Water quality -- Determination of the growth inhibition effects of waste waters, natural waters and chemicals on the duckweed Spirodela polyrhiza -- Method using a stock culture independent microbiotest

ISO 20227:2017 specifies a method for the determination of the inhibition of the growth of the first fronds of Spirodela polyrhiza germinated from turions, by substances and mixtures contained in water or waste water, including treated municipal waste water and industrial effluents. The test is also applicable to pure chemicals and in particular, plant protection products and pesticides.

Qualité de l'eau -- Détermination des effets d'inhibition sur la croissance de la lentille d'eau Spirodela polyrhiza par les eaux usées, les eaux naturelles et les produits chimiques -- Méthode utilisant un bioessai miniaturisé indépendant d'une culture mère

L'ISO 20227 :2017 spécifie une méthode permettant de déterminer l'inhibition de la croissance des premičres frondes de Spirodela polyrhiza ayant germé ŕ partir de turions, provoquée par des substances et des préparations contenues dans les eaux ou les eaux résiduaires, y compris les eaux résiduaires urbaines aprčs traitement et les effluents industriels. L'essai s'applique également aux produits chimiques purs et, en particulier, aux produits phytopharmaceutiques et aux pesticides.

General Information

Status
Published
Publication Date
14-Jun-2017
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
09-Apr-2017
Completion Date
15-Jun-2017
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ISO 20227:2017 - Water quality -- Determination of the growth inhibition effects of waste waters, natural waters and chemicals on the duckweed Spirodela polyrhiza -- Method using a stock culture independent microbiotest
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ISO 20227:2017 - Qualité de l'eau -- Détermination des effets d'inhibition sur la croissance de la lentille d'eau Spirodela polyrhiza par les eaux usées, les eaux naturelles et les produits chimiques -- Méthode utilisant un bioessai miniaturisé indépendant d'une culture mère
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20227
First edition
2017-06
Water quality — Determination of
the growth inhibition effects of waste
waters, natural waters and chemicals
on the duckweed Spirodela polyrhiza
— Method using a stock culture
independent microbiotest
Qualité de l’eau — Détermination des effets d’inhibition sur la
croissance de la lentille d’eau Spirodela polyrhiza par les eaux usées,
les eaux naturelles et les produits chimiques — Méthode utilisant un
bioessai miniaturisé indépendant d’une culture mère
Reference number
ISO 20227:2017(E)
ISO 2017
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ISO 20227:2017(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland

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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

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ii © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 20227:2017(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Test organisms ........................................................................................................................................................................................................ 3

6 Growth medium ..................................................................................................................................................................................................... 3

6.1 Preparation of stock solutions ................................................................................................................................................... 4

6.2 Preparation of the final concentration of modified Steinberg medium ................................................. 4

7 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 4

8 Reference chemicals ......................................................................................................................................................................................... 5

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 Germination of the Spirodela polyrhiza turions .......................................................................................................... 5

9.2 Tests on effluents (and waste waters) ................................................................................................................................ 5

9.2.1 Addition of concentrated growth medium to the effluent sample ....................................... 5

9.2.2 Preparation of the effluent dilutions .............................................................................................................. 6

9.2.3 Procedure ............................................................................................................................................................................... 6

9.3 Tests on chemical compounds ................................................................................................................................................... 7

9.3.1 Range finding test ........................................................................................................................................................... 7

9.3.2 Definitive test ...................................................................................................................................................................... 8

9.4 Filling of the test plate with the toxicant dilutions .................................................................................................. 9

9.4.1 General...................................................................................................................................................................................... 9

9.4.2 Procedure ............................................................................................................................................................................... 9

9.5 Transfer of the germinated turions in the test cups ............................................................................................10

9.6 Photo of the multiwell at the start of the toxicity test ........................................................................................10

9.7 Incubation of the multiwell .......................................................................................................................................................10

9.8 Photo of the multiwell at the end of the toxicity test ..........................................................................................11

9.9 Measurement of the area of the first fronds ...............................................................................................................11

10 Data treatment — Calculation of the growth inhibition ...........................................................................................11

11 Validity criterion ...............................................................................................................................................................................................12

12 Test sensitivity .....................................................................................................................................................................................................12

13 Test with reference chemicals .............................................................................................................................................................12

14 Test report ................................................................................................................................................................................................................15

Annex A (informative) Spirodela polyrhiza stock culturing for turion production ...........................................16

Annex B (informative) Sensitivity of the Spirodela polyrhiza microbiotest ..............................................................17

Annex C (informative) Performance data .....................................................................................................................................................19

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20

© ISO 2017 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20227:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5,

Biological methods.
iv © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20227:2017(E)
Introduction

Duckweeds are free-floating higher water plants commonly used in ecotoxicological research for the

assessment of the toxicity of waste waters, natural waters and chemicals (see ISO 20079 and References

[6] to [11] and in particular plant protection products, see Reference [12]).

Duckweeds are fast growing plants, many of which have a cosmopolitan distribution, and they are, hence,

well suited as primary producers for hazard assessment of pollutants in freshwater environments.

Contrary to terrestrial plants, for which bioassays can be started from the “dormant” life stages (seeds),

toxicity tests with duckweeds require continuous culturing and maintenance of live stocks, with the

inherent biological, technical and financial costs.

A few duckweed species, however, produce dormant vegetative buds (turions) which can be stored

for long periods of time, and which can be germinated on demand at the time of performance of the

bioassay.

One of the duckweeds producing turions is Spirodela polyrhiza, and this species was eventually selected

for a simple and practical microbiotest which is independent of the stock culturing and maintenance of

live stocks.

Spirodela polyrhiza was found to be as sensitive to toxicants as the conventional bioassays with

duckweeds.

The microbiotest procedure for this document involves a 3 d germination of the turions, followed by a

3 d toxicity test in a multiwell test plate, with determination of the growth inhibition of the first fronds

via image analysis.
The Spirodela polyrhiza microbiotest is very simple and easy to perform:

a) the assay does not require culturing or maintenance of live stocks of the test species, and can be

performed “anytime, anywhere” by the use of stored turions;

b) stored turions have a shelf life of several months with a high germination success;

c) the microbiotest requires minimal bench and incubation space, and minimal equipment;

d) the area measurements of the first fronds do not need to be made immediately and can be

postponed to an appropriate timing;

e) the area measurements by image analysis are very rapid and precise, and take less than 1 h for a

complete test.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20227:2017(E)
Water quality — Determination of the growth inhibition
effects of waste waters, natural waters and chemicals on
the duckweed Spirodela polyrhiza — Method using a stock
culture independent microbiotest

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to

ensure compliance with any national regulatory conditions.

IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this document be

carried out by suitably trained staff.
1 Scope

This document specifies a method for the determination of the inhibition of the growth of the first

fronds of Spirodela polyrhiza germinated from turions, by substances and mixtures contained in water

or waste water, including treated municipal waste water and industrial effluents.

The test is also applicable to pure chemicals and in particular, plant protection products and pesticides.

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples

3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
effective concentration

concentration of the test sample at which an effect of x % is measured, if compared to the control

3.2
frond
leaf-like structure which develops from a germinated turion
3.3
growth
increase in biomass over time as the result of proliferation of new tissues

Note 1 to entry: In this test, it refers to the increase in size of the first frond developing from a germinated turion.

© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 20227:2017(E)
3.4
growth medium
combination of dilution water and/or nutrient medium used in the test

Note 1 to entry: In this test, it refers to the nutrient medium used for the germination of the turions and the

growth of the fronds.
3.5
inoculum

transfer of a germinated turion with its small frond in all the test wells at the start of the toxicity test

3.6
pure water
deionized or distilled water with a conductivity below 10 µS/cm
[SOURCE: ISO 19827:2016, 3.4]
3.7
root

part of the Spirodela polyrhiza plant that assumes a root-like structure and develops underneath a frond

3.8
stock culture
culture of a single species of duckweed for the production of the turions
3.9
test medium

combination of test sample, dilution water and/or nutrient medium used in the test

[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.23]
3.10
test sample

discrete portion of a sample (taken from i.e. receiving water, waste water, dissolved chemical substances

or mixtures, products and compounds) pre-treated according to the needs of this test (e.g. dissolution,

filtering, neutralisation)
3.11
turion

small vegetative bud which develops from a colony of the duckweed under specific environmental

conditions
4 Principle

Turions produced by culturing Spirodela polyrhiza, or taken from test tubes in which they are stored

(see Annex A) are transferred to a Petri dish containing growth medium, and incubated for 3 d at 25 °C

−2 −1

with continuous illumination of at least 6 000 lx (corresponding approximately to 85 µE m s ).

During this time, the turions germinate and produce a small (first) frond (see Figure 1).

One germinated turion with its first frond is then taken from the Petri dish and inoculated into each

cup of a 6 × 8 multiwell test plate which contains the toxicant dilutions and the negative control (each of

which is prepared in growth medium).
2 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 20227:2017(E)
Key
1 turion
2 first frond

Figure 1 — Enlargement of a germinated turion with its first frond, in a cup of the test plate

On completion of the inoculations, a photo of the multiwell is taken (at t = 0 h) with a digital camera and

transferred to a computer file.

The multiwell is subsequently incubated for 3 d at (25 ± 1) °C with continuous illumination of minimum

6 000 lx, after which a photo is again taken (at t = 72 h) and transferred to a computer file.

The area of the first frond in each test cup is measured with the aid of an image analysis programme, on

the two photos of the multiwell (i.e. taken at t = 0 h and at t = 72 h).

The growth of the first fronds in the controls and in the test concentrations or dilutions is calculated as

the difference between the t = 72 h areas and the t = 0 h areas, after which the growth inhibition and

the 72 h EC or EC values are determined.
50 x
5 Test organisms

The test species used in this document is the duckweed Spirodela polyrhiza (L.) Schleid.

The test organisms are obtained by germination of (stored) turions.

Turions can be produced in the laboratory according to the procedure described in Annex A.

They can also be purchased from a commercial source .
6 Growth medium

The growth medium (3.4) used for the germination of the turions and the growth of the duckweeds

[2]

during the toxicity test is the modified Steinberg medium which is described and used in ISO 20079

and the OECD guideline for testing chemicals (Reference [8]).
This medium is also used to prepare the toxicant dilutions.

The growth medium is composed of macroelements and microelements of which stock solutions are

prepared according to Table 1 and Table 2 respectively.

1) The turions supplied by MicroBioTests Inc. are an example of a suitable product available commercially. This

information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO

of this product.
© ISO 2017 – All rights reserved 3
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ISO 20227:2017(E)
6.1 Preparation of stock solutions

Prepare the eight stock solutions by adding the prescribed weight of the chemicals to 1 l of pure

water (3.6).
Table 1 — Macroelements stock solutions
Macroelements (50-fold concentrated) g/l
KNO 17,50
Stock solution 1 KH PO 4,5
2 4
K HPO 0,63
2 4
Stock solution 2 MgSO ·7H O 5,00
4 2
Stock solution 3 Ca(NO ) ·4H O 14,75
3 2 2
Table 2 — Microelements stock solutions
Microelements (1 000-fold concentrated) mg/l
Stock solution 4 H BO 120,00
3 3
Stock solution 5 ZnSO ·7H O 180,00
4 2
Stock solution 6 Na MoO ·2H O 44,0
2 4 2
Stock solution 7 MnCl ·4H O 180,00
2 2
Stock solution 8 FeCl ·6H O 760,00
3 2
EDTA disodium-dihydrate 1 500,00

Stock solutions 2 and 3, and 4 to 7 may be pooled (taking into account the required concentrations).

6.2 Preparation of the final concentration of modified Steinberg medium

Add 20 ml each of stock solutions 1, 2 and 3 to about 900 ml pure water (3.6) in a 1 l volumetric flask.

Then add 1,0 ml each of stock solutions 4, 5, 6, 7 and 8.
Fill the volumetric flask to 1 000 ml with pure water.

The pH of the growth medium shall be 5,5 ± 0,2 and shall be adjusted with either HCl or NaOH.

Once prepared, the growth medium has a relatively short shelf life and shall be used within two weeks

after preparation.
7 Apparatus
Usual laboratory equipment and in particular the following.

7.1 Temperature-controlled cabinet or room, or incubator, with white fluorescent light providing

continuous uniform illumination of at least 6 000 lx at the surface of the turion germination Petri dish

and the multiwell test plate.

7.2 Lux meter, for the measurement of the light intensity at the surface of the turion germination Petri

dish and the multiwell test plate.
7.3 pH meter, for checking and/or adjustment of the pH of the growth medium.

7.4 Laboratory glassware, for the preparation of the test concentrations (volumetric flasks, graduated

cylinders, pipettes, test tubes).
4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 20227:2017(E)
7.5 Petri dishes, diameter 9 cm, with lid, for the germination of the turions.
7.6 Microsieve, 100 µm mesh, for rinsing the stored turions.
7.7 Multiwells, 6 × 8 cups, as test plates.

7.8 Plastic spatula, for the transfer of the germinated turions in the multiwell cups.

7.9 Digital camera, to take a picture of the multiwell with the growing duckweeds.

7.10 Image analysis system, for the measurement of the area of the first fronds.
8 Reference chemicals
8.1 3,5-dichlorophenol, analytical grade > 99 % purity.
8.2 Potassium chloride, KCl, analytical grade > 99 % purity.
9 Procedure
9.1 Germination of the Spirodela polyrhiza turions

When using turions from a culture of Spirodela polyrhiza, place the turions in a Petri dish (7.5) and pour

30 ml growth medium (3.4) into it.

Starting from stored turions, take a tube with stored turions and shake it slightly to re-suspend the

turions.

Pour the contents of the tube in the microsieve (7.6) and rinse with pure water (3.6) to remove the

storage medium.
Put 10 ml growth medium (3.4) in the Petri dish (7.5).

Turn the microsieve upside down and flush all the turions in the Petri dish by pouring 10 ml growth

medium over the surface of the microsieve.
Fill the Petri dish further by adding 10 ml growth medium.

Cover the Petri dish with the transparent lid and place it in the incubator or in the temperature

conditioned room (7.1).

Incubate the Petri dish for 3 d (72 ± 1) h at (25 ± 1) °C, with continuous illumination (at least 6 000 lx at

the surface of the Petri dish).

NOTE Both germination of the turions and the growth of the first fronds are very substantially dependent

on temperature and illumination conditions. It is therefore important that the prescribed values of temperature

and illumination be respected as closely as possible.
9.2 Tests on effluents (and waste waters)
Sampling and samples preparation shall be done according to ISO 5667-16.
9.2.1 Addition of concentrated growth medium to the effluent sample
Transfer about 80 ml effluent in a 100 ml calibrated flask.
© ISO 2017 – All rights reserved 5
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ISO 20227:2017(E)

Add 2 ml of each of the stock solutions 1, 2 and 3, and 100 µl of each of the stock solutions 4, 5, 6, 7 and

8 to the calibrated flask.

Fill the flask to the 100 ml mark with the effluent, stopper the flask and shake thoroughly to homogenize

the contents.

NOTE The addition of 6,5 ml growth medium (3.4) to 93,5 ml effluent, dilutes the effluent sample by about

6 %. This means that the highest effluent concentration which will be tested is about 94 % of the original

effluent sample.
9.2.2 Preparation of the effluent dilutions

A common procedure for the preparation of the dilution series is described in the following text.

Depending on the purpose of the test and the statistical requirements concerning the test results, other

dilution designs with concentrations in a geometric or a logarithmic series may be appropriate as well.

A 1:1 dilution series is prepared from the 94 % effluent (see Figure 2).
Key
C1 to C5 test tubes with C1 to C5 test concentrations
1 effluent with growth medium
2 growth medium
a Effluent
Figure 2 — Preparation of the 1:1 effluent dilution series
9.2.3 Procedure

Take five test tubes of 20 ml contents and label them, e.g. C1, C2, C3, C4 and C5.

Add 20 ml effluent (containing growth medium) to test tube C1.
Add 10 ml growth medium (as dilution medium) to the tubes C2, C3, C4 and C5.
6 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 20227:2017(E)

Transfer 10 ml effluent from tube C1 to tube C2, and cap and shake the test tube.

Transfer 10 ml test dilution from tube C2 to tube C3, and cap and shake the test tube.

Repeat this procedure for the next dilutions.
9.3 Tests on chemical compounds

If the approximate toxicity (= the order of magnitude) of the chemical compound to be tested is not

known, a range finding test should be performed first to determine the 0 % to 100 % tolerance range of

the duckweeds to the toxicant.
9.3.1 Range finding test

A dilution series 1:10 is prepared in test tubes of 10 ml, in growth medium (as dilution medium).

Figure 3 shows an example for preparation of a concentration range of a chemical from 100 mg/l down

to 0,01 mg/l.
© ISO 2017 – All rights reserved 7
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ISO 20227:2017(E)
Key
C1 to C5 test tubes
a) stock solution
b) test concentrations
1 25 ml volumetric flask
2 growth medium
3 test tube
Fill to the mark

Figure 3 — Preparation of a 100 mg/l to 0,01 mg/l dilution series for a range finding test on a

pure chemical
9.3.2 Definitive test

The dilution series to be prepared spans the range of the lowest concentration producing 100 % effect,

to the highest one producing less than 10 % effect in the range finding test.

A dilution series is prepared, starting with a test concentration of the toxicant which was the lowest

one giving 100 % growth inhibition in the range finding test.

A logarithmic dilution series (e.g. 10 mg/l, 5,6 mg/l, 3,2 mg/l, 1,8 mg/l, 1 mg/l + the negative control)

is then prepared in 10 ml test tubes, with the volumes of growth medium and toxicant indicated in

Figure 4.

The actual concentrations of the toxicant in the tubes (which will be needed for the EC or EC

50 x
determination) are calculated as follows:
8 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 20227:2017(E)
C1 = …. mg/l
C2 = 0,56 × C1 = … mg/l
C3 = 0,32 × C1 = … mg/l
C4 = 0,18 × C1 = … mg/l
C5 = 0,10 × C1 = … mg/l
Key
C1 to C5 test tubes
1 25 ml toxicant solution (in growth medium) = C1
2 growth medium
3 control

Figure 4 — Preparation of a logarithmic dilution series for a definitive test on a pure chemical

9.4 Filling of the test plate with the toxicant dilutions
9.4.1 General

The test is performed in a 6 × 8 multiwell cup (7.7), with eight replicates per test concentration and the

negative control.
9.4.2 Procedure
Put 1 ml growth medium (3.4) in the eight cups of control row A (see Figure 5).
Put 1 ml of each toxicant concentration in the rows B to F.

The distribution of the test solutions shall always be carried out starting with the control row on top

of the multiwell (row A), followed in sequence by the rows receiving increasing toxicant concentrations

(rows B to F).
© ISO 2017 – All rights reserved 9
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ISO 20227:2017(E)
Key
C5 to C1 test tubes with C5-C1 test concentrations
1 control medium

Figure 5 — Filling of the multiwell test plate with the toxicant dilutions (C1 to C5)

9.5 Transfer of the germinated turions in the test cups

Take the Petri dish (7.5) with the turions out of the incubator and transfer, with the aid of a spatula, one

germinated turion into each cup of the multiwell test plate.

NOTE Germinated turions can easily be distinguished from turions which have not germinated, by the

presence of a small first frond on one side of the turion, and by small roots underneath the frond.

The transfer of the germinated turions in the test cups shall be started with the control row (row A on

top of the multiwell) and continued in the next rows, in sequence of the increasing test concentrations.

The transfers shall be carried out randomly, i.e. one has to avoid picking up and transferring the turions

with the largest fronds first.
9.6 Photo of the multiwell at the start of the toxicity test

On completion of the transfers of the germinated turions (with their small first fronds), take a digital

photo (at t = 0 h) and transfer the picture to a computer file.

The digital camera (7.9) should not be held too close to the multiwell since this will lead to a distortion

of the view of the cups in the columns on the right and on the left side. The latter cups should also have

a round (and not an oval) look.

To increase the contrast between the turions and the first small fronds in the photo, it is advised to

place the multiwell on a light table, or on a white background.
9.7 Incubation of the multiwell
Put the cover on the multiwell and put the test plate in the incubator (7.1).

Incubate the multiwell at (25 ± 1) °C for 3 d (72 ± 1) h with a continuous illumination of 6 000 lx

(measured at the top of the test plate).
Similarly, as mentioned above for the germination of
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20227
Première édition
2017-06
Version corrigée
2018-02
Qualité de l'eau — Détermination des
effets d'inhibition sur la croissance
de la lentille d'eau Spirodela
polyrhiza par les eaux usées, les eaux
naturelles
et les produits chimiques — Méthode
utilisant un bioessai miniaturisé
indépendant d'une culture mère
Water quality — Determination of the growth inhibition effects
of waste waters, natural waters and chemicals on the duckweed
Spirodela polyrhiza — Method using a stock culture independent
microbiotest
Numéro de référence
ISO 20227:2017(F)
ISO 2017
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Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d'application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Organismes d’essai ............................................................................................................................................................................................. 3

6 Milieu de culture ................................................................................................................................................................................................... 3

6.1 Préparation des solutions mères ............................................................................................................................................. 4

6.2 Préparation du milieu de Steinberg modifié à la concentration finale ................................................... 4

7 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 4

8 Produits chimiques de référence ........................................................................................................................................................ 5

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 Germination des turions de Spirodela polyrhiza ........................................................................................................ 5

9.2 Essais sur des effluents (et des eaux résiduaires) .................................................................................................... 6

9.2.1 Ajout d'un milieu de culture concentré à l'échantillon d'effluent ......................................... 6

9.2.2 Préparation des dilutions d'effluent ............................................................................................................... 6

9.2.3 Mode opératoire ............................................................................................................................................................... 7

9.3 Essais sur des composés chimiques ..................................................................................................................................... 7

9.3.1 Essai préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur ................................................... 8

9.3.2 Essai définitif ....................................................................................................................................................................... 8

9.4 Remplissage de la plaque d'essai avec les dilutions de produit toxique ............................................... 9

9.4.1 Généralités ............................................................................................................................................................................ 9

9.4.2 Mode opératoire ............................................................................................................................................................... 9

9.5 Transfert des turions ayant germé dans les puits d'essai ...............................................................................10

9.6 Photographie de la plaque multipuits au début de l'essai de toxicité ..................................................10

9.7 Incubation de la plaque multipuits.....................................................................................................................................10

9.8 Photographie de la plaque multipuits à la fin de l'essai de toxicité .......................................................11

9.9 Mesurage de la surface des premières frondes ........................................................................................................11

10 Traitement des données — Calcul de l'inhibition de la croissance ..............................................................11

11 Critère de validité .............................................................................................................................................................................................12

12 Sensibilité de l'essai .......................................................................................................................................................................................12

13 Essai avec les produits chimiques de référence ................................................................................................................13

14 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................15

Annexe A (informative) Préparation d'une culture mère de Spirodela polyrhiza pour la

production de turions ..................................................................................................................................................................................16

Annexe B (informative) Sensibilité du bioessai miniaturisé avec Spirodela polyrhiza .................................18

Annexe C (informative) Données de performance ..............................................................................................................................21

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................22

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Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous-comité

SC 4, Méthodes biologiques.

La présente version corrigée de l'ISO 20227:2017 inclut les corrections suivantes:

— la date d’édition de la version française a été corrigée.
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Introduction

Les lentilles d'eau sont des plantes aquatiques flottantes qui sont couramment utilisées en recherche

écotoxicologique pour évaluer la toxicité des eaux résiduaires, des eaux naturelles et des produits

chimiques (voir l'ISO 20079 et les Références [6] à [11]) et, plus particulièrement, des produits

phytopharmaceutiques (voir Référence [12]).

Les lentilles d'eau sont des plantes à croissance rapide; un grand nombre d'entre elles ayant une

répartition cosmopolite, elles sont donc bien adaptées pour servir de producteurs primaires en vue de

l'évaluation des risques liés aux polluants en eau douce.

Contrairement aux végétaux terrestres, pour lesquels les essais biologiques peuvent débuter dès le

stade de « repos végétatif » (graines), les essais de toxicité réalisés avec des lentilles d'eau nécessitent

une mise en culture continue et la conservation de stocks vivants, avec les coûts biologiques, techniques

et financiers intrinsèques.

Toutefois, quelques espèces de lentille d'eau produisent des bourgeons végétatifs dormants (turions)

qui peuvent être stockés pendant de longues périodes et que l'on peut faire germer à la demande au

moment de la réalisation de l'essai biologique.

L'une des lentilles d'eau produisant des turions est Spirodela polyrhiza, et cette espèce a finalement été

sélectionnée pour un bioessai miniaturisé simple et pratique indépendant de la préparation de cultures

mères et de la conservation de stocks vivants.

Spirodela polyrhiza s'est avérée être aussi sensible aux produits toxiques que lors d'essais biologiques

conventionnels avec des lentilles d'eau.

Le mode opératoire du bioessai miniaturisé décrit dans le présent document implique une germination

des turions de 3 jours, suivie d'un essai de toxicité de 3 jours sur une plaque multipuits, avec une

détermination de l'inhibition de croissance des premières frondes par analyse d'image.

Le bioessai miniaturisé avec Spirodela polyrhiza est très simple et facile à réaliser:

a) l'analyse ne nécessite pas la préparation de cultures ni la conservation de stocks vivants des

espèces soumises à essai et peut être réalisée «en tout temps et en tout lieu» en utilisant des turions

stockés;

b) les turions stockés ont une durée de conservation de plusieurs mois avec un taux de germination

élevé;

c) le bioessai miniaturisé nécessite un espace minimal de travail et d'incubation et un équipement

minimal;

d) les mesurages de surface des premières frondes n'ont pas à être effectués immédiatement et

peuvent être reportés à un moment approprié;

e) les mesurages de surface par analyse d'image sont très rapides et précis, et prennent moins de 1 h

pour un essai complet.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20227:2017(F)
Qualité de l'eau — Détermination des effets d'inhibition
sur la croissance de la lentille d'eau Spirodela polyrhiza
par les eaux usées, les eaux naturelles et les produits
chimiques — Méthode utilisant un bioessai miniaturisé
indépendant d'une culture mère

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les

pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les

problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur du

présent document d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité, et de

s'assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est essentiel que les essais réalisés conformément au présent document soient

exécutés par du personnel formé.
1 Domaine d'application

Le présent document spécifie une méthode permettant de déterminer l'inhibition de la croissance des

premières frondes de Spirodela polyrhiza ayant germé à partir de turions, provoquée par des substances

et des préparations contenues dans les eaux ou les eaux résiduaires, y compris les eaux résiduaires

urbaines après traitement et les effluents industriels.

L'essai s'applique également aux produits chimiques purs et, en particulier, aux produits

phytopharmaceutiques et aux pesticides.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques

des échantillons
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse http:// www.e lectropedia. org/

— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse http:// www. iso. org/o bp

3.1
concentration efficace

concentration de l'échantillon pour essai à laquelle un effet de x % est mesuré, par rapport au témoin

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ISO 20227:2017(F)
3.2
fronde

structure semblable à une feuille qui se développe à partir d'un turion ayant germé

3.3
croissance

augmentation de la biomasse au fil du temps résultant de la production de nouveaux tissus

Note 1 à l'article: Dans le présent essai, elle désigne l'augmentation de taille de la première fronde se développant

à partir d'un turion ayant germé.
3.4
milieu de culture
combinaison d'eau de dilution et/ou de milieu nutritif utilisée lors de l'essai

Note 1 à l'article: Dans le présent essai, il désigne le milieu nutritif utilisé pour la germination des turions et la

croissance des frondes.
3.5
inoculum

transfert d'un turion ayant germé, avec sa petite fronde, dans tous les puits d'essai au début de l’essai de

toxicité
3.6
eau pure
eau déionisée ou distillée dont la conductivité est inférieure à 10 µS/cm
[SOURCE: ISO 19827:2016, 3.4]
3.7
racine

partie de la plante Spirodela polyrhiza qui présente une structure radiculaire et se développe sous

une fronde
3.8
culture mère
culture monospécifique de lentille d'eau en vue de produire les turions
3.9
milieu d'essai

combinaison d'échantillon pour essai, d'eau de dilution et/ou de milieu nutritif utilisée lors de l'essai

[SOURCE: ISO 20079:2005, 3.23]
3.10
échantillon pour essai

portion discrète d'un échantillon (par exemple, eau prélevée à partir du milieu récepteur, eaux

résiduaires, substances chimiques ou mélanges dissous, produits et composés) prétraitée selon les

besoins du présent essai (par exemple dissolution, filtration, neutralisation)
3.11
turion

petit bourgeon végétatif qui se développe à partir d'une colonie de la lentille d'eau dans des conditions

environnementales spécifiques
4 Principe

Les turions produits par mise en culture de Spirodela polyrhiza, ou prélevés dans les tubes à essai

dans lesquels ils sont stockés (voir Annexe A), sont transférés dans une boîte de Petri contenant un

milieu de culture, et mis à incuber pendant 3 jours à 25 °C avec un éclairage continu d'au moins 6 000 lx

−2 −1
(correspondant approximativement à 85 µE m s ).
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Pendant cette période, les turions germent et produisent une (première) petite fronde (voir Figure 1).

Un turion ayant germé avec sa première fronde est ensuite prélevé dans la boîte de Petri et ensemencé

dans chaque puits d'une plaque multipuits (6 × 8) contenant les dilutions de produit toxique et le témoin

négatif (chacun d'eux étant préparé dans un milieu de culture).
Légende
1 turion
2 première fronde

Figure 1 — Agrandissement d'un turion ayant germé avec sa première fronde, dans un puits de

plaque d'essai

À la fin des ensemencements, une photo de la plaque multipuits est prise (à t = 0 h) à l'aide d'un appareil

photo numérique et transférée dans un fichier informatique.

La plaque multipuits est ensuite mise à incuber à (25 ± 1) °C pendant 3 jours avec un éclairage

continu d'au moins 6 000 lx, puis une nouvelle photo est prise (à t = 72 h) et transférée dans un fichier

informatique.

La surface de la première fronde dans chaque puits d'essai est mesurée à l'aide d'un programme

d'analyse d'images, sur les deux photos de la plaque multipuits (c'est-à-dire prises à t = 0 h et à t = 72 h).

La croissance des premières frondes dans les témoins et dans les concentrations ou dilutions d'essai est

calculée comme la différence entre les surfaces à t = 72 h et les surfaces à t = 0 h, puis l'inhibition de la

croissance et les valeurs de CE or CE à 72 h sont déterminées.
50 x
5 Organismes d’essai

L'espèce utilisée pour l'essai décrit dans le présent document est la lentille d'eau Spirodela polyrhiza (L.)

Schleid.
Les organismes d'essai sont obtenus par germination de turions (stockés).

Les turions peuvent être produits en laboratoire selon le mode opératoire décrit à l'Annexe A.

Ils peuvent également être achetés dans le commerce .
6 Milieu de culture

Le milieu de culture (3.4) utilisé pour la germination des turions et la croissance des lentilles d'eau

[2]

pendant l'essai de toxicité est le milieu de Steinberg modifié qui est décrit et utilisé dans l'ISO 20079

et dans les lignes directrices de l'OCDE pour les essais de produits chimiques (Référence [8]).

1) Les turions fournis par MicroBioTests Inc. sont un exemple de produit approprié disponible dans le commerce.

Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO

approuve ou recommande l'emploi exclusif de ce produit.
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Ce milieu est également utilisé pour préparer les dilutions de produits toxiques.

Le milieu de culture est composé de macroéléments et de microéléments à partir desquels des solutions

mères sont préparées conformément au Tableau 1 et au Tableau 2, respectivement.
6.1 Préparation des solutions mères

Préparer les huit solutions mères en ajoutant la masse prescrite de produits chimiques à 1 l d'eau

pure (3.6).
Tableau 1 — Solutions mères de macroéléments
Macroéléments (concentrés 50 fois) g/l
KNO 17,50
Solution mère 1 KH PO 4,5
2 4
K HPO 0,63
2 4
Solution mère 2 MgSO ·7H O 5,00
4 2
Solution mère 3 Ca(NO ) ·4H O 14,75
3 2 2
Tableau 2 — Solutions mères de microéléments
Microéléments (concentrés 1 000 fois) mg/l
Solution mère 4 H BO 120,00
3 3
Solution mère 5 ZnSO ·7H O 180,00
4 2
Solution mère 6 Na MoO ·2H O 44,0
2 4 2
Solution mère 7 MnCl ·4H O 180,00
2 2
Solution mère 8 FeCl ·6H O 760,00
3 2
Sel disodique d'EDTA dihydraté 1 500,00

Les solutions mères 2 et 3 peuvent être réunies, de même que les solutions mères 4 à 7 (en tenant

compte des concentrations requises).
6.2 Préparation du milieu de Steinberg modifié à la concentration finale

Ajouter 20 ml de chacune des solutions mères 1, 2 et 3 à environ 900 ml d'eau pure (3.6) dans une fiole

jaugée de 1 l.
Ajouter ensuite 1,0 ml de chacune des solutions mères 4, 5, 6, 7 et 8.
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau pure.

Le pH du milieu de culture doit être de 5,5 ± 0,2; il doit être ajusté avec du HCl ou du NaOH.

Une fois préparé, le milieu de culture a une durée de conservation relativement courte et il doit être

utilisé dans les deux semaines qui suivent sa préparation.
7 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, les éléments suivants.

7.1 Enceinte ou local thermostaté, ou incubateur, avec un éclairage fluorescent blanc assurant un

éclairage continu uniforme d'au moins 6 000 lx à la surface de la boîte de Petri utilisée pour la germination

des turions et de la plaque multipuits.
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7.2 Luxmètre, pour le mesurage de l'intensité lumineuse à la surface de la boîte de Petri utilisée pour

la germination des turions et de la plaque multipuits.
7.3 pH-mètre, pour le contrôle et/ou l'ajustement du pH du milieu de culture.

7.4 Verrerie de laboratoire, pour la préparation des concentrations d'essai (fioles jaugées,

éprouvettes graduées, pipettes, tubes à essai).

7.5 Boîtes de Petri, de 9 cm de diamètre, munies d'un couvercle, pour la germination des turions.

7.6 Micro-tamis, à mailles de 100 µm, pour le rinçage des turions stockés.
7.7 Plaques multipuits, comportant 6 × 8 puits, comme plaques d'essai.

7.8 Spatule en plastique, pour le transfert des turions ayant germé dans les puits de la plaque

multipuits.

7.9 Appareil photo numérique, pour prendre une photographie de la plaque multipuits contenant

les lentilles d'eau en cours de croissance.

7.10 Système d'analyse d'image, pour le mesurage de la surface des premières frondes.

8 Produits chimiques de référence
8.1 3,5-dichlorophénol, de qualité analytique, pureté > 99 %.
8.2 Chlorure de potassium, KCl, de qualité analytique, pureté > 99 %.
9 Mode opératoire
9.1 Germination des turions de Spirodela polyrhiza

Lorsque des turions provenant d'une culture de Spirodela polyrhiza sont utilisés, placer les turions dans

une boîte de Petri (7.5) et verser 30 ml de milieu de culture (3.4).

Lorsque des turions stockés sont utilisés, prélever un tube contenant des turions stockés et l'agiter

légèrement pour remettre les turions en suspension.

Verser le contenu du tube sur le micro-tamis (7.6) et rincer avec de l'eau pure (3.6) pour éliminer le

milieu de conservation.
Mettre 10 ml de milieu de culture (3.4) dans la boîte de Petri (7.5).

Renverser le micro-tamis et transférer tous les turions dans la boîte de Petri en versant 10 ml de milieu

de culture sur la surface du micro-tamis.

Compléter le remplissage de la boîte de Petri en ajoutant 10 ml de milieu de culture.

Couvrir la boîte de Petri avec le couvercle transparent et la placer dans l'incubateur ou dans le local

thermostaté (7.1).
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Faire incuber la boîte de Petri pendant 3 jours (72 ± 1) h à (25 ± 1) °C, avec un éclairage continu (d'au

moins 6 000 lx à la surface de la boîte de Petri).

NOTE La germination des turions et la croissance des premières frondes dépendent fortement des conditions

de température et d'éclairement lumineux. Il est donc important de respecter aussi fidèlement que possible les

valeurs prescrites de température et d'éclairement lumineux.
9.2 Essais sur des effluents (et des eaux résiduaires)

L'échantillonnage et la préparation des échantillons doivent être effectués conformément à l'ISO 5667-16.

9.2.1 Ajout d'un milieu de culture concentré à l'échantillon d'effluent
Transférer environ 80 ml d'effluent dans une fiole jaugée de 100 ml.

Ajouter 2 ml de chacune des solutions mères 1, 2 et 3, et 100 µl de chacune des solutions mères 4, 5, 6, 7

et 8 dans la fiole jaugée.

Compléter au trait de 100 ml avec l'effluent, boucher la fiole et l'agiter vigoureusement pour

homogénéiser le contenu.

NOTE L'addition de 6,5 ml de milieu de culture (3.4) à 93,5 ml d'effluent dilue l'échantillon d'effluent

d'environ 6 %. Cela signifie que la plus haute concentration d'effluent qui sera soumise à essai est d'environ 94 %

par rapport à l'échantillon d'effluent initial.
9.2.2 Préparation des dilutions d'effluent

Un mode opératoire courant pour la préparation de la gamme de dilutions est décrit ci-après. Selon

l'objectif de l'essai et les exigences statistiques concernant les résultats d'essai, d'autres schémas de

dilution avec des concentrations en série géométrique ou logarithmique peut également être appropriés.

Une gamme de dilutions 1:1 est préparée à partir de l'effluent à 94 % (voir Figure 2).

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Légende
C1 à C5 tubes à essai avec les concentrations d'essai C1 à C5
1 effluent avec milieu de culture
2 milieu de culture
Effluent.
Figure 2 — Préparation de la gamme de dilutions 1:1
9.2.3 Mode opératoire
Prendre cinq tubes à essai de 20 ml et les étiqueter C1, C2, C3, C4 et C5.

Introduire 20 ml d'effluent (contenant du milieu de culture) dans le tube à essai C1.

Introduire 10 ml de milieu de culture (comme milieu de dilution) dans les tubes C2, C3, C4 et C5.

Transférer 10 ml d'effluent du tube C1 dans le tube C2, puis boucher et agiter le tube à essai.

Transférer 10 ml de la dilution d'essai du tube C2 dans le tube C3, puis boucher et agiter le tube à essai.

Répéter ce mode opératoire pour les dilutions suivantes.
9.3 Essais sur des composés chimiques

Si la toxicité approximative (= ordre de grandeur) du composé chimique à soumettre à essai n'est

pas connue, il convient tout d'abord d'effectuer un essai préliminaire de détermination de l'ordre de

grandeur afin de déterminer la plage de tolérance de 0 % à 100 % des lentilles d'eau vis-à-vis du produit

toxique.
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9.3.1 Essai préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur

Une gamme de dilutions 1:10 est préparée dans des tubes à essai de 10 ml, dans un milieu de culture

(comme milieu de dilution).

La Figure 3 montre un exemple de préparation d'une gamme de concentrations d'un produit chimique

de 100 mg/l à 0,01 mg/l.
Légende
C1 à C5 tubes à essai
a) solution mère
b) concentrations d'essai
1 fiole jaugée de 25 ml
2 milieu de culture
3 tube à essai
Compléter jusqu'au trait.

Figure 3 — Préparation d'une gamme de dilutions de 100 mg/l à 0,01 mg/l pour l'essai

préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur sur un produit chimique pur
9.3.2 Essai définitif

La gamme de dilutions à préparer couvre la plage allant de la plus faible concentration produisant un

effet de 100 %, jusqu'à la plus forte concentration produisant un effet inférieur à 10 % lors de l'essai

préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur.
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ISO 20227:2017(F)

Une gamme de dilutions est préparée, en commençant par la concentration d'essai du produit toxique

correspondant à celle qui a entraîné une inhibition de la croissance de 100 % lors de l'essai préliminaire

de détermination de l'ordre de grandeur.

Une gamme de dilutions logarithmique (par exemple 10 mg/l, 5,6 mg/l, 3,2 mg/l, 1,8 mg/l, 1 mg/l +

le témoin négatif) est ensuite préparée dans des tubes à essai de
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE
ISO/DIS 20227
ISO/TC 147/SC 5 Secrétariat: DIN
Début de vote: Vote clos le:
2016-04-28 2016-07-27
Qualité de l’eau — Détermination des effets d’inhibition
sur la croissance de la lentille d’eau Spirodela polyrhiza
par les eaux usées, les eaux naturelles et les produits
chimiques — Méthode utilisant un bioessai miniaturisé
indépendant d’une culture mère

Water quality — Determination of the growth inhibition effects of waste waters, natural waters and

chemicals on the duckweed Spirodela polyrhiza — Method using a stock culture independent microbiotest

ICS: 13.060.70
TRAITEMENT PTRAITEMENT PARRALLÈLE ISO/CENARRALLÈLE ISO/CEN

Le prLe présent présent projet a étojet a été élaboré élaboré dans le cadré dans le cadre de l’Ore de l’Orgganisation intanisation internationale deernationale de

normalisation (ISO) et soumis selon le mode de collabornormalisation (ISO) et soumis selon le mode de collaboration ation sous la dirsous la directionection

de l’ISOde l’ISO, t, tel que défini dans l’el que défini dans l’AAccorccord de Vd de Vienne.ienne.

Le prLe projet est par conséquent soumis en parojet est par conséquent soumis en parallèle aux comitallèle aux comités membrés membres de l’ISO etes de l’ISO et

CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR
OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC

aux comitaux comités membrés membres du Ces du CEN pour enquêtEN pour enquête de cinq mois.e de cinq mois.

SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE
AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR

PPoouur ar accccéélléérreer lr la da diissttrriibbuuttiioonn, l, le pe prréésseennt dt dooccuummeennt et esst dt diissttrriibbuué té teel ql quu’’iil el esstt

ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES
FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET

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COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE

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DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR
POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES
POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
Numéro de référence
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET
ISO/DIS 20227:2016(F)
SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS
OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS
DE PROPRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT
ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À
FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE. ISO 2016
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ISO/DIS 20227:2016(F) ISO/DIS 20227:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................. iv

Introduction ..................................................................................................................................................................... v

1  Domaine d'application ................................................................................................................................... 1

2  Références normatives .................................................................................................................................. 1

3  Termes et définitions ..................................................................................................................................... 1

4  Principe ............................................................................................................................................................... 2

5  Organismes d’essai .......................................................................................................................................... 3

6  Milieu de culture .............................................................................................................................................. 4

7  Appareillage ...................................................................................................................................................... 5

8  Produits chimiques de référence ............................................................................................................... 5

9  Mode opératoire .............................................................................................................................................. 6

10  Traitement des données – Calcul de l'inhibition de la croissance .............................................. 13

11  Critère de validité ......................................................................................................................................... 14

12  Sensibilité de l'essai ..................................................................................................................................... 14

13  Essai avec les produits chimiques de référence ................................................................................ 14

14  Rapport d'essai .............................................................................................................................................. 16

(informative) Préparation d'une culture mère de Spirodela polyrhiza pour la

production de turions ................................................................................................................................. 17

(informative) Sensibilité du bioessai miniaturisé avec Spirodela polyrhiza ...................... 19

(informative) Données de performances ........................................................................................ 22

Bibliographie ................................................................................................................................................................ 23

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO/DIS 20227:2016(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................. iv

Introduction ..................................................................................................................................................................... v

1  Domaine d'application ................................................................................................................................... 1

2  Références normatives .................................................................................................................................. 1

3  Termes et définitions ..................................................................................................................................... 1

4  Principe ............................................................................................................................................................... 2

5  Organismes d’essai .......................................................................................................................................... 3

6  Milieu de culture .............................................................................................................................................. 4

7  Appareillage ...................................................................................................................................................... 5

8  Produits chimiques de référence ............................................................................................................... 5

9  Mode opératoire .............................................................................................................................................. 6

10  Traitement des données – Calcul de l'inhibition de la croissance .............................................. 13

11  Critère de validité ......................................................................................................................................... 14

12  Sensibilité de l'essai ..................................................................................................................................... 14

13  Essai avec les produits chimiques de référence ................................................................................ 14

14  Rapport d'essai .............................................................................................................................................. 16

(informative) Préparation d'une culture mère de Spirodela polyrhiza pour la

production de turions ................................................................................................................................. 17

(informative) Sensibilité du bioessai miniaturisé avec Spirodela polyrhiza ...................... 19

(informative) Données de performances ........................................................................................ 22

Bibliographie ................................................................................................................................................................ 23

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iii
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ISO/DIS 20227:2016(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le

droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2

(voir www.iso.org/directives).

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet

de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour

responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails

concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés

lors de l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations

de brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation

de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion de l'ISO aux principes de

l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC)

voir le lien suivant: Avant‐propos – Informations supplémentaires
(www.iso.org/iso/fr/foreword.html).

Le comité chargé de l'élaboration du présent document est l'ISO/TC 147, Qualité de l’eau, sous‐

comité SC 5, Méthodes biologiques.
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ISO/DIS 20227:2016(F)
Introduction

Les lentilles d'eau sont des plantes aquatiques flottantes qui sont couramment utilisées en recherche

écotoxicologique pour évaluer la toxicité des eaux résiduaires, des eaux naturelles et des produits

chimiques (voir l'ISO 20079 et les Références [1] à [6]) et, plus particulièrement, des produits

phytopharmaceutiques (voir Référence [7]).

Les lentilles d'eau sont des plantes à croissance rapide ; un grand nombre d'entre elles ayant une

répartition cosmopolite, elles sont donc bien adaptées pour servir de producteurs primaires en vue de

l'évaluation des risques liés aux polluants en eau douce.

Contrairement aux végétaux terrestres, pour lesquels les essais biologiques peuvent débuter dès le

stade de « repos végétatif » (graines), les essais de toxicité réalisés avec des lentilles d'eau nécessitent

une mise en culture continue et la conservation de stocks vivants, avec les coûts biologiques, techniques

et financiers intrinsèques.

Toutefois, quelques espèces de lentille d'eau produisent des « bourgeons végétatifs dormants »

(turions) qui peuvent être stockés pendant de longues périodes et que l'on peut faire germer « à la

demande » au moment de la réalisation de l'essai biologique.

L'une des lentilles d'eau produisant des turions est Spirodela polyrhiza, et cette espèce a finalement été

sélectionnée pour un bioessai miniaturisé simple et pratique, indépendant de la préparation de cultures

mères et de la conservation de stocks vivants.

Spirodela polyrhiza s'est avérée être aussi sensible aux produits toxiques que les lentilles d’eau qui ont

été soumises aux bioessais conventionnels.

Le mode opératoire de l'essai microbiologique décrit dans la présente Norme internationale implique

une germination des turions de 3 jours, suivie d'un essai de toxicité de 3 jours sur une plaque

multipuits, avec une détermination de l'inhibition de croissance des premières frondes par analyse

d'image.

Le bioessai miniaturisé avec Spirodela polyrhiza est très simple et facile à réaliser ; il offre plusieurs

avantages par rapport aux essais classiques avec des lentilles d'eau :

1) l'analyse ne nécessite pas la préparation de cultures ni la conservation de stocks vivants des

espèces soumises à essai et peut être réalisée « n'importe quand, n'importe où » en utilisant

des turions stockés ;

2) les turions stockés ont une durée de conservation de plusieurs mois avec un taux de

germination élevé ;

3) le bioessai miniaturisé nécessite un espace minimal de travail et d'incubation et un équipement

minimal ;

4) l'essai ne nécessite pas la manipulation des organismes pendant ou à la fin de l'essai ;

5) les mesurages de surface des premières frondes n'ont pas à être effectués immédiatement et

peuvent être reportés à un moment approprié ;

6) les mesurages de surface par analyse d'image sont très rapides et précis, et prennent moins

d'une heure pour un essai complet.
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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 20227:2016(F)
Qualité de l'eau - Détermination des effets d'inhibition sur la croissance de
la lentille d'eau Spirodela polyrhiza par les eaux usées, les eaux naturelles
et les produits chimiques - Méthode utilisant un bioessai miniaturisé
indépendant d'une culture mère

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les

pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter tous les

problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur du

présent document d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité, et de

s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.

IMPORTANT — Il est essentiel que les essais réalisés conformément au présent document soient

exécutés par du personnel formé.
1 Domaine d'application

La présente Norme internationale spécifie une méthode permettant de déterminer l'inhibition de la

croissance des premières frondes de Spirodela polyrhiza ayant germé à partir de turions, provoquée par

des substances et des préparations contenues dans les eaux ou les eaux résiduaires, y compris les eaux

résiduaires urbaines après traitement et les effluents industriels.

L'essai s'applique également aux produits chimiques purs et, en particulier, aux produits

phytopharmaceutiques et aux pesticides.
2 Références normatives

Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de façon normative dans le présent

document et sont indispensables à son application. Pour les références datées, seule l'édition citée

s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y

compris les éventuels amendements).

ISO 5667‐16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16 : Lignes directrices pour les essais

biologiques des échantillons

ISO 20079, Qualité de l'eau — Détermination de l'effet toxique des constituants de l'eau et des eaux

résiduaires vis-à-vis des lentilles d'eau (Lemna minor) — Essai d'inhibition de la croissance des lentilles

d'eau

ISO/TS 20281, Qualité de l'eau — Lignes directrices relatives à l'interprétation statistique de données

écotoxicologiques
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

3.1
CEx

concentration calculée (d'une substance) ou dilution (d'un échantillon aqueux, en %) pour laquelle un

effet de x % est attendu par comparaison au témoin
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ISO/DIS 20227:2016(F)
3.2
fronde

structure semblable à une feuille qui se développe à partir d'un turion ayant germé

3.3
croissance

augmentation de taille de la première fronde se développant à partir d'un turion ayant germé

3.4
milieu de culture

milieu nutritif utilisé pour la germination des turions et la croissance des frondes

3.5
ensemencement

transfert d'un turion ayant germé, avec sa petite fronde, dans tous les puits d'essai au début de l’essai de

toxicité
3.6
eau pure
eau désionisée ou distillée dont la conductivité est inférieure à 10 µS/cm
3.7
racine
partie de la plante qui se développe sous une fronde
3.8
culture mère
culture en laboratoire de la lentille d'eau en vue de produire les turions
3.9
milieu de dilution d'essai
milieu de culture qui est également utilisé comme milieu de dilution d'essai
3.10
échantillon pour essai

portion de la matière collectée ou du produit chimique dissous à utiliser pour la préparation de la

gamme de dilutions
3.11
turion

petit bourgeon végétatif qui se développe à partir d'une colonie de la lentille d'eau dans des conditions

environnementales spécifiques
4 Principe

Les turions produits par mise en culture de Spirodela polyrhiza, ou prélevés dans les tubes à essai dans

lesquels ils sont stockés (voir Annexe A), sont transférés dans une boîte de Petri contenant un milieu de

culture, et mis à incuber pendant 3 jours à 25 °C avec un éclairement lumineux continu d'au moins

‐2 ‐1
6 000 lx (correspondant approximativement à 85 µE m s ).

Pendant cette période, les turions germent et produisent une (première) petite fronde (voir Figure 1).

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ISO/DIS 20227:2016(F)

Un turion ayant germé avec sa première fronde est ensuite prélevé dans la boîte de Petri et ensemencé

dans chaque puits d'une plaque multipuits (6 × 8) contenant les dilutions de produit toxique et le

témoin négatif (chacun d'eux étant préparé dans un milieu de culture).
Légende
1 turion
2 première fronde

Figure 1 — Agrandissement d'un turion ayant germé avec sa première fronde, dans un puits de

plaque d'essai

A la fin des ensemencements, une photo de la plaque multipuits est prise (= à t0h) à l'aide d'un appareil

photo numérique et transférée dans un fichier informatique.

La plaque multipuits est ensuite mise à incuber à (25 ± 1) °C pendant 3 jours avec un éclairement

lumineux continu d'au moins 6 000 lx, puis une nouvelle photo est prise (= à t72h) et transférée dans un

fichier informatique.

La surface de la première fronde dans chaque puits d'essai est mesurée à l'aide d'un programme

d'analyse d'images, sur les deux photos de la plaque multipuits (c'est‐à‐dire prises à t0h et à t72h).

La croissance des premières frondes dans les témoins et dans les concentrations ou dilutions d'essai est

calculée comme la différence entre les surfaces à t72h et les surfaces à t0h, puis l'inhibition de la

croissance et les valeurs de CE50 ou CEx à 72 h sont déterminées.
5 Organismes d’essai

L'espèce utilisée pour l'essai décrit dans la présente Norme internationale est la lentille d'eau Spirodela

polyrhiza (L.) Schleid.
Les organismes d'essai sont obtenus par germination de turions (stockés).

Les turions peuvent être produits en laboratoire selon le mode opératoire décrit à l'Annexe A.

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ISO/DIS 20227:2016(F)
Ils peuvent également être achetés dans le commerce.
6 Milieu de culture

Le milieu de culture (3.4) utilisé pour la germination des turions et la croissance des lentilles d'eau

pendant l'essai de toxicité est le « milieu de STEINBERG modifié » qui est décrit et utilisé dans

l'ISO 20079 et dans les lignes directrices de l'OCDE pour les essais de produits chimiques (voir

Référence [1]).

Ce milieu sera également utilisé pour préparer les dilutions de produits toxiques.

Le milieu de culture est composé de « macro‐éléments » et de « micro‐éléments » à partir desquels des

solutions mères sont préparées conformément au Tableau 1 et au Tableau 2, respectivement.

6.1 Préparation des solutions mères

Préparer les 8 solutions mères en ajoutant la masse prescrite de produits chimiques à 1 l d'eau

pure (3.6).
Tableau 1 — Solutions mères de macroéléments
Macroéléments (concentrés 50 fois) g/l
KNO 17,50
Solution mère 1 KH2PO4 4,5
KHPO 0,63
2 4
Solution mère 2 MgSO4·7H2O 5,00
Solution mère 3 Ca(NO)·4HO 14,75
3 2 2
Tableau 2 — Solutions mères de microéléments
Microéléments (concentrés 1 000 fois) mg/l
Solution mère 4 H3BO3 120,00
Solution mère 5 ZnSO·7HO 180,00
4 2
Solution mère 6 Na2MoO4·2H2O 44,0
Solution mère 7 MnCl·4HO 180,00
2 2
Solution mère 8 FeCl3·6H2O 760,00
Sel disodique d'EDTA dihydraté 1 500,00

Les solutions mères 2 et 3 peuvent être réunies, de même que les solutions mères 4 à 7 (en tenant

compte des concentrations requises).

Les turions fournis par MicroBioTests Inc. Mariakerke‐Gent, Belgique, sont un exemple de produit approprié

disponible dans le commerce. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme

internationale et ne signifie nullement que l'ISO recommande l'emploi exclusif de ce produit.

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ISO/DIS 20227:2016(F)
6.2 Préparation du milieu de Steinberg modifié à la concentration finale

Ajouter 20 ml de chacune des solutions mères 1, 2 et 3 à environ 900 ml d'eau pure (3.6) dans une fiole

jaugée de 1 l.
Ajouter ensuite 1,0 ml de chacune des solutions mères 4, 5, 6, 7 et 8.
Compléter à 1 000 ml avec de l'eau pure.

Il convient que le pH du milieu de culture soit de 5,5 ± 0,2 ; il peut être ajusté avec du HCl ou du NaOH.

Une fois préparé, le milieu de culture a une durée de conservation relativement courte et il convient de

l'utiliser dans les 2 semaines qui suivent sa préparation.
7 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, les éléments suivants.

7.1 Enceinte ou local thermostaté, ou incubateur, avec un éclairage fluorescent blanc assurant un

éclairement lumineux continu uniforme d'au moins 6 000 lx à la surface de la boîte de Petri employée

pour la germination des turions et de la plaque multipuits.

7.2 Luxmètre, pour le mesurage de l'intensité lumineuse à la surface de la boîte de Petri employée

pour la germination des turions et de la plaque multipuits.
7.3 pH-mètre, pour le contrôle et/ou l'ajustement du pH du milieu de culture.

7.4 Verrerie de laboratoire, pour la préparation des concentrations d'essai (fioles jaugées,

éprouvettes graduées, pipettes, tubes à essai).

7.5 Boîtes de Petri, de 9 cm de diamètre, munies d'un couvercle, pour la germination des turions.

7.6 Micro-tamis, à mailles de 100 µm, pour le rinçage des turions stockés.
7.7 Plaques multipuits, comportant 6 × 8 puits, comme plaques d'essai.

7.8 Spatule en plastique, pour le transfert des turions ayant germé dans les puits de la plaque

multipuits.

7.9 Appareil photo numérique, pour prendre une photographie de la plaque multipuits contenant

les lentilles d'eau en cours de croissance.

7.10 Système d'analyse d'images, pour le mesurage de la surface des premières frondes.

8 Produits chimiques de référence
8.1 3,5‐dichlorophénol, de qualité analytique, pureté > 99 %.
8.2 Chlorure de potassium, KCl, de qualité analytique, pureté > 99 %.
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9 Mode opératoire
9.1 Germination des turions de Spirodela polyrhiza

Lorsque des turions provenant d'une culture de Spirodela polyrhiza sont utilisés, placer les turions dans

une boîte de Petri (7.5) et verser 30 ml de milieu de culture (3.4).

Lorsque des turions stockés sont utilisés, prélever un tube contenant des turions stockés et l'agiter

légèrement pour remettre les turions en suspension.

Verser le contenu du tube sur le micro‐tamis (7.6) et rincer avec de l'eau pure (3.6) pour éliminer le

milieu de conservation.
Mettre 10 ml de milieu de culture (3.4) dans la boîte de Petri (7.5).

Renverser le micro‐tamis et transférer tous les turions dans la boîte de Petri en versant 10 ml de milieu

de culture sur la surface du micro‐tamis.

Compléter le remplissage de la boîte de Petri en ajoutant 10 ml de milieu de culture.

Couvrir la boîte de Petri avec le couvercle transparent et la placer dans l'incubateur ou dans le local

thermostaté (7.1).

Faire incuber la boîte de Petri pendant 3 jours (72 h ± 1 h) à (25 ± 1) °C, avec un éclairement lumineux

continu (d'au moins 6 000 lx à la surface de la boîte de Petri).

NOTE La germination des turions et la croissance des premières frondes dépendent « fortement » des

conditions de température et d'éclairement lumineux. Il est donc important de respecter aussi fidèlement que

possible les valeurs prescrites de température et d'éclairement lumineux.
9.2 Essais sur des effluents (et des eaux résiduaires)
9.2.1 Ajout d'un milieu de culture concentré à l'échantillon d'effluent
Transférer environ 80 ml d'effluent dans une fiole jaugée de 100 ml.

Ajouter 2 ml de chacune des solutions mères 1, 2 et 3, et 100 µl de chacune des solutions mères 4, 5, 6, 7

et 8 dans la fiole jaugée.

Compléter au trait de 100 ml avec l'effluent, boucher la fiole et l'agiter vigoureusement pour

homogénéiser le contenu.

NOTE L'addition de 6,5 ml de milieu de culture (3.4) à 93,5 ml d'effluent dilue l'échantillon d'effluent

d'environ 6 %. Cela signifie que la plus haute concentration d'effluent qui sera soumise à essai est d'environ 94 %

par rapport à l'échantillon d'effluent initial.
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9.2.2 Préparation des dilutions d'effluent

Une gamme de dilutions 1:1 est préparée à partir de l'effluent à 94 % (voir Figure 2).

Légende
1 effluent avec milieu de culture
2 milieu de culture
a effluent
Figure 2 — Préparation de la gamme de dilutions 1:1
9.2.3 Mode opératoire
Prendre 5 tubes à essai de 20 ml et les étiqueter C1, C2, C3, C4 et C5.

Introduire 20 ml d'effluent (contenant du milieu de culture) dans le tube à essai C1.

Introduire 10 ml de milieu de culture (comme milieu de dilution) dans les tubes C2, C3, C4 et C5.

Transférer 10 ml d'effluent du tube C1 dans le tube C2, puis boucher et agiter le tube à essai.

Transférer 10 ml de la dilution d'essai du tube C2 dans le tube C3, puis boucher et agiter le tube à essai.

Répéter ce mode opératoire pour les dilutions suivantes.

Les concentrations d'effluent qui seront soumises à essai sont indiquées dans le Tableau 3.

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ISO/DIS 20227:2016(F)
Tableau 3 — Gamme de dilutions de l'effluent
Tube à Concentration d'effluent
essai (en %)
C1 93,50
C2 46,75
C3 23,37
C4 11,68
C5 5,84
9.3 Essais sur des composés chimiques

Si la « toxicité approximative » (= ordre de grandeur) du composé chimique à soumettre à essai n'est

pas connue, un « essai préliminaire de détermination de l'ordre de grandeur » doit tout d'abord être

effectué afin de déterminer la plage de tolérance de 0 % à 100 % des lentilles d'eau vis‐à‐vis du produit

toxique.
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...

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