folded filter paper (6.3). Extract the unfumigated controls and
filter the extracts in the same way.
If not analyzed at once, store the extracts of fumigated and unfumigated soil samples in the freezer (6.9) at between
-15 “C and -20 “C. Homogenize frozen extracts before use, after thawing at room temperature.
NOTES
1 A white precipitate occurs during storage of the potassium sulfate soil extracts (especially if the samples are frozen)
because they are usually supersaturated with calcium sulfate (CaSO,). It is unnecessary to dissolve this excess CaSO,
because it does not interfere with any of the analytical procedures described in this method.
2 Cell membranes of young, living roots are also affected by chloroform fumigation. In soils containing large amounts of living
roots, the pre-extraction procedure given in annex B should be used.
8 Determination of carbon in the extracts
The carbon content of microorganisms in a soil sample is determined analytically and can be used to make
comparisons between different soil samples. Where a figure for actual microbial biomass is required, then such
analyses are multiplied by a conversion factor derived from experiments correlating a known cell mass to carbon
analysis after fumigation-extraction. All conversion factors used are related to this initial factor.
3
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0 IS0
IS0 14240-2: 1997(E)
Determine the carbon content in the extracts using either dichromate oxidation (8.1) or instrumental analysis (8.2).
8.1 Microbial biomass carbon by dichromate oxidation
8.1 .I Principle
In the presence of strong acid, organic matter is oxidized and Cr(VI) reduced to Cr(lll). The amount of dichromate
left is back-titrated.
8.1.2 Additional reagents
8.1.2.1 Potassium &chromate, c(K,Cr,O,) = 0,0667 mol/l (19,6125 g dry potassium dichromate/litre water).
hazardous nature of potassium dichromate, great should be taken in its
WARNING - Because of the
use and eventual disposal.
8.1.2.2 Phosphoric acid, (H,PO,), p= I,71 g/ml.
8.1.2.3 Sulfuric acid, (H,SO,), p = I,84 g/ml.
8.1.2.4 Iron ammonium sulfate, titration solution, c[(NH,),Fe(SO,),*6H,O] = 0,040 mol/l.
Iron ammonium sulfate (15,69 g) is dissolved in distilled water, acidified with 20 ml of the sulfuric acid (8.1.2.3)
and made up to 1 000 ml with distilled water.
8.1.2.5 1 ,I 0-phenanthroline sulfate complex solution, 0,025 mol/l.
8.1.2.6 Acid mixture: two volumes sulfuric acid (8.1.2.3) mixed with one volume phosphoric acid (8.1.2.2).
8.1.3 Additional apparatus
8.1.3.1 Liebig condenser (water-cooled).
8.1.3.2 250 ml round-bottom flask.
8.1.3.3 Burette, volume 10 ml, graduated in 0,05 ml divisions.
8.1.3.4 Pipette, volume 2 ml.
8.1.4 Procedure
Add 2 ml of the potassium dichromate solution (8.1.2.1) (&) using the pipette (8.1.3.4) and 15 ml of the acid mixture
(8.1.2.6) to 8 ml of filtered extract (7.1) (pS) in a 250 ml round-bottom flask (8.1.3.2). Gently reflux (8.1.3.1) the
whole mixture for 30 min, allow to cool and dilute with 20 ml to 25 ml water, added through the condenser to rinse it.
Digest duplicate blanks containing 8 ml of the potassium sulfate solution (5.2.3) in the same way.
NOTE - These digested blanks are
...
SLOVENSKI STANDARD
SIST ISO 14240-2:2006
01-september-2006
.DNRYRVWWDO±'RORþDQMHWDOQHPLNUREQHELRPDVH±GHO (NVWUDNFLMVNDPHWRGD]
]DSOLQMDQMHP
Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 2: Fumigation-extraction
method
Qualité du sol -- Détermination de la biomasse microbienne du sol -- Partie 2: Méthode
par fumigation-extraction
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 14240-2:1997
ICS:
13.080.30 Biološke lastnosti tal Biological properties of soils
SIST ISO 14240-2:2006 en
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
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SIST ISO 14240-2:2006
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SIST ISO 14240-2:2006
INTERNATIONAL
IS0
STANDARD
14240-2
First edition
1997-01-I 5
Soil quality - Determination of soil
microbial biomass -
Part 2:
Fumigation-extraction method
Qualit6 du sol - Dktermination de la biomasse microbienne du sol -
Partie 2: Mkthode d/extraction par fumigation
Reference number
IS0 14240-2: 1997(E)
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SIST ISO 14240-2:2006
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IS0 14240=2:1997(E)
Foreword
IS0 (the llnternational Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies (IS0
member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through IS0 technical
committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and non-governmental, in
liaison with ISO, also take part in the work. IS0 collaborates closely with the International Electrotechnical
Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
International Standard IS0 14240-2 was prepared by Technical Committee ISOmC 190, Soil quality, Subcommittee
SC 4, Biological methods.
Determination of soil microbial”
IS0 14240 consists of the following parts, under the general title Soil quality -
biomass:
- Part 1: Substrate-induced respiration method
Part 2: Fumigation-extraction method
0 IS0 1997
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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0 IS0 IS0 14240=2:1997(E)
Introduction
Soil consists of both living and nonliving components which exist in a complex and heterogeneous environment. Soil
microflora is responsible for the degradation of organic matter, stability of aggregates and most nutrient cycling
which occurs in soils. The purpose of determining the microbial biomass of soils is to allow assessment of the
continued maintenance of soil fertility, the potential ability to degrade added organic materials, and the effects of
added materials on the natural microbial population.
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SIST ISO 14240-2:2006
INTERNATIONAL STANDARD o IS0 IS0 14240-2: 1997(E)
Determination of soil microbial biomass -
Soil quality -
Part 2:
Fumigation-extraction method
1 Scope
This part of IS0 14240 specifies a method for the estimation of microbial biomass of soils by measurement of total
extractable organic biomass material mainly from freshly killed microorganisms. The method is also applicable to
the estimation of microbial nitrogen and microbial ninhydrin-reactive nitrogen in soil, but this part of IS0 14240
describes only the measurement of extractable organic carbon. The fumigation-extraction (FE) method is applicable
to aerobic and anaerobic (water-logged, paddy) soils over the whole range of soil pH. Biomass can be also
measured in soils containing actively decomposing substrates and soils supersaturated with potassium sulfate
solution.
NOTE - Chloroform fumigation also affects soil fauna. The contribution of carbon from these organisms is generally small
(< 5 %) and can usually be neglected.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference in this text, constitute provisions of this part of
IS0 14240. At the time of publication, the editions indicated were valid. All standards are subject to revision, and
parties to agreements based on this part of IS0 14240 are encouraged to investigate the possibility of applying fhe
most recent editions of the standards indicated below. Members of IEC and IS0 maintain registers of currently valid
International Standards.
IS0 10381-6:1993, Soil quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratorym
IS0 10694:1995, Soil quality - Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary
analysis).
IS0 11465:1993, Soil quality - Determination of dry matter and water content on a mass basis - Gravimetric
method.
3 Definition
For the purposes of this part of IS0 14240, the following definition applies.
3.1 soil microbial biomass
mass of intact microbial cells in a given soil
NOTE - This parameter can be estimated from the measurement of the carbon or nitrogen content of these cells or by the
measurement of their ability to mineralize an added carbon source. Dead cells and cell fragments may be detected when
carbon or nitrogen analysis is used but only intact cells will be detected when respiration is measured.
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4 Principle
Through fumigation of the soil sample, intact microbial cells are lysed and the microbial organic matter released.
Soil samples are fumigated with
Nonliving soil organic matter is not seriously affected by such fumigation.
chloroform for 24 h. The organic carbon extracted using 05 mol/l potassium sulfate is determined in fumigated and
unfumigated samples, and the difference in extracted organic carbon is used to determine microbial biomass
carbon. The method is usually termed fumigation-extraction (FE).
5 Materials and reagents
5.6 Soils
Guidance for the collection, handling and storage of soil (IS0 10381-6) shall be followed, as far as applicable. Sieve
the soil samples at approximately 40 % water-holding capacity (WHC) if homogeneous samples are required.
Determine the soil WHC in accordance with annex A.
The water content of samples shall be higher than 30 % WHC to ensure uniform chloroform distribution and
effective fumigation. Take care to avoid smearing and compaction of wet soil in this method. Samples of
waterlogged soils do not have to be dried prior to analysis.
5.2 Reagents
Reagents of recognized analytical grade shall be used, including:
5.2.1 Silicone grease (medium viscosity).
5.2.2 Ethanol-free chloroform.
of light, ethanol-free chloroform degrades rapidly to form phosgene is
WARNING - In the presence
odourless and highly toxic.
5.2.3 Potassium sulfate solution, c(K,SO,) = 05 mol/l (p = 87,135 g/l)=
5.2.4 Soda lime.
6 Apparatus
6.1 Room, or incubator, capable of being maintained at (25 * 2) “C.
6.2 Implosion-protected desiccator.
6.3 Filter paper ’).
6.4 Glass beakers.
6.5 Petri dishes.
6.6 Polyethylene bottles, of capacity 250 ml.
1) Whatman No. 42, Schleicher & Schijll 595 l/2, Machery & Nagel 261 G l/4, are examples of suitable products available
commercially. This information is given for the convenience of users of this part of IS0 14240 and does not constitute an
endorsement by IS0 of these products.
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SIST ISO 14240-2:2006
0 IS0
IS0 14240-2: 1997(E)
6.7 Vacuum line (water-pump or electric pump).
6.8 Horizontal or overhead shaker.
6.9 Freezer, operation at (-15 to -20) “C.
6.10 Antibumping granules.
7 Fumigation and extraction
7.1 Fumigation.
Line the desiccator (6.2) with moist filter paper (6.3) for fumigation of the soil samples.
Weigh at least three samples of moist soil (5.1), each containing a mass equivalent to 25 to 50 g of oven-dry soil,
into glass beakers (6.4) or Petri dishes (6.5) and place them in the desiccator with a beaker containing 25 ml of
ethanol-free chloroform (5.2.2) and a few antibumping granules (6.10), and a beaker with soda lime (5.2.4).
Evacuate the desiccator until the chloroform has boiled vigorously for approximately 2 min. Close the vacuum tap
on the desiccator and incubate in the dark (6.1) at (25 t 2) “C for 22 h to 24 h.
If there is insufficient soil available, use smaller samples provided the ratio of soil mass to volume of extractant is
kept the same (1:4). In soils containing more than 20 % organic material (as determined according to IS0 10694),
increase the ratio soil:extract above I:4 (to a maximum of I:30 for soils containing 95 % organic matter, e.g. L-layer)
in order to obtain sufficient extracted matter. Record the mass of soil used.
After fumigation is completed, remove the beaker containing the chloroform and the filter paper from the
desiccators. Remove the chloroform vapour from the soil by repeated evacuation (6 times for 2 min each) in the
desiccator. The samples are ready for extraction.
Place three unfumigated, moist control samples (50 g dry mass) into polyethylene bottles (6.6) and immediately
extract with 200 ml of the potassium sulfate (5.2.3), as indicated in 7.2.
7.2 Extraction
To extract organic carbon, transfer the soil quantitatively to polyethylene bottles (6.6), add 200 ml of potassium
sulfate (5.2.3), shake the bottles on a horizontal shaker (6.8) at 200 r/min for 30 min or an overhead shaker at
60 r/min for 45 min and filter the extracts through a folded filter paper (6.3). Extract the unfumigated controls and
filter the extracts in the same way.
If not analyzed at once, store the extracts of fumigated and unfumigated soil samples in the freezer (6.9) at between
-15 “C and -20 “C. Homogenize frozen extracts before use, after thawing at room temperature.
NOTES
1 A white precipitate occurs during storage of the potassium sulfate soil extracts (especially if the samples are frozen)
because they are usually supersaturated with calcium sulfate (CaSO,). It is unnecessary to dissolve this excess CaSO,
because it does not interfere with any of the analytical procedures described in this method.
2 Cell membranes of young, living roots are also affected by chloroform fumigation. In soils containing large amounts of living
roots, the pre-extraction procedure given in annex B should be used.
8 Determination of carbon in the extracts
The carbon content of microorganisms in a soil sample is determined analytically and can be used to make
comparisons between different soil samples. Where a figure for actual microbial biomass is required, then such
analyses are multiplied by a conversion factor derived from experiments correlating a known cell mass to carbon
analysis after fumigation-extraction. All conversion factors used are related to this initial factor.
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SIST ISO 14240-2:2006
0 IS0
IS0 14240-2: 1997(E)
Determine the carbon content in the extracts using either dichromate oxidation (8.1) or instrumental analysis (8.2).
8.1 Microbial biomass carbon by dichromate oxidation
8.1 .I Principle
In the presence of strong acid, organic matter is oxidized and Cr(VI) reduced to Cr(lll). The amount of dichromate
left is back-titrated.
8.1.2 Additional reagents
8.1.2.1 Potassium &chromate, c(K,Cr,O,) = 0,0667 mol/l (19,6125 g dry potassium dichromate/litre water).
hazardous nature of potassium dichromate, great should be taken in its
WARNING - Because of the
use and eventual disposal.
8.1.2.2 Phosphoric acid, (H,PO,), p= I,71 g/ml.
8.1.2.3 Sulfuric acid, (H,SO,), p = I,84 g/ml.
8.1.2.4 Iron ammonium sulfate, titration solution, c[(NH,),Fe(SO,),*6H,O] = 0,040 mol/l.
Iron ammonium sulfate (15,69 g) is dissolved in distilled water, acidified with 20 ml of the sulfuric acid (8.1.2.3)
and made up to 1 000 ml with distilled water.
8.1.2.5 1 ,I 0-phenanthroline sulfate complex solution, 0,025 mol/l.
8.1.2.6 Acid mixture: two volumes sulfuric acid (8.1.2.3) mixed with one volume phosphoric acid (8.1.2.2).
8.1.3 Additional apparatus
8.1.3.1 Liebig condenser (water-cooled).
8.1.3.2 250
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14240-2
Première édition
1997-01-I 5
Qualité du sol - Détermination de la
biomasse microbienne du sol
Partie 2:
Méthode par fumigation-extraction
Soi1 guality - Determination of soi/ microbial biomass -
Par? 2: Fumigation-extraction method
Numéro de référence
ISO 14240-2: 1997(F)
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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales’ en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14240-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-
comité SC 4, Méthodes biologiques.
L’ISO 14240 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol- Détermination de la
biomasse microbienne du sol:
- Partie 1: Méthode par respiration induite par le substrat
Partie 2: Méthode par fumigation-extraction
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 14240. Les annexes 9, C et D sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
Internet central @? iso.ch
x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
@ ISO
ISO 14240-2: 1997(F)
Introduction
Le sol se compose d’éléments vivants et non vivants qui existent dans un milieu complexe et hétérogène. La
microflore du sol est responsable de la dégradation de la matière organique, de la stabilité des agrégats et de la
plupart des cycles nutritifs qui se produisent dans les sols. La détermination de la biomasse microbienne des sols a
pour but de permettre d’évaluer le maintien permanent de la fertilité des sols, la capacité potentielle à dégrader les
matières organiques, et les effets des matériaux ajoutés sur la population microbienne naturelle.
. . .
Ill
---------------------- Page: 3 ----------------------
Page blanche
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 14240-2: 1997(F)
Qualité du sol - Détermination de la biomasse microbienne
du sol -
Partie 2:
Méthode par fumigation-extration
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 14240 prescrit une méthode pour l’estimation de la biomasse microbienne des sols par
mesurage de la matière extractible totale de biomasse organique, essentiellement à partir de microorganismes
venant d’être tués. La méthode est également applicable à l’estimation de l’azote microbien et de l’azote microbien
réagissant à la ninhydrine dans les sols; toutefois, seul le mesurage du carbone organique extractible est décrit
dans le cadre de la présente partie de I’ISO 14240. La méthode par fumigation-extraction (FE) est applicable aux
sols aérobies et anaérobies (saturés, irrigués) dans toute la gamme des pH du sol. La biomasse peut également
être mesurée dans des sols contenant des substrats en décomposition active et dans des sols sursaturés de
solution de sulfate de potassium.
NOTE - La fumigation au chloroforme affecte également la faune du sol. La contribution du carbone de ces organismes est
généralement faible (< 5 %) et peut en r&gle générale être négligée.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO 14240. Au moment de la publication, les éditions indiquées
btaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO 14240 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 10381-6: 1993, Qualité du sol - Échantillonnage - Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation de sols destinés à une étude en laboratoire des processus microbiens aérobies.
OS0 10694:1995, Qualité du sol - Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire).
Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau - Méthode
ISO 114651993, Qualifé du sol -
gravimétrique.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 14240, la définition suivante s’applique.
3.1 biomasse microbienne du sol
masse de cellules microbiennes intactes dans un sol donné
NOTE - Ce paramètre peut être estimé à partir du mesurage de la teneur en carbone ou en azote de ces cellules ou par le
mesurage de leur aptitude à minéraliser une source de carbone ajoutée. Les cellules mortes et les fragments ceMaires
peuvent être décelés en effectuant des analyses du carbone ou de l’azote, mais seules les cellules intactes seront détectées
lors du mesurage de la respiration.
1
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0 ISO
ISO 14240=2:1997(F)
4 Principe
Par fumigation, les cellules microbiennes intactes sont lysées et la matière organique microbienne libérée. La
matière organique non vivante du sol n’est pas sérieusement affectée par une telle fumigation. Les échantillons de
sol sont fumigés au chloroforme pendant 24 h. Le carbone organique extrait par le sulfate de potassium à 0,5 mol/1
est déterminé dans des échantillons fumigés et non fumigés, et l’augmentation du carbone organique extrait est
utilisée pour déterminer le carbone de la biomasse microbienne. Cette méthode est généralement désignée sous le
nom de fumigation-extraction (FE).
5 Réactifs et matériaux
5.1 Sols
Les lignes directrices relatives à la collecte, à la manipulation et à la conservation des sols (voir I’ISO 10381-6)
doivent être suivies, dans la mesure du possible. Tamiser les échantillons de sol à environ 40 % de la capacité de
rétention d’eau (CRE) si des échantillons homogènes sont requis.
Déterminer la capacité de rétention d’eau conformément à l’annexe A.
La teneur en eau des échantillons doit être supérieure à 30 % de la capacité de rétention d’eau du sol afin d’assurer
une répartition uniforme du chloroforme et une fumigation efficace. Veiller à éviter de salir et de compacter le sol
humide dans cette méthode. Les échantillons de sols saturés en eau ne doivent pas être séchés avant l’analyse.
5.2 Réactifs
Des réactifs de qualité analytique reconnue doivent être utilisés.
52.1 Graisse silicone, de viscosité moyenne.
5.2.2 Chloroforme exempt d’éthanol.
AVERTISSEMENT - À la lumière, le chloroforme exempt d’éthanol se dégrade rapidement pour former du
phosgène à l’état de gaz (COCI,) qui est inodore et très toxique.
5.2.3 Sulfate de potassium, solution, c(K2S04) = 0,5 mol/1 (p = 87,135 g/l).
5.2.4 Chaux sodée.
6 Appareillage
6.1 Local, ou incubateur, pouvant être maintenu à (25 + 2) OC.
6.2 Dessiccateur, protégé contre l’implosion.
6.3 Papier filtre’).
6.4 Béchers en verre.
6.5 Boîtes de Petri.
SI Whatman N” 42, Schleicher & Schüll 595 112, Machery & Nagel 261 G 1/4 sont des exemples de produits appropriés
disponibles sur le marche. Cette information est donnée a l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 14240 et ne
signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
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@ ISO
ISO l4240-2:1997( F)
6.6 Flacons en polyéthylène, de 250 ml de capacité.
6.7 Chaîne de vide (pompe à eau ou électrique).
6.8 Agitateur horizontal ou de type rotatif.
6.9 Congélateur, fonctionnant de - 15 OC à - 20 OC.
6.10 Granules régulateurs d’ébullition.
7 Fumigation et extraction
7.1 Fumigation
Garnir le dessiccateur (6.2) d’un papier filtre humide (6.3) pour la fumigation des échantillons de sol.
Peser au moins trois échantillons de sol humide (5.1), contenant chacun une masse équivalant à 25 g à 50 g de sol
sec en les transvasant dans des béchers en verre (6.4) ou dans des boîtes de Petri (6.5) et les placer dans un
dessiccateur avec un bécher contenant 25 ml de chloroforme exempt d’éthanol (5.2.2) et quelques granules
régulateurs d’ébullition (6.10) ainsi qu’un bécher contenant de la chaux sodée (5.2.4). Faire le vide dans le
dessiccateur jusqu’à forte ébullition du chloroforme pendant environ 2 min. Fermer le robinet du dessiccateur et
incuber à l’obscurité (voir 6.1) à (25 k 2) OC pendant 22 h à 24 h.
S’il n’y a pas suffisamment de sol, utiliser des échantillons plus faibles à condition que le rapport de la masse de sol
au volume d’extractant reste le même (1:4). Dans les sols contenant plus de 20 % de matière organique
(déterminée conformément à I’ISO 10694), augmenter le rapport sol:extrait au-dessus de 1:4 (jusqu’à un maximum
de 1:30 pour les sols contenant 95 % de matière organique, par exemple couche L) afin d’obtenir un extrait suffisant
de matière. Noter la masse de sol utilisée.
À l’issue de la fumigation, retirer le bécher contenant le chloroforme et le papier filtre du dessiccateur. Éliminer les
vapeurs de chloroforme du sol par mise sous vide répétée du dessiccateur (6 fois de 2 min chacune). Les
échantillons sont prêts pour l’extraction.
Ptacer trois échantillons témoins humides non fumigés (50 g de masse sèche) dans des flacons en polyéthylène
(6.6) et extraire immédiatement avec 200 ml de sulfate de potassium (5.2.3), comme indiqué en 7.2.
7.2 Extraction
Pour extraire le carbone organique, transférer quantitativement le sol dans des flacons en polyéthylène (6.6),
ajouter 200 ml de sulfate de potassium (5.2.3), agiter les flacons à l’aide d’un agitateur horizontal (6.8) à 200 tr/min
pendant 30 min ou à l’aide d’un agitateur rotatif à 60 tr/min pendant 45 min, puis filtrer les extraits sur un papier filtre
plié (6.3). Extraire les témoins non fumigés et les filtrer de la même manière.
Si l’analyse n’est pas immédiate, conserver les extraits d’échantillons de sol fumigés et non fumigés au congélateur
(6.9) entre - 15 OC et - 20 OC. Homogénéiser les extraits congelés avant utilisation, après décongélation à
température ambiante.
NOTES
1 Un précipité blanc se produit au cours de la conservation des extraits de sol de sulfate de potassium (en particulier dans le
cas d’échantillons congelés) car ils sont généralement sursaturés en sulfate de calcium (CaSO,). II n’est pas nécessaire de
dissoudre cet excès de CaSO, car il ne perturbe aucune des procédures analytiques décrites dans la présente méthode.
2 Les membranes cellulaires des jeunes racines vivantes sont également affectées par la fumigation au chloroforme. II
convient d’utiliser le mode opératoire de pré-extraction donné à l’annexe 6 dans les sols contenant de grandes quantités de
racines vivantes.
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@ ISO
ISO 14240-2: 1997(F)
8 Détermination du carbone dans les extraits
La teneur en carbone des microorganismes présents dans un échantillon de sol est déterminée analytiquement et
peut être utiliser pour effectuer des comparaisons entre différents échantillons de sol. Lorsqu’un chiffre de biomasse
microbienne réelle est requis, ces valeurs sont multipliées par un facteur de conversion déduit d’expériences
établissant une corrélation entre une masse cellulaire connue et l’analyse de carbone après fumigation-extraction.
Tous les facteurs de conversion utilisés sont liés à ce facteur initial.
Wterminer la teneur en carbone dans les extraits soit par oxydation au dichromate (8.1), soit par analyse
spectrométrique (8.2).
8.1 Carbone de la biomasse microbienne par oxydation du dichromate
8.1 .l Principe
En présence d’un acide fort, la matière organique est oxydée et Cr(VI) réduit en Cr(lll). La quantité de dichromate
restante est titrée en retour.
8.1.2 Réactifs supplémentaires
Dichromate de potassium, c(K&07) = 0,066 7 mol/1 (19,612 5 g de dichromate de potassium séché
8.1.2.1
par litre d’eau).
AVERTISSEMENT - En raison du danger du dichromate de potassium, il convient de prendre de grandes
précautions lors de son utilisation et de son rejet éventuel.
8.1.2.2 Acide phosphorique, H,PO,, p = 1,71 g/ml.
8.1.2.3 Acide sulfurique, H$O,+ p = 1,84 g/ml.
8.1.2.4 Sulfate d’ammonium et de fer(lI), solution de titrage, c[(NH,),Fe(SO,),,GH,0] = 0,040 mol/l.
Le sulfate d’ammonium et de fer(ll) (1569 g) est dissous dans de l’eau distillée acidifiée avec 20 ml d’acide
sulfurique (8.1.2.3) et le tout est complété à 1 000 ml avec de l’eau distillée.
8.1.2.5 Complexe de sulfate de fer(ll) et de phénanthroline-1 ,lO, solution à 0,025 mol/l.
8.1.2.6 Mélange d’acides: deux volumes d’acide sulfurique (8.1.2.3) sont mélangés à un volume d’acide
phosphorique (8.1.2.2).
8.1.3 Appareillage complémentaire
8.1.3.1 Réfrigérant de Liebig (eau refroidie).
8.1.3.2 Ballon à fond rond, de 250 ml de capacité.
8.1.3.3 Burette, de 10 ml de capacité, graduée tous les 0,05 ml.
8.1.3.4 Pipette, de 2 ml de capacité.
8.1.4 Mode opératoire
Ajouter 2 ml de solution de dichromate de potassium (8.1.2.1) à l’aide d’une pipette (8.1.3.4) (PD) et 15 ml du
mélange d’acides (8.1.2.6) à 8 ml d’extrait filtré (7.1) (PS) dans
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 14240-2
Première édition
1997-01-I 5
Qualité du sol - Détermination de la
biomasse microbienne du sol
Partie 2:
Méthode par fumigation-extraction
Soi1 guality - Determination of soi/ microbial biomass -
Par? 2: Fumigation-extraction method
Numéro de référence
ISO 14240-2: 1997(F)
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ISO 14240=2:1997(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales’ en
liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour
vote. Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
La Norme internationale ISO 14240-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-
comité SC 4, Méthodes biologiques.
L’ISO 14240 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol- Détermination de la
biomasse microbienne du sol:
- Partie 1: Méthode par respiration induite par le substrat
Partie 2: Méthode par fumigation-extraction
L’annexe A fait partie intégrante de la présente partie de I’ISO 14240. Les annexes 9, C et D sont données
uniquement à titre d’information.
0 ISO 1997
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-121 1 Genève 20 l Suisse
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x.400 c=ch; a=400net; p=iso; o=isocs; s=central
Imprimé en Suisse
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ISO 14240-2: 1997(F)
Introduction
Le sol se compose d’éléments vivants et non vivants qui existent dans un milieu complexe et hétérogène. La
microflore du sol est responsable de la dégradation de la matière organique, de la stabilité des agrégats et de la
plupart des cycles nutritifs qui se produisent dans les sols. La détermination de la biomasse microbienne des sols a
pour but de permettre d’évaluer le maintien permanent de la fertilité des sols, la capacité potentielle à dégrader les
matières organiques, et les effets des matériaux ajoutés sur la population microbienne naturelle.
. . .
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NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 14240-2: 1997(F)
Qualité du sol - Détermination de la biomasse microbienne
du sol -
Partie 2:
Méthode par fumigation-extration
1 Domaine d’application
La présente partie de I’ISO 14240 prescrit une méthode pour l’estimation de la biomasse microbienne des sols par
mesurage de la matière extractible totale de biomasse organique, essentiellement à partir de microorganismes
venant d’être tués. La méthode est également applicable à l’estimation de l’azote microbien et de l’azote microbien
réagissant à la ninhydrine dans les sols; toutefois, seul le mesurage du carbone organique extractible est décrit
dans le cadre de la présente partie de I’ISO 14240. La méthode par fumigation-extraction (FE) est applicable aux
sols aérobies et anaérobies (saturés, irrigués) dans toute la gamme des pH du sol. La biomasse peut également
être mesurée dans des sols contenant des substrats en décomposition active et dans des sols sursaturés de
solution de sulfate de potassium.
NOTE - La fumigation au chloroforme affecte également la faune du sol. La contribution du carbone de ces organismes est
généralement faible (< 5 %) et peut en r&gle générale être négligée.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de I’ISO 14240. Au moment de la publication, les éditions indiquées
btaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de I’ISO 14240 sont invitées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
ISO 10381-6: 1993, Qualité du sol - Échantillonnage - Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation de sols destinés à une étude en laboratoire des processus microbiens aérobies.
OS0 10694:1995, Qualité du sol - Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire).
Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau - Méthode
ISO 114651993, Qualifé du sol -
gravimétrique.
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 14240, la définition suivante s’applique.
3.1 biomasse microbienne du sol
masse de cellules microbiennes intactes dans un sol donné
NOTE - Ce paramètre peut être estimé à partir du mesurage de la teneur en carbone ou en azote de ces cellules ou par le
mesurage de leur aptitude à minéraliser une source de carbone ajoutée. Les cellules mortes et les fragments ceMaires
peuvent être décelés en effectuant des analyses du carbone ou de l’azote, mais seules les cellules intactes seront détectées
lors du mesurage de la respiration.
1
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ISO 14240=2:1997(F)
4 Principe
Par fumigation, les cellules microbiennes intactes sont lysées et la matière organique microbienne libérée. La
matière organique non vivante du sol n’est pas sérieusement affectée par une telle fumigation. Les échantillons de
sol sont fumigés au chloroforme pendant 24 h. Le carbone organique extrait par le sulfate de potassium à 0,5 mol/1
est déterminé dans des échantillons fumigés et non fumigés, et l’augmentation du carbone organique extrait est
utilisée pour déterminer le carbone de la biomasse microbienne. Cette méthode est généralement désignée sous le
nom de fumigation-extraction (FE).
5 Réactifs et matériaux
5.1 Sols
Les lignes directrices relatives à la collecte, à la manipulation et à la conservation des sols (voir I’ISO 10381-6)
doivent être suivies, dans la mesure du possible. Tamiser les échantillons de sol à environ 40 % de la capacité de
rétention d’eau (CRE) si des échantillons homogènes sont requis.
Déterminer la capacité de rétention d’eau conformément à l’annexe A.
La teneur en eau des échantillons doit être supérieure à 30 % de la capacité de rétention d’eau du sol afin d’assurer
une répartition uniforme du chloroforme et une fumigation efficace. Veiller à éviter de salir et de compacter le sol
humide dans cette méthode. Les échantillons de sols saturés en eau ne doivent pas être séchés avant l’analyse.
5.2 Réactifs
Des réactifs de qualité analytique reconnue doivent être utilisés.
52.1 Graisse silicone, de viscosité moyenne.
5.2.2 Chloroforme exempt d’éthanol.
AVERTISSEMENT - À la lumière, le chloroforme exempt d’éthanol se dégrade rapidement pour former du
phosgène à l’état de gaz (COCI,) qui est inodore et très toxique.
5.2.3 Sulfate de potassium, solution, c(K2S04) = 0,5 mol/1 (p = 87,135 g/l).
5.2.4 Chaux sodée.
6 Appareillage
6.1 Local, ou incubateur, pouvant être maintenu à (25 + 2) OC.
6.2 Dessiccateur, protégé contre l’implosion.
6.3 Papier filtre’).
6.4 Béchers en verre.
6.5 Boîtes de Petri.
SI Whatman N” 42, Schleicher & Schüll 595 112, Machery & Nagel 261 G 1/4 sont des exemples de produits appropriés
disponibles sur le marche. Cette information est donnée a l’intention des utilisateurs de la présente partie de I’ISO 14240 et ne
signifie nullement que I’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
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ISO l4240-2:1997( F)
6.6 Flacons en polyéthylène, de 250 ml de capacité.
6.7 Chaîne de vide (pompe à eau ou électrique).
6.8 Agitateur horizontal ou de type rotatif.
6.9 Congélateur, fonctionnant de - 15 OC à - 20 OC.
6.10 Granules régulateurs d’ébullition.
7 Fumigation et extraction
7.1 Fumigation
Garnir le dessiccateur (6.2) d’un papier filtre humide (6.3) pour la fumigation des échantillons de sol.
Peser au moins trois échantillons de sol humide (5.1), contenant chacun une masse équivalant à 25 g à 50 g de sol
sec en les transvasant dans des béchers en verre (6.4) ou dans des boîtes de Petri (6.5) et les placer dans un
dessiccateur avec un bécher contenant 25 ml de chloroforme exempt d’éthanol (5.2.2) et quelques granules
régulateurs d’ébullition (6.10) ainsi qu’un bécher contenant de la chaux sodée (5.2.4). Faire le vide dans le
dessiccateur jusqu’à forte ébullition du chloroforme pendant environ 2 min. Fermer le robinet du dessiccateur et
incuber à l’obscurité (voir 6.1) à (25 k 2) OC pendant 22 h à 24 h.
S’il n’y a pas suffisamment de sol, utiliser des échantillons plus faibles à condition que le rapport de la masse de sol
au volume d’extractant reste le même (1:4). Dans les sols contenant plus de 20 % de matière organique
(déterminée conformément à I’ISO 10694), augmenter le rapport sol:extrait au-dessus de 1:4 (jusqu’à un maximum
de 1:30 pour les sols contenant 95 % de matière organique, par exemple couche L) afin d’obtenir un extrait suffisant
de matière. Noter la masse de sol utilisée.
À l’issue de la fumigation, retirer le bécher contenant le chloroforme et le papier filtre du dessiccateur. Éliminer les
vapeurs de chloroforme du sol par mise sous vide répétée du dessiccateur (6 fois de 2 min chacune). Les
échantillons sont prêts pour l’extraction.
Ptacer trois échantillons témoins humides non fumigés (50 g de masse sèche) dans des flacons en polyéthylène
(6.6) et extraire immédiatement avec 200 ml de sulfate de potassium (5.2.3), comme indiqué en 7.2.
7.2 Extraction
Pour extraire le carbone organique, transférer quantitativement le sol dans des flacons en polyéthylène (6.6),
ajouter 200 ml de sulfate de potassium (5.2.3), agiter les flacons à l’aide d’un agitateur horizontal (6.8) à 200 tr/min
pendant 30 min ou à l’aide d’un agitateur rotatif à 60 tr/min pendant 45 min, puis filtrer les extraits sur un papier filtre
plié (6.3). Extraire les témoins non fumigés et les filtrer de la même manière.
Si l’analyse n’est pas immédiate, conserver les extraits d’échantillons de sol fumigés et non fumigés au congélateur
(6.9) entre - 15 OC et - 20 OC. Homogénéiser les extraits congelés avant utilisation, après décongélation à
température ambiante.
NOTES
1 Un précipité blanc se produit au cours de la conservation des extraits de sol de sulfate de potassium (en particulier dans le
cas d’échantillons congelés) car ils sont généralement sursaturés en sulfate de calcium (CaSO,). II n’est pas nécessaire de
dissoudre cet excès de CaSO, car il ne perturbe aucune des procédures analytiques décrites dans la présente méthode.
2 Les membranes cellulaires des jeunes racines vivantes sont également affectées par la fumigation au chloroforme. II
convient d’utiliser le mode opératoire de pré-extraction donné à l’annexe 6 dans les sols contenant de grandes quantités de
racines vivantes.
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ISO 14240-2: 1997(F)
8 Détermination du carbone dans les extraits
La teneur en carbone des microorganismes présents dans un échantillon de sol est déterminée analytiquement et
peut être utiliser pour effectuer des comparaisons entre différents échantillons de sol. Lorsqu’un chiffre de biomasse
microbienne réelle est requis, ces valeurs sont multipliées par un facteur de conversion déduit d’expériences
établissant une corrélation entre une masse cellulaire connue et l’analyse de carbone après fumigation-extraction.
Tous les facteurs de conversion utilisés sont liés à ce facteur initial.
Wterminer la teneur en carbone dans les extraits soit par oxydation au dichromate (8.1), soit par analyse
spectrométrique (8.2).
8.1 Carbone de la biomasse microbienne par oxydation du dichromate
8.1 .l Principe
En présence d’un acide fort, la matière organique est oxydée et Cr(VI) réduit en Cr(lll). La quantité de dichromate
restante est titrée en retour.
8.1.2 Réactifs supplémentaires
Dichromate de potassium, c(K&07) = 0,066 7 mol/1 (19,612 5 g de dichromate de potassium séché
8.1.2.1
par litre d’eau).
AVERTISSEMENT - En raison du danger du dichromate de potassium, il convient de prendre de grandes
précautions lors de son utilisation et de son rejet éventuel.
8.1.2.2 Acide phosphorique, H,PO,, p = 1,71 g/ml.
8.1.2.3 Acide sulfurique, H$O,+ p = 1,84 g/ml.
8.1.2.4 Sulfate d’ammonium et de fer(lI), solution de titrage, c[(NH,),Fe(SO,),,GH,0] = 0,040 mol/l.
Le sulfate d’ammonium et de fer(ll) (1569 g) est dissous dans de l’eau distillée acidifiée avec 20 ml d’acide
sulfurique (8.1.2.3) et le tout est complété à 1 000 ml avec de l’eau distillée.
8.1.2.5 Complexe de sulfate de fer(ll) et de phénanthroline-1 ,lO, solution à 0,025 mol/l.
8.1.2.6 Mélange d’acides: deux volumes d’acide sulfurique (8.1.2.3) sont mélangés à un volume d’acide
phosphorique (8.1.2.2).
8.1.3 Appareillage complémentaire
8.1.3.1 Réfrigérant de Liebig (eau refroidie).
8.1.3.2 Ballon à fond rond, de 250 ml de capacité.
8.1.3.3 Burette, de 10 ml de capacité, graduée tous les 0,05 ml.
8.1.3.4 Pipette, de 2 ml de capacité.
8.1.4 Mode opératoire
Ajouter 2 ml de solution de dichromate de potassium (8.1.2.1) à l’aide d’une pipette (8.1.3.4) (PD) et 15 ml du
mélange d’acides (8.1.2.6) à 8 ml d’extrait filtré (7.1) (PS) dans
...
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