ISO 23349:2020
(Main)Animal and vegetable fats and oils — Determination of sterols and stanols in foods and dietary supplements containing added phytosterols
Animal and vegetable fats and oils — Determination of sterols and stanols in foods and dietary supplements containing added phytosterols
This document specifies a reference method for the determination of free sterols/stanols and steryl/stanol esters (0,1 % to 97 % mass fraction) in foods and dietary supplements containing added phytosterols and in phytosterol food additive concentrates. Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this document. This method does not apply to matrices that contain rice bran oil at concentrations of more than 20 % due to possible interferences in the gas chromatogram.
Corps gras d'origines végétale et animale — Dosage des stérols et des stanols dans les aliments et les compléments alimentaires contenant des phytostérols ajoutés
Le présent document spécifie une méthode de référence pour le dosage des stérols/stanols libres et des esters de stérols/stanols (0,1 % à 97 % de fraction massique) dans les aliments et les compléments alimentaires contenant des phytostérols ajoutés et dans les additifs alimentaires concentrés en phytostérols. Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du domaine d'application du présent document. Cette méthode ne s'applique pas aux matrices d'une teneur supérieure à 20 % en huile de son de riz en raison des interférences éventuelles dans le chromatogramme en phase gazeuse.
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STANDARD 23349
First edition
2020-01
Animal and vegetable fats and oils —
Determination of sterols and stanols
in foods and dietary supplements
containing added phytosterols
Corps gras d'origines végétale et animale — Dosage des stérols et des
stanols dans les aliments et les compléments alimentaires contenant
des phytostérols ajoutés
Reference number
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Published in Switzerland
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ISO 23349:2020(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus . 2
7 Sampling . 4
8 Test portion . 4
9 Procedure. 4
9.1 Selection of analysis protocol . 4
9.2 Dilute and shoot protocol . 4
9.3 15 min and 120 min alkaline protocols . 5
9.4 45 min acid/15 min alkaline protocol . 5
10 Gas chromatography . 6
11 Peak identification . 6
12 Calculations. 7
13 Quality control/quality assurance . 8
14 Precision . 8
Annex A (normative) Reference gas chromatograms . 9
Annex B (informative) Results of the interlaboratory test .13
Bibliography .30
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ISO 23349:2020(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
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This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11,
Animal and vegetable fats and oils.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
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ISO 23349:2020(E)
Introduction
Plant sterols and plant stanols, collectively referred to as phytosterols, are increasingly recognized
for their role in reducing the risk of coronary heart disease by lowering serum total and low-density
lipoprotein cholesterol. Because of these potential health benefits, health claim regulations authorizing
the addition of phytosterols and phytosterol esters to foods and dietary supplements now exist in
countries throughout Europe, North and South America, Asia, New Zealand and Australia.
This document was developed in response to the worldwide demand for a reference method for
quantifying total and individual phytosterols in foods and dietary supplements containing added
phytosterols, and in the phytosterol food additive concentrates used to prepare such products. This
[1]
reference method is based on the single-laboratory validated methods of Clement et al. and Srigley
[2]
and Haile for the preparation and gas chromatographic separation of phytosterol trimethylsilyl ether
derivatives, respectively.
In 2016 to 2017, an international collaborative study co-organized by the United States Food and Drug
Administration (FDA), Cargill (USA) and the American Oil Chemists’ Society (AOCS) was carried out to
evaluate the performance of this method for the determination of total and individual phytosterols in
[3]
foods, dietary supplements and phytosterol concentrates. A total of 14 laboratories from 6 countries
successfully completed the analysis of 18 test materials, upon which the method was approved as AOCS
[4]
Official Method Ce 12-16 .
This reference method is appropriate for the determination of the five major phytosterols (i.e.
campesterol, campestanol, stigmasterol, β-sitosterol and sitostanol) that are the subject of FDA’s health
[5]
claim regulation for phytosterols and the reduced risk of coronary heart disease .
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 23349:2020(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
sterols and stanols in foods and dietary supplements
containing added phytosterols
1 Scope
This document specifies a reference method for the determination of free sterols/stanols and steryl/
stanol esters (0,1 % to 97 % mass fraction) in foods and dietary supplements containing added
phytosterols and in phytosterol food additive concentrates.
Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this
document. This method does not apply to matrices that contain rice bran oil at concentrations of more
than 20 % due to possible interferences in the gas chromatogram.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Principle
Free sterols/stanols and saponified steryl/stanol esters are derivatized to phytosterol trimethylsilyl
(TMS) ethers and separated on a capillary gas chromatography column.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade.
WARNING — Attention is drawn to regulations that specify the handling of hazardous substances.
Technical, organizational and personal safety measures shall be followed. A chemical fume hood
shall be used for the work.
5.1 Pyridine.
5.2 N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide +1 % trimethylchlorosilane (BSTFA).
5.3 Internal standard dissolving solvent, toluene (recommended) or ethyl acetate.
5.4 Methanol.
5.5 Sodium hydroxide, pellets, of purity ≥ 97 %.
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ISO 23349:2020(E)
5.6 Sodium hydroxide solution, 2,3 N.
Weigh 92 g of sodium hydroxide (5.5) into a 1 000 ml volumetric flask (6.14). Add a stir bar (6.20) and
750 ml of methanol (5.4). Place the flask on a magnetic stirrer (6.21) to disperse. Dilute to the mark
with methanol, and invert to mix. The sodium hydroxide solution shall be stirred each time before use
because it will settle out with time.
5.7 Hydrochloric acid, 3,0 N.
5.8 Epicoprostanol (5β-cholestan-3α-ol), of purity > 95 %.
5.9 Epicoprostanol internal standard (IS) solution, 5 mg/ml.
Accurately weigh 5,0 g of epicoprostanol (5.8) into a glass weighing scoop (6.8). Transfer the
epicoprostanol to a 1 000 ml volumetric flask (6.14). Rinse the scoop with internal standard dissolving
solvent (5.3) into the flask. Dilute to the mark with toluene or ethyl acetate and invert to mix. The
epicoprostanol IS solution of concentration 5 mg/ml is used for sterol/stanol concentrates, steryl/
stanol ester concentrates and some dietary supplements.
5.10 Epicoprostanol internal standard (IS) solution, 2 mg/ml.
Accurately weigh 2,0 g of epicoprostanol (5.8) into a glass weighing scoop (6.8). Transfer the
epicoprostanol to a 1 000 ml volumetric flask (6.14). Rinse the scoop with internal standard dissolving
solvent (5.3) into the flask. Dilute to the mark with toluene or ethyl acetate and invert to mix. The
epicoprostanol IS solution of concentration 2 mg/ml is used for analysis of foods and some dietary
supplements.
5.11 Phytosterols, mixture of soya sterols, gas chromatography reference standard.
5.12 Sodium sulfate, anhydrous, granular, of purity ≥ 99 %.
5.13 Sodium chloride, crystalline, of purity ≥ 99 %.
5.14 Sodium chloride solution, saturated.
Weigh approximately 400 g of sodium chloride (5.13) into a storage bottle (6.15). Dilute with 1 000 ml
of deionized water.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Gas-liquid chromatograph, equipped with flame ionization detector and capillary split
injection system.
6.2 Carrier gas, hydrogen (recommended) or helium, of purity ≥ 99,99 % pure or better, gas
chromatography quality, dried, oxygen removed by suitable filters (< 0,1 mg/kg), free from organic
impurities.
6.3 Other gases, nitrogen, hydrogen and synthetic air, of gas chromatography quality and
purity ≥ 99,99 %.
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6.4 Capillary column, with a stationary phase that has been successfully employed to perform the
separation of phytosterol TMS ethers.
The use of a bonded (5 %-phenyl)-methylpolysiloxane stationary phase column, such as the HP-5, of
length 30 m, internal diameter 0,32 mm and film thickness 0,25 μm, is recommended. The use of a
non-bonded (5 %-phenyl)(1 %-vinyl)-methylpolysiloxane stationary phase column, such as the SE-54,
of length 30 m, internal diameter 0,32 mm and film thickness 0,25 μm, is also appropriate.
6.5 Injection port split liner, tapered, deactivated, of length 78,5 mm, internal diameter 4 mm and
outer diameter 6,3 mm, with glass wool.
6.6 Microsyringe, of capacity 10 μl, with hardened needle for gas chromatography.
6.7 Sample preparation system, suitable for performing saponification and acid hydrolysis
procedures, and equipped with the following.
6.7.1 Round bottom flasks, of capacity 50 ml, with 24/40 joints.
6.7.2 Flask neck sleeves, polytetrafluoroethylene (PTFE), size 24/40.
6.7.3 Glass stoppers, full-length, size 24/40.
6.7.4 Hot plate, explosion-proof.
6.7.5 Condensers, water-cooled.
6.8 Glass weighing scoops, suitable for the test portion and insertion into volumetric flasks (6.14).
6.9 Analytical balance, of readability 0,000 1 g and weighing accuracy 0,001 g.
6.10 Spatulas, PFTE-coated.
6.11 Volumetric pipette, of capacities 5 ml, 40 ml and 50 ml, class A, with aspiration bulb.
6.12 Pipette or automatic pipette, of capacities 1 ml and 10 ml, with pipette tips.
6.13 Pasteur pipettes, of length 150 mm, with aspiration bulb.
6.14 Volumetric flasks, of capacities 100 ml and 1 000 ml, class A.
6.15 Storage bottle, of capacity 1 000 ml, glass or polymethylpentene, with screw cap.
6.16 Glass tubes, of length 100 mm and outer diameter 13 mm, with PTFE-lined screw caps.
6.17 Autosampler vials, of capacity 2 ml, amber, with PTFE-lined caps.
6.18 Vortex mixer.
6.19 Boiling chips.
6.20 Stir bar and stir bar remover tool.
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6.21 Magnetic stirrer.
7 Sampling
Treat the sample as needed (e.g. cryogrind, homogenize or shake) to obtain a homogeneous composite.
Refer to the appropriate International Standard for the matrix concerned.
8 Test portion
Use Table 1 to select the appropriate test portion size and concentration of IS solution based on the
estimated content of total phytosterols in the sample.
Table 1 — Guidelines for determining the sample test portion size and concentration of IS
solution
Phytosterol Test portion IS concentration IS added
concentration
Sample type
% (mass fraction) mg mg/ml mg
Sterol/stanol
> 90 50 5 25
concentrates
Steryl/stanol ester
concentrates, ~50 100 5 25
dietary supplements
Foods and dietary
~20 250 5 25
supplements
Food and dietary
~10 500 5 25
supplements
Food and dietary
< 10 1 000 2 10
supplements
9 Procedure
9.1 Selection of analysis protocol
For new formulations (phytosterol type and matrix), determine the optimal protocol by triplicate
analysis according to the following protocols: a) 120 min alkaline, b) 15 min alkaline and c) 45 min
acid/15 min alkaline. Select the protocol that produces the highest phytosterol recovery and lowest
variability. Further refine this protocol, as needed, by decreasing the saponification time from 120 min
to 60 min to 30 min, or the acid hydrolysis time from 45 min to 30 min to 15 min, with triplicate analyses
for each. The optimal protocol will show a repeatability coefficient of variation (C ) of less than 5 % for
V,r
triplicate analyses over a period of five days of testing.
The 120 min alkaline protocol is appropriate for the analysis of most foods and dietary supplements
containing added phytosterols. The 45 min acid/15 min alkaline protocol can be required for complete
liberation of phytosterol esters from certain matrices, such as some cereals.
9.2 Dilute and shoot protocol
Use this protocol for sterol/stanol concentrates and phytosterol reference standards.
a) Accurately weigh 50 mg of sample into a tared glass tube (6.16). Record the exact weight.
b) Add 5,00 ml of 5 mg/ml epicoprostanol IS solution (5.9). Cap tightly and vortex (6.18) to mix.
c) Add 0,5 ml of pyridine (5.1) and 1 ml of BSTFA (5.2). Cap tightly and vortex (6.18) to mix. Heating
can be required because some concentrates are pellets that fail to dissolve at room temperature.
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d) Transfer 300 μl of derivatized sample solution, 1 ml of toluene or ethyl acetate (5.3) and 25 mg
of sodium sulfate (5.12) to an autosampler vial (6.17). Cap tightly and vortex (6.18) to mix. The
sample is now ready for gas chromatographic separation (see Clause 10).
9.3 15 min and 120 min alkaline protocols
Use this protocol for most foods, dietary supplements and steryl/stanol ester concentrates.
a) Accurately weight the test portion into a tarred round bottom flask (6.7.1). Record the exact weight.
b) Add a few boiling chips (6.19) and place a PTFE sleeve (6.7.2) in the neck of the flask.
c) Add 5,00 ml of the appropriate epicoprostanol IS solution (5.9 or 5.10).
d) Add 5 ml of sodium hydroxide solution (5.6).
e) Boil the sample at 100 °C for 15 min or 120 min (see 9.1).
f) Remove the flask from the heat source, insert a stopper (6.7.3) and let cool to room temperature.
g) Add 7 ml of hydrochloric acid (5.7), insert a stopper (6.7.3) and shake to mix.
h) Add 40 ml of sodium chloride solution (5.14), insert a stopper (6.7.3) and shake to mix. Allow the
two phases to separate. Wait until the cloudy organic phase is clear before proceeding.
i) Transfer 300 μl of organic phase and 25 mg of sodium sulfate (5.12) to an autosampler vial (6.17).
j) Add 0,5 ml of pyridine (5.1) and 1 ml of BSTFA (5.2). Cap tightly and vortex (6.18) to mix. The
sample is now ready for gas chromatographic separation (see Clause 10).
9.4 45 min acid/15 min alkaline protocol
Use this protocol for some foods and dietary supplements containing added phytosterol esters. Acid
hydrolysis prior to saponification is needed for the complete liberation of phytosterol esters from
certain matrices, such as some cereals (see 9.1).
a) Accurately weight the test portion into a tarred round bottom flask (6.7.1). Record the exact weight.
b) Add a few boiling chips (6.19) and place a PTFE sleeve (6.7.2) in the neck of the flask.
c) Add 5 ml of hydrochloric acid (5.7).
d) Add 5,00 ml of the appropriate epicoprostanol IS solution (5.9 or 5.10).
e) Boil the sample at 100 °C for 45 min.
f) Remove the flask from the heat source, insert a stopper (6.7.3) and let cool to room temperature.
g) Add 40 ml of sodium chloride solution (5.14), insert a stopper (6.7.3) and shake to mix. Allow the
two phases to separate.
h) Transfer the organic phase (as much as possible without disrupting the solids on the surface) to a
new round bottom flask (6.7.1).
i) Add 5 ml of sodium hydroxide solution (5.6).
j) Boil the sample at 100 °C for 15 min.
k) Remove the flask from the heat source, insert a stopper (6.7.3) and let cool to room temperature.
l) Add 7 ml of hydrochloric acid (5.7), insert a stopper (6.7.3) and shake to mix.
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ISO 23349:2020(E)
m) Add 40 ml of sodium chloride solution (5.14), insert a stopper (6.7.3) and shake to mix. Allow the
two phases to separate. Wait until the cloudy organic phase is clear before proceeding.
n) Transfer 300 μl of organic phase and 25 mg of sodium sulfate (5.12) to an autosampler vial (6.17).
o) Add 0,5 ml of pyridine (5.1) and 1 ml of BSTFA (5.2). Cap tightly and vortex (6.18) to mix. The
sample is now ready for gas chromatographic separation (see Clause 10).
10 Gas chromatography
Operating conditions are as follows.
a) Injection port temperature: 290 °C.
b) Detector temperature: 290 °C.
c) Oven temperature: 250 °C for 60 min, ramp at 15 °C/min to 265 °C, hold for 7 min.
d) Post-run temperature: 250 °C for 3 min.
e) Carrier gas (6.2): hydrogen or helium, 1,0 ml/min, constant flow rate.
f) Detector gases (6.3): air, 400 ml/min, hydrogen, 30 ml/min.
g) Makeup gas (6.3): nitrogen, 30 ml/min.
h) Split ratio: 25:1.
i) Injection volume: 1,0 μl.
j) Phytosterol concentration: 10 mg/ml.
11 Peak identification
Identify phytosterol TMS ethers by retention time (see Table 2) and by comparison with reference
chromatograms (see Figures A.1 to A.4). Peaks of unknown identity should be omitted from the
summation of peak areas, unless they are confirmed to be phytosterols.
Samples containing added plant stanols and stanol esters require special attention during peak
identification and integration. Refer to Figure A.4 when analysing samples known to contain high
concentrations of plant stanols.
Table 2 — Elution order and theoretical correction factors (TCFs) for sterols and stanols
commonly found in foods and dietary supplements containing added phytosterols
Retention time Relative retention time
a b
Peak # Compound TCF
min min
1 Epicoprostanol 25,3 1,00 1,000 0
2 Cholesterol 30,5 1,21 0,995 6
3 Brassicasterol 33,7 1,33 0,988 7
4 Ergosterol 37,8 1,49 0,984 5
24-Methylene
5 38,3 1,51 0,988 7
cholesterol
a
Peak numbers are used in Figures A.1 to A.4. Peaks corresponding to cholesterol and ergosterol are not included in the
quantitation of total phytosterols.
b
TCFs were calculated relative to epicoprostanol TMS ether, which had a factor of 1,000 0. Atomic weights were as
follows: carbon, 12,011; hydrogen, 1,007 9; oxygen, 15,999 4; silicon, 28,085 5. TCFs account for the proportion of active
[6]
carbon atoms contributing to the response of the flame ionization detector .
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Table 2 (continued)
Retention time Relative retention time
a b
Peak # Compound TCF
min min
6 Campesterol 39,1 1,55 0,993 0
7 Campestanol 39,9 1,58 0,997 2
8 Stigmasterol 42,0 1,66 0,986 4
9 Δ22-Stigmastenol 43,0 1,70 0,990 5
10 Δ7-Campesterol 44,4 1,75 0,993 0
Clerosterol +
11 46,3 1,83 0,986 4
Δ5,23-Stigmastadienol
12 β-Sitosterol 48,1 1,90 0,990 5
13 Sitostanol 49,0 1,94 0,994 6
14 Δ5-Avenasterol 50,0 1,98 0,986 4
15 Fucosterol + unidentified 53,0 2,09 0,986 4
16 Δ7-Stigmastenol 54,8 2,17 0,990 5
17 Δ7-Avenasterol 57,0 2,25 0,986 4
a
Peak numbers are used in Figures A.1 to A.4. Peaks corresponding to cholesterol and ergosterol are not included in the
quantitation of total phytosterols.
b
TCFs were calculated relative to epicoprostanol TMS ether, which had a factor of 1,000 0. Atomic weights were as
follows: carbon, 12,011; hydrogen, 1,007 9; oxygen, 15,999 4; silicon, 28,085 5. TCFs account for the proportion of active
[6]
carbon atoms contributing to the response of the flame ionization detector .
12 Calculations
12.1 Calculate the mass of individual phytosterols (in mg) in a test sample by using Formula (1):
mA=×mF× ÷A (1)
()
PSxxPS IS TC IS
where
m is the mass of phytosterol x;
PSx
A is the area count for phytosterol x;
PSx
m is the mass of epicoprostanol IS (in mg, corrected for purity) added to the test sample;
IS
F is the theoretical correction factor for phytosterol x (see Table 2);
TC
A is the area count for epicoprostanol IS.
IS
12.2 Calculate the concentration of individual phytosterols (in percentage) in a test sample by using
Formula (2):
Cm=÷m ×100 (2)
()
PSxxPS TS
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where
C is the concentration of phytosterol x;
PSx
m is the mass (in mg) of phytosterol x;
PSx
m is the mass (in mg) of the test sample.
TS
12.3 Calculate the concentration of total phytosterols in a test sample (% mass fraction) by using
Formula (3):
Cm=∑ ÷m ×100 (3)
()
PStxPS TS
where
C is the concentration of total phytosterols t;
PSt
Σm is the sum of the mass (in mg) of all phytosterols identified in a test sample
PSx
(cholesterol and ergosterol are not included in the quantitation of total phytosterols);
m is the mass (in mg) of the test sample.
TS
13 Quality control/quality assurance
13.1 Verify acceptable chromatographic separations by analysing the phytosterol reference standard.
Ensure that a baseline resolution is achieved between peaks corresponding to campesterol and
campestanol, and β-sitosterol and sitostanol. Decrease the flow rate of the H carrier gas (e.g. by 0,05 ml/
2
min to 0,1 ml/min) if a greater resolution is needed.
13.2 Perform a spike-recovery experiment to verify the accuracy of the method for determining
phytosterols in the subject sample matrix. Prepare the spiked sample by adding a known amount of
stigmasterol to the subject sample and analyse according to the appropriate sample preparation protocol.
Calculate the recovery of stigmasterol by determining the analysed content, taken as a proportion of the
spiked content and corrected for any incurred amount in the sample.
13.3 Analyse a blank matrix sample to verify the absence of interferences in the analysis due to matrix,
reagents or equipment used. Confirm that the chromatogram of the blank matrix sample is devoid of
peaks eluting in the region in which phytosterols elute (i.e. 23 min to 60 min).
13.4 A standard reference material has yet to be created for food and dietary supplement samples
containing added phytosterols.
14 Precision
Results of the international collaborative study carried out to evaluate the performance of this reference
method are presented in Annex B.
8 © ISO 2020 – All rights reserved
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Annex A
(normative)
Reference gas chromatograms
Figure A.1 gives an example of a typical partial gas chromatogram of phytosterol TMS ethers derived
from a phytosterol reference standard (5.11).
Key
X min 9 Δ22-stigmastenol
Y pA 10 Δ7-campesterol
1 epicoprostanol (IS) 11 clerosterol + Δ5,23-stigmastadienol
2 cholesterol 12 β-sitosterol
3 brassicasterol 13 sitostanol
4 ergosterol 14 Δ5-avenasterol
5 24-methylene cholesterol 15 fucosterol + unidentified
6 campesterol 16 Δ7-stigmastenol
7 campestanol 17 Δ7-avenasterol
8 stigmasterol
Figure A.1 — Typical partial gas chromatogram from a phytosterol reference standard
© ISO 2020 – All rights reserved 9
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ISO 23349:2020(E)
Figure A.2 gives an example of a typical partial gas chromatogram of phytosterol TMS ethers derived
from a vegetable spread containing added plant sterol esters.
Key
X min 9 Δ22-stigmastenol
Y pA 10 Δ7-campesterol
1 epicoprostanol (IS) 11 clerosterol + Δ5,23-stigmastadienol
2 cholesterol 12 β-sitosterol
3 brassicasterol 13 sitostanol
4 ergosterol 14 Δ5-avenasterol
5 24-methylene cholesterol 15 fucosterol + unidentified
6 campesterol 16 Δ7-stigmastenol
7 campestanol 17 Δ7-avenasterol
8 stigmasterol
Figure A.2 — Typical partial gas chromat
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23349
Première édition
2020-01
Corps gras d'origines végétale et
animale — Dosage des stérols et
des stanols dans les aliments et les
compléments alimentaires contenant
des phytostérols ajoutés
Animal and vegetable fats and oils — Determination of sterols
and stanols in foods and dietary supplements containing added
phytosterols
Numéro de référence
ISO 23349:2020(F)
©
ISO 2020
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ISO 23349:2020(F)
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Publié en Suisse
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ISO 23349:2020(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 1
6 Appareillage . 2
7 Échantillonnage . 4
8 Prise d’essai . 4
9 Mode opératoire. 4
9.1 Sélection du protocole d’analyse . 4
9.2 Protocole de dilution et d’injection . 5
9.3 Protocoles alcalins de 15 min et 120 min . 5
9.4 Protocole acide de 45 min/alcalin de 15 min . 6
10 Chromatographie en phase gazeuse . 6
11 Identification des pics . 7
12 Calculs . 8
13 Contrôle qualité/assurance qualité . 8
14 Fidélité . 9
Annexe A (normative) Chromatogrammes en phase gazeuse de référence .10
Annexe B (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires .14
Bibliographie .32
© ISO 2020 – Tous droits réservés iii
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ISO 23349:2020(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2020 – Tous droits réservés
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ISO 23349:2020(F)
Introduction
Les stérols et stanols végétaux, collectivement désignés phytostérols, jouissent d’une reconnaissance
croissante pour leur rôle dans la réduction du risque de maladie coronarienne en diminuant le
cholestérol total sérique et le cholestérol à lipoprotéines de basse densité. Ces bienfaits potentiels sur la
santé ont contribué à l’émergence de réglementations relatives aux allégations de santé qui autorisent
l’ajout de phytostérols et d’esters de phytostérols aux aliments et compléments alimentaires dans
des pays à travers l’Europe, l’Amérique du Nord et du Sud et l’Asie, ainsi qu’en Nouvelle-Zélande et en
Australie.
Le présent document a été élaboré en réponse à la demande mondiale d’une méthode de référence
pour la quantification des phytostérols totaux et individuels dans les aliments et les compléments
alimentaires contenant des phytostérols ajoutés ainsi que les additifs alimentaires concentrés en
phytostérols utilisés dans la préparation de ces produits. Cette méthode de référence s’appuie sur
[1] [2]
les méthodes validées dans un seul laboratoire de Clement et al. et de Srigley et Haile pour la
préparation et la séparation par chromatographie en phase gazeuse des dérivés de triméthylsilyléthers
de phytostérols, respectivement.
En 2016–2017, une étude interlaboratoires internationale, co-organisée par la United States Food et
Drug Administration (FDA), Cargill (USA), et l’American Oil Chemists’ Society (AOCS), a été menée
pour évaluer les performances de cette méthode pour le dosage des phytostérols totaux et individuels
[3]
dans les aliments et les compléments alimentaires ainsi que les concentrés de phytostérols. Au total,
14 laboratoires de six pays ont procédé avec succès à l’analyse de 18 matériaux d’essai, à la suite de quoi
[4]
la méthode a été approuvée comme méthode officielle Ce 12-16 de l’AOCS .
Cette méthode de référence convient pour le dosage de cinq phytostérols majeurs (à savoir le
campestérol, le campestanol, le stigmastérol, le β-sitostérol et le sitostanol) qui sont soumis à la
réglementation de la FDA relative aux allégations de santé impliquant les phytostérols et le risque
[5]
réduit de maladie coronarienne .
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NORME INTERNATIONALE ISO 23349:2020(F)
Corps gras d'origines végétale et animale — Dosage des
stérols et des stanols dans les aliments et les compléments
alimentaires contenant des phytostérols ajoutés
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de référence pour le dosage des stérols/stanols libres et
des esters de stérols/stanols (0,1 % à 97 % de fraction massique) dans les aliments et les compléments
alimentaires contenant des phytostérols ajoutés et dans les additifs alimentaires concentrés en
phytostérols.
Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du
domaine d’application du présent document. Cette méthode ne s’applique pas aux matrices d’une teneur
supérieure à 20 % en huile de son de riz en raison des interférences éventuelles dans le chromatogramme
en phase gazeuse.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ .
4 Principe
Les stérols/stanols libres et les esters de stérols/stanols saponifiés sont dérivés en triméthylsilyléthers
de phytostérols (TMS) et séparés à l’aide d’une colonne capillaire de chromatographie en phase gazeuse.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
AVERTISSEMENT — L’attention est attirée sur les règlements qui régissent la manipulation des
substances dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et du
personnel doivent être suivies. Une hotte de chimie doit être utilisée pour les travaux.
5.1 Pyridine
5.2 N,O-Bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide +1 % triméthylchlorosilane (BSTFA).
5.3 Solvant de dissolution pour l’étalon interne, toluène (recommandé) ou acétate d’éthyle.
5.4 Méthanol.
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ISO 23349:2020(F)
5.5 Hydroxyde de sodium, granules, d’une pureté ≥ 97 %.
5.6 Solution d’hydroxyde de sodium, 2,3 N.
Peser 92 g d’hydroxyde de sodium (5.5) dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.14). Ajouter un barreau
d’agitation (6.20) et 750 ml de méthanol (5.4). Placer la fiole sur un agitateur magnétique (6.21) pour
procéder à la dispersion. Diluer jusqu’au volume avec du méthanol et retourner la fiole pour mélanger.
La solution d’hydroxyde de sodium doit être agitée à nouveau avant emploi, car elle se décante au fil
du temps.
5.7 Acide chlorhydrique, 3,0 N.
5.8 Épicoprostanol (5β-cholestan-3α-ol), d’une pureté > 95 %.
5.9 Solution d’étalon interne (EI) d’épicoprostanol, 5 mg/ml.
Peser précisément 5,0 g d’épicoprostanol (5.8) dans une nacelle de pesée en verre (6.8). Transférer
l’épicoprostanol dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.14). Rincer la nacelle avec du solvant de dissolution
pour l’étalon interne (5.3) et verser dans la fiole. Diluer jusqu’au volume avec du toluène ou de l’acétate
d’éthyle et retourner la fiole pour mélanger. La solution d’EI d’épicoprostanol d’une concentration de
5 mg/ml est utilisée pour l’analyse des concentrés de stérols/stanols, des concentrés d’esters de stérols/
stanols et de certains compléments alimentaires.
5.10 Solution d’étalon interne (EI) d’épicoprostanol, 2 mg/ml.
Peser précisément 2,0 g d’épicoprostanol (5.8) dans une nacelle de pesée en verre (6.8). Transférer
l’épicoprostanol dans une fiole jaugée de 1 000 ml (6.14). Rincer la nacelle avec du solvant de dissolution
pour l’étalon interne (5.3) et verser dans la fiole. Diluer jusqu’au volume avec du toluène ou de l’acétate
d’éthyle et retourner la fiole pour mélanger. La solution d’EI d’épicoprostanol d’une concentration de
2 mg/ml est utilisée pour l’analyse des aliments et de certains compléments alimentaires.
5.11 Phytostérols, mélange de stérols de soja, étalon de référence pour la chromatographie en phase
gazeuse.
5.12 Sulfate de sodium, anhydre, granules, d’une pureté ≥ 99 %.
5.13 Chlorure de sodium, cristallin, d’une pureté ≥ 99 %.
5.14 Solution de chlorure de sodium, saturée.
Peser environ 400 g de chlorure de sodium (5.13) dans un flacon de stockage (6.15). Diluer avec
1 000 ml d’eau déionisée.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire, et notamment ce qui suit.
6.1 Système de chromatographie en phase gazeuse, équipé d’un détecteur à ionisation de flamme
et d’un système d’injection capillaire à diviseur de flux.
6.2 Gaz vecteur, hydrogène (recommandé) ou hélium, d’une pureté ≥ 99,99 %, de qualité
chromatographie en phase gazeuse, séché, l’oxygène ayant été éliminé à l’aide de filtres adaptés (<0,1 mg/
kg), exempt d’impuretés organiques.
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ISO 23349:2020(F)
6.3 Autres gaz, azote, hydrogène et air synthétique, de qualité chromatographie en phase gazeuse et
d’une pureté ≥ 99,99 %.
6.4 Colonne capillaire, avec une phase stationnaire qui permet de réaliser une séparation satisfaisante
des triméthylsilyléthers de phytostérols (TMS).
L’utilisation d’une colonne à phase stationnaire greffée de (5 %-phényl)-méthylpolysiloxane, telle
qu’une colonne HP-5, d’une longueur de 30 m, d’un diamètre interne de 0,32 mm et d’une épaisseur
de film de 0,25 μm, est recommandée. L’utilisation d’une colonne à phase stationnaire non greffée de
(5 %-phényl)(1 %-vinyl)-méthylpolysiloxane, telle qu’une colonne SE-54, d’une longueur de 30 m, d’un
diamètre interne de 0,32 mm et d’une épaisseur de film de 0,25 μm est aussi appropriée.
6.5 Insert d’injecteur à débit divisé, conique, désactivé, d’une longueur de 78,5 mm, d’un diamètre
interne de 4 mm et d’un diamètre externe de 6,3 mm, avec laine de verre.
6.6 Microseringue, d’une capacité de 10 μl, dotée d’une aiguille renforcée pour la chromatographie en
phase gazeuse.
6.7 Système de préparation d’échantillons, adapté aux modes opératoires d’hydrolyse acide et de
saponification et équipé des composants suivants.
6.7.1 Ballons à fond rond, d’une capacité de 50 ml, dotés de rodages 24/40.
6.7.2 Manchons pour col de ballon, polytétrafluoroéthylène (PTFE), taille 24/40.
6.7.3 Bouchons en verre, pleine longueur, taille 24/40.
6.7.4 Plaque chauffe-ballon, antidéflagrante.
6.7.5 Condenseurs, avec refroidissement à eau.
6.8 Nacelles de pesée en verre, adaptées à la prise d’essai, à insérer dans les fioles jaugées (6.14).
6.9 Balance analytique, d’une précision d’affichage de 0,000 1 g et d’une exactitude de pesée de
0,001 g.
6.10 Spatules, avec revêtement en PFTE.
6.11 Pipettes jaugées, d’une capacité de 5 ml, 40 ml et 50 ml, classe A, avec poire d’aspiration.
6.12 Pipette ou pipette automatique, d’une capacité de 1 ml et de 10 ml, avec embouts de pipette.
6.13 Pipettes Pasteur, d’une longueur de 150 mm, avec poire d’aspiration.
6.14 Fioles jaugées, d’une capacité de 100 ml et de 1 000 ml, classe A.
6.15 Flacon de stockage, d’une capacité de 1 000 ml, en verre ou en polyméthylpentène, avec
bouchon à vis.
6.16 Tubes à essai en verre, d’une longueur de 100 mm et d’un diamètre extérieur de 13 mm, avec
bouchons à vis et revêtement en PTFE.
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ISO 23349:2020(F)
6.17 Flacons pour passeur d’échantillons, d’une capacité de 2 ml, ambrés, avec bouchons avec
revêtement en PTFE.
6.18 Agitateur de type vortex.
6.19 Granulés régulateurs d’ébullition.
6.20 Barreau d’agitation et récupérateur de barreau d’agitation.
6.21 Agitateur magnétique.
7 Échantillonnage
Traiter l’échantillon tel que nécessaire (par exemple, cryobroyage, homogénéisation ou agitation) pour
obtenir un matériau composite homogène. Se reporter à la Norme internationale appropriée pour la
matrice concernée.
8 Prise d’essai
Se reporter au Tableau 1 pour sélectionner la taille de prise d’essai appropriée et la concentration de la
solution d’EI en fonction de la teneur estimée en phytostérols totaux dans l’échantillon.
Tableau 1 — Lignes directrices pour la détermination de la taille de la prise d’essai et de la
concentration de la solution d’EI
Teneur en phytostérols Prise d’essai Concentration de l’EI EI ajouté
Type d’échantillon
% (fraction massique) mg mg/ml mg
Concentrés de stérols/
> 90 50 5 25
stanols
Concentrés d’esters
de stérols/stanols,
~50 100 5 25
compléments
alimentaires
Aliments et
compléments ~20 250 5 25
alimentaires
Aliments et
compléments ~10 500 5 25
alimentaires
Aliments et
compléments < 10 1 000 2 10
alimentaires
9 Mode opératoire
9.1 Sélection du protocole d’analyse
Pour des formulations inconnues (matrice et type de phytostérols), déterminer le protocole optimal
par triple analyse conformément aux protocoles suivants: a) alcalin de 120 min, b) alcalin de 15 min
et c) acide de 45 min/alcalin de 15 min. Sélectionner le protocole qui produit la récupération en
phytostérols la plus élevée et la variabilité la plus faible. Affiner encore ce protocole, si nécessaire, en
diminuant la durée de saponification de 120 min à 60 min à 30 min ou la durée d’hydrolyse acide de
45 min à 30 min à 15 min, à l’aide d’une triple analyse pour chacun des paramètres. Le protocole optimal
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ISO 23349:2020(F)
présentera un coefficient de variation de répétabilité (C ) inférieur à 5 % pour les trois analyses sur
V,r
une période de cinq jours d’essai.
Le protocole alcalin de 120 min convient à l’analyse de la plupart des aliments et compléments
alimentaires contenant des phytostérols ajoutés. Le protocole acide de 45 min/alcalin de 15 min peut
être requis pour une libération complète des esters de phytostérols de certaines matrices, telles que
certaines céréales.
9.2 Protocole de dilution et d’injection
Utiliser ce protocole pour les concentrés de stérols/stanols et les étalons de référence de phytostérols.
a) Peser précisément 50 mg d’échantillon dans un tube à essai taré en verre (6.16). Consigner la
masse exacte.
b) Ajouter 5,00 ml de solution d’EI d’épicoprostanol à 5 mg/ml (5.9). Fermer le tube à essai de manière
hermétique et mélanger avec un agitateur de type vortex (6.18).
c) Ajouter 0,5 ml de pyridine (5.1) et 1 ml de BSTFA (5.2). Fermer le tube à essai de manière hermétique
et mélanger avec un agitateur de type vortex (6.18). Il peut être requis de chauffer le tube, car
certains concentrés sont fournis sous forme de granulés, qui ne se dissolvent pas à température
ambiante.
d) Transférer 300 μl de la solution échantillon dérivée, 1 ml de toluène ou d’acétate d’éthyle (5.3) et
25 mg de sulfate de sodium (5.12) dans un flacon pour passeur d’échantillons (6.17). Fermer le
flacon de manière hermétique et mélanger avec un agitateur de type vortex (6.18). L’échantillon est
maintenant prêt pour la séparation par chromatographie en phase gazeuse (voir Article 10).
9.3 Protocoles alcalins de 15 min et 120 min
Utiliser ce protocole pour la plupart des aliments, compléments alimentaires et concentrés d’esters de
stérols/stanols.
a) Peser précisément la prise d’essai dans un ballon à fond rond taré (6.7.1). Consigner la masse exacte.
b) Ajouter quelques granulés régulateurs d’ébullition (6.19) et placer un manchon en PTFE (6.7.2) dans
le col du ballon.
c) Ajouter 5,00 ml de la solution d’EI d’épicoprostanol appropriée (5.9 ou 5.10).
d) Ajouter 5 ml de solution d’hydroxyde de sodium (5.6).
e) Porter l’échantillon à ébullition à 100 °C pendant 15 min ou 120 min (voir 9.1).
f) Retirer le ballon de la source de chaleur, insérer un bouchon (6.7.3) et laisser refroidir à température
ambiante.
g) Ajouter 7 ml d’acide chlorhydrique (5.7), insérer un bouchon (6.7.3) et agiter pour mélanger.
h) Ajouter 40 ml de solution de chlorure de sodium (5.14), insérer un bouchon (6.7.3) et agiter pour
mélanger. Laisser les deux phases se séparer. Attendre jusqu’à ce que la phase organique trouble
devienne limpide avant de poursuivre.
i) Transférer 300 μl de phase organique et 25 mg de sulfate de sodium (5.12) dans un flacon pour
passeur d’échantillons (6.17).
j) Ajouter 0,5 ml de pyridine (5.1) et 1 ml de BSTFA (5.2). Fermer le flacon de manière hermétique
et mélanger avec un agitateur de type vortex (6.18). L’échantillon est maintenant prêt pour la
séparation par chromatographie en phase gazeuse (voir Article 10).
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9.4 Protocole acide de 45 min/alcalin de 15 min
Utiliser ce protocole pour certains aliments et compléments alimentaires contenant des esters de
phytostérols ajoutés. Il est nécessaire de procéder à une hydrolyse acide avant la saponification pour
garantir une libération complète des esters de phytostérols de certaines matrices, telles que certaines
céréales (voir 9.1).
a) Peser précisément la prise d’essai dans un ballon à fond rond taré (6.7.1). Consigner la masse exacte.
b) Ajouter quelques granulés régulateurs d’ébullition (6.19) et placer un manchon en PTFE (6.7.2) dans
le col du ballon.
c) Ajouter 5 ml d’acide chlorhydrique (5.7).
d) Ajouter 5,00 ml de la solution d’EI d’épicoprostanol appropriée (5.9 ou 5.10).
e) Porter l’échantillon à ébullition à 100 °C pendant 45 min.
f) Retirer le ballon de la source de chaleur, insérer un bouchon (6.7.3) et laisser refroidir à température
ambiante.
g) Ajouter 40 ml de solution de chlorure de sodium (5.14), insérer un bouchon (6.7.3) et agiter pour
mélanger. Laisser les deux phases se séparer.
h) Transférer la phase organique (sans perturber les particules solides à la surface dans la mesure du
possible) dans un nouveau ballon à fond rond (6.7.1).
i) Ajouter 5 ml de solution d’hydroxyde de sodium (5.6).
j) Porter l’échantillon à ébullition à 100 °C pendant 15 min.
k) Retirer le ballon de la source de chaleur, insérer un bouchon (6.7.3) et laisser refroidir à température
ambiante.
l) Ajouter 7 ml d’acide chlorhydrique (5.7), insérer un bouchon (6.7.3) et agiter pour mélanger.
m) Ajouter 40 ml de solution de chlorure de sodium (5.14), insérer un bouchon (6.7.3) et agiter pour
mélanger. Laisser les deux phases se séparer. Attendre jusqu’à ce que la phase organique trouble
devienne limpide avant de poursuivre.
n) Transférer 300 μl de phase organique et 25 mg de sulfate de sodium (5.12) dans un flacon pour
passeur d’échantillons (6.17).
o) Ajouter 0,5 ml de pyridine (5.1) et 1 ml de BSTFA (5.2). Fermer le flacon de manière hermétique
et mélanger avec un agitateur de type vortex (6.18). L’échantillon est maintenant prêt pour la
séparation par chromatographie en phase gazeuse (voir Article 10).
10 Chromatographie en phase gazeuse
Les conditions opératoires sont présentées ci-après:
a) température de l’injecteur: 290 °C;
b) température du détecteur: 290 °C;
c) température du four: 250 °C pendant 60 min, vitesse de chauffe de 15 °C/min jusqu’à 265 °C,
maintien pendant 7 min.;
d) température post-cycle: 250 °C pendant 3 min.;
e) gaz vecteur (6.2): hydrogène ou hélium, débit constant de 1,0 ml/min.;
f) gaz du détecteur (6.3): air, 400 ml/min, hydrogène, 30 ml/min.;
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ISO 23349:2020(F)
g) gaz d’appoint (6.3): azote, 30 ml/min;
h) rapport de division: 25:1;
i) volume d’injection: 1,0 μl;
j) concentration en phytostérols: 10 mg/ml.
11 Identification des pics
Identifier les triméthylsilyléthers de phytostérols en fonction de leur temps de rétention (Voir Tableau 2)
et par comparaison avec des chromatogrammes de référence (voir Figures A.1 à A.4). Il convient de ne
pas inclure les pics d’identité inconnue à la somme des surfaces de pics, sauf s’ils s’avèrent être des
phytostérols.
Les échantillons contenant des stanols et des esters de stanols ajoutés requièrent une attention
particulière lors de l’identification et de l’intégration des pics. Se reporter à la Figure A.4 lors de l’analyse
d’échantillons connus pour présenter des teneurs élevées de stanols végétaux.
Tableau 2 — Ordre d’élution et facteurs de correction théoriques (FCT) pour les stérols et les
stanols habituellement présents dans les aliments et les compléments alimentaires contenant
des phytostérols ajoutés
Temps de rétention Temps de rétention relatif
a b
Pic n° Composé FCT
min min
1 Épicoprostanol 25,3 1,00 1,000 0
2 Cholestérol 30,5 1,21 0,995 6
3 Brassicastérol 33,7 1,33 0,988 7
4 Ergostérol 37,8 1,49 0,984 5
24-Méthylène
5 38,3 1,51 0,988 7
cholestérol
6 Campestérol 39,1 1,55 0,993 0
7 Campestanol 39,9 1,58 0,997 2
8 Stigmastérol 42,0 1,66 0,986 4
9 Δ22-Stigmasténol 43,0 1,70 0,990 5
10 Δ7-Campestérol 44,4 1,75 0,993 0
Clérostérol + Δ5,23-
11 46,3 1,83 0,986 4
Stigmastadiénol
12 β-Sitostérol 48,1 1,90 0,990 5
13 Sitostanol 49,0 1,94 0,994 6
14 Δ5-Avénastérol 50,0 1,98 0,986 4
Fucostérol +
15 53,0 2,09 0,986 4
non identifié
16 Δ7-Stigmasténol 54,8 2,17 0,990 5
17 Δ7-Avénastérol 57,0 2,25 0,986 4
a
Les numéros des pics sont utilisés aux Figures A.1 à A.4. Les pics correspondant au cholestérol et à l’ergostérol ne sont
pas inclus dans l’analyse quantitative des phytostérols totaux.
b
Les FCT ont été calculés en fonction du triméthylsilyléther d’épicoprostanol, qui présentait un facteur de 1,000 0. Les
masses atomiques étaient les suivantes: carbone, 12,011; hydrogène, 1,007 9; oxygène, 15,999 4; silicium, 28,085 5. Les
FCT sont représentatifs de la proportion d’atomes de carbone actifs contribuant à la réponse du détecteur à ionisation de
[6]
flamme .
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ISO 23349:2020(F)
12 Calculs
12.1 Calculer la masse de chacun des phytostérols (en mg) dans un échantillon d’essai à l’aide de la
Formule (1):
mA=×()mF× ÷A (1)
PSxPSx EI CT EI
où
m est la masse du phytostérol x;
PSx
A est la surface du pic du phytostérol x;
PSx
m est la masse de l’EI d’épicoprostanol (en mg, corrigée en fonction de la pureté) ajoutée à
EI
l’échantillon d’essai;
F est le facteur de correction théorique pour le phytostérol x (voir Tableau 2);
CT
A est la surface du pic de l’EI d’épicoprostanol.
EI
12.2 Calculer la concentration de chacun des phytostérols (en pourcentage) dans un échantillon d’essai
à l’aide de la Formule (2):
Cm=÷m ×100 (2)
()
PSxPSx EE
où
C est la concentration du phytostérol x;
PSx
m est la masse (en mg) du phytostérol x;
PSx
m est la masse (en mg) de l’échantillon d’essai.
EE
12.3 C
...
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