Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique

ISO 4833-2:2013 specifies a horizontal method for enumeration of microorganisms that are able to grow and form colonies on the surface of a solid medium after aerobic incubation at 30 °C. The method is applicable to: a) products intended for human consumption or for animal feed; b) environmental samples in the area of food and feed production and food handling. ISO 4833-2:2013 is applicable to: 1) products containing heat-sensitive organisms that are likely to form a significant proportion of the total flora (e.g. psychrotrophic organisms in chilled and frozen foods, dried foods, other foods that may contain heat-sensitive organisms); 2) products containing obligately aerobic bacteria that are likely to form a significant proportion of the total flora (e.g. Pseudomonas spp.); 3) products that contain small particles that can prove difficult to distinguish from colonies in a pour plate; 4) products whose intense colour prevents the recognition of colonies in a pour plate; 5) products for which distinction between different types of colony is required as part of the assessment of food quality. In addition to the manual spread plating technique, an annex to ISO 4833-2:2013 also specifies the use of a spiral plater, a rapid method of performing surface colony counts. The applicability of ISO 4833-2:2013 to the examination of certain fermented food and animal feeds is limited and other media or incubation conditions can be more appropriate. However, this method can be applied to such products even though it is possible that the predominant microorganisms in these products are not detected effectively. For some matrices, the method described in ISO 4833-2:2013 can give different results to those obtained using the method described in ISO 4833‑1.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour le dénombrement des micro-organismes — Partie 2: Comptage des colonies à 30 °C par la technique d'ensemencement en surface

L'ISO 4833-2:2013 spécifie une méthode horizontale de dénombrement des micro-organismes capables de se développer et de former des colonies à la surface d'un milieu solide après incubation aérobie à 30 °C. La méthode est applicable: a) aux produits destinés à la consommation humaine ou aux aliments pour animaux; b) aux échantillons d'environnement dans le domaine de la production d'aliments destinés à l'homme ou aux animaux et de la préparation des aliments. L'ISO 4833-2:2013 est applicable: 1) aux produits contenant des organismes sensibles à la chaleur susceptibles de former une partie significative de l'ensemble de la flore (par exemple des organismes psychrotrophes présents dans des aliments réfrigérés et congelés, des aliments secs, d'autres aliments pouvant contenir des organismes sensibles à la chaleur); 2) aux produits contenant des bactéries aérobies susceptibles de former une partie significative de l'ensemble de la flore (par exemple Pseudomonas spp.); 3) aux produits contenant de petites particules qu'il peut se révéler difficile de distinguer des colonies dans une boîte ensemencée en profondeur; 4) aux produits dont la couleur intense empêche la reconnaissance des colonies dans une boîte ensemencée en profondeur; 5) aux produits pour lesquels il est nécessaire de faire la différence entre les différents types de colonies dans le cadre de l'évaluation de la qualité des aliments. En plus de la technique d'ensemencement en surface manuelle, une annexe de l'ISO 4833-2:2013 spécifie également l'utilisation d'un dispositif d'ensemencement en spirale, méthode rapide de dénombrement des colonies en surface. L'ISO 4833-2:2013 peut ne pas être adaptée à l'analyse de certains aliments fermentés et aliments pour animaux et d'autres milieux ou conditions d'incubation peuvent être plus appropriés. Toutefois, cette méthode peut être appliquée à de tels produits, même si elle ne détecte pas totalement les micro-organismes présents en majorité dans ces produits. Pour certaines matrices, la méthode décrite dans l'ISO 4833-2:2013 peut donner des résultats différents de ceux obtenus avec la méthode décrite dans l'ISO 4833-1.

General Information

Status
Published
Publication Date
18-Aug-2013
Current Stage
9093 - International Standard confirmed
Start Date
20-Mar-2019
Completion Date
20-Mar-2019
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ISO 4833-2:2013 - Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the enumeration of microorganisms
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ISO 4833-2:2013 - Microbiologie de la chaîne alimentaire -- Méthode horizontale pour le dénombrement des micro-organismes
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 4833-2
First edition
2013-09-01
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the
enumeration of microorganisms —
Part 2:
Colony count at 30 °C by the surface
plating technique
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
le dénombrement des micro-organismes —
Partie 2: Comptage des colonies à 30 °C par la technique
d’ensemencement en surface
Reference number
ISO 4833-2:2013(E)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 4833-2:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2013

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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO 4833-2:2013(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 2

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Culture media and diluents ....................................................................................................................................................................... 2

5.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 2

5.2 Diluents ......................................................................................................................................................................................................... 2

5.3 Agar medium: plate count agar (PCA) ................................................................................................................................ 2

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 3

7 Sampling ........................................................................................................................................................................................................................ 4

8 Preparation of test sample ......................................................................................................................................................................... 4

9 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 4

9.1 Test portion, initial suspension and dilutions .............................................................................................................. 4

9.2 Inoculation and incubation .......................................................................................................................................................... 4

9.3 Counting of colonies ........................................................................................................................................................................... 5

10 Expression of results ........................................................................................................................................................................................ 5

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 5

Annex A (normative) Surface colony count using a spiral plater............................................................................................ 6

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................12

© ISO 2013 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 4833-2:2013(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2, www.iso.org/directives.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any

patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on

the ISO list of patent declarations received, www.iso.org/patents.

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology.

This first edition, together with ISO 4833-1, cancels and replaces ISO 4833:2003.

ISO 4833 consists of the following parts, under the general title Microbiology of the food chain —

Horizontal method for the enumeration of microorganisms:
— Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique
— Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique
iv © ISO 2013 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 4833-2:2013(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the enumeration of microorganisms —
Part 2:
Colony count at 30 °C by the surface plating technique
1 Scope

This part of ISO 4833 specifies a horizontal method for enumeration of microorganisms that are able to

grow and form colonies on the surface of a solid medium after aerobic incubation at 30 °C. The method

is applicable to:
a) products intended for human consumption or for animal feed;

b) environmental samples in the area of food and feed production and food handling.

This part of ISO 4833 is applicable to:

1) products containing heat-sensitive organisms that are likely to form a significant proportion of the

total flora (e.g. psychrotrophic organisms in chilled and frozen foods, dried foods, other foods that

may contain heat-sensitive organisms);

2) products containing obligately aerobic bacteria that are likely to form a significant proportion of

the total flora (e.g. Pseudomonas spp.);

3) products that contain small particles that can prove difficult to distinguish from colonies in a pour plate;

4) products whose intense colour prevents the recognition of colonies in a pour plate;

5) products for which distinction between different types of colony is required as part of the assessment

of food quality.

In addition to the manual spread plating technique, this part of ISO 4833 also specifies the use of a spiral

plater, a rapid method of performing surface colony counts (Annex A).

The applicability of this part of ISO 4833 to the examination of certain fermented food and animal feeds

is limited and other media or incubation conditions can be more appropriate. However, this method can

be applied to such products even though it is possible that the predominant microorganisms in these

products are not detected effectively.

For some matrices, the method described in this part of ISO 4833 can give different results to those

obtained using the method described in ISO 4833-1.
2 Normative references

The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are

indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated

references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial

suspension and decimal dilutions for microbiological examination

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations
© ISO 2013 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 4833-2:2013(E)

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and performance

testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
microorganism
entity of microscopic size, encompassing bacteria, fungi, protozoa and viruses
[SOURCE: ISO/TS 11139:2006, 2.26]

Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO 4833, microorganisms are bacteria, yeasts and moulds that

are able to produce colonies under the conditions specified in this part of ISO 4833.

4 Principle

A specified quantity of the test sample, or a specified quantity of an initial suspension in the case of

other products, is surface plated on a solid agar culture medium contained in Petri dishes.

Other plates are prepared under the same conditions using decimal dilutions of the test sample or of the

initial suspension.
The plates are incubated under aerobic conditions at 30 °C for 72 h.

The number of microorganisms per gram of sample or the number of microorganisms per millilitre of

sample is calculated from the number of colonies obtained on the plates containing fewer than 300 colonies.

5 Culture media and diluents
5.1 General

Follow ISO 11133 for the preparation, production and performance testing of culture media.

5.2 Diluents

Use the diluent(s) specified in ISO 6887 for the product concerned or the specific International Standard

dealing with the product under examination.
5.3 Agar medium: plate count agar (PCA)
5.3.1 Composition
Enzymatic digest of animal tissues 5,0 g
Yeast extract 2,5 g
Glucose, anhydrous (C H O ) 1,0 g
6 12 6
Agar 9 g to 18 g
Water 1 000 ml
Depending on the gel strength of the agar.

When dairy products are examined, add skimmed milk powder at 1,0 g/l of the culture medium. The

skimmed milk powder shall be free from inhibitory substances.
2 © ISO 2013 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 4833-2:2013(E)
5.3.2 Preparation

Dissolve the components or the dehydrated complete medium in the water, by heating if necessary. Mix

thoroughly and leave to stand for several minutes.

Adjust the pH (6.5), if necessary, so that after sterilization it is 7,0 ± 0,2 at 25 °C.

Dispense the medium into flasks or bottles (6.9) of suitable capacity. Sterilize in an autoclave (6.1) at

121 °C for 15 min.

If the medium is to be used immediately, cool it in a water bath (6.4) maintained at 47 °C to 50 °C before

use. If not, allow the medium to solidify in the flask or bottle. Before use, melt the medium completely in

a boiling water bath, then cool it in the water bath (6.4) maintained at 47 °C to 50 °C.

5.3.3 Preparation of agar plates

Pour 15 ml to 20 ml of the medium into sterile Petri dishes (6.6) and allow to solidify.

The plates may be stored at (5 ± 3) °C for up to 4 weeks.

Immediately before use, the agar plates should be dried in accordance with ISO 11133.

5.3.4 Performance testing of the culture medium
5.3.4.1 General

Plate count agar is a non-selective medium, used in this part of ISO 4833 as a pre-poured plate for surface

inoculation. Productivity shall be tested according to ISO 11133.
5.3.4.2 Productivity
Incubation (30 ± 1) °C for (72 ± 3) h

Control strains Escherichia coli WDCM 00013 or WDCM 00012 [World Data Centre for Microor-

ganisms (WDCM)]
Bacillus subtilis subsp. spizizenii WDCM 00003
Staphylococcus aureus WDCM 00032 or WDCM 00034
Reference medium Tryptone soya agar
Control method Quantitative
Criterion Productivity ratio (PR) ≥0,7

The strains to be used by the user laboratory (minimum). See Reference [15] for information on culture collection strain

numbers and contact details.
6 Apparatus

Disposable apparatus is an acceptable alternative to re-usable glassware and plastic if it has suitable

specifications.

Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and in particular the following.

6.1 Oven for dry sterilization or autoclave for wet sterilization, used in accordance with ISO 7218.

6.2 Drying cabinet or incubator, ventilated by convection, for drying plates, capable of being

maintained between 37 °C and 55 °C, or laminar flow cabinet.
© ISO 2013 – All rights reserved 3
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ISO 4833-2:2013(E)
6.3 Incubator, capable of being maintained at (30 ± 1) °C.

6.4 Water baths, capable of being maintained at 47 °C to 50 °C, and another capable of maintaining

water at boiling point.
6.5 pH-meter, accurate to within ±0,1 pH unit at 25 °C.

6.6 Petri dishes, made of glass or plastic, of diameter 90 mm to 100 mm, or140 mm.

[1]

6.7 Total delivery graduated pipettes, sterile, of nominal capacities 0,1 ml and 1 ml, ISO 835

[2]
class A, or automatic pipettes, ISO 8655-2, with use of sterile tips.

6.8 Colony-counting equipment (optional), consisting of an illuminated base and, optionally, a

mechanical or electronic digital counter.

6.9 Bottles or flasks, of appropriate capacity, for preparation, sterilization and, if necessary, storage

of culture media.

6.10 Spreaders, made of glass, plastic or steel, sterile, for spreading the inoculum on the surface of

the culture medium.
7 Sampling

Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 4833. See the specific International

Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard, it is

recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.

It is important the laboratory receive a truly representative sample which has not been damaged or

changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample

Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the

product concerned.
9 Procedure
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions

Follow the specifications of ISO 6887 or the specific International Standard appropriate to the

product concerned.
9.2 Inoculation and incubation

9.2.1 Transfer, using a sterile pipette (6.7), 0,1 ml of the test sample, if the product is liquid, or of the

initial suspension in the case of other products, to the centre o
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 4833-2
Première édition
2013-09-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour le dénombrement des micro-
organismes —
Partie 2:
Comptage des colonies à 30 °C par
la technique d’ensemencement en
surface
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
enumeration of microorganisms —
Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique
Numéro de référence
ISO 4833-2:2013(F)
ISO 2013
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 4833-2:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
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Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 4833-2:2013(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 2

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Milieux de culture et diluants ................................................................................................................................................................. 2

5.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 2

5.2 Diluants ......................................................................................................................................................................................................... 2

5.3 Milieu gélosé: gélose pour dénombrement (PCA) .................................................................................................... 3

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 4

7 Échantillonnage ..................................................................................................................................................................................................... 4

8 Préparation de l’échantillon pour essai ....................................................................................................................................... 5

9 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions ................................................................................................................... 5

9.2 Ensemencement et incubation .................................................................................................................................................. 5

9.3 Dénombrement des colonies ...................................................................................................................................................... 5

10 Expression des résultats............................................................................................................................................................................... 6

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 6

Annexe A (normative) Comptage des colonies en surface au moyen d’un dispositif

d’ensemencement en spirale ................................................................................................................................................................... 7

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................13

© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 4833-2:2013(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne

la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2, www.iso.

org/directives.

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les

références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration

du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues,

www.iso.org/brevets.

Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour

information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.

Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie.

Cette première édition, conjointement avec l’ISO 4833-1, annule et remplace l’ISO 4833:2003.

L’ISO 4833 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie de la chaîne

alimentaire —Méthode horizontale pour le dénombrement des micro-organismes:

— Partie 1: Comptage des colonies à 30 °C par la technique d’ensemencement en profondeur

— Partie 2: Comptage des colonies à 30 °C par la technique d’ensemencement en surface

iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 4833-2:2013(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour le dénombrement des micro-organismes —
Partie 2:
Comptage des colonies à 30 °C par la technique
d’ensemencement en surface
1 Domaine d’application

La présente partie de l’ISO 4833 spécifie une méthode horizontale de dénombrement des micro-

organismes capables de se développer et de former des colonies à la surface d’un milieu solide après

incubation aérobie à 30 °C. La méthode est applicable:
a) aux produits destinés à la consommation humaine ou aux aliments pour animaux;

b) aux échantillons d’environnement dans le domaine de la production d’aliments destinés à l’homme

ou aux animaux et de la préparation des aliments.
La présente partie de l’ISO 4833 est applicable:

1) aux produits contenant des organismes sensibles à la chaleur susceptibles de former une partie

significative de l’ensemble de la flore (par exemple des organismes psychrotrophes présents dans

des aliments réfrigérés et congelés, des aliments secs, d’autres aliments pouvant contenir des

organismes sensibles à la chaleur);

2) aux produits contenant des bactéries aérobies susceptibles de former une partie significative de

l’ensemble de la flore (par exemple Pseudomonas spp.);

3) aux produits contenant de petites particules qu’il peut se révéler difficile de distinguer des colonies

dans une boîte ensemencée en profondeur;

4) aux produits dont la couleur intense empêche la reconnaissance des colonies dans une boîte

ensemencée en profondeur;

5) aux produits pour lesquels il est nécessaire de faire la différence entre les différents types de

colonies dans le cadre de l’évaluation de la qualité des aliments.

En plus de la technique d’ensemencement en surface manuelle, la présente partie de l’ISO 4833 spécifie

également l’utilisation d’un dispositif d’ensemencement en spirale, méthode rapide de dénombrement

des colonies en surface (Annexe A).

La présente partie de l’ISO 4833 peut ne pas être adaptée à l’analyse de certains aliments fermentés

et aliments pour animaux et d’autres milieux ou conditions d’incubation peuvent être plus appropriés.

Toutefois, cette méthode peut être appliquée à de tels produits, même si elle ne détecte pas totalement

les micro-organismes présents en majorité dans ces produits.

Pour certaines matrices, la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO 4833 peut donner des

résultats différents de ceux obtenus avec la méthode décrite dans l’ISO 4833-1.
2 Références normatives

Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à

l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 4833-2:2013(F)

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension

mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

ISO 11133, Microbiologie des aliments et de l’eau — Préparation, production, stockage et essais de

performance des milieux de culture
3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

3.1
micro-organisme

entité de taille microscopique, comprenant les bactéries, les champignons, les protozoaires et les virus

[SOURCE: ISO/TS 11139:2006, 2.26]

Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO 4833, les micro-organismes sont des bactéries, levures

et moisissures capables de produire des colonies dans les conditions spécifiées dans la présente partie de l’ISO 4833.

4 Principe

Une quantité déterminée de l’échantillon pour essai, ou une quantité déterminée de suspension mère

dans le cas d’autres produits, est ensemencée à la surface d’un milieu de culture gélosé solide contenu

dans des boîtes de Petri.

D’autres boîtes sont préparées dans les mêmes conditions, à partir de dilutions décimales de l’échantillon

pour essai ou de la suspension mère.
Les boîtes sont incubées dans des conditions aérobies à 30 °C pendant 72 h.

Le nombre de micro-organismes par gramme d’échantillon ou le nombre de micro-organismes par

millilitre d’échantillon est calculé à partir du nombre de colonies obtenues sur les boîtes contenant

moins de 300 colonies.
5 Milieux de culture et diluants
5.1 Généralités

Suivre l’ISO 11133 pour la préparation, la production et les essais de performance du milieu de culture.

5.2 Diluants

Utiliser le ou les diluants spécifiés dans l’ISO 6887 pour le produit concerné ou la Norme internationale

spécifique du produit soumis à examen.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO 4833-2:2013(F)
5.3 Milieu gélosé: gélose pour dénombrement (PCA)
5.3.1 Composition
Digestat enzymatique de tissus d’animaux 5,0 g
Extrait de levure 2,5 g
Glucose anhydre (C H O ) 1,0 g
6 12 6
Gélose 9 g à 18 g
Eau 1 000 ml
En fonction du pouvoir gélifiant de la gélose.

Dans le cas de l’analyse de produits laitiers, ajouter 1,0 g de poudre de lait écrémé par litre de milieu de

culture. La poudre de lait écrémé doit être exempte de substances inhibitrices.
5.3.2 Préparation

Dissoudre, dans de l’eau, les composants ou le milieu complet déshydraté, en chauffant si nécessaire.

Mélanger soigneusement et laisser reposer plusieurs minutes.

Ajuster le pH (6.5), si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il soit de 7,0 ± 0,2 à 25 °C.

Répartir le milieu dans des fioles ou flacons (6.9) de capacité appropriée. Stériliser pendant 15 min à

l’autoclave (6.1) à 121 °C.

Si le milieu est à utiliser extemporanément, le refroidir dans un bain d’eau (6.4) maintenu entre 47 °C et

50 °C, avant utilisation. Sinon, le laisser se solidifier dans une fiole ou dans un flacon. Avant utilisation,

faire fondre complètement le milieu dans un bain d’eau bouillante, puis le refroidir dans un bain d’eau

(6.4) maintenu entre 47 °C et 50 °C.
5.3.3 Préparation des boîtes gélosées

Verser entre 15 ml et 20 ml de milieu dans des boîtes de Petri stériles (6.6) et laisser solidifier.

Les boîtes peuvent être stockées à (5 ± 3) °C pendant 4 semaines au plus.

Immédiatement avant utilisation, il est recommandé de sécher les boîtes gélosées conformément à l’ISO 11133.

5.3.4 Essai de performance du milieu de culture
5.3.4.1 Généralités

La gélose pour dénombrement (PCA) est un milieu non sélectif, utilisé dans la présente partie de l’ISO 4833

comme milieu pré-coulé pour ensemencement en surface. Les essais portant sur la productivité doivent

être réalisés conformément à l’ISO 11133.
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ISO 4833-2:2013(F)
5.3.4.2 Productivité
Incubation (72 ± 3) h à (30 ± 1) °C
Souches témoins Escherichia coli WDCM 00013 ou WDCM 00012 [World Data Centre for
Microorganisms (WDMC), Centre mondial de données pour les micro-orga-
nismes]
Bacillus subtilis subsp. spizizenii WDCM 00003
Staphylococcus aureus WDCM 00032 ou WDCM 00034
Milieu de référence Gélose tryptone soja
Méthode de contrôle Quantitative
Critère Rapport de productivité (RP) ≥ 0,7

Souches à utiliser par le laboratoire utilisateur (au minimum). Voir la Référence [15] pour obtenir des informations sur les

références des souches de collections et les coordonnées des centres concernés.
6 Appareillage

Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie et le matériel en plastique

réutilisables, si leurs spécifications sont appropriées.

Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.

6.1 Four pour la stérilisation en chaleur sèche ou autoclave pour la stérilisation en chaleur humide,

utilisé conformément à l’ISO 7218.

6.2 Étuve ou armoire de séchage, ventilée par convection, pour sécher les boîtes, pouvant être

maintenue entre 37 °C et 55 °C, ou hotte à flux d’air laminaire.
6.3 Étuve, pouvant être maintenue à (30 ± 1) °C.

6.4 Bains d’eau, l’un pouvant maintenir une température comprise entre 47 °C et 50 °C et l’autre

pouvant maintenir l’eau au point d’ébullition.
6.5 pH-mètre, d’une précision de ± 0,1 unité pH à 25 °C.

6.6 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, de 90 mm à 100 mm, ou 140 mm de diamètre.

6.7 Pipettes graduées à écoulement total, stériles, ayant une capacité nominale de 0,1 ml et de

[1] [2]

1 ml, ISO 835 classe A, ou pipettes automatiques, ISO 8655-2 , utilisant des embouts stériles.

6.8 Appareil de comptage des colonies (facultatif), constitué d’une base éclairée et d’un compteur

(facultatif) mécanique ou électronique à affichage numérique.

6.9 Fioles ou flacons, de capacité appropriée pour la préparation, la stérilisation et, si nécessaire, le

stockage des milieux de culture.

6.10 Spatules, en verre, en plastique ou en métal, stériles, servant à étaler l’inoculum sur le milieu de

culture.
7 Échantillonnage

L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 4833. Se

reporter à la Norme internationale spécifique traitant du produit concerné. S’il n’existe aucune Norme

internationale spécifique, il est recommandé aux parties intéressées de convenir d’un accord à ce sujet.

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ISO 4833-2:2013(F)

Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou

modifié pendant le transport ou le stockage.
8 Préparation de l’échantillon pour essai

Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique du produit concerné.

9 Mode opératoire
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions

Suivre les spécifications de l’ISO 6887 ou la Norme internationale spécifique appropriée au produit concerné.

9.2 Ensemencement et incubation

9.2.1 Au moyen d’une pipette stérile (6.7), transférer 0,1 ml de l’échantillon pour essai si le produit est

liquide, ou de la suspension mère dans le cas d’autres produits, au centre de deux boîtes de milieu gélosé

(5.3). Si des boîtes sont préparées à partir de plus d’une dilution, le nombre de boîtes par dilution peut

être réduit à une boîte (voir l’ISO 7218).

Si, pour certains produits, il est souhaitable de dénombrer de faibles quantités d’organismes, les limites

de détection peuvent être augmentées d’un facteur de 10 en ensemençant 1,0 ml de l’échantil

...

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