Water quality — Enumeration of Legionella

ISO 11731:2017 specifies culture methods for the isolation of Legionella and estimation of their numbers in water samples. These methods are applicable to all kinds of water samples including potable, industrial, waste and natural waters. These methods can be used for water related matrices, e.g. biofilms, sediments, etc. Not all Legionella species are culturable; therefore, the methods described in this document do not recover all species of Legionella.

Qualité de l'eau — Dénombrement des Legionella

ISO 11731:2017 spécifie des méthodes de culture pour l'isolement des Legionella et leur dénombrement dans des échantillons d'eau. Ces méthodes sont applicables à tous les types d'échantillons d'eau, y compris les eaux potables, industrielles, usées et naturelles. Elles peuvent également être utilisées pour les matrices liées à l'eau (biofilms, sédiments, etc.). Toutes les espèces de Legionella n'étant pas cultivables, les méthodes décrites dans le présent document peuvent ne pas retrouver la totalité des espèces de Legionella.

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Published
Publication Date
11-May-2017
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Completion Date
19-Sep-2022
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ISO 11731:2017 - Water quality -- Enumeration of Legionella
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ISO 11731:2017 - Qualité de l'eau -- Dénombrement des Legionella
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11731
Second edition
2017-05
Water quality — Enumeration of
Legionella
Qualité de l’eau — Dénombrement des Legionella
Reference number
ISO 11731:2017(E)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11731:2017(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

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ii © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11731:2017(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

4.2 Examination............................................................................................................................................................................................... 2

4.3 Confirmation ............................................................................................................................................................................................. 2

5 Apparatus and glassware ............................................................................................................................................................................ 2

6 Culture media and reagents ...................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 4

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Samples ......................................................................................................................................................................................................... 4

8.2 Concentration of water samples .............................................................................................................................................. 5

8.2.1 General...................................................................................................................................................................................... 5

8.2.2 Membrane filtration and direct placing of the membrane filter on culture media 5

8.2.3 Membrane filtration followed by a washing procedure ................................................................. 5

8.3 Sample pre-treatment ....................................................................................................................................................................... 6

8.3.1 Heat treatment................................................................................................................................................................... 6

8.3.2 Acid treatment ................................................................................................................................................................... 6

8.4 Culture ............................................................................................................................................................................................................ 6

8.4.1 General...................................................................................................................................................................................... 6

8.4.2 Samples with a high concentration of Legionella species and a low

concentration of interfering microorganisms ........................................................................................ 6

8.4.3 Samples with a low concentration of Legionella species and a low

concentration of interfering microorganisms ........................................................................................ 6

8.4.4 Samples with a high concentration of interfering microorganisms .................................... 7

8.4.5 Samples with an extremely high concentration of interfering microorganisms ...... 7

8.4.6 Incubation .............................................................................................................................................................................. 7

8.4.7 Examination of the plates ......................................................................................................................................... 7

8.5 Confirmation of presumptive Legionella colonies on culture media: BCYE agar and

BCYE–cys agar ......................................................................................................................................................................................... 8

9 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 8

10 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

11 Quality assurance .............................................................................................................................................................................................10

11.1 General ........................................................................................................................................................................................................10

11.2 Performance testing of Legionella culture media .................................................................................................10

11.3 Preparing working culture and test suspension for performance testing .......................................10

Annex A (informative) Legionella species ....................................................................................................................................................12

Annex B (normative) Culture media ..................................................................................................................................................................14

Annex C (normative) Diluents ..................................................................................................................................................................................20

Annex D (normative) Acid solution.....................................................................................................................................................................21

Annex E (informative) Scraping or rubbing the bacteria from membrane filters ..............................................22

Annex F (informative) Centrifugation technique ..................................................................................................................................23

© ISO 2017 – All rights reserved iii
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ISO 11731:2017(E)

Annex G (informative) Indirect immunofluorescent antibody assay for the identification of

Legionella species .............................................................................................................................................................................................24

Annex H (informative) Performance data ....................................................................................................................................................27

Annex I (informative) Pre-treatment of water related matrices ..........................................................................................31

Annex J (normative) Decision matrix ...............................................................................................................................................................32

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................38

iv © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 11731:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,

Microbiological methods.

This second edition of ISO 11731 cancels and replaces ISO 11731:1998 and ISO 11731-2:2004, which

have been technically revised.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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ISO 11731:2017(E)
Introduction

After the first recognized outbreak of Legionnaires’ disease in 1976, the isolated bacterium was named

Legionella pneumophila. Legionellae are widely found in natural and artificial aquatic environments,

soils, composts and can cause legionellosis. Legionellae can grow intracellularly in protozoa like

Acanthamoeba castellanii, Hartmannella species or Naegleria species. At least 61 different Legionella

species have been described. In 26 of these species, some strains infecting humans have been reported.

Legionella pneumophila can be subtyped into at least 15 different serogroups; nine other species also

can be subtyped into at least two separate serogroups. Monitoring for legionellae is important for

public health reasons to identify environmental sources which can pose a risk of legionellosis, such

as evaporative cooling towers, hot- and cold-water distribution systems in buildings and associated

equipment such as spa pools, dental units, air conditioning units, etc. Monitoring is also important for

validation of control measures and ongoing verification that controls remain effective.

vi © ISO 2017 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11731:2017(E)
Water quality — Enumeration of Legionella

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with

its use. It is the responsibility of the user of this document to establish appropriate safety and

health practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document

be carried out by suitably qualified and competent staff.
1 Scope

This document specifies culture methods for the isolation of Legionella and estimation of their numbers

in water samples.

These methods are applicable to all kinds of water samples including potable, industrial, waste and

natural waters. These methods can be used for water related matrices, e.g. biofilms, sediments, etc.

Not all Legionella species are culturable; therefore, the methods described in this document do not

recover all species of Legionella.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods

ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses

ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and

performance testing of culture media
ISO 19458, Water quality — Sampling for microbiological analysis
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
Legionella

genus of microorganisms normally capable of growth on buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar

containing L-cysteine and iron(III) salts

Note 1 to entry: For a more detailed description of Legionella species, see Annex A.

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ISO 11731:2017(E)
4 Principle
4.1 General

Legionellae in the water sample are concentrated by membrane filtration, diluted or directly plated

depending on the origin/characteristics of the sample. The desired level of detection can vary depending

on (inter)national legislation and the reason for sampling or investigation. Samples expected to contain

high numbers of legionellae, such as those obtained during outbreak investigations, can be processed

with and/or without the concentration steps. To reduce the growth of the concentrated non-target

bacteria, which can interfere with the recovery of the target legionellae, portions of the water samples

are also subjected to heat treatment, acid treatment or a combination of both treatments.

Dilution is necessary when high concentrations of Legionella and/or other bacteria are expected.

Separate portions of the diluted sample should be pre-treated; one with heat and a second with acid

solution or, in case of extremely contaminated samples, with a combination of acid solution and heat

before culturing on selective media.

Treated and/or untreated portions of the sample are transferred onto plates of the chosen culture

medium selective for Legionella and incubated.
NOTE Mechanical treatment of the sample can enhance the recovery of Legionella.
4.2 Examination

After incubation, morphologically characteristic colonies on the selective culture media are regarded

as presumptive Legionella.
4.3 Confirmation

Presumptive colonies are confirmed as Legionella by subculture to demonstrate their growth

requirement for L-cysteine and iron(III).

NOTE If species and serotype identification are requested, further tests are needed (see Annex G). These

tests are not part of the standardized methods described in this document.
5 Apparatus and glassware
Usual laboratory equipment and in particular:
5.1 Sterile Petri dishes.
5.2 Incubator, capable of being maintained at (36 ± 2) °C.
5.3 Ultraviolet lamp, emitting light of wavelength (360 ± 20) nm.

5.4 Membrane filtration equipment, suitable for filtering water volumes of 10 ml up to 1 000 ml.

5.5 Membrane filter.

5.5.1 Membrane filter for concentration and elution, polycarbonate or polyethersulfone membrane

filters, diameter 47 mm to 142 mm with rated pore sizes of 0,2 µm; see Reference [6]. These types of

membrane filters are used for concentration followed by a washing procedure.

5.5.2 Membrane filter for direct placing on culture media, membrane filters from cellulose nitrate

or mixed cellulose esters, diameter 47 mm to 50 mm with rated pore sizes of 0,2 µm or 0,45 µm. These

2 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 11731:2017(E)

types of membrane filters are used for direct placing onto the culture media after filtration. Filters shall

be evaluated prior to use in accordance with ISO 7704.

NOTE Black membrane filters contrast better with the white Legionella colonies than light-coloured

membrane filters.
5.6 pH meter, with an accuracy of ± 0,1 at 20 °C to 25 °C.
5.7 Vortex mixer.

5.8 Ultrasonic water bath, suitable for ensuring that the level of diluent covering the membrane filter

is below the level of water in the water bath.
5.9 Water bath, capable of being maintained at (50 ± 1) °C.
5.10 Glassware, sterilized according to ISO 8199.

5.11 Dissection microscope, stereoscopic, with magnification of at least 4× and with oblique incident

illumination.
NOTE Also, a hand lens (magnification at least 4×) can be used.
5.12 Disinfected forceps, for handling of membrane filters.

NOTE Forceps with round ends are generally used in order not to damage the membrane during handling.

5.13 Screw cap sterile container, with or without sterile glass beads. To ensure maximum removal of

the legionellae from the membrane filter, sterile glass beads (diameter 2 mm to 3 mm) can be added to

the sterile container. Add sufficient glass beads to the sterile container just enough to cover the bottom of

the container.
6 Culture media and reagents

Use chemicals of analytical grade in the preparation of culture media and reagents unless otherwise

stated (see the Note). Prepare the culture media and reagents according to the instructions given in

Annexes B, C and D. Prepare culture media using distilled or demineralized water, which is free from

substances that might affect growth of microorganisms under the test conditions. The water shall

comply with the requirements of ISO 3696, grade 3.

Alternatively, use commercially available culture media and reagents prepared and used according to

the manufacturer’s instructions.

NOTE Chemicals of other grades can be used, providing they are shown to be of equal performance in the test.

6.1 Culture media.
See Annex B.
6.1.1 Buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar.
See B.1.
© ISO 2017 – All rights reserved 3
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ISO 11731:2017(E)
6.1.2 Buffered charcoal yeast extract agar without L-cysteine (BCYE–cys).
See B.2.

NOTE Blood agar (see B.6), nutrient agar (see B.7) or tryptone soy agar (see B.8) can be used instead of

BCYE–cys agar.
6.1.3 Buffered charcoal yeast extract agar with selective supplements (BCYE+AB).
See B.3.
6.1.4 Glycine vancomycin polymyxin B cycloheximide (GVPC) agar.
See B.4.
6.1.5 Modified Wadowsky Yee (MWY) agar.
See B.5.
6.2 Diluents.
See Annex C.
6.2.1 Page’s saline.
See C.1.
6.2.2 Diluted Ringer’s solution.
See C.2.
6.3 Acid solution.
See Annex D.
7 Sampling

Carry out sampling, transport and storage of the samples in accordance with ISO 19458. Take care not

to expose the samples to adverse temperature conditions (e.g. freezing or overheating).

NOTE The use of insulated containers is helpful in this regard.
8 Procedure
8.1 Samples

Due to the complex nature of different sample matrices, the laboratory shall determine the appropriate

method for each sample type. The decision matrix is provided in Annex J to determine which appropriate

method shall be undertaken. Annex J describes the requirements and provides additional options.

In order to ensure the detection of legionellae from water samples, a concentration technique by

membrane filtration (see 8.2.2 or 8.2.3) will be required in most cases. Where the concentration of

legionellae is expected to be greater than 10 colony forming units per litre (cfu/l), direct plating of

the unconcentrated sample can also be carried out. For highly contaminated samples, dilute (refer

to Annex C for suitable diluents) and use direct plating before and after the pre-treatment (see 8.3).

Record volumes of sample diluted or processed and which pre-treatment(s) has (have) been applied.

4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 11731:2017(E)

When the number of legionellae in any given sample is not known, concentration techniques are usually

performed. Therefore, follow the procedure described in 8.2.2 or 8.2.3.
8.2 Concentration of water samples
8.2.1 General

For a general description of the membrane filtration technique, see ISO 8199. Filtration can be done by

vacuum filtration or positive pressure filtration.

The flow rate should be adjusted so as not to exceed the maximum specified by the manufacturer for

the filter size or type.

NOTE The procedure for water related matrices (swabs, sediment, etc.) is described in Annex I.

8.2.2 Membrane filtration and direct placing of the membrane filter on culture media

Filter the water sample (without treatment, after acid treatment and, if required, after heat treatment)

through a cellulose nitrate or mixed cellulose esters membrane filter (5.5.2). The acid treatment can

also be done directly on the membrane filter in the funnel (see 8.3.2). The volume filtered depends on

the particulate content of the water or the desired detection level. The filtered volume of the sample

shall be recorded. Carefully remove the membrane filter from the stand with disinfected forceps

(5.12) and place it (right-side up) directly on the culture media, ensuring that no air bubble is trapped

underneath.

NOTE Where concentration by filtration is not possible (e.g. due to a high level of deposit), the sample can be

concentrated by centrifugation (see Annex F).
8.2.3 Membrane filtration followed by a washing procedure

Filter the water sample through a polycarbonate or polyethersulfone membrane filter (5.5.1). The

volume filtered depends on the particulate content of the water or the desired detection level. The

filtered volume of the sample shall be recorded. Remove the membrane filter from the stand with

disinfected forceps (5.12). Work carefully to avoid loss of residual deposit. Place the membrane filter

(right-side down) in a screw cap sterile container with or without sterile glass beads (5.13). To wash the

microorganisms from the membrane filter, add 5 ml to 10 ml of sterile diluent (see Annex C) or sample,

and shake vigorously using a vortex mixer (5.7) for at least 2 min. Alternatively, place the container

(5.13) in an ultrasonic water bath (5.8) for a time interval that has been verified to determine the

optimum time interval for maximum recovery. Ensure that the level of diluent covering the membrane

is below the level of water in the ultrasonic water bath.

This concentrate represents the prepared sample. Record the volume of the concentrate. Membrane

filters may be cut into pieces using sterile scissors to aid elution.

Divide the concentrate into three portions. Use one portion untreated, one portion for treatment with

heat (see 8.3.1) and one portion for treatment with acid solution (see 8.3.2).

NOTE 1 Alternatively, the scraping or rubbing technique can be used for removal of the bacteria from the

membrane filter (see Annex E).

NOTE 2 Where concentration by filtration is not possible (e.g. due to a high level of deposit), the sample can be

concentrated by centrifugation (see Annex F).

NOTE 3 An additional membrane filtration can be used for the acid pre-treatment directly on the membrane

filter in the funnel.
© ISO 2017 – All rights reserved 5
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ISO 11731:2017(E)
8.3 Sample pre-treatment
8.3.1 Heat treatment

Add the sample (concentrated or unconcentrated) to a sterile container and place it in a water bath

(5.9) at (50 ± 1) °C for (30 ± 2) min. Small volumes (≤ 5 ml) should be used to ensure a short period until

the desired temperature is reached. If many samples are treated together or large sample volumes are

treated or thick-walled containers are used, monitor the temperature in a separate container similar

to that used for the sample. The time starts when the required temperature is reached. Large sample

volumes or thick-walled containers should be cooled to avoid overheating after being removed from the

water bath.
8.3.2 Acid treatment

Dilute one volume of the sample (concentrated or unconcentrated) with nine volumes of the acid

solution (see Annex D), mix well and leave it for (5,0 ± 0,5) min. If the diluted acid treated sample is used

for the calculation of the final concentration of Legionella species in the sample, the dilution should be

factored. Volumes greater than 0,1 ml can be plated to decrease the limit of detection.

Acid treatment can also be done directly on the membrane filter in the funnel. Transfer around 30 ml

acid solution (see Annex D) onto the membrane filter. Leave it for (5 ± 0,5) min and remove the acid

solution by filtration. Wash the membrane filter with at least 20 ml of the diluent (see Annex C). It is

important that the diluent does not rinse the surface of the funnel that had not been in contact with the

acid solution.
8.4 Culture
8.4.1 General

The choice of the method used for the enumeration of Legionella species depends on the

origin/characteristics of the sample and the reason of sampling or investigation. An assumption shall

be made about the expected concentration of interfering microorganisms based on experience or origin

of the sample. Also, the desired lower limit of detection level needs to be considered. A decision matrix

for choosing an appropriate method is described in detail in Annex J.

Depending on the desired detection level, it is possible to use more than one plate of the different

culture media mentioned in the following subclauses.

8.4.2 Samples with a high concentration of Legionella species and a low concentration of

interfering microorganisms

Plate the sample directly if the number of Legionella is expected to exceed 10 cfu/l. Inoculate and

spread 0,1 ml to 0,5 ml of the sample on one plate of BCYE agar (see B.1) and one plate of BCYE+AB agar

(see B.3). Record the inoculated volume.

8.4.3 Samples with a low concentration of Legionella species and a low concentration of

interfering microorganisms

8.4.3.1 Direct placing of membrane filter on culture media after membrane filtration

Filter the sample (see 8.2.2) and place the untreated membrane filter directly on one plate of BCYE agar

(see B.1). The membrane filters treated with acid solution according to 8.3.2 are placed on one or more

of the selective or highly selective plates of BCYE+AB agar (see B.3) or GVPC agar (see B.4) or MWY agar

(see B.5).
6 © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 11731:2017(E)
8.4.3.2 Plating after membrane filtration with washing p
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11731
Deuxième édition
2017-05
Qualité de l’eau — Dénombrement des
Legionella
Water quality — Enumeration of Legionella
Numéro de référence
ISO 11731:2017(F)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 11731:2017(F)
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© ISO 2017, Publié en Suisse

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l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 11731:2017(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

4.2 Examen .......................................................................................................................................................................................................... 2

4.3 Confirmation ............................................................................................................................................................................................. 2

5 Appareillage et verrerie ................................................................................................................................................................................ 2

6 Milieux de culture et réactifs ................................................................................................................................................................... 3

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 4

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 5

8.1 Échantillons ............................................................................................................................................................................................... 5

8.2 Concentration des échantillons d’eau ................................................................................................................................. 5

8.2.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 5

8.2.2 Filtration sur membrane et dépôt direct de la membrane filtrante sur

milieu de culture .............................................................................................................................................................. 5

8.2.3 Filtration sur membrane suivie d’une procédure de lavage....................................................... 5

8.3 Prétraitement de l’échantillon ................................................................................................................................................... 6

8.3.1 Traitement thermique ................................................................................................................................................. 6

8.3.2 Traitement acide .............................................................................................................................................................. 6

8.4 Culture ............................................................................................................................................................................................................ 6

8.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 6

8.4.2 Échantillons ayant une forte concentration en Legionella et une faible

concentration en micro-organismes interférents ............................................................................... 7

8.4.3 Échantillons ayant une faible concentration en Legionella et une faible

concentration en micro-organismes interférents ............................................................................... 7

8.4.4 Échantillons ayant une forte concentration en micro-organismes interférents ....... 7

8.4.5 Échantillons ayant une très forte concentration en micro-

organismes interférents ............................................................................................................................................ 7

8.4.6 Incubation .............................................................................................................................................................................. 8

8.4.7 Examen des boîtes .......................................................................................................................................................... 8

8.5 Confirmation des colonies présomptives de Legionella sur milieux de culture:

géloses BCYE et BCYE sans cys ................................................................................................................................................. 8

9 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 9

10 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................10

11 Assurance qualité .............................................................................................................................................................................................10

11.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................10

11.2 Essais de performance des milieux de culture de Legionella ......................................................................10

11.3 Préparation de la culture de travail et de la suspension pour les essais de performance ..10

Annexe A (informative) Espèces de Legionella ........................................................................................................................................12

Annexe B (normative) Milieux de culture ....................................................................................................................................................14

Annexe C (normative) Diluants ...............................................................................................................................................................................20

Annexe D (normative) Solution d’acide ..........................................................................................................................................................21

Annexe E (informative) Retrait des bactéries par grattage ou frottement

des membranes filtrantes ........................................................................................................................................................................22

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ISO 11731:2017(F)

Annexe F (informative) Technique de centrifugation ......................................................................................................................23

Annexe G (informative) Technique des anticorps par immunofluorescence indirecte pour

l’identification des espèces de Legionella ...............................................................................................................................24

Annexe H (informative) Données de performance .............................................................................................................................27

Annexe I (informative) Matrices de pré-traitement liées à l’eau .........................................................................................32

Annexe J (normative) Matrice de décision ..................................................................................................................................................33

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................39

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ISO 11731:2017(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien

suivant: Avant-propos — Informations supplémentaires.

Le présent document a été élaboré par le comité technique l’ISO/TC 147, Qualité de l’eau, Sous-comité

SC 4, Méthodes microbiologiques.

Cette seconde édition de l’ISO 11731 annule et remplace les ISO 11731:1998 et ISO 11731-2:2004, qui

ont fait l’objet d’une révision technique.
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ISO 11731:2017(F)
Introduction

Après la première épidémie reconnue de la maladie du légionnaire survenue en 1976, la bactérie isolée

fut appelée Legionella pneumophila. Les Legionella sont largement présentes dans les environnements

aquatiques naturels et artificiels, les sols, les composts et peuvent provoquer la légionellose. Les

Legionella peuvent se développer par voie intracellulaire dans les protozoaires tels que Acanthamoeba

castellanii, l’espèce Hartmannella ou l’espèce Naegleria. Au moins 61 différentes espèces de Legionella

ont été décrites. Dans 26 de ces espèces, plusieurs souches infectieuses pour les humains ont été

signalées. Legionella pneumophila peut être subdivisée en au moins 15 sérogroupes différents;

neuf autres espèces peuvent également être subdivisées en au moins deux sérogroupes distincts.

La surveillance des Legionella est importante pour des raisons de santé publique car elle permet

d’identifier dans l’environnement les sources qui peuvent créer un risque de légionellose, telles que les

tours de refroidissement, les systèmes de distribution d’eau chaude ou froide dans les bâtiments et les

équipements associés tels que les bassins de spas, les unités dentaires, les appareils de climatisation,

etc. La surveillance est également importante pour valider les mesures de contrôle et vérifier leur

efficacité constante.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 11731:2017(F)
Qualité de l’eau — Dénombrement des Legionella

AVERTISSEMENT — Il convient que les utilisateurs du présent document maîtrisent les pratiques

courantes de laboratoire. Le présent document ne prétend pas couvrir tous les problèmes

de sécurité potentiels associés à son utilisation. Il incombe à ses utilisateurs d’établir des

pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité et de s’assurer de la conformité à la

réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est absolument indispensable que les essais menés conformément au présent

document le soient par du personnel dûment qualifié et compétent.
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie des méthodes de culture pour l’isolement des Legionella et leur

dénombrement dans des échantillons d’eau.

Ces méthodes sont applicables à tous les types d’échantillons d’eau, y compris les eaux potables,

industrielles, usées et naturelles. Elles peuvent également être utilisées pour les matrices liées à l’eau

(biofilms, sédiments, etc.).

Toutes les espèces de Legionella n’étant pas cultivables, les méthodes décrites dans le présent document

peuvent ne pas retrouver la totalité des espèces de Legionella.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai

ISO 7704, Qualité de l’eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour des analyses

microbiologiques

ISO 8199, Qualité de l’eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur

milieu de culture

ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,

stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 19458, Qualité de l’eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp

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ISO 11731:2017(F)
3.1
Legionella

genre de micro-organismes normalement capables de croître sur gélose tamponnée au charbon actif et

à l’extrait de levure (BCYE) contenant de la L-cystéine et des sels de fer

Note 1 à l’article: Voir l’Annexe A pour obtenir une description plus détaillée des espèces de Legionella.

4 Principe
4.1 Généralités

Selon l’origine et/ou les caractéristiques de l’échantillon, les Legionella présentes dans l’échantillon

d’eau sont concentrées par filtration sur membrane, diluées ou directement ensemencées. Le niveau

de détection souhaité peut varier en fonction de la législation (inter)nationale et de la raison de

l’échantillonnage ou de l’étude. Les échantillons suspectés de contenir des Legionella en grand nombre,

tels que ceux obtenus au cours d’études épidémiologiques, peuvent être traités avec et/ou sans étapes

de concentration. Pour réduire le développement des bactéries non cibles concentrées et susceptibles

d’interférer avec la récupération des Legionella cibles, des fractions des échantillons d’eau sont

également soumises à un traitement thermique, à un traitement acide, ou à une combinaison des deux.

Une dilution est nécessaire dès lors qu’une forte concentration en Legionella et/ou d’autres bactéries est

attendue. Il convient de traiter au préalable des fractions séparées de l’échantillon dilué: une première

fraction étant soumise à un traitement thermique, une seconde à une solution d’acide ou, dans le cas

d’échantillons fortement contaminés, à une combinaison d’une solution d’acide et d’un traitement

thermique avant culture sur milieux sélectifs.

Les fractions traitées et/ou non traitées de l’échantillon sont transférées sur des boîtes du milieu de

culture sélectif choisi pour les Legionella, et incubées.

NOTE Le traitement mécanique de l’échantillon peut améliorer la récupération des Legionella.

4.2 Examen

Après incubation, les colonies de morphologie caractéristique sur les milieux de culture sélectifs sont

considérées comme des Legionella présomptives.
4.3 Confirmation

Les colonies présomptives sont confirmées comme étant des Legionella par repiquage afin de mettre en

évidence leur besoin en L-cystéine et en fer(III) pour se développer.

NOTE Si l’identification des espèces et des sérotypes est demandée, des essais complémentaires sont requis

(voir Annexe G). Ces essais ne sont pas inclus dans les méthodes normalisées décrites dans le présent document.

5 Appareillage et verrerie
Appareillage courant de laboratoire et notamment:
5.1 Boîtes de Petri stériles.
5.2 Étuve thermostatée, pouvant être maintenue à (36 ± 2) °C.

5.3 Lampe à ultraviolets, émettant une lumière d’une longueur d’onde de (360 ± 20) nm.

5.4 Appareillage de filtration sur membrane, permettant de filtrer des volumes d’eau de 10 ml à

1 000 ml.
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ISO 11731:2017(F)
5.5 Membrane filtrante.

5.5.1 Membrane filtrante pour concentration et élution, en polycarbonate ou en polyéthersulfone,

d’un diamètre de 47 mm à 142 mm, avec des pores de dimension nominale 0,2 µm (voir Référence [6]).

Ces types de membranes filtrantes sont utilisés pour la concentration suivie d’une procédure de lavage.

5.5.2 Membrane filtrante pour dépôt direct sur milieu de culture, en nitrate de cellulose ou en

esters de cellulose mixtes, d’un diamètre de 47 mm à 50 mm, avec des pores de dimension nominale

0,2 µm ou 0,45 µm. Ces types de membranes filtrantes sont destinés à être directement placés sur les

milieux de culture, après filtration. Avant leur utilisation, les filtres doivent être évalués conformément à

l’ISO 7704.

NOTE Les membranes filtrantes foncées offrent un meilleur contraste des colonies de Legionella blanches

que les membranes plus claires.
5.6 pH-mètre, d’une exactitude de ± 0,1 de 20 °C à 25 °C.
5.7 Agitateur vortex.

5.8 Bain d’eau à ultrasons, permettant de s’assurer que le niveau de diluant qui recouvre la membrane

filtrante est inférieur au niveau d’eau du bain.
5.9 Bain d’eau, pouvant être maintenu à (50 ± 1) °C.
5.10 Verrerie, stérilisée conformément à l’ISO 8199.

5.11 Microscope de dissection, stéréoscopique, permettant un grossissement d’au moins 4× et à

éclairage incident oblique.

NOTE Une loupe simple (grossissement d’au moins 4×) peut également être utilisée.

5.12 Pince stérile, pour manipuler les membranes filtrantes.

NOTE Une pince à bouts arrondis est généralement utilisée pour éviter d’endommager les membranes au

cours des manipulations.

5.13 Récipient stérile à bouchon à vis, avec ou sans billes de verre stériles. Pour extraire un maximum

de Legionella de la membrane filtrante, des billes de verre stériles (diamètre de 2 mm à 3 mm) peuvent

être ajoutées en quantité suffisante pour recouvrir le fond du récipient stérile.

6 Milieux de culture et réactifs

Sauf spécification contraire, utiliser des produits chimiques de qualité analytique pour la préparation

des milieux de culture et des réactifs (voir Note). Préparer les milieux de culture et les réactifs

conformément aux instructions des Annexes B, C et D. Préparer les milieux de culture en utilisant de

l’eau distillée ou déminéralisée, exempte de substances susceptibles d’affecter la croissance des micro-

organismes dans les conditions d’essai. L’eau doit être conforme aux exigences de l’ISO 3696, Qualité 3.

Il est également possible d’utiliser des milieux de culture et des réactifs disponibles dans le commerce,

préparés et utilisés conformément aux instructions du fabricant.

NOTE D’autres qualités de produits chimiques peuvent être utilisées, sous réserve de démontrer qu’elles

engendrent une performance égale pour l’essai.
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ISO 11731:2017(F)
6.1 Milieux de culture.
Voir l’Annexe B.
6.1.1 Gélose tamponnée au charbon actif et à l’extrait de levure (BCYE).
Voir B.1.

6.1.2 Gélose tamponnée au charbon actif et à l’extrait de levure sans L-cystéine (BCYE sans cys).

Voir B.2.

NOTE La gélose BCYE sans cys peut être remplacée par de la gélose au sang (voir B.6), de la gélose nutritive

(voir B.7) ou de la gélose tryptone-soja (voir B.8).

6.1.3 Gélose tamponnée au charbon actif et à l’extrait de levure avec suppléments sélectifs

(BCYE+AB).
Voir B.3.

6.1.4 Gélose à base de glycine, vancomycine, polymyxine B et cycloheximide (GVPC).

Voir B.4.
6.1.5 Gélose de Wadowsky et Yee modifiée (MWY).
Voir B.5.
6.2 Diluants.
Voir l’Annexe C.
6.2.1 Solution saline de Page.
Voir C.1.
6.2.2 Solution de Ringer diluée.
Voir C.2.
6.3 Solution d’acide.
Voir l’Annexe D.
7 Échantillonnage

Procéder à l’échantillonnage, au transport et au stockage des échantillons conformément à l’ISO 19458.

Ne pas exposer les échantillons à des conditions de température défavorables (gel ou traitement

thermique excessif, par exemple).
NOTE Des récipients isolés peuvent s’avérer utiles à cet égard.
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ISO 11731:2017(F)
8 Mode opératoire
8.1 Échantillons

Du fait de la nature complexe des différentes matrices d’échantillons, le laboratoire doit déterminer

la méthode appropriée à chaque type d’échantillon. L’Annexe J fournit une matrice de décision pour

déterminer la méthode appropriée à appliquer. Elle décrit également les exigences associées et suggère

des options supplémentaires.

Afin de garantir la détection des Legionella dans les échantillons d’eau, une méthode de concentration

par filtration sur membrane (voir 8.2.2 ou 8.2.3) sera requise dans la majorité des cas. Lorsque la

concentration attendue de Legionella est supérieure à 10 unités formant colonie par litre (ufc/l),

l’échantillon non concentré peut également être directement ensemencé. Pour les échantillons fortement

contaminés, diluer (voir l’Annexe C pour obtenir les diluants adaptés) et utiliser l’ensemencement direct

avant et après le prétraitement (voir 8.3). Noter les volumes d’échantillon dilués ou traités et le(s)

prétraitement(s) appliqué(s).

Lorsque le nombre de Legionella dans un échantillon donné n’est pas connu, les méthodes de

concentration sont généralement mises en œuvre. Par conséquent, suivre le mode opératoire décrit au

8.2.2 ou 8.2.3.
8.2 Concentration des échantillons d’eau
8.2.1 Généralités

Pour obtenir une description générale de la méthode de filtration sur membrane, voir l’ISO 8199. La

filtration peut être effectuée sous vide ou par pression positive.

Il convient de régler le débit de façon à ne pas dépasser la valeur maximale spécifiée par le fabricant

pour la taille ou le type du filtre.

NOTE Le mode opératoire pour les matrices liées à l’eau (écouvillons, sédiments, etc.) est décrit dans

l’Annexe I.

8.2.2 Filtration sur membrane et dépôt direct de la membrane filtrante sur milieu de culture

Filtrer l’échantillon d’eau (sans traitement, après traitement acide et, si nécessaire, après traitement

thermique) sur une membrane filtrante en nitrate de cellulose ou en esters de cellulose mixtes

(5.5.2). Le traitement acide peut également être directement effectué sur la membrane filtrante dans

l’entonnoir (voir 8.3.2). Le volume filtré dépend de la teneur en particules de l’eau ou du niveau de

détection souhaité. Le volume filtré de l’échantillon doit être noté. Retirer soigneusement la membrane

filtrante du support de filtration à l’aide d’une pince stérile (5.12) et la déposer (dessus vers le haut)

directement sur le milieu de culture, en s’assurant qu’aucune bulle d’air ne soit piégée dessous.

NOTE Lorsque la concentration par filtration est impossible (par exemple en raison d’un niveau de dépôt

élevé), l’échantillon peut être concentré par centrifugation (voir l’Annexe F).
8.2.3 Filtration sur membrane suivie d’une procédure de lavage

Filtrer l’échantillon d’eau sur une membrane filtrante en polycarbonate ou en polyéthersulfone (5.5.1).

Le volume filtré dépend de la teneur en particules de l’eau ou du niveau de détection souhaité. Le volume

filtré de l’échantillon doit être noté. Retirer la membrane filtrante du support de filtration à l’aide d’une

pince stérile (5.12). Réaliser cette opération avec soin de manière à éviter la perte de dépôt résiduel.

Placer la membrane filtrante (dessus vers le bas) dans un récipient stérile à bouchon à vis contenant ou

non des billes de verre stériles (5.13). Pour détacher les micro-organismes de la membrane filtrante,

ajouter 5 ml à 10 ml de diluant stérile (voir l’Annexe C) ou d’échantillon, et agiter vigoureusement

en utilisant un agitateur vortex (5.7) pendant au moins 2 min. Une autre méthode consiste à placer

le récipient (5.13) dans un bain d’eau à ultrasons (5.8) pendant une durée qui a été validée pour une

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ISO 11731:2017(F)

récupération maximale. S’assurer que le niveau de diluant qui recouvre la membrane est inférieur au

niveau d’eau dans le bain d’eau à ultra-sons.

Ce concentré représente l’échantillon préparé. Noter le volume du concentré. Afin de faciliter l’élution,

les membranes filtrantes peuvent être coupées en plusieurs morceaux à l’aide de ciseaux stériles.

Diviser le concentré en trois portions. Utiliser une portion non traitée, une portion pour le traitement

thermique (voir 8.3.1) et une portion pour le traitement à la solution d’acide (voir 8.3.2).

NOTE 1 La méthode de grattage ou de frottement peut également être utilisée pour détacher les bactéries de

la membrane filtrante (voir l’Annexe E).

NOTE 2 Lorsque la concentration par filtration est impossible (par exemple en raison d’un niveau de dépôt

élevé), l’échantillon peut être concentré par centrifugation (voir l’Annexe F).

NOTE 3 Une membrane filtrante supplémentaire peut être utilisée pour réaliser le prétraitement acide

directement sur la membrane dans l’entonnoir.
8.3 Prétraitement de l’échantillon
8.3.1 Traitement thermique

Verser l’échantillon (concentré ou non) dans un récipient stérile et placer ce récipient dans un bain

d’eau (5.9) à (50 ± 1) °C pendant (30 ± 2) min. Il convient d’utiliser de petits volumes (≤5 ml) afin de

garantir un court laps de temps jusqu’à ce que la température souhaitée soit atteinte. Si de nombreux

échantillons sont traités simultanément ou si des échantillons de gros volume sont traités ou si des

récipients à paroi épaisse sont utilisés, surveiller la température dans un récipient séparé analogue

à celui utilisé pour l’éch
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.