ISO 11268-1:2012

Soil quality - Effects of pollutants on earthworms - Part 1: Determination of acute toxicity to Eisenia fetida/Eisenia andrei

1 Scope This part of ISO 11268 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining the acute toxicity of soil contaminants and chemicals to Eisenia fetida/Eisenia andrei by dermal and alimentary uptake. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended soils, soils after remediation, agricultural or other sites concerned, and waste materials. Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For contaminated soils, the effects on survival are determined in the test soil and in a control soil. According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be either an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil (e.g. artificial soil). Information is provided on how to use this method for testing chemicals under temperate as well as under tropical conditions. The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry's constant) or the air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C. This method does not take into account the possible degradation of the substances or contaminants during the test.

Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre — Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei

1 Domaine d'application La présente partie de l'ISO 11268 spécifie l'une des méthodes permettant d'évaluer la fonction d'habitat des sols et de déterminer la toxicité aiguë de contaminants du sol et de produits chimiques pour Eisenia fetida/Eisenia andrei par absorption cutanée et ingestion. Elle s'applique aux sols et aux matériaux de type sol de qualité inconnue, provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sols agricoles ou autres sites d'intérêt et de déchets. Les effets des substances sont évalués à l'aide d'un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel défini. Pour les sols contaminés, les effets sur la survie sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un sol témoin. Selon l'objectif de l'étude, le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d'un sol contaminé) peut être soit un sol non contaminé comparable à l'échantillon de sol à évaluer (sol de référence), soit un sol standard (par exemple un sol artificiel). Des informations sont fournies sur la manière d'utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques dans des conditions tempérées ainsi que dans des conditions tropicales. La méthode ne s'applique pas aux substances volatiles, c'est-à-dire aux substances pour lesquelles H (constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa. Cette méthode ne tient pas compte de l'éventuelle dégradation des substances ou contaminants pendant l'essai

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 28-Oct-2012
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 2 - Effects on soil fauna
• Current Stage: 9092 - International Standard to be revised
• Start Date: 14-Apr-2025
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Revises: ISO 11268-1:1993 - Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part 1: Determination of acute toxicity using artificial soil substrate
• Effective Date: 10-Jan-2009

Overview

ISO 11268-1:2012 - "Soil quality - Effects of pollutants on earthworms - Part 1" - specifies a standardized laboratory method to determine the acute toxicity of soils, soil materials and chemicals to earthworms (Eisenia fetida / Eisenia andrei). The test evaluates the habitat function of soil by measuring earthworm survival after dermal and alimentary exposure to contaminated or amended soils, using either a reference soil or a standard (artificial) soil as control.

Key topics and technical requirements

• Test organisms: Adult Eisenia fetida or Eisenia andrei (≥3 months, with clitellum), selected for homogeneous size and mass.
• Endpoints: Survival, reported as mortality, NOEC (no observed effect concentration) and LC50 (median lethal concentration after test period).
• Test duration: Effects assessed after 7 and 14 days; a preliminary test determines appropriate concentration ranges and a definitive test establishes dose–response (10–90% mortality targeted). A single-concentration limit test is allowed when preliminary mortality is absent.
• Sample handling: Field soils sieved at 4 mm, air-dried if needed, stored per ISO 10381-6; key soil properties (pH, texture, water content, water‑holding capacity, cation exchange capacity, organic carbon) must be measured.
• Mixtures and controls: Test mixtures expressed as percentage of contaminated soil (dry mass); controls must be either comparable uncontaminated soil (reference) or standard soil.
• Exclusions and caveats: Not applicable to volatile substances (Henry’s constant or air/water partition coefficient > 1, or vapour pressure > 0.0133 Pa at 25 °C). The method does not account for chemical degradation during the test.
• Documentation & analysis: Requirements include experimental design, preparation, test conditions, reference substance use, calculation methods, validity criteria and statistical analysis.

Applications and users

ISO 11268-1 is used by:

• Environmental testing laboratories conducting soil ecotoxicity assays
• Regulators and risk assessors evaluating contaminated sites, land‑disposal suitability and remediation outcomes
• Remediation practitioners monitoring biological recovery after treatment
• Pesticide and chemical manufacturers performing acute toxicity screening under temperate and tropical conditions
• Researchers in soil ecology and ecotoxicology

Practical benefits include standardized, comparable acute toxicity data (LC50, NOEC) for decision-making on site management, remediation prioritization and chemical hazard assessment.

Related standards

Key normative references and complementary standards:

• ISO 10381-6 (soil sampling/storage)
• ISO 10390 (pH)
• ISO 10694 (organic carbon)
• ISO 11260 (cation exchange capacity)
• ISO 11277 (particle size distribution)
• ISO 11465 (water content)

Keywords: ISO 11268-1, soil quality, earthworm toxicity test, Eisenia fetida, Eisenia andrei, acute toxicity, LC50, NOEC, contaminated soils, artificial soil, ecotoxicology.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11268-1
Second edition
2012-11-01
Soil quality — Effects of pollutants on
earthworms —
Part 1:
Determination of acute toxicity to Eisenia
fetida/Eisenia andrei
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/
Eisenia andrei
Reference number
©
ISO 2012
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E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2012 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Reagents and material . 3
6 Apparatus . 5
7 Procedure . 5
7.1 Experimental design . 5
7.2 Preparation of test mixture . 6
7.3 Addition of the earthworms . 8
7.4 Test conditions and measurements . 8
7.5 Reference substance . 8
8 Calculation and expression of results . 8
8.1 Calculation . 8
8.2 Expression of results . 8
9 Validity of the test . 9
10 Statistical analysis . 9
10.1 General . 9
10.2 Single-concentration tests . 9
10.3 Multi-concentration tests .10
11 Test report . 11
Annex A (informative) Determination of the acute toxicity of chemicals (in particular pesticides) on
earthworms under tropical test conditions .12
Annex B (informative) Culturing of Eisenia fetida and Eisenia andrei .14
Annex C (informative) Determination of water holding capacity of artificial soil .15
Annex D (informative) Background information on the acute effect of boric acid on earthworms .16
Bibliography .17
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the International
Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11268-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11268-1:1993), which has been technically revised.
ISO 11268 consists of the following parts, under the general title Soil quality — Effects of pollutants on earthworms:
— Part 1: Determination of acute toxicity to Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Part 2: Determination of effects on reproduction of Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Part 3: Guidance on the determination of effects in field situations
iv © ISO 2012 – All rights reserved

Introduction
Ecotoxicological test systems are applied to obtain information about the effects of contaminants in soil and are
[33] [34]
proposed to complement conventional chemical analysis (see ISO 15799 and ISO 17616 ). ISO 15799
includes a list and short characterization of recommended and standardized test systems, and ISO 17616 gives
guidance on the choice and evaluation of the bioassays. Aquatic test systems with soil eluate are applied to
obtain information about the fraction of contaminants potentially reaching the groundwater by the water path
(retention function of soils), whereas terrestrial test systems are used to assess the habitat function of soils. As
standardized test systems using earthworms as indicator organisms for the habitat function of soil, an acute
test for survival and a chronic test for reproduction are available.
This part of ISO 11268 describes a method that is based on the determination of the acute toxicity of
contaminated soils to adult earthworms of the species Eisenia fetida (Savigny 1826) and Eisenia andrei (André
1963). Optionally, the method can be used for testing chemicals added to a standard soil (e.g. artificial soil) for
their acute toxic potential to earthworms. Finally, information is provided on how to use this method for testing
chemicals under tropical conditions (see Annex A).
Eisenia fetida and Eisenia andrei are considered to be representatives of soil fauna and earthworms in
particular. Background information on the ecology of earthworms and their use in ecotoxicological testing is
available. Other species, e.g. Aporrectodea caliginosa, Lumbricus rubellus and Lumbricus terrestris, have also
been used as test organisms. These or other species have not been proven to be more sensitive in general,
[15][16][23]
and the database and experience in testing soils is small .
This part of ISO 11268 has been drawn up taking into consideration test procedures adopted by the Organization
[26][27] [9]
for Economic Cooperation and Development and by the European Union .
INTERNATIONAL STANDARD ISO 11268-1:2012(E)
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 1:
Determination of acute toxicity to Eisenia fetida/Eisenia andrei
WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or otherwise harmful
chemicals or infectious microorganisms. Occupational health risks may arise from dust or evaporated
chemicals during handling and incubation. Precautions should be taken to avoid skin contact.
1 Scope
This part of ISO 11268 specifies one of the methods for evaluating the habitat function of soils and determining
the acute toxicity of soil contaminants and chemicals to Eisenia fetida/Eisenia andrei by dermal and alimentary
uptake. It is applicable to soils and soil materials of unknown quality, e.g. from contaminated sites, amended
soils, soils after remediation, agricultural or other sites concerned, and waste materials.
Effects of substances are assessed using a standard soil, preferably a defined artificial soil substrate. For
contaminated soils, the effects on survival are determined in the test soil and in a control soil. According to
the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil) should be
either an uncontaminated soil comparable to the soil sample to be tested (reference soil) or a standard soil
(e.g. artificial soil).
Information is provided on how to use this method for testing chemicals under temperate as well as under
tropical conditions.
The method is not applicable to volatile substances, i.e. substances for which H (Henry’s constant) or the
air/water partition coefficient is greater than 1, or for which the vapour pressure exceeds 0,013 3 Pa at 25 °C.
This method does not take into account the possible degradation of the substances or contaminants during the test.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document
(including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level using
barium chloride solution
ISO 11277, Soil quality — Determination of particle size distribution in mineral soil material — Method by
sieving and sedimentation
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
contaminant
substance or agent present in the soil as a result of human activity
[ISO 15176:2002]
3.2
survival
percentage of living worms at the end of the test period
3.3
mortality
percentage of dead or missing worms at the end of the test period
3.4
LC
lethal concentration
median lethal percentage of a test sample in a reference or a standard control soil, or concentration of a
substance in the test sample, which kills 50 % of the test animals within the test period
NOTE The LC is expressed as a percentage of test-soil dry mass per test-mixture dry mass.
3.5
limit test
single concentration test consisting of at least four replicates each, the test sample without any dilution or the
highest concentration of test substance mixed into the control soil and the control
3.6
lowest observed effect rate (LOER) or effect concentration (LOEC)
lowest tested percentage of a test sample in a control soil or concentration of a substance at which a statistically
significant effect is observed
NOTE The LOEC is expressed as a percentage of test-soil dry mass per test-mixture dry mass. All test mixtures
above the LOEC have a harmful effect equal to or greater than that observed at the LOEC. If this condition cannot be
satisfied, an explanation should be given for how the LOEC and NOEC (3.7) have been selected.
3.7
NOEC
no observed effect concentration
test soil percentage immediately below the LOEC or, highest tested concentration of a test substance which,
when compared to the control, has no statistically significant lethal or other effect such as mass alteration (error
probability: p < 0,05)
NOTE The NOEC is expressed as a percentage of test-soil dry mass per test-mixture dry mass.
3.8
reference soil
uncontaminated site-specific soil (e.g. collected in the vicinity of a contaminated site) with similar properties
(nutrient concentrations, pH, organic carbon content and texture) to the test soil
3.9
standard soil
field-collected soil or artificial soil whose main properties (e.g. pH, texture, organic matter content) are within
a known range
[21] [26] [24]
EXAMPLE Euro-Soils , artificial soil LUFA Standard Soil .
2 © ISO 2012 – All rights reserved

NOTE The properties of standard soils can differ from those of the test soil.
3.10
control soil
reference or standard soil used as a control and as a medium for preparing dilution series with test samples or
a reference substance which fulfils the validity criteria
NOTE In the case of natural soil, it is advisable to demonstrate its suitability for a test and for achieving the test
validity criteria before using the soil in a definitive test.
3.11
test mixture
mixture of contaminated soil or the test substance with a control soil (3.10)
NOTE Test mixtures are given in percentage of contaminated soil based on soil dry mass.
3.12
test mixture ratio
ratio of test soil to control soil in a test mixture
NOTE Different ratios may be applied in a dilution series to establish a dose-response relationship.
4 Principle
The percent mortality of adult earthworms (species: Eisenia fetida or Eisenia andrei) exposed to the test soil are
compared to those observed for samples exposed to a control soil. If appropriate, effects based on exposure to
a dilution range of contaminated soil or range of concentrations of a test substance are determined after seven
days and 14 days. Test mixtures are prepared at the start of the test and are not renewed within the test period.
The results obtained from the tests are compared with a control and are used to determine the dilutions or
concentrations which cause no effects on biomass and survival (NOEC) and the mortality of 50 % of earthworms
(LC , 14 days).
The test is conducted in two steps:
— a preliminary test, which gives an approximate indication of the dilutions (concentrations) responsible for
total mortality and for the absence of mortality, which serves to determine the range of concentrations for
the definitive test;
— the definitive test to determine the dilutions (concentrations) causing between 10 % and 90 % mortality,
which yields the test result.
If the preliminary test shows no mortality, a limit test (see 7.1.3) may be performed as the definitive test.
NOTE The use of a reference soil is an essential requirement to demonstrate the present status of the test population,
and to avoid misinterpretation of results.
5 Reagents and material
[12]
5.1 Biological material, consists of adult earthworms of the species Eisenia fetida or Eisenia andrei
[17][19]
at least three months old, with a clitellum and a wet mass between 300 mg and 600 mg (E. fetida) and
between 250 mg and 600 mg (E. andrei).
Select worms used for the test to form, as far as is practicable, a homogeneous population from the standpoint of
size and mass. Worms should preferably be selected from a synchronized culture with a relatively homogeneous
age structure. Before the test, wash them with potable water.
NOTE An example of culturing Eisenia fetida/Eisenia andrei is given in Annex B.
5.2 Test sample, which may consist of field-collected soil or control soil amended by the test substance.
5.2.1 Field-collected soils, soil or waste materials
The sample(s) can be field-collected soil from an industrial, agricultural or other site of concern, or waste
materials (e.g. dredged material, municipal sludge from a wastewater treatment plant, composed material, or
manure) under consideration for possible land disposal.
Test samples shall be sieved by 4 mm mesh and thoroughly mixed. If necessary, soil may be air-dried without
heating before sieving. Storage of test samples should be as short as possible. Store the soil in accordance
with ISO 10381-6 using containers that minimize losses of soil contaminants by volatilization and sorption to
the container walls. Soil pH should not be corrected as it can influence bioavailability of soil contaminants.
For interpretation of test results, the following characteristics shall be determined for each soil sampled from
a field site:
a) pH in accordance with ISO 10390,
b) texture (sand, loam, silt) in accordance with ISO 11277,
c) water content in accordance with ISO 11465,
d) water holding capacity according to Annex C,
e) cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260,
f) organic carbon in accordance with ISO 10694.
According to the objective of the study, the control and dilution substrate (dilution series of contaminated soil)
should be either an uncontaminated soil comparable to the soil sample (reference soil) to be tested or standard
soil, preferably the artificial soil substrate.
NOTE It is important to measure the water holding capacity of all mixtures used in the test.
5.2.2 Control soil, either a) reference soil (3.8) or b) standard soil (3.9) that allows the presence of earthworms.
a) If reference soils from uncontaminated areas near a contaminated site are available, they should be treated
and characterized like the test samples. If a toxic contamination or unusual soil properties cannot be ruled
out, standard control soils should be preferred.
b) For testing the effects of substances mixed into soil or making dilutions of the test sample, standard soils
shall be used to prepare the test sample. The properties of the field-collected standard soil shall be reported.
The substrate called artificial soil can be used as a standard soil and has the following composition:
Percentage expressed
on a dry-mass basis
— Sphagnum peat finely ground and with no visible plant remains 10 %
— Kaolinite clay containing not less than 30 % kaolinite 20 %
— Industrial quartz sand (dominant fine sand with more than 69 %
50 % of particle sizes 0,05 mm to 0,2 mm)
Approximately 0,3 % to 1,0 % calcium carbonate (CaCO , pulverized, analytical grade) are necessary to get a
pH of 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Taking the properties of highly non-polar [log K > 2, where K is the partitioning coefficient (octanol/water)]
ow ow
or ionizing substances into account, 5 % of peat have proven to be sufficient for maintaining the desired structure of the
artificial soil.
4 © ISO 2012 – All rights reserved

NOTE 2 It has been demonstrated that Eisenia fetida can comply with the validity criteria, even as regards reproduction,
[17]
when tested in field soils with lower organic carbon content (e.g. 2,7 %) , and experience shows that this can be achieved in
artificial soil with 5 % peat. It is therefore not necessary, before using such a soil in a definitive test, to demonstrate the suitability
[27]
of the artificial soil in complying with the validity criteria, unless the peat contents lowered more than specified above .
Prepare the artificial soil at least three days prior to starting the test, by mixing the dry constituents listed above
thoroughly in a large-scale laboratory mixer. A portion of the deionized water required is added while mixing
is continued. Allowance should be made for any water that is used for introducing the test substance into the
soil. The amount of calcium carbonate required can vary, depending on the properties of the individual batch
of sphagnum peat and should be determined by measuring sub-samples immediately before the test. Store
the mixed artificial soil at room temperature for at least two days to equilibrate acidity. To determine pH and the
maximum water holding capacity, the dry artificial soil is pre-moistened one or two days before starting the test
by adding deionized water to obtain approximately half of the required final water content of 40 % to 60 % of
the maximum water holding capacity.
The total water holding capacity is determined according to Annex C; the pH is determined according to ISO 10390.
5.2.3 Boric acid, as a reference substance (see Annex D).
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and the following.
6.1 Test containers, made of glass or another chemically inert material, of about one to two litres in capacity,
should be used. The containers should have a cross-sectional area of approximately 200 cm so that a moist
substrate depth of about 5 cm to 6 cm is achieved when 500 g dry mass of substrate are added. Test containers
shall permit gaseous exchange between the medium and the atmosphere and access of light (e.g. by means of
a perforated transparent cover), and shall have provisions to prevent earthworms from escaping (e.g. by using
a tape to fix the cover).
6.2 Apparatus to determine the dry mass of the substrate, in accordance with ISO 11465.
6.3 Large-scale laboratory mixer, for the preparation of the test sample (5.2).
6.4 Precision balance, with an accuracy of at least 1 mg.
6.5 Polyethylene-membrane, perforated with small holes allowing exchanges between the sample and
the atmosphere.
6.6 Test environment.
6.6.1 Enclosure, capable of being controlled at a temperature of (20 ± 2) °C.
6.6.2 Light source (e.g. white fluorescent tubes), capable of delivering a constant light intensity of 400 Ix to
800 Ix on the containers at a controlled light/dark cycle of between 12 h:12 h and 16 h:8 h.
7 Procedure
7.1 Experimental design
7.1.1 General
A sample of field-collected test soil can be tested at a single concentration (typically 100 %) or evaluated for
toxicity in a multi-concentration test, whereby a series of dilutions are prepared by mixing measured quantities
with a control soil (5.2.2). When testing substances a series of concentrations is prepared by mixing quantities
of the test substance with a standard soil (e.g. artificial soil). The concentrations are expressed in milligrams of
test substance per kilogram of dried control soil.
Depending on the knowledge of relevant response levels, a preliminary test may precede the definitive test. Each
definitive test consists of a series of test mixtures (treatments). Each treatment is replicated at least four times.
7.1.2 Preliminary test
A preliminary test to find the range of mixture ratios affecting earthworms is optional, e.g. 0 %, 1 %, 5 %, 25 %,
50 %, 75 %, 100 %, or of the test substance, e.g. 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg and 1 000 mg/kg.
The preliminary test is conducted without replication.
When no effects are observed, even at 100 % contaminated soil or at concentrations of 1 000 mg test
substance/kg standard soil (dry mass), the definitive test can be designed as a limit test.
7.1.3 Definitive test
The design of the definitive test depends on the test objectives. Typically, the habitat properties of samples of a
field-collected test soil are characterized by comparing the biological effects found in the test soil(s) with those
found in the control soil (3.10) (single-concentration tests). If a reference soil (3.8) to be used as a control is not
available or not appropriate due to toxicity or atypical physicochemical characteristics, effects are compared
to a standard soil instead. If a reference soil is available to be used as a control soil, it is recommended that a
standard soil exhibiting a typical known response be included, and that the results be used to judge the validity
[17]
and acceptability of the test . Results found for the standard soil assist in distinguishing contaminant effects
from non-contaminant effects caused by soil physicochemical properties.
If, for characterization purposes, a test design including a dilution series is required, a minimum of five test
mixtures shall be prepared. Therefore, a geometric series of mixture rates with a factor not exceeding 2 shall be
selected based on the preliminary test. At least four replicates of each treatment are prepared. A limit test can
be sufficient if, in the preliminary test, no toxic effect was observed. In the limit test, only the test soil without
any dilution and the control soil shall be tested with at least four replicates each.
When testing chemicals added to standard soil, perform the definitive test on five concentrations of the test
substance, providing a geometric progression between the highest concentration causing no mortality and the
lowest concentration causing total mortality. Proceed simultaneously with four replicates per concentration
and for a control without the test substance and, if necessary, for another control with solvent, placing each
container in the test environment (6.6).
To increase the precision and power of statistical testing when analysing quantitative single-concentration tests
(e.g. effects on biomass development), it is recommended that eight replicates be prepared for the control.
7.2 Preparation of test mixture
7.2.1 Testing of contaminated soil
Mix the test soil with the reference soil or the standard soil thoroughly (either manually or by using a hand
mixer) according to the selected dilution range. Check the homogeneity of the mixture visually. The total mass
of the test soil and the reference soil or the standard soil shall be 500 g to 600 g (dry mass) in each test
container (6.1). Wet the test mixture with deionized water to reach an appropriate water content of usually 40 %
to 60 % of the total water holding capacity determined according to Annex C. In some cases, e.g. when testing
waste materials, higher percentages are required. A rough check of the soil moisture content can be obtained
by gently squeezing the soil in the hand; if the moisture content is correct, small drops of water should appear
between the fingers.
Determine the pH for each test mixture (one container per concentration) according to ISO 10390 at the
beginning and end of the test (when acid or basic substances are tested, do not adjust the pH).
Proceed simultaneously with at least four replicates per concentration and the control(s).
6 © ISO 2012 – All rights reserved

WARNING — Contaminated soils may contain unknown mixtures of toxic, mutagenic, or otherwise
harmful chemicals or infectious microorganisms. Precautions should be taken to avoid skin contact.
Occupational health risks may arise from dust or evaporated chemicals during handling and incubation.
7.2.2 Testing substances added to the control soil
Control soil (5.2.2) is used to prepare the test sample. For each test container (6.1), the mass of the substrate
used shall be 500 g (dry mass). Add substances to the control soil and mix thoroughly.
For the introduction of test substances, use either method a), b) or c), as appropriate:
a) Water-soluble substance
— Immediately before starting the test, dissolve the quantity of the test substance in the water or a portion of
it required to wet the soil samples for the replicates of one concentration in order to meet the requirements
of 5.2.2. Mix it thoroughly with the soil substrate before introducing it into the test containers.
b) Substances insoluble in water but soluble in organic solvents
— Dissolve the quantity of test substance required to obtain the desired concentration in a volatile solvent
(such as acetone or hexane) and mix it with a portion of the quartz sand required. After evaporating
the solvent by placing the container under a fume hood, add the remainder of the standard soil and
the water and mix it thoroughly before introducing it into the test containers.
Ultrasonic dispersion, organic solvents, emulsifiers or dispersants can be used to disperse substances with low
aqueous solubility. When such auxiliary substances are used, all test concentrations and an additional control
should contain the same minimum amount of auxiliary substance.
WARNING — Take appropriate precautions when dealing with solvent vapour to avoid danger from
inhalation or explosion, and to avoid damage to extraction equipment, pumps, etc.
c) Substances insoluble in water or organic solvents
— For a substance insoluble in a volatile solvent, prepare a mixture of 10 g of finely ground industrial quartz
sand (see 5.2.2) and the quantity of the te
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11268-1
Deuxième édition
2012-11-01
Qualité du sol — Effets des polluants vis-
à-vis des vers de terre —
Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë vis-à-
vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
Soil quality — Effects of pollutants on earthworms —
Part 1: Determination of acute toxicity to Eisenia fetida/Eisenia andrei
Numéro de référence
©
ISO 2012
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de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction . v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 3
5 Réactifs et matériaux . 4
6 Appareillage . 5
7 Mode opératoire . 6
7.1 Plan d’expérimentation . 6
7.2 Préparation des mélanges d’essai . 7
7.3 Introduction des vers de terre . 8
7.4 Conditions d’essai et mesurages . 8
7.5 Substance de référence . 9
8 Calcul et expression des résultats . 9
8.1 Calcul . 9
8.2 Expression des résultats . 9
9 Validité de l’essai . 9
10 Analyse statistique .10
10.1 Généralités .10
10.2 Essais à une seule concentration .10
10.3 Essais à plusieurs concentrations . 11
11 Rapport d’essai .12
Annexe A (informative) Détermination de la toxicité aiguë des substances chimiques (en particulier les
pesticides) sur les vers de terre dans des conditions d’essai tropicales .13
Annexe B (informative) Élevage d’Eisenia fetida et d’Eisenia andrei .15
Annexe C (informative) Détermination de la capacité de rétention d’eau .16
Annexe D (informative) Informations de base sur l’effet aigu de l’acide borique sur les vers de terre .17
Bibliographie .18
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec la Commission
électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication
comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités membres votants.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de droits
de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir
identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO 11268-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11268-1:1993), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
L’ISO 11268 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Qualité du sol — Effets des
polluants vis-à-vis des vers de terre:
— Partie 1: Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 2: Détermination des effets sur la reproduction de Eisenia fetida/Eisenia andrei
— Partie 3: Lignes directrices relatives à la détermination des effets sur site
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Introduction
Des systèmes d’essais écotoxicologiques sont mis en œuvre pour obtenir des informations sur les effets des
contaminants présents dans le sol et sont proposés en complément d’une analyse chimique conventionnelle
[33] [34]
(voir l’ISO 15799 et l’ISO 17616 ). L’ISO 15799 comprend une liste et une brève caractérisation des
systèmes d’essais recommandés et normalisés et l’ISO 17616 donne des lignes directrices pour le choix et
l’évaluation des essais biologiques. Les systèmes d’essais aquatiques sur éluat de sol sont mis en œuvre pour
obtenir des informations sur la fraction des contaminants susceptibles d’atteindre les eaux souterraines par le
mouvement de l’eau (fonction de rétention des sols), alors que les systèmes d’essais terrestres sont utilisés
pour évaluer la fonction d’habitat des sols. En tant que systèmes d’essais normalisés utilisant des vers de terre
comme organismes indicateurs pour la fonction d’habitat du sol, un essai de toxicité aiguë pour la survie et un
essai de toxicité chronique pour la reproduction sont disponibles.
La présente partie de l’ISO 11268 décrit une méthode basée sur la détermination de la toxicité aiguë des sols
contaminés pour des vers de terre adultes des espèces Eisenia fetida (Savigny 1826) et Eisenia andrei (André
1963). La méthode peut éventuellement être utilisée pour évaluer le potentiel toxique aigu pour les vers de terre
de produits chimiques ajoutés à un sol standard (par exemple un sol artificiel). En dernier lieu, des informations
sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques dans des conditions
tropicales (voir l’Annexe A).
Eisenia fetida et Eisenia andrei sont considérés comme étant représentatifs de la faune du sol et des vers de
terre en particulier. Des informations de base sur l’écologie des vers de terre et leur utilisation en écotoxicologie
sont disponibles. D’autres espèces, par exemple Aporrectodea caliginosa, Lumbricus rubellus et Lumbricus
terrestris, ont également été utilisées comme organismes d’essai. En général, ces espèces ou d’autres ne
se sont pas avérées plus sensibles, et les bases de données et l’expérience dans l’évaluation des sols sont
[15][16][23]
réduites .
La présente partie de l’ISO 11268 a été élaborée en tenant compte des modes opératoires d’essai adoptés par
[26][27] [9]
l’Organisation de coopération et de développement économiques et par l’Union européenne .
NORME INTERNATIONALE ISO 11268-1:2012(F)
Qualité du sol — Effets des polluants vis-à-vis des vers de terre —
Partie 1:
Détermination de la toxicité aiguë vis-à-vis de Eisenia fetida/
Eisenia andrei
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes infectieux.
Des risques pour la santé au travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de
produits chimiques pendant la manipulation et l’incubation. Il convient de prendre des mesures pour
éviter tout contact avec la peau.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 11268 spécifie l’une des méthodes permettant d’évaluer la fonction d’habitat des sols
et de déterminer la toxicité aiguë de contaminants du sol et de produits chimiques pour Eisenia fetida/Eisenia
andrei par absorption cutanée et ingestion. Elle s’applique aux sols et aux matériaux de type sol de qualité
inconnue, provenant, par exemple, de sites contaminés, de sols amendés, de sols après remédiation, de sols
agricoles ou autres sites d’intérêt et de déchets.
Les effets des substances sont évalués à l’aide d’un sol standard, de préférence un substrat de sol artificiel
défini. Pour les sols contaminés, les effets sur la survie sont déterminés dans le sol soumis à essai et dans un
sol témoin. Selon l’objectif de l’étude, le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d’un sol contaminé)
peut être soit un sol non contaminé comparable à l’échantillon de sol à évaluer (sol de référence), soit un sol
standard (par exemple un sol artificiel).
Des informations sont fournies sur la manière d’utiliser cette méthode pour évaluer des produits chimiques
dans des conditions tempérées ainsi que dans des conditions tropicales.
La méthode ne s’applique pas aux substances volatiles, c’est-à-dire aux substances pour lesquelles H
(constante de Henry) ou le coefficient de partage air/eau est supérieur à 1, ou pour lesquelles la pression de
vapeur à 25 °C excède 0,013 3 Pa.
Cette méthode ne tient pas compte de l’éventuelle dégradation des substances ou contaminants pendant l’essai.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l’application du présent document. Pour les
références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s’applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11277, Qualité du sol — Détermination de la répartition granulométrique de la matière minérale des sols —
Méthode par tamisage et sédimentation
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
contaminant
substance ou agent présent(e) dans le sol et résultant de l’activité humaine
[ISO 15176:2002]
3.2
survie
pourcentage de vers vivants au terme de la période d’essai
3.3
mortalité
pourcentage de vers morts ou manquants au terme de la période d’essai
3.4
CL
concentration létale
pourcentage létal médian d’un échantillon soumis à essai dans un sol témoin standard ou un sol de référence,
ou concentration d’une substance dans l’échantillon soumis à essai, qui provoque la mort de 50 % des animaux
d’essai au cours de la période d’exposition
NOTE La CL est exprimée en pourcentage de masse sèche du sol d’essai par masse sèche du mélange d’essai.
3.5
essai limite
essai à une seule concentration comprenant au moins quatre réplicats pour chacun, l’échantillon pour essai
sans dilution ou la plus forte concentration de substances d’essai mélangées dans le sol témoin et le témoin
3.6
plus faible taux (RMEO) ou concentration ayant un effet observé (CMEO)
pourcentage le plus faible d’un échantillon pour essai dans un sol témoin, ou concentration la plus faible d’une
substance, pour lequel (laquelle) un effet statistiquement significatif est observé
NOTE La CMEO est exprimée en pourcentage de masse sèche de sol d’essai par masse sèche de mélange d’essai.
Tous les mélanges d’essai supérieurs à la CMEO ont un effet nuisible supérieur ou égal à celui observé à la CMEO. Si
cette condition ne peut pas être satisfaite, il convient d’expliquer comment la CMEO et la CSEO (3.7) ont été choisies.
3.7
CSEO
concentration sans effet observé
pourcentage de sol d’essai immédiatement inférieur à la CMEO ou concentration d’essai la plus élevée d’une
substance soumise à essai qui, comparée au témoin, n’a aucun effet létal ou autre effet (tel qu’une modification
de la masse (probabilité d’erreur p < 0,05) statistiquement significatif
NOTE La CSEO est exprimée en pourcentage de masse sèche du sol d’essai par masse sèche du mélange d’essai.
3.8
sol de référence
sol non contaminé spécifique au site (par exemple prélevé au voisinage d’un site contaminé) ayant des
propriétés similaires (concentrations d’éléments nutritifs, pH, teneur en carbone organique et texture) à celles
du sol soumis à essai
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3.9
sol standard
sol prélevé sur le terrain ou sol artificiel dont les principales propriétés (par exemple pH, texture, teneur en
matières organiques) se situent dans une gamme connue
[21] [26] [24]
EXEMPLE Euro-Soils , sol artificiel , sol standard LUFA .
NOTE Les propriétés des sols standards peuvent différer de celles du sol d’essai.
3.10
sol témoin
sol de référence ou sol standard utilisé comme témoin et comme milieu pour préparer une gamme de dilutions
avec les échantillons pour essai ou une substance de référence qui satisfait les critères de validité
NOTE Pour un sol naturel, il est recommandé de démontrer sa capacité à être utilisé pour un essai et à atteindre les
critères de validité de l’essai avant de l’utiliser dans un essai définitif.
3.11
mélange d’essai
mélange d’un sol contaminé ou de la substance soumise à essai avec un sol témoin (3.10)
NOTE Les mélanges d’essai sont donnés en pourcentage de sol contaminé sur la base de la masse sèche du sol.
3.12
ratio de mélange d’essai
rapport entre le sol soumis à essai et le sol témoin dans un mélange d’essai
NOTE Différents ratios peuvent être appliqués dans une gamme de dilutions afin de déterminer une relation dose-réponse.
4 Principe
Le pourcentage de mortalité de vers de terre adultes (espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei) exposés au
sol soumis à essai est comparé à celui observé pour des échantillons exposés à un sol témoin. Si cela est
approprié, les effets observés à la suite d’une exposition à une gamme de dilutions de sol contaminé ou à une
gamme de concentrations d’une substance d’essai sont déterminés après sept jours et 14 jours. Les mélanges
d’essai sont préparés au début de l’essai et ne sont pas renouvelés pendant la période d’essai.
Les résultats obtenus lors des essais sont comparés à ceux d’un témoin et sont utilisés pour déterminer les
dilutions ou concentrations qui n’ont aucun effet sur la biomasse et la survie (CSEO) et qui entraînent une
mortalité de 50 % des vers de terre (CL , 14 jours).
L’essai est réalisé en deux étapes:
— un essai préliminaire qui donne une indication approximative des dilutions (concentrations) responsables
de la mortalité totale et de l’absence de mortalité, et qui sert à déterminer la gamme des concentrations
pour l’essai définitif;
— un essai définitif pour déterminer les dilutions (concentrations) provoquant une mortalité de 10 % à 90 %,
et qui conduit au résultat de l’essai.
Si l’essai préliminaire révèle une absence de mortalité, un essai limite (voir 7.1.3) peut être réalisé comme
essai définitif.
NOTE L’utilisation d’un sol de référence est une exigence essentielle pour démontrer l’état actuel de la population
soumise à essai et éviter toute mauvaise interprétation des résultats.
5 Réactifs et matériaux
[12][17]
5.1 Réactif biologique, constitué de vers de terre adultes de l’espèce Eisenia fetida ou Eisenia andrei
[19]
, âgés d’au moins trois mois, possédant un clitellum et dont la masse humide est comprise entre 300 mg et
600 mg (E. fetida) ou entre 250 mg et 600 mg (E. andrei).
Sélectionner les vers à utiliser pour l’essai de manière à obtenir, dans la mesure du possible, une population
homogène du point de vue de la taille et de la masse. Il est préférable de sélectionner les vers dans un élevage
synchrone ayant une structure d’âge relativement homogène. Laver les vers à l’eau potable avant l’essai.
NOTE Un exemple de technique d’élevage d’Eisenia fetida/Eisenia andrei est donné dans l’Annexe B.
5.2 Échantillon soumis à essai, qui peut être constitué d’un sol prélevé sur le terrain ou d’un sol témoin
amendé par la substance soumise à essai.
5.2.1 Sols prélevés sur le terrain, sol ou déchets
Le ou les échantillons peuvent être un sol prélevé sur un site industriel, agricole ou autre site d’intérêt, ou des
déchets (par exemple matériau de dragage, boues provenant d’une station d’épuration des eaux urbaines,
matériau composite ou fumier) pour lesquels une éventuelle mise en dépôt terrestre est envisagée.
Les échantillons pour essai doivent être tamisés à 4 mm et soigneusement mélangés. Si nécessaire, le sol
peut être séché à l’air sans chauffage avant le tamisage. Il convient que la conservation des échantillons pour
essai soit aussi courte que possible. Conserver le sol conformément à l’ISO 10381-6 en utilisant des récipients
qui réduisent au minimum les pertes de contaminants du sol par volatilisation et sorption sur les parois des
récipients. Il convient de ne pas corriger le pH du sol car il peut avoir une incidence sur la biodisponibilité des
contaminants du sol.
Pour l’interprétation des résultats d’essai, les caractéristiques suivantes doivent être déterminées pour chaque
échantillon de sol prélevé sur le terrain:
a) pH conformément à l’ISO 10390;
b) texture (sable, limon, vase) conformément à l’ISO 11277;
c) teneur en eau conformément à l’ISO 11465;
d) capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe C;
e) capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260;
f) carbone organique conformément à l’ISO 10694.
Selon l’objectif de l’étude, il convient que le substrat témoin et de dilution (gamme de dilutions d’un sol contaminé)
soit un sol non contaminé comparable à l’échantillon de sol à évaluer (sol de référence) ou un sol standard, de
préférence le substrat de sol artificiel.
NOTE Il est important de mesurer la capacité de rétention d’eau de tous les mélanges utilisés dans l’essai.
5.2.2 Sol témoin, soit a) sol de référence (3.8) soit b) sol standard (3.9) permettant la présence de vers de terre.
a) Si des sols de référence provenant de zones non contaminées voisines d’un site contaminé sont
disponibles, il convient de les traiter et de les caractériser de la même manière que les échantillons pour
essai. S’il est impossible d’exclure une contamination toxique ou des propriétés inhabituelles du sol, il
convient de préférer des sols témoins standards.
b) Pour évaluer les effets de substances mélangées au sol ou pour préparer les dilutions de l’échantillon pour
essai, des sols standards doivent être utilisés pour préparer l’échantillon pour essai. Les propriétés du sol
standard prélevé sur le terrain doivent être consignées dans le rapport.
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Le substrat appelé «sol artificiel» peut être utilisé comme un sol standard et a la composition suivante:
Pourcentage exprimé
en masse sèche
— Tourbe de sphaignes, finement moulue, exempte de tout résidu 10 %
végétal visible
— Argile kaolinique contenant au moins 30 % de kaolinite 20 %
— Sable de quartz industriel (contenant en majorité du sable fin, 69 %
constitué à plus de 50 % de grains de granulométrie comprise
entre 0,05 mm et 0,2 mm)
Environ 0,3 % à 1,0 % de carbonate de calcium (CaCO , pulvérisé, de qualité analytique) sont nécessaires
pour obtenir un pH de 6,0 ± 0,5.
NOTE 1 Afin de prendre en compte les propriétés des substances fortement non polaires [log K > 2, où K est le
ow ow
coefficient de partage (octanol/eau)] ou des substances ionisantes, 5 % de tourbe se sont avérés suffisants pour maintenir
la structure souhaitée du sol artificiel.
NOTE 2 Il a été démontré que Eisenia fetida peut respecter les critères de validité, même en ce qui concerne la
reproduction, lorsqu’il est soumis à essai dans des sols ayant une plus faible teneur en carbone organique (par
[17]
exemple 2,7 %) , et l’expérience montre que cette teneur peut être obtenue dans un sol artificiel avec 5 % de tourbe.
Par conséquent, avant d’utiliser un tel sol dans un essai définitif, il n’est pas nécessaire de démontrer que le sol artificiel
[27]
permet de respecter les critères de validité, sauf si la teneur en tourbe est inférieure à la valeur spécifiée ci-dessus .
Préparer le sol artificiel au moins trois jours avant le début de l’essai, en mélangeant soigneusement les
constituants secs indiqués ci-dessus dans un mélangeur de laboratoire de grandes dimensions. Une partie
de l’eau déionisée nécessaire est ajoutée pendant le mélange. Il convient de tenir compte de l’eau qui est
utilisée pour introduire la substance d’essai dans le sol. La quantité de carbonate de calcium nécessaire peut
varier selon les propriétés du lot particulier de tourbe de sphaignes et il convient qu’elle soit déterminée par
des mesurages effectués sur des sous-échantillons immédiatement avant l’essai. Conserver le sol artificiel
mélangé à température ambiante pendant au moins deux jours pour équilibrer l’acidité. Pour déterminer le pH
et la capacité maximale de rétention d’eau, le sol artificiel sec est pré-humidifié un jour ou deux jours avant le
début de l’essai en ajoutant de l’eau déionisée de manière à atteindre approximativement la moitié de la teneur
finale en eau requise correspondant à 40 % à 60 % de la capacité maximale de rétention d’eau.
La capacité totale de rétention d’eau est déterminée conformément à l’Annexe C; le pH est déterminé
conformément à l’ISO 10390.
5.2.3 Acide borique, utilisé comme substance de référence (voir Annexe D).
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et ce qui suit.
6.1 Récipients d’essai, en verre ou autre matériau chimiquement inerte, de capacité comprise environ entre
1 l et 2 l. Il convient que les récipients aient une section transversale d’environ 200 cm de manière à atteindre
une hauteur de substrat humide d’environ 5 cm à 6 cm lorsque 500 g de substrat équivalent sec sont ajoutés. Les
récipients d’essai doivent permettre les échanges gazeux entre le milieu et l’atmosphère ainsi que le passage
de la lumière (par exemple au moyen d’un couvercle transparent perforé). Ils doivent être conçus de manière à
empêcher les vers de terre de s’échapper (par exemple en fixant le couvercle à l’aide de ruban adhésif).
6.2 Appareillage permettant de déterminer la masse sèche du substrat, conformément à l’ISO 11465.
6.3 Mélangeur de laboratoire de grandes dimensions, pour la préparation de l’échantillon soumis à essai (5.2).
6.4 Balance, ayant une précision d’au moins 1 mg.
6.5 Membrane de polyéthylène, perforée de petits trous pour permettre les échanges entre l’échantillon et
l’atmosphère.
6.6 Environnement d’essai.
6.6.1 Enceinte, thermostatée à (20 ± 2) °C.
6.6.2 Source lumineuse (par exemple tubes fluorescents blancs), permettant de soumettre les récipients à
une intensité lumineuse constante de 400 Ix à 800 Ix, selon un cycle contrôlé lumière/obscurité compris entre
12 h:12 h et 16 h:8 h.
7 Mode opératoire
7.1 Plan d’expérimentation
7.1.1 Généralités
Un échantillon de sol d’essai prélevé sur le terrain peut être soumis à essai à une seule concentration (généralement
100 %) ou faire l’objet d’une évaluation de sa toxicité lors d’un essai à plusieurs concentrations pour lequel une
gamme de dilutions est préparée en mélangeant des quantités calculées avec un sol témoin (5.2.2). Lorsque des
substances sont soumises à essai, une gamme de concentrations est préparée en mélangeant des quantités de
la substance testée avec un sol standard (par exemple le sol artificiel). Les concentrations sont exprimées en
milligrammes de substance d’essai par kilogramme de sol témoin équivalent sec.
Selon la connaissance des niveaux de réponse pertinents, un essai préliminaire peut précéder l’essai définitif.
Chaque essai définitif comprend une gamme de mélanges d’essai (traitements). Chaque traitement est répété
au moins quatre fois.
7.1.2 Essai préliminaire
L’essai préliminaire permettant de déterminer la gamme de mélanges ou de concentrations de substance
d’essai affectant les vers de terre est facultatif, par exemple ratios de mélange de 0 %, 1 %, 5 %, 25 %,
50 %, 75 % et 100 %, ou concentrations de substance d’essai de 0 mg/kg, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg et
1 000 mg/kg. L’essai préliminaire est effectué sans répétition.
Lorsqu’aucun effet n’est observé, même à 100 % de sol contaminé ou à une concentration de substance
d’essai de 1 000 mg/kg de sol standard (équivalent sec), l’essai définitif peut être conçu comme un essai limite.
7.1.3 Essai définitif
La conception de l’essai définitif dépend des objectifs de l’essai. Les propriétés d’habitat des échantillons
de sol d’essai prélevé sur le terrain sont généralement caractérisées en comparant les effets biologiques
observés dans le(s) sol(s) soumis à essai avec ceux observés dans le sol témoin (3.10) (essais à une seule
concentration). Si un sol de référence (3.8) devant être utilisé comme témoin n’est pas disponible ou n’est
pas approprié en raison de sa toxicité ou de caractéristiques physico-chimiques atypiques, les effets sont
alors comparés à ceux observés dans un sol standard. Si l’on dispose d’un sol de référence à utiliser comme
sol témoin, il est recommandé d’inclure également un sol standard présentant une réponse type connue et
[17]
d’utiliser ces résultats pour évaluer la validité et l’acceptabilité de l’essai . Les résultats obtenus pour le sol
standard aident à faire la distinction entre les effets liés aux contaminants et ceux non liés aux contaminants,
provoqués par les propriétés physico-chimiques du sol.
Si, à des fins de caractérisation, la conception d’essai requiert d’inclure une gamme de dilutions, au moins
cinq mélanges d’essai doivent être préparés. Par conséquent, une série géométrique de ratios de mélange
ne dépassant pas un facteur de deux doit être choisie sur la base de l’essai préliminaire. Au moins quatre
répétitions de chaque traitement sont préparées. Un essai limite peut suffire si aucun effet toxique n’a été
observé au cours de l’essai préliminaire. Dans l’essai limite, seul le sol soumis à essai sans dilution et le sol
témoin doivent être testés, avec au moins quatre répétitions pour chacun d’eux.
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Lorsque les essais concernent des produits chimiques ajoutés à un sol standard, réaliser l’essai définitif sur
cinq concentrations de la substance d’essai afin d’obtenir une progression géométrique entre la plus forte
concentration n’entraînant pas de mortalité et la plus faible concentration entraînant une mortalité totale.
Effectuer l’essai simultanément sur quatre échantillons identiques par concentration et sur un témoin exempt
de substance d’essai et, si nécessaire, sur un autre témoin avec solvant, en plaçant chaque récipient dans
l’environnement d’essai (6.6).
Pour accroître la fidélité et la puissance des tests statistiques lors de l’analyse des essais quantitatifs à une
seule concentration (par exemple les effets sur l’évolution de la biomasse), il est recommandé de préparer huit
échantillons identiques pour le témoin.
7.2 Préparation des mélanges d’essai
7.2.1 Essai sur sols contaminés
Mélanger soigneusement le sol soumis à essai avec le sol de référence ou avec le sol standard (manuellement
ou à l’aide d’un mélangeur à main) conformément à la gamme de dilutions choisie. Contrôler visuellement
l’homogénéité du mélange. La masse totale du sol soumis à essai et du sol de référence ou du sol standard doit
être comprise entre 500 g et 600 g (équivalent sec) dans chaque récipient d’essai (6.1). Humidifier le mélange
d’essai avec de l’eau déionisée pour atteindre une teneur en eau appropriée, généralement comprise entre
40 % et 60 % de la capacité totale de rétention d’eau déterminée conformément à l’Annexe C. Dans certains
cas, par exemple lorsque l’essai est réalisé sur des déchets, des pourcentages plus élevés sont nécessaires.
Une vérification sommaire de la teneur en eau du sol peut être obtenue en comprimant légèrement le sol dans
la main; si la teneur en eau est correcte, de petites gouttes d’eau apparaissent entre les doigts.
Déterminer le pH de chaque mélange d’essai (un récipient par concentration) conformément à l’ISO 10390 au
début et à la fin de l’essai (lorsque des substances acides ou basiques sont soumises à essai, ne pas ajuster le pH).
Réaliser l’essai simultanément sur au moins quatre réplicats par concentration et sur le(s) témoin(s).
AVERTISSEMENT — Les sols contaminés peuvent contenir des mélanges inconnus de produits
chimiques toxiques, mutagènes ou nocifs d’une autre manière ou des micro-organismes infectieux. Il
convient de prendre des mesures pour éviter tout contact avec la peau. Des risques pour la santé au
travail peuvent survenir en raison de la poussière ou de l’évaporation de produits chimiques pendant
la manipulation et l’incubation.
7.2.2 Essais sur substances ajoutées au sol témoin
Un sol témoin (5.2.2) est utilisé pour préparer l’échantillon pour essai. Pour chaque récipient d’essai (6.1), la
masse du substrat utilisé doit être de 500 g (équivalent sec). Ajouter les substances au sol témoin et mélanger
soigneusement.
Pour l’introduction des substances d’essai, utiliser la méthode a), b) ou c), selon le cas.
a) Substances solubles dans l’eau
— Immédiatement avant le début de l’essai, dissoudre la quantité de substance d’essai dans l’eau, ou
une partie de celle-ci, requise pour humidifier les échantillons de sol correspondant aux réplicats
d’une concentration de façon à satisfaire aux exigences de 5.2.2. Mélanger soigneusement avec le
substrat avant son introduction dans les récipients d’essai.
b) Substances insolubles dans l’eau mais solubles dans les solvants organiques
— Dissoudre dans un solvant volatil (tel que l’acétone ou l’hexane) la quantité de substance d’essai
nécessaire pour obtenir la concentration désirée, et la mélanger avec une partie de la quantité
nécessaire de sable de quartz. Après avoir évaporé le solvant en plaçant le récipient sous une hotte
aspirante, ajouter le reste du sol standard et l’eau et mélanger soigneusement le tout avant son
introduction dans les récipients d’essai.
Pour disperser les substances peu solubles dans l’eau, il est possible d’avoir recours aux ultrasons, à des
solvants organiques, des émulsifiants ou des dispersants. Dans ce cas, il convient que les concentrations
soumises à essai et un témoin supplémentaire contiennent la même quantité minimale de substance auxiliaire.
AVERTISSEMENT — Prendre les précautions appropriées concernant les vapeurs de solvant pour
éviter les risques d’inhalation ou d’explosion et pour éviter d’endommager le matériel d’extraction,
les pompes, etc.
c) Substances insolubles dans l’eau ou dans les solvants organiques
— Pour une substance insoluble dans un solvant volatil, préparer un mélange de 10 g de sable de
quartz industriel finement broyé (voir 5.2.2) et la quantité de substance d’essai nécessaire pour
obtenir la concentration souhaitée. Ajouter ce mélange au reste du sol standard et à l’eau et mélanger
soigneusement avant son introduction dans les récipients d’essai.
— Mélanger la substance d’essai au sol standard avant d’introduire les vers de terre.
Choisir les concentrations permettant d’obtenir la CMEO/CSEO sur la base des résultats de l’essai préliminaire.
Les concentrations doivent être espacées par un facteur inférieur ou égal à 2. Il n’est pas nécessaire de
soumettre à essai les substances mélangées au substrat à des concentrations supérieures à 1 000 mg/kg de
l’échantillon d’essai. Réaliser l’essai simultanément avec au moins quatre réplicats par concentration et pour
le(s) témoin(s).
Déterminer le pH de chaque échantillon soumis à essai (un récipient par concentration) conformément à
l’ISO 10390 au début et à la fin de l’essai.
7.2.3 Préparation des récipients témoins
Le récipient témoin contient le sol témoin (5.2.2) humidifié avec de l’eau déionisée pour atteindre 40 % à 60 %
de la capacité totale de rétention d’eau (déterminée conformément à l’Annexe C).
Préparer un récipient témoin pour l’essai préliminaire et au moins quatre récipients témoins pour l’essai définitif.
Préparer les récipients témoins de la même manière que les récipients d’essai. Si la préparation de l’essai
nécessite l’utilisation d’un solvant (voir 7.2.2), utiliser un témoin supplémentaire préparé avec le solvant, mais
sans la substance d’essai. Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1.
7.3 Introduction des vers de terre
Pour chaque récipient d’essai ainsi que pour le(s) récipient(s) témoin(s), préparer, laver et essuyer doucement
(à l’aide de papier absorbant) 10 vers (5.1). Pour éviter les erreurs systématiques dans la répartition des vers
dans les récipients d’essai, déterminer l’homogénéité de la population d’essai en pesant un échantillon de
20 vers individuellement. L’homogénéité ayant été vérifiée, choisir des lots de 10 vers, les peser et les placer
dans chaque récipient d’essai. Placer les lots de vers dans les récipients de façon aléatoire. Il convient que la
plage de biomasse moyenne entre les récipients ne dépasse pas 100 mg.
Couvrir les récipients comme indiqué en 6.1 et les placer dans l’enceinte d’essai (6.6.1).
7.4 Conditions d’essai et mesurages
Placer les récipients de façon aléatoire dans l’enceinte d’essai (6.6.1) pendant 14 jours.
Au bout de sept jours, compter les vers vivants et retirer les vers morts, s’ils sont visibles (un ver est considéré
comme étant mort s’il ne réagit pas à une piqûre sur sa partie antérieure). Noter les symptômes observés
sur les animaux.
À la fin de l’essai après 14 jours, déterminer, pour chaque récipient, le nombre total et la masse des vers
vivants, la teneur en eau dans un récipient témoin et le pH dans un récipient pour chaque concentration d’essai.
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7.5 Substance de référence
La CSEO et/ou la CL d’une substance de référence doivent être déterminées afin de s’assurer que les
x
conditions d’essai en laboratoire sont adéquates et de vérifier que la réponse de l’organisme soumis à essai ne
varie pas statistiquement dans le temps. Il est conseillé de tester une substance de référence au moins deux
fois par an ou, lorsque l’essai est effectué à une fréquence plus faible, parallèlement à la détermination de la
toxicité de la substance soumise à essai.
L’acide borique est utilisé comme substance de référence. Il convient que des effets significatifs sur la mortalité
soient observés à des concentrations comprises entre 3 000 mg et 4 500 mg d’acide borique par kilogramme
de sol artificiel (équivalent sec). D’après la littérature, la CL moyenne (n = 7, où n est le nombre d’échantillons)
dans un sol artificiel est de 3 500 mg d’acide borique par kilogramme (intervalle de confiance de 3 000 mg/kg
à 4 500 mg/kg).
8 Calcul et expression des résultats
8.1 Calcul
Déterminer, pour chaque dilution ou concentration, le pourcentage de mortalité obtenu au cours de l’essai
définitif. Les données sont regroupées pour les réplicats d’une concentration donnée.
Pour les essais de létalité aiguë ou d’autres effets quantaux, les pourcentages d’effets sont transformés en
probits ou logits permettant d’estimer un modèle linéaire et de limiter les paramètres à estimer.
Lorsque deux dilutions ou concentrations consécutives dans un rapport inférieur ou égal à 2 (par exemple 10,
18) donnent, d’une part 0 % et, d’autre part 100 % de mortalité, ces deux valeurs suffisent à indiquer la gamme
dans laquelle se situe la CL .
8.2 Expression des résultats
Il convient d’établir une représentation graphique des valeurs moyennes des critères d’effets, incluant l’écart-
type des valeurs mesurées pour le(s) sol(s) d’essai, le(s) sol(s) témoin(s) ou les ratios de mélange d’essai. Cette
comparaison ou courbe donne un aperçu de la qualité des effets et de leur amplitude. Le ratio de mélange est
exprimé sur la base de la masse sèche du sol.
Si une gamme de dilutions ou de concentrations a été préparée, indiquer:
— pour la relation dose-effet, le pourcentage de mélange d’essai en équivalent sec ou en milligrammes
par kilogramme de substrat de sol sec, la dilution létale médiane en pourcentage de sol contaminé ou la
concentration létale médiane de la substance d’essai, qui provoque la mort de 50 % des animaux au cours
de la période d’essai conformément au modèle choisi (CL ); ou
— pour l’approche CSEO, le ratio de mélange d’essai immédiatement inférieur à la CMEO ou la plus forte
concentration de la substance d’essai qui, comparée au témoin, n’a aucun effet létal ou autre effet
statistiquement significatif, tel qu’une modification de la masse (CSEO).
9 Validité de l’essai
Les résultats sont considérés comme valides si
— le pourcentage de mortalité observé dans le témoin est < 10 %, et
— la perte moyenne en biomasse des vers dans le témoin ne dépasse pas 20 %.
10 Analyse statistique
10.1 Généralités
L’évaluation d’un effet statistiquement significatif lors d’essais à une seule concentration pour des données
quantales (mortalité par exemple) dépend du programme de recherche et de sa conception. Pour un échantillon
provenant d’un seul site, les résultats obtenus sur des échantillons «de terrain» identiques (par exemple étude
d’un sol contaminé) peuvent être analysés par le test exact de Fisher. Pour une étude de différents sites
intégrant plusieurs réplicats, les résultats peuvent être évalués par une régression logistique ou sous le contrôle
d’un statisticien; une analyse de variance (ANOVA) peut parfois être réalisable.
Les essais à une seule concentration pour des données quantitatives (par exemple effets sur le développement
de la biomasse) nécessitent différentes méthodes statistiques. Pour un échantillonnage réalisé sur plusieurs
sites avec répétitions, l’ANOVA constitue une première étape si les résultats sont appropriés. Si l’hypothèse
nulle d’absence de différence est rejetée, l’analyse se poursuit par l’un des divers tests de comparaisons
[8]
multiples .
NOTE Les lignes directrices données dans le présent document pour l’évaluation statistique des résultats d’essai
visent à alerter le chercheur sur les problèmes pouvant survenir du fait du type de test choisi. Les programmes informatiques
ne protègent pas nécessairement contre les violations des règles susceptibles d’aboutir à des analyses erronées. Il est
fortement recommandé de rechercher des informations complémentaires dans les guides spécifiques (par exemple tels
qu’indiqués en Référence [8]) ou de prendre contact avec un statisticien.
10.2 Essais à une seule concentration
10.2.1 Effets pour des données quantales
Dans un essai relatif à des données quantales, chaque organisme présente un effet ou ne présente pas d’effet.
L’effet est binaire. Binaire et quantal sont synonymes. L’effet peut être létal ou sublétal (par exemple un ver
meurt ou vit ou bien présente ou non une réaction d’évitement). Par conséquent, les essais sont basés sur
la proportion d’organismes présentant l’effet, après exposition à une concentration déterminée du matériau
soumis à essai pendant une période définie. Les résultats pour les données quantales suivent une loi binomiale
qui détermine le choix des tests statistiques appropriés.
La mortalité est le critère d’effet le plus courant dans les essais à une seule concentration et les données
obtenues sont quantales. Un essai peut évaluer la mortalité des vers de terre exposés à un sol contaminé non
dilué. Le choix du test statistique approprié dépend de la conception de l’essai. Cette dernière peut comprendre
un seul échantillon sans répétition et un témoin ou l’utilisation de réplicats prélevés sur le terrain à un même
endroit, c’est-à-dire plusieurs échantillons prélevés en même temps et au même endroit. Dans les deux cas,
le test exact de Fisher est le premier choix recommandé. Si des échantillons uniques de sol provenant de
plusieurs localisations sont soumis à essai à une seule concentration avec un témoin, il n’existe aucune
possibilité de test statistique. Une telle étude est simplement exploratoire, et peut éventuellement conduire à un
échantillonnage supplémentaire et des essais avec répétition. Si des réplicats sont prélevés sur le terrain,
...