ISO 7581:2023
(Main)Evaluation of bactericidal activity of a non-porous antimicrobial surface used in a dry environment
Evaluation of bactericidal activity of a non-porous antimicrobial surface used in a dry environment
This document specifies the test conditions and the levels of activity to determine the bactericidal activity of non-porous surfaces used in a dry environment. It defines a protocol to validate the bactericidal character of a surface and to measure its performance. It is not intended to be used to substantiate cleaning or disinfecting properties. This document is applicable to surfaces claiming to have an activity against vegetative bacteria. The obligatory test conditions are defined in this document. It does not apply to porous surfaces. It does not refer to methods for testing the toxicological and ecotoxicological properties of the surfaces. This document is used to measure bactericidal action, not bacteriostatic activity of a surface.
Évaluation de l’activité bactéricide d’une surface antimicrobienne non poreuse utilisée dans un environnement sec
Le présent document spécifie les conditions d’essai et les niveaux d’activité pour déterminer l’activité bactéricide des surfaces non poreuses utilisées dans un environnement sec. Il définit un protocole de validation du caractère bactéricide d’une surface et de mesure de sa performance. Il n’est pas destiné à être utilisé pour démontrer des propriétés nettoyantes ou désinfectantes. Le présent document est applicable aux surfaces revendiquant une activité contre les bactéries végétatives. Les conditions d’essai obligatoires sont définies dans le présent document. Il ne s’applique pas aux surfaces poreuses. Il ne fait pas référence à des méthodes d’essai des propriétés toxicologiques et écotoxicologiques des surfaces. Le présent document permet de mesurer l'action bactéricide et non l'activité bactériostatique d’une surface.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 7581
First edition
2023-12
Evaluation of bactericidal activity of
a non-porous antimicrobial surface
used in a dry environment
Évaluation de l’activité bactéricide d’une surface antimicrobienne non
poreuse utilisée dans un environnement sec
Reference number
© ISO 2023
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative reference .1
3 Terms and definitions . 1
4 Apparatus, reagents and materials . 3
4.1 Test organisms . 3
4.2 Culture media and reagents. 3
4.3 Reference and test surfaces . 4
4.3.1 General . 4
4.3.2 Reference surfaces . 4
4.3.3 Test surfaces . . 5
4.4 Apparatus and materials . 6
5 Preparation of the test organism suspensions . 7
5.1 Stock cultures of the test bacteria . 7
5.2 Working culture of the test bacteria . 7
5.3 Test suspensions . 8
5.4 Quantifying of bacterial test suspensions . 8
5.5 Calculation of the weighted mean bacteria concentration in the test suspensions. 8
6 Evaluation method of the bactericidal activity of a non-porous surface and its
efficacy .10
6.1 Obligatory experimental conditions . 10
6.2 Test procedure . 10
6.2.1 Sampling . 10
6.2.2 Test (T and T ) . 10
0 xh
6.2.3 Reference surfaces (C and C ) . 11
0 xh
6.2.4 Validation (V ). 11
n
7 Results . .12
7.1 Determination of the number of viable bacteria .12
7.2 Verification of the methodology. 13
7.3 Expression of results . .13
7.3.1 Reduction . 13
7.3.2 Conclusion: Bactericidal activity of non-porous surfaces . 14
8 Test report .14
Annex A (normative) Corresponding obligatory reference strains .16
Annex B (informative) Standard test report of the measurement of the bactericidal activity
of non-porous surfaces .17
Annex C (informative) Examples of surface preparation protocols .19
Annex D (informative) Neutralizers .20
Annex E (informative) Technical guide to depositing the inoculum .22
Bibliography .24
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use
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the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 330, Surfaces with biocidal and
antimicrobial properties.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
The surfaces in our environment can constitute significant reservoirs of bacteria and a risk to health
that is essential to control.
In healthcare establishments, healthcare-associated infections (HAI) are a major cause of mortality
and disability the world over. HAI affects 5 % to 15 % of hospital patients in developed countries and
can affect 9 % to 37 % of patients admitted to intensive care units. Each year, about 1 in 25 U.S. hospital
patients is diagnosed with at least one infection related to hospital care alone. At least five million
HAI are estimated to occur in acute care hospitals in Europe, causing 135 000 deaths per year and
approximately 25 million additional days spent in hospital, representing a financial cost of €13 billion
to €24 billion.
In public transport, the risks of contamination between travellers are extremely high due to the
frequency and number of contacts points. In establishments receiving the public, all common areas and
collective spaces constitute a risk of the spread of pathogens microorganisms.
In the agri-food sector, microbial hazards are the highest risk amongst those that can impact
consumer health, above malnutrition and chemical contaminants. In addition to the impact on health,
the consequences of a case of contamination can be disastrous for the image and sustainability of a
company. For instance:
— an estimated 600 million – almost 1 in 10 people in the world – fall ill after eating contaminated
food and 420 000 die every year, resulting in the loss of 33 million healthy life years [disability-
adjusted life years];
— US$110 billion is lost each year in productivity and medical expenses resulting from unsafe food in
low- and middle-income countries;
— children under 5 years of age carry 40 % of the foodborne disease burden, with 125 000 deaths
every year;
— diarrhoeal diseases are the most common illnesses resulting from the consumption of contaminated
food, causing 550 million people to fall ill and 230 000 deaths every year.
The drive to control microbial risks extends to many other sectors (transport, pharmaceuticals,
aeronautics, cosmetics, the phytosanitary sector, services, etc.), and even to the entire industrial
manufacturing sector.
Pathogenic agents can be transmitted in a variety of ways, such as via food and water, via air (aerosols),
via body contact with infected person and via surfaces contaminated by body secretions and fomites.
Healthcare-associated infections, or infections acquired in healthcare settings are the most frequent
adverse event in healthcare delivery worldwide. Hundreds of millions of patients are affected by
healthcare-associated infections worldwide each year, leading to significant mortality and financial
losses for health systems. Of every 100 hospitalized patients at any given time, 7 in developed and 10 in
developing countries will acquire at least one healthcare-associated infection. Such infections annually
account for 37 000 attributable deaths in Europe and potentially many more that can be related, and
they account for 99 000 deaths in the USA. Amongst the available tools for reducing microbial risks,
surfaces with biocidal properties can help to control cross-contaminations when used in combination
with standard cleaning and disinfecting practice.
This document was written to address the need to demonstrate the biocidal efficacy of a surface under
ambient conditions close to the conditions found in the field. The method described in this document
simulates the contamination of a surface by a microdroplet. For example, this pathway of contamination
is representative of a surface contamination following a sneeze (microdroplet post sneeze might have
a mobility of several meters). The temperatures and humidity required for the test were defined in
relation to conditions that are representative of the atmosphere in the healthcare facilities.
v
Numerous non-porous surfaces claim to perform a bactericidal function:
— surfaces of materials that have been treated with or include a biocidal product in order to give the
material bactericidal properties, either temporarily or permanently.
— surfaces of materials, such as certain metals, that claim to have intrinsic bactericidal properties.
The method prescribes the representative basic strains to be tested. Additional strains may be tested,
depending on the intended use. For a given use, further experiments including in use condition (soiling
substances, ageing, adaption of environmental condition) are needed for demonstrating bactericidal
activity of the tested surface as claimed.
This method will be revised in the near future to include interfering substances and to adapt strains/
efficacy/contact time specifications to the needs of different sectors, in addition to the medical area.
Surfaces with bactericidal properties supplement, but do not replace, the regular use of surface-
treatment products, such as detergents, detergent-disinfectants and surface disinfectants which must
be demonstrated to be compatible with maintaining the surface bactericidal activity.
vi
INTERNATIONAL STANDARD ISO 7581:2023(E)
Evaluation of bactericidal activity of a non-porous
antimicrobial surface used in a dry environment
WARNING — Persons using this document shall have technical microbiological knowledge.
1 Scope
This document specifies the test conditions and the levels of activity to determine the bactericidal
activity of non-porous surfaces used in a dry environment. It defines a protocol to validate the
bactericidal character of a surface and to measure its performance. It is not intended to be used to
substantiate cleaning or disinfecting properties.
This document is applicable to surfaces claiming to have an activity against vegetative bacteria. The
obligatory test conditions are defined in this document. It does not apply to porous surfaces.
It does not refer to methods for testing the toxicological and ecotoxicological properties of the surfaces.
This document is used to measure bactericidal action, not bacteriostatic activity of a surface.
2 Normative reference
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
EN 12353, Chemical disinfectants and antiseptics — Preservation of test organisms used for the
determination of bactericidal (including Legionella), mycobactericidal, sporicidal, fungicidal and virucidal
(including bacteriophages) activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
bactericidal activity
capability of a surface to produce a reduction in the number of viable bacterial cells of representative
test organisms (3.6) under defined conditions without soil load, nor ageing test nor test conditions
adaptation to a specific sector.
Note 1 to entry: Note to entry: At the moment this document does not include soiling or ageing condition.
3.2
bacteriostatic activity
capability of a surface to inhibit the growth of viable bacterial cells of representative test organisms
(3.6) under defined conditions
Note 1 to entry: The term "bacteriostatic activity" cannot be used for claims according to this document.
3.3
additional condition
test conditions that are optional and not obligatory, that can be used for additional claims of bactericidal
activity (3.1) regarding a surface
3.4
cleaning
all operations that achieve a level of cleanliness, appearance, comfort and hygiene
Note 1 to entry: Such operations use, to varying degrees, the following combined factors: chemical action,
mechanical action, temperature, duration of action
3.5
neutralizer
chemical agent or formulation that suppresses the residual microbicidal activity of a product or active
substance from the surface to be tested for a specific test but does not inactivate or inhibit the test
organism (3.6)
3.6
test organism
strain of a microorganism selected to evaluate the antimicrobial activity of a surface for a standardized
test
3.7
bactericidal surface
surface that irreversibly kill vegetative bacteria under defined conditions
Note 1 to entry: The adjective “bactericidal” corresponds to the noun “bactericide”.
3.8
reference surface
surface without any bactericidal activity (3.1) or properties, that is used to evaluate the quantity of
culturable bacteria present at the moment when the bactericidal activity of the test surface (3.9) is
evaluated
3.9
test surface
surface claiming bactericidal activity (3.1)
Note 1 to entry: This method is suitable for testing any type of non-porous surfaces (such as metals, plastic, glass,
coated surfaces, etc.) as long as recovery of bacteria from the test surface shall not lose more than 1 log at T=0.
Note 2 to entry: Very hydrophobic surfaces, for which a drying time greater than 10 min (see 6.2.2) is necessary,
cannot be tested according this method.
3.10
ambient light
light corresponding to a maximum value of 2 000 lux
Note 1 to entry: Any specific light or light spectrum (e.g. strong light, UV, etc.) is not considered as ambient.
3.11
porous surface
surface permeable to water, air, or other fluids
4 Apparatus, reagents and materials
4.1 Test organisms
Bactericidal activity shall be evaluated using the following four strains:
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 = CIP 103-467;
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 = CIP 4.83;
— Enterococcus hirae ATCC 10541 = CIP 5855;
— Escherichia coli ATCC 10536 = CIP 54127.
The reference strain numbers in other culture collections shall be in accordance with the strains
specified in Annex A.
The activity data can be completed with other strains using the experimental design described in
this document, varying the conditions to meet the needs of the intended -practice application(s). If
additional strains are used, they shall be incubated under optimum growth conditions (temperature,
time, atmosphere) to be recorded in the test report.
Their suitability for supplying the inoculum and controls with a sufficient concentration shall
be verified. If these additional test strains are not classified at a culture collection centre, their
identification characteristics shall be stated. In addition, they shall be held by the testing laboratory or
national culture collection under a reference for a five-year period.
NOTE ISO/TC 330 is currently adapting the method in terms of strains/efficacy levels/contact times/
interfering substances according to different sectors’ needs and to include not only the medical area.
4.2 Culture media and reagents
The reagents shall be of analytical grade and/or appropriate for microbiological purposes. They shall
be free from substances that are toxic or inhibitory to the test organisms.
4.2.1 Water, which shall be free from any substances that are toxic or that inhibit the bacteria. It shall
be freshly glass-distilled water or water for injection or possibly deionized or demineralized water.
Sterilize in the autoclave (4.4.1).
NOTE If the water is sterilized during the sterilization of the reagents, this is not necessary.
4.2.2 Microbial suspension diluents
Tryptone-salt solution:
Tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Water (see 4.2.1) 1,000 ml
Sterilize in the autoclave (see 4.4.1). After sterilization, the pH of the medium shall be equivalent to
7,0 ± 0,2 when measured at 20 °C.
4.2.3 Liquid for bacteria recovery and for membrane rinsing
4.2.3.1 Composition
Tryptone, pancreatic digest of casein 1,0 g
Sodium chloride 8,5 g
Polysorbate 80 5,0 g
Water (see 4.2.1) 1 000 ml
4.2.3.2 Preparation
a) Dissolve the sodium chloride and tryptone in the water (see 4.2.2). Add the Polysorbate 80, mix and
complete up to 1 000 ml with water.
b) Distribute into smaller adapted flasks. Sterilize in the autoclave.
c) If necessary, add a neutralizer to the recovery liquid.
The use of a validated neutralizer of the respective antimicrobial active substance is compulsory to
warrant a correct test time for bacteria recovery and for membrane rinsing (see 4.2.3): The functionality
of the respective neutralizer shall be validated beforehand. The neutralizer:
— shall be validated for the tested surface, as per 6.2.4 and it shall be sterile;
— shall be mentioned in the test report.
Examples of neutralizers are given in Annex D.
4.2.4 Agar for bacteria maintenance and counting [tryptone soya agar (TSA)]
Use agar to preserve the bacterial strains and count the viable bacteria.
Tryptone, pancreatic digest of casein 15,0 g
Soya peptone, papaic digest of soybean meal 5,0 g
Sodium chloride 5,0 g
Agar 15,0 g
Water (see 4.2.1) 1 000 ml
Sterilize in the autoclave. After sterilization, the pH of the medium shall be equivalent to 7,2 ± 0,2
when measured at 20 °C. Pre pored plate TSA are acceptable if they meet the composition and pH value
described in 4.2.4.
4.3 Reference and test surfaces
4.3.1 General
The surfaces shall be used only once.
4.3.2 Reference surfaces
4.3.2.1 Description
Inox 304 stainless steel, disk 2 cm in diameter, of which both sides have a grade 2B finish. The surfaces
shall be flat.
For the testing of surface coated, if the coated surface without antimicrobial agent (the test surface)
exists, it can be used as a reference surface similar to inox and therefore can be used for log reduction
calculation.
The reference surface used during the test shall be specified in the report.
4.3.2.2 Cleaning — Disinfection/sterilization
The reference surfaces shall be cleaned and disinfected before use.
If a specific preparation protocol is applied to the test surface (see examples in Annex C), the same
protocol should be applied to the reference surface (see 4.3.3.2). Otherwise, the protocol in example 1
of Annex C should be used.
No residual action or changes of the antimicrobial properties shall result from disinfection/cleaning
procedure on the reference surface.
The reference surface treatment used during the test shall be specified in the report.
4.3.3 Test surfaces
4.3.3.1 Identification and production
The characteristics (e.g. dimensions, thickness, etc.) and references of the finished product shall be
defined and specified in the final test report.
If the test surface is treated with a bactericide, the nature of the active substance(s) shall be specified
to the lab for safety and security reasons, and indicated in the final test report. For coated surfaces
with unknown porosity (e.g. paint), recovery of the microorganisms shall be checked by the laboratory,
comparing the coated surface with the antimicrobial agent and the reference surface (C0 vs T0) or the
coated surface with and without the antimicrobial agent, to ensure the accuracy of bacteria reduction
evaluation. Recovery of bacteria from the test surface shall not lose more than 1 log at T=0 compared to
the reference one.
The test surface shall be produced from the materials intended for the finished product claiming
bactericidal activity, and according to the same steps of the final production process. If it is impossible
to perform the steps on the same equipment, it is permitted to use a representative simulation of these
steps.
The test surface shall have flat surfaces and measure between 12 mm and 25 ± 2 mm on the sides
or in diameter. If it is impossible to cut the test surface into squares or disks of this size, other sizes
and shapes can be used. In this case, the actual dimensions used will be stated in the test report. Any
changes made to the protocol (recovery volume, etc.) due to the dimensions of the tested test surface
shall be specified in the test report.
The uniformity of each test surface shall be visually inspected. Test surfaces with anomalies on the
surface or edges shall be discarded (e.g. corrosion/rust, slivers, deep grooves or ridges, etc.).
4.3.3.2 Cleaning — Disinfection/sterilization
All the test surfaces shall be at least rinsed with sterile distilled water before performing the tests.
If necessary, disinfection or sterilization can be performed according to the nature of the surface,
indicated by the manufacturer and detailed in the test report. The manufacturer shall propose/
validate the complete treatment. If necessary, preliminary tests shall be performed to define the
appropriate treatment to avoid impacting the efficacy of the tested surfaces. These tests can result in
the methodology described in 4.3.2.2 being adapted with identical treatment for the reference surface
and the test surface.
No residual action or changes of the antimicrobial properties shall result from disinfection/cleaning
procedure on the reference and tested surface.
Annex C contains examples of surface preparation protocols.
The test surface treatment used during the test shall be specified in the report.
4.4 Apparatus and materials
Sterilize all glassware and parts of the apparatus that will come into contact with the culture media
and reagents or the sample, except those which are supplied sterile, by one of the following methods:
— in the autoclave (see 4.4.1), by keeping them at between 121 °C and 124 °C for at least 15 min;
— in the hot air oven (see 4.4.1), by keeping them at 180 °C for at least 30 min, at 170 °C for at least 1 h
or at 160 °C for at least 2 h.
Usual microbiological laboratory equipment, and in particular:
4.4.1 Apparatus for sterilization
— For moist heat sterilization, an autoclave capable of being maintained at between 121 °C and 124 °C
for at least 15 min.
— For dry heat sterilization, a hot air oven capable of being maintained at between 180 °C and 185 °C
for at least 30 min, at between 170 °C and 175 °C for at least 1 h, or at between 160 °C and 165 °C for
at least 2 h.
4.4.2 Water baths. Thermostat-controlled bath at 45 °C ± 1 °C.
4.4.3 Incubators
— Incubators capable of being maintained in the range of 35 °C to 38 ± 1 °C.
— Thermostat-controlled incubators at the defined test temperatures (excluding ambient temperature).
4.4.4 pH-meter, accurate to ±0,1 pH units at 20 °C ± 1 °C
For measuring the pH of the agar media, a puncture electrode or a flat membrane electrode shall be
used.
4.4.5 Calibrated thermometer or temperature probe accurate to ±1 °C.
4.4.6 Calibrated relative humidity meter accurate to ±2 % RH .
4.4.7 Light measuring apparatus.
4.4.8 Stopwatch.
4.4.9 Mechanical or electromechanical shaker.
4.4.10 Refrigerator, temperature-controllable to between 2 °C and 8 °C.
4.4.11 Graduated pipettes of nominal capacities of 10 ml, 2 ml, 1 ml and 0,1 ml. Calibrated automatic
pipettes may be used, in particular for small volumes (inoculum deposit).
4.4.12 Petri dishes, 90 mm to 100 mm in diameter. 55 mm Petri dishes can be used for the membranes.
4.4.13 Glass beads (diameter: 3 mm to 5 mm).
4.4.14 Analytical balance of suitable operating range.
4.4.15 Spectrophotometer fitted with a monochromator.
4.4.16 Vacuum pump (max. flow rate 3,8 m /h, final vacuum < 7,5 kPa).
4.4.17 0,45 µm pore-size sterile filter membranes (diameter 47 mm to 50 mm) in cellulose ester or
any other suitable material.
4.4.18 Microscope, fitted with x40 and x100 immersion lenses (purity checks after colouring: strain
visual control).
4.4.19 Forceps.
4.4.20 Sterile test tubes in neutral glass, 18 mm or 20 mm in diameter.
4.4.21 Recipients, flasks or vials of adequate capacity for the intended use.
4.4.22 Class II biological safety enclosure (that can also be used in the stage to dry the inocula).
4.4.23 Freezer, with a temperature equal to or lower than – 70 °C.
4.4.24 Membrane filtration apparatus, built in a material compatible with the filtrate substances.
The apparatus shall be equipped with a funnel with a capacity of at least 50 ml. It shall be suitable
for use with 47 mm to 50 mm-diameter, 0,45 µm pore-size filters. The vacuum source used shall give
an even filtration flow rate. In order to obtain a uniform distribution of the microorganisms over the
membrane and prevent filtration that lasts too long, the targeted filter speed is 100 ml of rinsing liquid
in less than 40 seconds.
4.4.25 Climatic/Seal chamber or box capable of controlling temperature and relative humidity.
5 Preparation of the test organism suspensions
5.1 Stock cultures of the test bacteria
The test organisms and their stock cultures shall be prepared and kept in accordance with the
requirements of EN 12353.
5.2 Working culture of the test bacteria
To prepare the working culture of the test organisms, prepare a subculture from the stock culture (see
5.1) by streaking onto TSA slopes (slants) or plates (4.2.4, before incubating them (see 4.4.3.). After
incubating for 18 h to 24 h, take the first subculture and prepare a second one in the same way, and
incubate for 18 h to 24 h. The second subculture can be used to prepare a third one in the same manner.
The second and/or third subcultures are the working cultures.
If it is not possible to prepare the second subculture on a particular day, a 48 h ± 2 h subculture may
be used for subsequent subculturing, provided that the subculture has been kept in the incubator over
the 48 h ± 2 h period. In this case, prepare another 24-hour subculture before running the test. Do not
prepare a fourth subculture.
For additional strains (see 4.1), any departure from this bacterial culture method or test suspension
preparation method shall be recorded in the test report, with the reasons substantiating this departure.
5.3 Test suspensions
Take 10 ml of diluent (see 4.2.2) and place in a 100 ml flask or container with 5 g of sterile glass beads
(see 4.4.13). Take loopfuls of working culture (see 5.2) and transfer it into the diluent. The cells shall be
suspended in the diluent by immersing the loop in the diluent and by rubbing it against the wall of the
vessel to dislodge the cells. Shake the vessel for 3 min using a mechanical shaker (see 4.4.9). Aspirate
the suspension, leaving the glass beads at the bottom, and transfer it to another vial. Adjust the number
8 8 1)
of cells of the suspension to a value between 1,5 10 CFU/ml and 5,0 10 CFU/ml using the diluent,
estimating the number by appropriate means (i.e. spectrophotometry). The suspension shall be used
within 2 h of preparation.
For Gram negative bacteria, use the top part of the inoculum.
The test laboratory is responsible for the precision of the titres obtained in the preliminary tests.
5.4 Quantifying of bacterial test suspensions
-6 -7
Dilute the adjusted bacterial suspensions to 10 (serial dilutions) and 10 using the diluent (see 4.2.2).
Mix the suspension (see 4.4.9).
Take a duplicate sample of 1,0 ml of each dilution and inoculate using the pour plate technique. Use a
pipette to introduce each 1,0 ml sample into separate Petri dishes (see 4.4.12) and add 15 ml to 20 ml of
molten TSA agar (see 4.2.4).
-5
The spread plate technique can also be used. In this case, use 100 µl of bacterial suspensions 10 and
-6
10 (serial dilutions).
Incubate the dishes in the range of 35 °C to 38 °C ± 1 °C for 24 h ± 2 h. Discard any dishes which are not
countable (for any reason). Incubate the dishes for a further 24 h ± 2 h. Do not repeat the count on the
dishes for which it is not possible to count the colonies. Count the remaining dishes again.
Determine the highest colony count for each sample.
See 6.2.2 i) for the incubation and counting.
5.5 Calculation of the weighted mean bacteria concentration in the test suspensions
a) Discard all the dishes for which counting is impossible (for any reason). Determine the total
number of CFUs per dish. Do not repeat the count on the dishes for which the colonies are not
clearly separate. Count the remaining dishes again after 48 h. If the number has increased, only use
the higher number for the subsequent calculations.
b) Only the dishes with a number of colonies between 14 and 330 for the bacteria are used to calculate
the result.
Calculate the weighted mean values of the test suspension by using Formula (1):
c
X = ×d (1)
()nn+01,
1) CFU = Colony forming unit
where
X is initial suspension concentration in CFU/ml (refer to 7.2);
c is the sum total of the values of Viable cultivable bacteria (Vc) considered;
n is the number of values of Vc considered in the lowest dilution;
n is the number of values of Vc considered in the highest dilution;
d is the dilution level corresponding to the lowest dilution.
Calculation examples following the use of the pour plate method:
EXAMPLE 1:
V for n : 215 and 230
c 1
V for n : 25 and 30
c 2
c = 215 + 230 + 25 + 30 = 500
-6
n the number of values of Vc considered in the lowest dilution, i.e. 10 ; 2
-7
n the number of values of Vc considered in the highest dilution, i.e. 10 ; 2
X = ×10
()22,
So
X= 2,27. 10 CFU/ml (8,36 log CFU/ml)
EXAMPLE 2:
V for n : 312 and 342 (>330: not included)
c 1
V for n : 32 and 35
c 2
c = 312 + 32 + 35 = 379
-6
n the number of values of Vc considered in the lowest dilution, i.e. 10 ; 1
-7
n the number of values of Vc considered in the highest dilution, i.e. 10 ; 2
X = ×10
12,
()
X= 3,16. 10 CFU/ml (8,50 log CFU/ml)
6 Evaluation method of the bactericidal activity of a non-porous surface and its
efficacy
6.1 Obligatory experimental conditions
The defined experimental conditions to determine the bactericidal activity of a non-porous surface are
as follows:
a) test temperature shall be 20 ± 1 °C; additional temperatures can be chosen and shall be reported in
the test report;
b) relative humidity shall be between 30 % and 65 % (additional levels of relative humidity can be
chosen and shall be reported in the test report);
c) ambient light;
d) contact time, t (minutes): minimum 60 min ± 10 s to maximum 120 min ± 10 s;
e) strains: they shall match those specified in 4.1 and annex A.
Additional conditions (light, strains, contact time) can be tested using the described protocol, provided
that all the test validation criteria are met and reported in the test report.
Test shall be performed using a climatic/seal chamber or box (see 4.4.25).
6.2 Test procedure
6.2.1 Sampling
Each test to evaluate bactericidal activity shall be performed on at least three test surfaces and
reference surfaces. Ultimately, eight test surfaces (and 6 reference surfaces for 6.2.3) are the minimum
for performing the test (test surfaces: 3 for T and 3 for T and 2 for Vn; reference surfaces: 3 for C0 and
0 xh
3 for Cxh ). If 1H and 2H be both tested in the same run, 11 samples for the test surfaces are needed (3
for T , 3 for T1h, 3 for T and 2 for Vn).
0 2h
Using more than three test surfaces per test can help to reduce variability and, therefore, the value of
the standard deviation used in the calculation of the log reduction.
6.2.2 Test (T and T )
0 xh
This subclause details the test to evaluate the number of viable bacteria remaining on the test surface
(4.3.3).
The data corresponding to time 0 (preferably < 3 min not exceeding 10 min for drying) are identified
as T . The data corresponding to time 1 h are identified as T . . The data corresponding to the contact
0 1h
time x are identified as T (example: T or T ).
xh 1h 2h
Perform the following for each test strain.
a) Put the test surfaces (4.3.3) in a sterile Petri dish and make sure that the dish is horizontal.
b) Inoculate each test surface with 1 µl of the final test suspension (5.3) using a calibrated pipette or a
calibrated loop.
NOTE Hydrophobic surfaces are treated in the same way.
c) Spread the inoculum to about 3 mm from the edge of each test surface (over a surface of about
10 mm × 10 mm), using the tip of the pipette. Guidance for inoculum deposit is given in Annex E.
d) Leave to dry in a laminar flow hood and record the drying time T , which shall be <3 min to 10 min
maximum.
e) Record the contact time, which starts after drying is complete.
f) Make a record of the temperature and relative humidity in the laboratory during the contact time.
The test surfaces shall remain horizontal and in the ambient conditions, with the cover on the Petri
dish.
g) After a contact time of 0 (end of the drying time preferably <3 min to 10 min) to 1 h to 2 h, aseptically
transfer each surface into a separate recipient containing 10 ml of recovery liquid (4.2.3) and
sufficient glass beads (for example 5 g) to support the surface. The samples should be placed with
the inoculated surface downwards in contact with the beads. Manually stir the recipient for at least
1 min. Force shall be used so that the beads move freely under the test surface. Any additional
contact time can be done as long as the inoculum remain enough concentrated on the control
surface (4 log is the minimum).
h) After stirring (a neutralization time of 5 min ± 10 s can be necessary for certain surfaces), prepare
-1 -4
a series of decimal solutions, from 10 to 10 , of the mixture in the diluent (4.2.2). Take a double
sample of 1,0 ml of the initial mixture and of each of the dilutions, and inoculate the dishes using
the pour-plate technique.
i) Then filter the remaining liquid, i.e. about 7 ml, in the sterile filtration apparatus. Filter and rinse
the membrane three times using 50 ml of recovery liquid (4.2.3) previously poured into the flask
and stirred with the surface. Then, transfer the membrane onto the solidified agar medium for
counting.
j) Retrieve the test surface, allow the liquid to flow off, and rinse with 10 ml of water (4.2.1). Transfer
the surface into a Petri dish containing 10 ml of solidified TSA agar, placing the inoculated surface
side down onto the agar. Add 10 ml of molten TSA agar, cooled to 45 °C.
k) Incubate the dishes at 35 °C to 38 °C for 24 h ± 2 h. Discard any dishes which are not countable (for
any reason) and record the counts for the rest. Incubate the dishes for a further 24 h ± 2 h. Do not
repeat the count for colonies on dishes which no longer show well-separated colonies. Count them
again on the remaining dishes. Only the dishes with a number of colonies between 15 and 300 are
used to calculate the result. A deviation of 10 % is permitted. Therefore, the limits for the bacteria
are 14 and 330.
6.2.3 Reference surfaces (C and C )
0 xh
For each test strain, treat at least 3 reference surfaces according to the instructions in 6.2.2, at times 0
-2 -3 -4
and xh. For reference surfaces, use at least dilutions 10 , 10 and 10 for CFU counts.
The data corresponding to time 0 are identified as C . The data corresponding to the contact time x are
identified as C .
xh
Any additional contact time can be done as long as the inoculum remain enough concentrated on the
control surface (4 log is the minimum).
If a difference is detected between T and C then an activity is identified during the wet phase and
0 0
shall be mentioned in the test report.
6.2.4 Validation (V )
n
For each strain, it is necessary to validate the experimental conditions for each t
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7581
Première édition
2023-12
Évaluation de l’activité bactéricide
d’une surface antimicrobienne
non poreuse utilisée dans un
environnement sec
Evaluation of bactericidal activity of a non-porous antimicrobial
surface used in a dry environment
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Appareillage, réactifs et matériels .3
4.1 Organismes d’essai. 3
4.2 Milieux de culture et réactifs . 3
4.3 Surfaces de référence et surfaces d’essai . 4
4.3.1 Généralités . 4
4.3.2 Surfaces de référence . 5
4.3.3 Surfaces d'essai . 5
4.4 Appareillage et matériels . 6
5 Préparation des suspensions de microorganismes d’essai. 7
5.1 Cultures mères des bactéries d’essai . 7
5.2 Culture de travail des bactéries d’essai . 8
5.3 Suspensions d’essai . 8
5.4 Quantification des suspensions bactériennes d’essai . 8
5.5 Calcul de la concentration bactérienne moyenne pondérée dans les suspensions
d’essai . 9
6 Méthode d’évaluation de l’activité bactéricide d’une surface non poreuse et de son
efficacité . . .10
6.1 Conditions expérimentales obligatoires . 10
6.2 Mode opératoire d'essai. 10
6.2.1 Échantillonnage. 10
6.2.2 Essai (T et T ) . 10
0 xh
6.2.3 Surfaces de référence (C et C ) . 11
0 xh
6.2.4 Validation (V ).12
n
7 Résultats .12
7.1 Détermination du nombre de bactéries viables .12
7.2 Vérification de la méthodologie .13
7.3 Expression des résultats . 14
7.3.1 Réduction . 14
7.3.2 Conclusion: Activité bactéricide des surfaces non poreuses . 14
8 Rapport d’essai .15
Annexe A (normative) Souches de référence obligatoires correspondantes .16
Annexe B (informative) Rapport type d’essai de mesure d’activité bactéricide de surfaces
non poreuses .17
Annexe C (informative) Exemples de protocoles de préparation des surfaces.20
Annexe D (informative) Neutralisants .21
Annexe E (informative) Aide technique au dépôt de l’inoculum .23
Bibliographie .25
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO, participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner
l’utilisation d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité
et à l’applicabilité de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent
document, l’ISO n'avait pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa
mise en application. Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent
document que des informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de
brevets, disponible à l'adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 330, Surfaces aux propriétés biocides
et antimicrobiennes.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Les surfaces de notre environnement peuvent constituer des réservoirs de bactéries importants et un
risque pour la santé qu’il est indispensable de maîtriser.
Dans les établissements de santé, les infections associées aux soins (IAS) sont une cause majeure de
mortalité et d’invalidité au niveau mondial. Dans les pays développés, les IAS concernent 5 % à 15 %
des patients hospitalisés et peuvent affecter 9 % à 37 % des patients admis en unités de soins intensifs.
Aux États-Unis, au moins une infection nosocomiale est diagnostiquée annuellement sur environ un
patient hospitalisé sur 25. On estime à au moins cinq millions le nombre d’IAS survenant chaque année
dans les hôpitaux de soins aigus en Europe, provoquant 135 000 morts par an et environ 25 millions
de journées d’hospitalisation supplémentaires, ce qui représente une charge financière comprise
entre 13 et 24 milliards d’euros.
Dans les transports en commun, les risques de contamination entre voyageurs sont extrêmement élevés
compte tenu de la fréquence et du nombre de points de contact. Dans les établissements recevant du
public, l’ensemble des parties communes et des espaces collectifs constitue un risque de propagation
des microorganismes pathogènes.
Dans l’agroalimentaire, le risque microbien occupe le premier rang de ceux pouvant impacter la santé
du consommateur, devant les cas de malnutrition et de contamination chimique. En sus de l’impact
sanitaire, les conséquences d’une contamination microbienne sur l’image et la pérennité d’une
entreprise peuvent être désastreuses. Par exemple:
— on estime que 600 millions de personnes – près d’une sur dix dans le monde – tombent malades
après avoir mangé des aliments contaminés, que 420 000 personnes en meurent chaque année, et
qu’il en résulte une perte de 33 millions d’années de vie en bonne santé [espérance de vie corrigée
de l’incapacité];
— les pertes de productivité et les dépenses de santé provoquées par les aliments impropres à la
consommation dans les pays en développement représentent 110 milliards de dollars américains
par an;
— les enfants de moins de 5 ans supportent 40 % de la charge des maladies d’origine alimentaire,
avec 125 000 décès par an;
— les maladies les plus courantes imputables à la consommation d’aliments contaminés sont les
maladies diarrhéiques, qui touchent 550 millions de personnes et entraînent 230 000 décès chaque
année.
Cette volonté de maîtriser les risques microbiens s’étend à bien d’autres secteurs (transport,
pharmaceutique, aéronautique, cosmétique, phytosanitaire, prestations de services, etc.) pour ne pas
dire à l’ensemble du secteur de la production industrielle.
Les agents pathogènes peuvent être transmis de diverses manières, notamment par l'eau et les aliments,
par l'air (aérosols), par le contact corporel avec une personne infectée, par les surfaces contaminées,
par les sécrétions corporelles et les fomites. Les infections associées aux soins ou celles contractées
dans les établissements de santé sont, à l’échelle mondiale, les événements indésirables les plus
fréquents lorsque sont prodigués des soins de santé. Dans le monde entier, des centaines de millions
de patients sont touchés chaque année par des infections associées aux soins, avec pour conséquence
une mortalité importante et des pertes financières significatives pour les systèmes de santé. Sur
100 patients hospitalisés à un instant donné, 7 contracteront au moins une infection associée aux soins,
dans les pays développés, et 10 dans les pays en développement. Annuellement, de telles infections sont
la cause directe de 37 000 décès en Europe et de potentiellement beaucoup plus indirectement; aux
États-Unis, 99 000 décès y sont imputables. Dans le panel des outils disponibles pour réduire les risques
microbiens, les surfaces à propriétés biocides peuvent participer à la maîtrise des contaminations
croisées lorsqu’elles sont utilisées conjointement avec des procédures adéquates de nettoyage et de
désinfection.
v
La rédaction de ce document trouve sa genèse dans le besoin de démontrer l’efficacité biocide d’une
surface dans des conditions ambiantes proches des conditions de terrain. La méthode décrite dans
le présent document simule la contamination d’une surface par une microgouttelette. Par exemple,
ce mode de contamination est représentatif d'une contamination de surface suite à un éternuement
(les microgouttelettes excrétées pouvant avoir une mobilité de plusieurs mètres). Les températures et
l’humidité requises pour réaliser l’essai ont été définies par rapport à des conditions représentatives de
l’environnement des établissements de soins de santé.
Nombreuses sont les surfaces non poreuses à revendiquer des fonctions bactéricides:
— surfaces de matériaux qui ont été traitées avec un produit biocide ou qui contiennent un produit
biocide avec l'intention de conférer des propriétés bactéricides au matériau concerné, de manière
transitoire ou permanente;
— surfaces de matériaux comme certains métaux, revendiquant des propriétés bactéricides
intrinsèques.
La méthode indique les souches de base représentatives à soumettre à essai. Des souches additionnelles
peuvent être soumises à essai en fonction de l’utilisation prévue. Pour une utilisation donnée, d'autres
expériences incluant les conditions d'utilisation (substances salissantes, vieillissement, adaptation des
conditions environnementales) sont nécessaires pour démontrer l'activité bactéricide de la surface
soumise à essai telle qu'elle est revendiquée.
La présente méthode sera révisée dans un avenir proche pour inclure des substances interférentes et
adapter les spécifications relatives aux souches/temps de contact/efficacité aux besoins des différents
secteurs, en plus de la sphère médicale.
Les surfaces ayant des propriétés bactéricides complètent, mais ne remplacent pas l’utilisation
régulière de produits de traitement des surfaces (détergents, détergents-désinfectants et désinfectants
de surface), dont la compatibilité avec le maintien de l'activité bactéricide de la surface doit être
démontrée.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 7581:2023(F)
Évaluation de l’activité bactéricide d’une surface
antimicrobienne non poreuse utilisée dans un
environnement sec
AVERTISSEMENT — Les utilisateurs du présent document doivent avoir une connaissance des
techniques microbiologiques.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie les conditions d’essai et les niveaux d’activité pour déterminer l’activité
bactéricide des surfaces non poreuses utilisées dans un environnement sec. Il définit un protocole de
validation du caractère bactéricide d’une surface et de mesure de sa performance. Il n’est pas destiné à
être utilisé pour démontrer des propriétés nettoyantes ou désinfectantes.
Le présent document est applicable aux surfaces revendiquant une activité contre les bactéries
végétatives. Les conditions d’essai obligatoires sont définies dans le présent document. Il ne s’applique
pas aux surfaces poreuses.
Il ne fait pas référence à des méthodes d’essai des propriétés toxicologiques et écotoxicologiques des
surfaces. Le présent document permet de mesurer l'action bactéricide et non l'activité bactériostatique
d’une surface.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
EN 12353, Antiseptiques et désinfectants chimiques — Conservation des micro-organismes d’essai utilisés
pour la détermination de l’activité bactéricide (Legionella incluses), mycobactéricide, sporicide, fongicide et
virucide (bactériophages inclus)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
activité bactéricide
capacité d’une surface à réduire le nombre de cellules bactériennes viables appartenant à des
organismes d’essai (3.6) représentatifs, dans des conditions définies sans substances interférentes, ni
essai de vieillissement, ni adaptation des conditions d'essai à un secteur spécifique
Note 1 à l'article: Actuellement, le présent document n’inclut pas de condition de saleté ou de vieillissement.
3.2
activité bactériostatique
capacité d’une surface à inhiber le développement de cellules bactériennes viables appartenant à des
organismes d’essai (3.6) représentatifs, dans des conditions définies
Note 1 à l'article: Le terme «activité bactériostatique» ne peut être utilisé à des fins de revendications
conformément au présent document
3.3
condition additionnelle
conditions d’essai facultatives et non obligatoires, pouvant être utilisées pour des revendications
additionnelles d’activité bactéricide (3.1) concernant une surface
3.4
nettoyage
ensemble des opérations permettant d’assurer un niveau de propreté, d’aspect, de confort et d’hygiène
Note 1 à l'article: De telles opérations utilisent dans des proportions variables, les facteurs combinés suivants:
action chimique, action mécanique, température, durée d’action.
3.5
neutralisant
agent chimique ou formulation qui supprime l’activité microbicide résiduelle d’un produit ou d’une
substance active, de la surface à évaluer dans le cadre d’un essai spécifique mais qui n’a pas pour effet
d’inactiver ou d’inhiber l’organisme d’essai (3.6)
3.6
organisme d’essai
souche d’un microorganisme choisi pour évaluer l’activité antimicrobienne d’une surface dans le cadre
d’un essai normalisé
3.7
surface bactéricide
surface qui détruit de façon irréversible les bactéries végétatives dans des conditions définies
Note 1 à l'article: Le terme «bactéricide» a valeur de substantif ou d’adjectif, selon le cas.
3.8
surface de référence
surface dépourvue de propriété ou d’activité bactéricide (3.1) permettant d’évaluer la quantité de
bactéries cultivables présentes au moment où l’activité bactéricide de la surface d’essai (3.9) est évaluée
3.9
surface d'essai
surface revendiquant une activité bactéricide (3.1)
Note 1 à l'article: Cette méthode convient pour réaliser des essais sur tous les types de surfaces non poreuses
(telles que métaux, matériau plastique, verre, surfaces revêtues, etc.) dans la mesure où la récupération des
bactéries présentes sur la surface d’essai ne perd pas plus de 1 log à T = 0
Note 2 à l'article: Les surfaces hautement hydrophobes qui nécessitent un temps de séchage supérieur à 10 min
(voir 6.2.2) ne peuvent pas être testées selon cette méthode
3.10
luminosité ambiante
luminosité correspondant à une valeur maximale de 2 000 lux
Note 1 à l'article: Une luminosité ou un spectre lumineux spécifique (par exemple: forte luminosité, UV, etc.) ne
sont pas considérés comme «ambiants».
3.11
surface poreuse
surface perméable à l’eau, à l’air ou à tout autre fluide
4 Appareillage, réactifs et matériels
4.1 Organismes d’essai
L’activité bactéricide doit être évaluée en utilisant les quatre souches suivantes:
— Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 = CIP 103-467;
— Staphylococcus aureus ATCC 6538 = CIP 4.83;
— Enterococcus hirae ATCC 10541 = CIP 5855;
— Escherichia coli ATCC 10536 = CIP 54127.
Les numéros de souches de référence dans d'autres collections de cultures doivent être conformes aux
souches spécifiées à l’Annexe A.
Les données d’activité peuvent être complétées par d’autres souches en s’appuyant sur le schéma
expérimental décrit dans le présent document, en faisant varier les conditions selon les besoins de la
ou des applications pratiques envisagées. Si des souches additionnelles sont utilisées, elles doivent être
incubées dans des conditions de croissance optimale (température, temps, atmosphère) qui doivent
être mentionnées dans le rapport d’essai.
Leur aptitude à fournir l’inoculum et des témoins de concentration suffisants doit être vérifiée. Si
ces souches d’essai additionnelles ne sont pas répertoriées dans un centre de collection de cultures,
il est indispensable de mentionner leurs caractéristiques d’identification. De plus, elles doivent être
référencées et conservées par le laboratoire d’essai ou le centre national de collection de cultures,
pendant une durée de cinq ans.
NOTE L’ISO/TC 330 procède actuellement à l’adaptation de la méthode en ce qui concerne les souches/les
niveaux d’efficacité/les temps de contact/les substances interférentes selon les besoins des différents secteurs et
pour inclure d’autres domaines que le médical.
4.2 Milieux de culture et réactifs
Les réactifs doivent être de qualité analytique et/ou adaptés aux usages microbiologiques. Ils doivent
être exempts de substances toxiques ou inhibitrices pour les organismes d’essai.
4.2.1 Eau, qui doit être exempte de toute substance toxique ou inhibant les bactéries. Ce doit être
de l’eau fraîchement distillée sur verre ou pour préparations injectables ou éventuellement de l'eau
désionisée ou non déminéralisée.
Stériliser à l’autoclave (4.4.1).
NOTE Si l’eau est stérilisée au cours de la stérilisation des réactifs, cela n’est pas nécessaire.
4.2.2 Diluant des suspensions microbiennes
Solution tryptone-sel:
Tryptone, digestion pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau (voir 4.2.1) 1 000 ml
Stériliser à l’autoclave (voir 4.4.1). Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 7,0 ± 0,2 pour
une mesure à 20 °C.
4.2.3 Liquide de récupération des bactéries et de rinçage des membranes
4.2.3.1 Composition
Tryptone, digestion pancréatique de caséine 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Polysorbate 80 5,0 g
Eau (voir 4.2.1) 1 000 ml
4.2.3.2 Préparation
a) Dissoudre le chlorure de sodium et le tryptone dans l’eau (voir 4.2.2). Ajouter le polysorbate 80,
mélanger et compléter à 1 000 ml avec de l’eau.
b) Répartir dans des fioles adaptées de petite taille. Stériliser à l'autoclave.
c) Si nécessaire, ajouter un neutralisant dans le liquide de récupération.
L’utilisation d’un neutralisant validé pour la substance active antimicrobien concerné est obligatoire
pour garantir une durée d’essai correcte, pour la récupération des bactéries et le rinçage des membranes
(voir 4.2.3): la qualité du neutralisant concerné doit être validée en amont. Le neutralisant:
— doit être validé au regard de la surface soumise à essai, conformément à 6.2.4 et il doit être stérile;
— doit être mentionné dans le rapport d’essai.
Des exemples de neutralisants sont donnés dans l'Annexe D.
4.2.4 Gélose pour l’entretien et le dénombrement des bactéries [(tryptone soja agar (TSA)]
Utiliser la gélose pour conserver les souches bactériennes et dénombrer les bactéries viables.
Tryptone, digestion pancréatique de caséine 15,0 g
Peptone de soja, digestion papaïnique de farine de soja 5,0 g
Chlorure de sodiume 5,0 g
Gélose 15,0 g
Eau (voir 4.2.1) 1 000 ml
Stériliser à l'autoclave. Après stérilisation, le pH du milieu doit être équivalent à 7,2 ± 0,2 lorsque
mesuré à 20 °C. Les boîtes de gélose TSA prêtes à l'emploi sont acceptables si leur composition et leur
pH correspondent aux conditions décrites en 4.2.4.
4.3 Surfaces de référence et surfaces d’essai
4.3.1 Généralités
Les surfaces doivent être utilisées une seule fois.
4.3.2 Surfaces de référence
4.3.2.1 Description
Disque en acier inoxydable, de 2 cm de diamètre, dont les deux faces ont une finition de grade 2B. Les
surfaces doivent être planes.
Pour le test de la surface revêtue, s'il existe une surface revêtue sans agent antimicrobien (la surface
d'essai), elle peut être utilisée comme surface de référence comme l’inox et peut donc être utilisée pour
le calcul de la réduction logarithmique.
La surface de référence utilisée pendant l’essai doit être spécifiée dans le rapport d’essai.
4.3.2.2 Nettoyage — Désinfection/stérilisation
Les surfaces de référence doivent être nettoyées et désinfectées avant utilisation.
Si un protocole de préparation spécifique est appliqué à la surface d’essai (voir exemples en Annexe C), il
convient d’appliquer le même protocole à la surface de référence (voir 4.3.3.2). Sinon, il est recommandé
d’utiliser le protocole indiqué en exemple 1 dans l’Annexe C.
Aucune action résiduelle ou modification des propriétés antimicrobiennes ne doit résulter de la
procédure de désinfection/nettoyage de la surface de référence.
Le traitement appliqué à la surface de référence pendant l’essai doit être spécifié dans le rapport d’essai.
4.3.3 Surfaces d'essai
4.3.3.1 Identification et fabrication
Les caractéristiques (par exemple dimensions, épaisseur, etc.) et références du produit fini doivent être
définies et précisées dans le rapport d’essai final.
Si la surface d'essai est traitée avec un produit bactéricide, la nature de la ou des substances actives
doit être précisée au laboratoire pour des raisons de sûreté et de sécurité, et indiquée dans le rapport
d’essai final. Pour les surfaces avec un revêtement de porosité inconnue (par exemple, des peintures),
la récupération des microorganismes doit être vérifiée par le laboratoire en comparant la surface
revêtue avec l’agent microbien et la surface de référence (C0 vs T0) ou la surface revêtue avec et sans
agent antimicrobien afin de s’assurer de la précision de l’évaluation de la réduction bactérienne. La
récupération des bactéries présentes sur la surface d’essai ne doit pas perdre plus de 1 log à T = 0 en
comparaison avec la surface de référence.
La surface d’essai doit être fabriquée à partir des matériaux prévus pour le produit fini pour lequel
l’activité bactéricide est revendiquée et selon les mêmes étapes de fabrication que celles prévues pour
la production finale. S’il est impossible de réaliser les étapes sur les mêmes équipements, il est permis
d’utiliser une simulation représentative de ces étapes.
La surface d'essai doit présenter des surfaces planes et mesurer entre 12 mm et 25 ± 2 mm de côté ou
de diamètre. S'il est impossible de découper la surface d'essai en carrés ou disques de cette taille, des
tailles et formes différentes peuvent être utilisées. Dans ce cas, les dimensions réelles utilisées seront
indiquées dans le rapport d’essai. Toute modification apportée au protocole (volume de récupération,
etc.) en raison des dimensions de la surface d'essai doit être précisée dans le rapport d’essai
L’uniformité de chaque surface d'essai doit faire l’objet d’un contrôle à l'œil nu. Les surfaces d'essai dont
la surface ou les bords présentent des anomalies doivent être mises au rebut (par exemple, corrosion/
rouille, éclats, rainures ou stries profondes, etc.).
4.3.3.2 Nettoyage — Désinfection/stérilisation
Toutes les surfaces d’essai doivent être rincées à l’eau distillée stérile avant de conduire les essais.
Si nécessaire, la désinfection ou la stérilisation peut être réalisée en fonction de la nature de la surface,
selon les indications du fabricant, et détaillées dans le rapport d’essai. Le fabricant doit proposer/valider
l’ensemble du traitement. Si nécessaire, des essais préliminaires doivent être réalisés pour définir le
traitement adapté de façon à ne pas altérer l’efficacité des surfaces soumises à essai. Ces essais peuvent
conduire à une adaptation de la méthodologie décrite en 4.3.2.2, la surface de référence et la surface
d'essai devant être soumises à un traitement identique.
Aucune action résiduelle ou modification des propriétés antimicrobiennes ne doit résulter du mode
opératoire de désinfection/nettoyage sur la surface de référence et la surface d’essai.
L’Annexe C contient des exemples de protocoles de préparation des surfaces.
Le traitement appliqué à la surface d’essai pendant l’essai doit être spécifié dans le rapport.
4.4 Appareillage et matériels
Stériliser toute la verrerie et tous les éléments de l’appareillage qui entrent en contact avec les milieux
de culture et les réactifs ou l’échantillon, à l’exception de ceux qui sont fournis stériles, par l’une des
méthodes suivantes:
— dans l’autoclave (voir 4.4.1), en les maintenant entre 121 °C et 124 °C pendant au moins 15 min;
— dans le four à air chaud (voir 4.4.1), en les maintenant à 180 °C pendant au moins 30 min, à 170 °C
pendant au moins 1 h ou à 160 °C pendant au moins 2 h.
Utiliser le matériel courant de laboratoire de microbiologie et, en particulier:
4.4.1 Appareils de stérilisation
— Pour la stérilisation par vapeur, un autoclave pouvant être maintenu entre 121 °C et 124 °C pendant
au moins 15 min.
— Pour la stérilisation par chaleur sèche, un four à air chaud pouvant être maintenu entre 180 °C
et 185 °C pendant au moins 30 min, entre 170 °C et 175 °C pendant au moins 1 h, ou entre 160 °C
et 165 °C pendant au moins 2 h.
4.4.2 Bains d’eau. Bain thermostaté à 45 °C ± 1 °C.
4.4.3 Incubateurs
— Incubateurs pouvant être maintenus dans la plage de 35 °C à 38 ± 1 °C.
— Incubateurs thermostatés aux températures d’essai définies (hors température ambiante).
4.4.4 pH-mètre, ayant une exactitude de ±0,1 unité de pH à 20 °C ± 1 °C
Pour mesurer le pH des milieux gélosés, utiliser une électrode de pénétration ou une électrode à embout
plat.
4.4.5 Thermomètre ou sonde de température calibré(e) ayant une exactitude de ±1 °C.
4.4.6 Appareil de mesure de l'humidité relative calibré ayant une exactitude de ±2 % d’HR.
4.4.7 Appareil de mesure de la luminosité.
4.4.8 Chronomètre.
4.4.9 Agitateur électromécanique ou mécanique.
4.4.10 Réfrigérateur, dont la température peut être réglée entre 2 °C et 8 °C.
4.4.11 Pipettes graduées, de capacité nominale de 10 ml, 2 ml, 1 ml et 0,1 ml. Il est permis d’utiliser
des pipettes à calibrage automatique en particulier pour les petits volumes (dépôt de l’inoculum).
4.4.12 Boîtes de Petri, de 90 mm à 100 mm de diamètre. Des boîtes de Petri de 55 mm peuvent être
utilisées pour les membranes.
4.4.13 Billes de verre (diamètre: de 3 mm à 5 mm).
4.4.14 Balance analytique de portée adaptée.
4.4.15 Spectrophotomètre équipé d’un monochromateur.
4.4.16 Pompe à vide (débit maximal 3,8 m /h, vide final < 7,5 kPa).
4.4.17 Membranes filtrantes stériles de porosité 0,45 µm (diamètre 47 mm à 50 mm) en ester de
cellulose ou en tout autre matériau adapté.
4.4.18 Microscope, équipé d’objectifs × 40 et × 100 à immersion (contrôles de pureté après coloration:
examen visuel des souches).
4.4.19 Pinces.
4.4.20 Tubes à essai stériles en verre neutre, de diamètre 18 mm ou 20 mm.
4.4.21 Récipients: fioles ou flacons de capacité adéquate pour l'utilisation prévue.
4.4.22 Enceinte de sécurité biologique, classe II (pouvant également servir lors de l’étape de séchage
des inoculums).
4.4.23 Congélateur avec une température inférieure ou égale à – 70 °C.
4.4.24 Appareil de filtration sur membrane, fabriqué en un matériau compatible avec les
constituants du filtrat.
L’appareil doit être équipé d’un entonnoir d’une capacité au moins égale à 50 ml. Il doit être adapté à
une utilisation avec des filtres de 47 mm à 50 mm de diamètre et de 0,45 µm de porosité. La source
de vide utilisée doit assurer un débit de filtration régulier. Pour obtenir une répartition uniforme des
microorganismes sur la membrane et éviter une filtration trop longue, la vitesse de filtration ciblée est
de 100 ml de liquide de rinçage en moins de 40 secondes.
4.4.25 Chambre ou enceinte climatique/étanche permettant un contrôle de la température et de
l’humidité relative.
5 Préparation des suspensions de microorganismes d’essai
5.1 Cultures mères des bactéries d’essai
Les microorganismes d’essai et leurs cultures mères doivent être préparés et conservés conformément
aux exigences de l’EN 12353.
5.2 Culture de travail des bactéries d’essai
Pour préparer la culture de travail des microorganismes d’essai, préparer une subculture à partir de
la culture mère (voir 5.1) en ensemençant en stries des tubes inclinés ou des boîtes (4.2.4) de gélose
TSA avant de les incuber (voir 4.4.3.). Après 18 h à 24 h d’incubation, préparer de la même manière une
deuxième subculture à partir de la première et l'incuber pendant 18 h à 24 h. Une troisième subculture
peut être réalisée de la même façon à partir de la deuxième.
La deuxième et/ou la troisième subcultures constituent les cultures de travail.
S’il n’est pas possible de préparer la deuxième subculture un jour particulier, il est admis d’utiliser une
subculture de 48 h ± 2 h pour repiquage ultérieur, à condition que ladite subculture ait été maintenue
dans l’incubateur pendant la période de 48 h ± 2 h. Dans ce cas, préparer une autre subculture
de 24 heures avant de faire l’essai. Ne pas réaliser de quatrième subculture.
Dans le cas de souches additionnelles (voir 4.1), tout écart par rapport à cette méthode de culture des
bactéries ou de préparation des suspensions d’essai doit être noté dans le rapport d’essai, en indiquant
les raisons qui ont justifié cet écart.
5.3 Suspensions d’essai
Prélever 10 ml de diluant (voir 4.2.2) et les introduire dans une fiole ou un récipient de 100 ml avec 5 g
de billes de verre stériles (voir 4.4.13). Prélever à l’anse la culture de travail (voir 5.2) et transférer
les prélèvements dans le diluant. Les cellules doivent être mises en suspension dans le diluant en
immergeant l’anse et en la frottant contre la paroi du récipient pour en détacher les cellules. Agiter le
récipient pendant 3 min à l’aide d’un agitateur mécanique (voir 4.4.9). Aspirer la suspension en laissant
au fond les billes de verre, puis la transférer dans une autre fiole. Ajuster le nombre de cellules de la
8 8 1)
suspension à une valeur comprise entre 1,510 ufc/ml et 5,0 10 ufc/ml à l’aide du diluant, en estimant
le nombre d’unités par un moyen approprié (à savoir par spectrophotométrie). La suspension doit être
utilisée dans les 2 h suivant sa préparation. Pour les bactéries à Gram négatif, utiliser la partie haute de
l’inoculum.
Il appartient au laboratoire réalisant les essais de s’assurer de la précision des titres obtenus lors des
essais préliminaires.
5.4 Quantification des suspensions bactériennes d’essai
−6 −7
Diluer les suspensions bactériennes ajustées à 10 (dilutions sérielles) et 10 à l’aide du diluant (voir
4.2.2). Mélanger la suspension (voir 4.4.9).
Prélever en double un échantillon de 1,0 ml de chaque dilution et inoculer par la technique
d’ensemencement en profondeur. À l’aide d’une pipette, introduire chaque échantillon de 1,0 ml dans
des boîtes de Petri (voir 4.4.12) distinctes et ajouter 15 ml à 20 ml de gélose TSA en surfusion (voir
4.2.4).
La technique de dénombrement en surface peut également être utilisée. Dans ce cas, utiliser 100 µl de
−5 −6
suspensions bactériennes ajustées à 10 et 10 (dilutions sérielles).
Incuber les boîtes dans la plage de 35 °C à 38 °C ± 1 °C pendant 24 h ± 2 h. Éliminer les boîtes dont
les colonies ne peuvent pas être dénombrées (pour quelque raison que ce soit). Incuber les boîtes
pendant 24 h ± 2 h supplémentaires. Ne pas procéder au dénombrement sur les boîtes dont les colonies
ne peuvent pas être dénombrées. . Recompter les boîtes restantes.
Déterminer le plus grand nombre de colonies pour chaque échantillon.
Voir 6.2.2 i) pour l’incubation et le dénombrement.
1) ufc = unité formant colonie
5.5 Calcul de la concentration bactérienne moyenne pondérée dans les suspensions
d’essai
a) Éliminer toutes les boîtes dont les colonies ne peuvent pas être dénombrées (pour quelque raison
que ce soit). Déterminer le nombre total d'ufc par boîte. Ne pas dénombrer de nouveau celles où
les colonies ne se présentent plus de façon bien séparée. Recompter les boîtes restantes au bout
de 48 h. Si le nombre a augmenté, ne retenir que le nombre le plus élevé pour les calculs ultérieurs.
b) Seules les boîtes présentant un nombre de colonies comprises entre 14 et 330 pour les bactéries
sont utilisées pour calculer le résultat.
Calculer les valeurs moyennes pondérées de la suspension d’essai à l’aide de la Formule (1):
c
X = ×d (1)
nn+01,
()
où
X est la concentration de la suspension initiale en ufc/ml (se référer à 7.2);
c est le nombre total de bactéries viables cultivables (Vc) prises en compte;
n est le nombre des valeurs de Vc prises en compte dans la plus faible dilution
n est le nombre des valeurs de Vc prises en compte dans la plus forte dilution;
d est le taux de dilution correspondant à la plus faible dilution.
Exemples de calculs pour la technique d’ensemencement en profondeur:
Exemple 1:
V pour n : 215 et 230
c 1
V pour n : 25 et 30
c 2
c = 215 + 230 + 25 + 30 = 500
−6
n est le nombre des valeurs de Vc prises en compte dans la plus faible dilution, à savoir 10 ; 2
−7
n est le nombre des valeurs de Vc prises en compte dans la plus forte dilution, à savoir 10 ; 2
X = ×10
()22,
Ainsi
X= 2,27. 10 ufc/ml (8,36 log ufc/ml)
Exemple 2:
V pour n : 312 et 342 (>330: non inclus)
c 1
V pour n : 32 et 35
c 2
c = 312 + 32 + 35 = 379
−6
n est le nombre des valeurs de Vc prises en compte dans la plus faible dilution, à savoir 10 ; 1
−7
n est le nombre des valeurs de Vc prises en compte dans la plus forte dilution, à savoir 10 ; 2
X = ×10
12,
()
X = 3,16. 10 ufc/ml (8,50 log ufc/ml)
6 Méthode d’évaluation de l’activité bactéricide d’une surface non poreuse et de
son efficacité
6.1 Conditions expérimentales obligatoires
Pour la détermination de l’activité bactéricide d’une surface non poreuse, les conditions expérimentales
définies sont les suivantes:
a) la température d’essai doit être de 20 ± 1 °C; il est possible de choisir des températures additionnelles
qui doivent alors être notées dans le rapport d’essai;
b) l’humidité relative doit être comprise entre 30 % et 65 %; il est possible de choisir des niveaux
additionnels d’humidité relative qui doivent alors être notés dans le rapport d’essai;
c) luminosité ambiante;
d) temps de contact; t (minutes) minimum: 60 min ± 10 s jusqu’à un maximum de 120 min ± 10 s;
e) souches: elles doivent correspondre à celles spécifiées en 4.1 et à l’Annexe A.
Des conditions additionnelles (luminosité, souches, temps de contact) peuvent être mises en œuvre
selon le protocole décrit, dans la mesure où tous les critères de validation de l’essai sont respectés et
notés dans le rapport d’essai.
L’essai doit être conduit en utilisant une chambre étanche ou une enceinte climatique (voir 4.4.25).
6.2 Mode opératoire d'essai
6.2.1 Échantillonnage
Chaque essai visant à évaluer l’activité bactéricide doit être réalisé sur au moins trois surfaces d’essai
et surfaces de référence. En définitive, huit surfaces d'essai (et six surfaces de référence pour 6.2.3)
constituent le minimum pour effectu
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.
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