ISO 11290-1:1996
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes — Part 1: Detection method
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes — Part 1: Detection method
Specifies a horizontal method for the detection of Listeria monocytogenes. Applicable to products intended for human consumption or as animal feeding stuffs.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes — Partie 1: Méthode de recherche
La présente partie de l'ISO 11290 prescrit une méthode horizontale pour la recherche de Listeria monocytogenes. La présente partie de l'ISO 11290 est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation animale, avec les quelques restrictions signalées dans l'introduction.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL
IS0
STANDARD 11290-I
First edition
1996-l 2-15
Microbiology of food and animal feeding
stuffs - Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria
monocytogenes -
Part 1:
Detection method
Microbiologic des aliments - Mkthode horizontale pour la recherche et le
dknombrement de Listeria monocytogenes -
Partie I: Mkthode de recherche
Reference number
IS0 11290-1:1996(E)
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IS011290=1:1996(E)
Page
Contents
1
1 Scope .
1
2 Normative references .
1
3 Definitions .
2
4 Principle .
2
5 Culture media and reagents .
.............................................................. 3
6 Apparatus and glassware
3
7 Sampling .
3
8 Preparation of test sample .
3
......................................................................................
9 Procedure
7
.....................................................................
10 Expression of results
7
11 Test report .
Annexes
8
....................................................................
A Diagram of procedure
9
........
B Composition and preparation of culture media and reagents
16
Henry illumination test .
C
0 IS0 1996
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
International Organization for Standardization
Case Postale 56 l CH-1211 Geneve 20 l Switzerland
Printed in Switzerland
ii
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@ IS0 ISO11290-1:1996(E)
Foreword
IS0 (the lnternational Organization for Standardization) is a worldwide fed-
eration of national standards bodies (IS0 member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through IS0
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liason with ISO, also take part in the work. IS0 collab-
orates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on
all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are cir-
culated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard IS0 11290-I was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 9, Microbiology.
IS0 11290 consists of the following parts, under the general title Micro-
biology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the de-
tection and enumeration of Listeria monocytogenes:
- Part I: Detection method
- Part 2: Enumeration method
Annexes A and B form an integral part of this part of IS0 11290. Annex C
is for information only.
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IS011290=1:1996(E) 0 IS0
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal
method may not be appropriate in every detail for certain products for
which it may be necessary to use different or specific methods. Neverthe-
less, in all cases, every attempt should be made to apply this horizontal
method as far as possible and that deviations from this will only be made if
absolutely necessary for justified technical reasons.
When this part of IS0 11290 is next reviewed, account will be taken of all
information then available regarding the extent to which this horizontal
method has been followed and the reasons for deviations from it in the
case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain
groups of products International Standards and/or national standards may
already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped that
when such standards are reviewed they will be changed to comply with this
part of IS0 11290 so that eventually the only remaining departures from
this horizontal method will be those necessary for well-established techni-
cal reasons.
IV
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IS0 11290-I : 1996(E)
INTERNATIONAL STANDARD @ IS0
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal
method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes -
Part 1:
Detection method
In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is strongly recommended that
WARNING -
tests for detecting Listeria monocytogenes are undertaken in properly equipped laboratories, under the
control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated materials. In
particular, it is strongly recommended that pregnant personnel do not manipulate cultures of L. monocyto-
genes.
IS0 7218: 1996, Microbiology of food and animal feed-
1 Scope
ing stuffs - General rules for microbiological exam-
ina tions.
This part of IS0 11290 specifies a horizontal method
for the detection of Listeria monocytogenes.
Subject to the limitations discussed in the introduction,
this part of IS0 11290 is applicable to products in-
tended for human consumption or animal feeding.
3 Definitions
For the purposes of this part of IS0 11290, the follow-
2 Normative references
ing definitions apply.
The following standards contain provisions which,
through reference in this text, constitute provisions of
3.1 Lis teria monocytogenes: Microorganisms
this part of IS0 11290. At the time of publication, the
which form typical colonies on solid selective media
editions indicated were valid. All standards are subject
and which display the morphological, physiological
to revision, and parties to agreements based on this
and biochemical characteristics described when tests
part of IS0 11290 are encouraged to investigate the
are carried out in accordance with this part of
possibility of applying the most recent editions of the
IS0 11290.
standards indicated below. Members of IEC and IS0
maintain registers of currently valid International Stan-
dards.
3.2 detection of Listeria monocytogenes: Deter-
mination of the presence or absence of these micro-
organisms, in a given mass or volume of product,
IS0 6887:1983, Microbiology - General guidance for
when tests are carried out in accordance with this part
the preparation of dilutions for microbiological exam-
of IS0 11290.
ina tion.
1
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IS0 11290-l :1996(E)
5 Culture media and reagents
4 Principle
Within the limits of this part of IS0 11290, the detec-
5.1 General
tion of L. monocytogenes necessitates four successive
stages (see annex A for a flowchart).
For current laboratory practice, see IS0 7218.
NOTE 1 Listeria spp. may be present in small numbers
NOTE 2 Because of the large number of culture media and
and are often accompanied by considerably larger numbers
reagents, it has been considered preferable, for clarity of
of other genera, therefore selective enrichment is neces-
the text, to give their composition and preparation in
sary. It is also necessary to detect injured Listeria spp. and
annex B.
the primary selective enrichment medium, with reduced in-
hibitor concentration, fulfils at least part of this function.
5.2 Selective primary enrichment medium:
Fraser broth with reduced concentration of
4.1 Primary enrichment in a selective liquid
selective agents (half Fraser broth)
enrichment medium with reduced
concentration of selective agents (half Fraser
See clause B.l .
broth)
5.3 Selective secondary enrichment medium
inoculation of a selective primary enrichment medium
with full concentration of selective agents
containing one volume of lithium chloride and half a
(Fraser broth)
volume of both acriflavine and nalidixic acid (half
Fraser broth), which is also used as a dilution fluid for
See clause B.2.
the test portion (9.1).
Incubation of the test portion at 30 “C for 24 h.
5.4 Selective solid plating-out media
5.4.1 First medium: Oxford agar
4.2 Secondary enrichment with a selective
liquid enrichment medium with full
See clause B.3.
concentration of selective agents (Fraser
broth)
5.4.2 Second medium: PALCAM agar
Inoculation of full-strength secondary liquid enrichment
medium (Fraser broth) with a culture obtained from
See clause B.4.
4.1.
5.5 Solid culture medium: Tryptone soya
Incubation of the Fraser broth at 35 OC or 37 OC for
yeast extract agar (TSYEA)
4% h.
See clause B.5.
4.3 Plating out and identification
5.6 Liquid culture medium: Tryptone soya
From the cultures obtained in 4.1 and in 4.2, plating
yeast extract broth (TSYEB)
out on the two selective solid media:
a) Oxford agar; See clause B.6.
b) PALCAM agar.
5.7 Sheep blood agar
Incubation at 30 OC, 35 OC or 37 “C and examination
after 24 h and, if necessary, after 48 h to check for the See clause B.7.
presence of characteristic colonies which are pre-
sumed to be L. monocyfogenes.
5.8 Carbohydrate utilization broth
(rhamnose and xylose)
4.4 Confirmation
See clause B.8.
Subculturing of the colonies of presumptive L. mono-
cytogenes, plated out as described in 4.3, and con- 5.9 Motility agar (optional)
firmation by means of appropriate morphological,
See clause B.9.
physiological and biochemical tests.
2
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IS0 11290-l : 1996(E)
@ IS0
6.9 Total-delivery graduated pipettes, of nominal
5.10 CAMP (Christie, Atkins, Munch-
capacities 10 ml and 1 ml, graduated respectively in
Petersen) medium and test strains
05 ml and 0,l ml divisions.
See clause B.10.
6.10 Petri dishes, of diameter 90 mm to 100 mm.
5.11 Hydrogen peroxide solution
6.11 Jars, suitable for microaerobic incubation
(opt ion al).
See clause B.11.
6.12 Gas mixture (optional), of specified compo-
sition for microaerobic incubation:
5.12 Phosphate-buffered saline (PBS)
5%to12%COZ,5%to15%0,,and75%N,.
See clause B.12.
6.13 Equipment for the Henry illumination test
(optional).
6 Apparatus and glassware
See annex C.
Usual microbiological equipment (see IS0 7218) and,
in particular, the following. 6.14 Microscope, preferably with phase-contrast,
and with slides and coverslips.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet
sterilization (autoclave)
7 Sampling
See IS0 7218.
It is important that the laboratory receive a sample
6.2 Drying cabinet or incubator, capable of being
which is truly representative and has not been dam-
maintained at between 25 OC & 1 OC and 50 OC + 1 OC.
aged or changed during transport or storage.
6.3 Incubators, for maintaining the inoculated me- Sampling is not part of the method specified in this
dia, plates and tubes within the following temperature part of IS0 11290. If there is no specific International
ranges: Standard dealing with sampling of the product con-
cerned, it is recommended that the parties concerned
a) 25 OC + 1 “C;
come to an agreement on this subject.
b) 30 “C & 1 “C; and
c) 35”Cf.l oCor37°C&1 OC.
8 Preparation of test sample
6.4 Water bath, capable of being maintained at
47 “C I!I 2 “C.
Prepare the test sample in accordance with the
specific International Standard appropriate to the
6.5 Loops, of platinum/iridium or nickel/chromium,
product concerned. If there is no specific International
approximately 3 mm in diameter, and wires of the
Standard, it is recommended that the parties con-
same material, or hockey-stick-shaped glass rods
cerned come to an agreement on this subject.
or single-use loops.
6.6 pH-meter, capable of being read to the nearest
0,Ol pH unit at 25 OC, enabling measurements to be
9 Procedure
made which are accurate to + 0,l pH unit.
9.1 Test portion and initial suspension
6.7 Test tubes or flasks, of appropriate capacity, for
sterilization and storage of *culture media and incu-
See IS0 6887 and any specific International Standard
bation of liquid media.
appropriate to the product concerned.
6.8 Measuring cylinders, of capacity 50 ml to
For preparation of the initial suspension, use as di-
1 000 ml, for preparation of dilutions and complete
lution fluid the selective primary enrichment medium
media.
specified in 5.2.
3
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IS0 11290-l :1996(E) 0 IS0
35 “C or 37 “C because Listeria spp. tend to develop at the
In general, to prepare the initial suspension, add a test
same time as the supplementary flora. In all cases, the in-
portion of x g or x ml to 9x ml or 9x g of the selective
cubation temperature of the agar should be agreed upon
primary enrichment medium (5.2), to obtain a ratio of
between the parties concerned and recorded in the test re-
test portion to selective primary enrichment medium of
port.
l/IO (mass to volume or volume to volume).
9.4.4 After incubation for 24 h and for an additional
18 h to 24 h (if growth is slight or if no colonies are ob-
9.2 Primary enrichment
served after 24 h of incubation), examine the dishes
(9.4.3) for the presence of colonies presumed to be
Incubate [6.3 b)] the initial suspension, prepared in ac-
Listeaia spp.
cordance with 9.1, at 30 OC for 24 h + 2 h.
9.4.4.1 Oxford agar: Typical colonies of Listeria spp.
coloration may develop during the incu-
NOTE 3 A black
bation. grown on Oxford agar for 24 h are small (1 mm) grey-
ish colonies surrounded by black halos. After 48 h
colonies become darker, with a possible greenish
9.3 Secondary enrichment
sheen, and are about 2 mm in diameter, with black
halos and sunken centres.
9.3.1 After incubation of the initial suspension
(primary enrichment) for 24 h & 2 h (9.2), transfer
9.4.4.2 PALCAM agar: For plates incubated micro-
0,l ml of the culture obtained in 9.2 (regardless of its
aerobically, after incubation expose the PALCAM agar
colour) to a tube (6.7) containing 10 ml of secor
dary
plates to air for 1 h to allow the medium to regain its
enrichment medium (Fraser broth) (5.3).
pink to purple colour. After 24 h Listeria spp. grow as
small or very small greyish green or olive green colo-
9.3.2 Incubate the inoculated medium (9.3.1 for
nies, I,5 mm to 2 mm in diameter, sometimes with
48 h + 2 h at 35 OC or 37 “C.
black centres, but always with black halos. After 48 h
Listeria spp. appear in the form of green colonies
NOTE 4 The temperature of the inoculated medium s lould
about I,5 mm to 2 mm in diameter, with a central de-
between the parties concerned and re-
be agreed upon
pression and surrounded by a black halo.
corded in the test report.
9.4 Plating out and identification
9.5 Confirmation of LiSferia spp.
9.4.1 From the primary enrichment culture incubated
9.5.1 Selection of colonies for confirmation
for 24 h rfI 2 h at 30 OC (9.2), take, by means of a loop
or glass rod (6.5), a portion of the culture and inocu-
9.5.1.1 For confirmation, take from each plate of
late the surface of the first selective plating medium
each selective medium (see 9.4.4.1 and 9.4.4.2), five
(Oxford agar) (5.4.1) so that well-separated colonies
colonies presumed to be Listeria spp.
are obtained.
If on one plate there are fewer than five presumed
Proceed in the same way with the second selective
colonies, take for confirmation all of them.
plating-out medium (PALCAM agar) (5.4.2).
9.5.1.2 Streak the selected colonies onto the surface
NOTE 5 This plating out is carried out regardless of the
of pre-dried plates of tryptone soya yeast extract agar
colour of the medium.
(TSYEA) (5.5) in a manner which will allow well-
separated colonies to develop.
9.4.2 From the secondary enrichment medium incu-
bated for 48 h + 2 h at 35 OC or 37 OC (9.3.2), repeat
Place the plates in the incubator 16.3 c)] set at 35 OC
the procedure described in 9.4.1 with the two selective
or 37 “C for 18 h to 24 h or until growth is satisfactory.
plating-out media.
NOTE 7 The temperature of the inoculated medium should
9.4.3 Invert the dishes obtained in 9.4.1 and 9.4.2
be agreed upon between the parties concerned and re-
and place them in an incubator (6.3) set at 30 OC,
corded in the test report.
35 OC or 37 OC. PALCAM agar plates are incubated
either microaerobically in a jar (6.11) containing the
Typical colonies are 1 mm to 2 mm in diameter, con-
gas mixture (6.12) or aerobically.
vex, colourless and opaque with an entire edge. If the
colonies are not well separated, pick a typical Listeria
NOTE 6 Incubation of the Oxford agar at 30 “C is suitable
spp. colony onto another TSYEA plate. Carry out the
for foodstuffs only lightly contaminated by a supplementary
following tests from colonies of a pure culture on the
flora. For products heavily contaminated by a supplemen-
tary flora, it is preferable to incubate the Oxford agar at TSYEA.
4
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IS0 11290-l :1996(E)
@ IS0
The Henry illumination test (see annex C) may be inoculate the sheep blood agar plates (5.7) to deter-
NOTE 8
conducted, if necessary. For this test, it is important that the mine the haemolytic reaction.
agar medium is thin (15 ml/plate).
Dry the agar surface well before use. Take a colony
9.5.2 Catalase reaction
separated in 9.5.1.2 and plate and stab one space for
each culture, using a wire (6.5). Simultaneously stab
Take an isolated colony obtained in 9.5.1.2 and sus-
positive (L. monocytogenes) and negative control cul-
pend it in a drop of hydrogen peroxide solution (5.11)
tures (L. innocua).
on a slide. The immediate formation of gas bubbles
indicates a positive reaction.
After incubation at 35 OC or 37 OC for 24 h + 2 h, ex-
amine the test strains and controls. L. monocytogenes
9.5.3 Gram staining
show narrow, clear, light zones (P-haemolysis*); see
figure 1); L. innocua show no clear zone around the
Perform the Gram stain on a colony separated in
stab. L. seeligeri show a weak zone of haemolysis.
951.2. Listeria spp. are revealed as Gram-positive
L. ivanovii usually show wide, clearly delineated zones
slim, short rods.
of P-haemolysis. Examine the plates in a bright light to
compare test cultures with controls.
9.5.4 Motility test (if necessary)‘)
NOTE 9 The haemolytic reaction may also be carried out
Take an isolated colony obtained in 9.5.1.2 and sus- using red blood corpuscles. Disperse the colony in 150 ~1 of
pend it in a tube containing TSYEB (5.6). TSYEB (5.6); incubate at 35 OC or 37 OC for 2 h. Add 150 ~1
of sheep red blood corpuscles in a 2 %. solution of PBS
(5.12). Incubate at 35 “C or 37 “C for between 15 min and
Incubate in the incubator [6.3 a)] set at 25 OC for 8 h to
60 min, then refrigerate at 3 OC + 2 OC for about 2 h. Then
24 h until a cloudy medium is observed.
examine for the presence or absence of haemolysis. If the
reaction is not definite, leave the culture at 3 “C + 2 “C for
Deposit a drop of the above culture using a loop (6.5)
up to 24 h.
onto a clean glass microscope slide. Place a coverslip
on top and examine it with the microscope (6.14).
9.6.2 Carbohydrate utilization
Lisferia spp. appear as slim, short rods with tumbling
motility.
Inoculate using a loop (6.5) each of the carbohydrate
utilization broths (5.8) with a culture from TSYEB
Cultures grown above 25 “C may fail to exhibit this
(9.5.4). Incubate at 35 OC or 37 OC for up to 5 days.
motion. Always compare them to a known culture.
Positive reactions (acid formation) are indicated by a
Cocci, large rods, or rods with rapid swimming motility
yellow colour and occur mostly within 24 h to 48 h.
are not Listeria spp.
As an alternative test for motil
...
NORME
ISO
INTERNATIONALE
11290-I
Première édition
1996-l 2-15
Microbiologie des aliments - Méthode
horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria
monocytogenes -
Partie 1:
Méthode de recherche
Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria monocytogenes -
Part 1: Detection method
Numéro de référence
ISO 11290-I :1996(F)
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 1129011:1996(F)
Page
Sommaire
1
1 Domaine d’application .
1
..................................................................
2 Références normatives
1
Définitions .
3
1
4 Principe .
2
..........................................................
5 Milieux de culture et réactifs
3
6 Appareillage et verrerie .
3
.............................................................................
7 Échantillonnage
.......................................... 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai
4
............................................................................
9 Mode opératoire
8
...............................................................
10 Expression des résultats
8
11 Rapport d’essai .
Annexes
9
A Représentation schématique du mode opératoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
B Composition et préparation des milieux de culture et des
10
réactifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .*.
17
. . . . . . . . . . . . .*.
C Test d’illumination de Henry
0 ISO 1996
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l’accord
écrit de l’éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 l CH-1 211 Genève 20 l Suisse
Imprimé en Suisse
ii
---------------------- Page: 2 ----------------------
@ ISO ISO 11290=1:1996(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de
I’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en générai confiée aux
comités techniques de I’ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les or-
ganisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec I’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des co-
mités membres votants.
La Norme internationale ISO 11290-I a été élaborée par le comité techni-
que ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9, Micro-
biologie.
L’ISO 11290 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre géné-
ral Microbiologie des aliments - Méthode horizontale pour /a recherche et
le dénombrement de Listeria monocytogenes:
- Parfie 7: Méthode de recherche
- Parfie 2: Méthode de dénombrement
1 de la présente Norme internatio-
Les annexes A et B font partie intégrante
nale . L’annexe C est donnée uniquement à titre d’information.
D.
III
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 11290=1:1996(F) @ ISO
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible
que cette méthode horizontale ne convienne pas exactement, dans tous
ses détails, pour certains produits pour lesquels il peut être nécessaire
d’employer des méthodes différentes ou spécifiques à ces produits. Néan-
moins, tous les efforts devront être faits pour appliquer cette méthode hori-
zontale chaque fois qu’il sera possible et l’on n’aura recours à des
dérogations que si cela est absolument nécessaire pour des raisons tech-
niques justifiées.
Lorsque la présente partie de I’ISO 11290 sera réexaminée, il sera tenu
compte de tous les renseignements disponibles à ce moment-là, à savoir
dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie et les rai-
sons pour lesquelles il aura été nécessaire d’y déroger dans le cas de pro-
duits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon im-
médiate et, pour certains groupes de produits, des Normes internationales
et/ou des normes nationales qui ne concordent pas avec cette méthode
horizontale, existent peut-être déjà. Lorsque de telles normes viendront en
révision, il serait souhaitable de les aligner sur la présente partie de
I’ISO 11290, si bien que, finalement, les seules divergences restantes se-
ront celles qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
---------------------- Page: 4 ----------------------
NORME INTERNATIONALE @ ISO ISO 112904 : 1996(F)
Microbiologie des aliments - Méthode horizontale pour la
recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes -
Partie 1:
Méthode de recherche
AVERTISSEMENT - Afin de sauvegarder la santé du personnel de laboratoire, il est fortement recomman-
dé que les essais de recherche des Liste& monocyfogenes soient réalisés dans les laboratoires équipés à
cet effet et sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand soin soit pris pour se dé-
barrasser des éléments incubés. II est en particulier fortement recommandé que les femmes enceintes ne
manipulent pas de cultures de L. monocytogenes.
ISO 7218:1996, Microbiologie des aliments - Règles
1 Domaine d’application
générales pour les examens microbiologiques.
La présente partie de I’ISO 11290 prescrit une mé-
thode horizontale pour la recherche de Listeria mono-
cytogenes.
3 Définitions
La présente partie de I’ISO 11290 est applicable aux
Pour les besoins de la présente partie de I’ISO 11290,
produits destinés à la consommation humaine ou à
les définitions suivantes s’appliquent.
l’alimentation animale, avec les quelques restrictions
signalées dans l’introduction.
3.1 Liste& monocytogenes: Microorganismes
formant des colonies typiques sur des milieux sélectifs
et possédant les caractéristiques biochimiques, mor-
2 Références normatives
phologiques et physiologiques décrites lorsque l’essai
est effectué conformément à la présente partie de
Les normes suivantes contiennent des dispositions I’ISO 11290.
qui, par suite de la référence qui en est faite, consti-
tuent des dispositions valables pour la présente partie
3.2 recherche de Listeria monocytogenes: Dé-
de I’ISO 11290. Au moment de la publication, les édi-
termination de la présence ou de l’absence de ces
tions indiquées étaient en vigueur. Toute norme est
microorganismes dans une masse ou un volume dé-
sujette à révision et les parties prenantes des accords
terminé(e) de produit, lorsque l’essai est effectué
fondés sur la présente partie de I’ISO 11290 sont invi-
conformément à la présente partie de I’ISO 11290.
tées à rechercher la possibilité d’appliquer les éditions
les plus récentes des normes indiquées ci-après. Les
membres de la CEI et de I’ISO possèdent le registre
4 Principe
des Normes internationales en vigueur à un moment
donné.
Dans le cadre de la présente partie de I’ISO 11290, la
ISO 6887: 1983, Microbiologie - Directives générales
recherche de L. monocytogenes nécessite quatre
pour la préparation des dilutions en vue de l’examen
phases successives (voir en annexe A une représen-
microbiologique.
tation schématique du mode opératoire).
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ISO 112904 :1996(F)
NOTE 1 Les Lisferia spp. peuvent être présentes en petit
5 Milieux de culture et réactifs
nombre et sont souvent accompagnées d’un nombre beau-
coup plus élevé d’autres microorganismes appartenant â
5.1 Général ités
d’autres genres; un enrichissement sélectif est donc néces-
saire. De plus, il est aussi nécessaire de rechercher les
Lisieria spp. ayant subi une altération et le milieu d’enri- Pour les prat iques courantes de laboratoire,
voir
chissement sélectif primaire, présentant une concentration
NS0 7218.
réduite en inhibiteurs, permet de remplir au moins en partie
cette fonction.
NOTE 2 En raison du nombre important de milieux de
culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté
du texte, de donner leur composition et leur préparation
dans l’annexe l3.
4.1 Enrichissement primaire en milieu
d’enrichissement sélectif liquide avec
concentration réduite en agents sélectifs
5.2 Milieu d’enrichissement sélectif
(bouillon Fraser-demi)
primaire: bouillon Fraser avec concentration
réduite en agents sélectifs (bouillon Fraser-
Inoculation d’un milieu d’enrichissement sélectif pri-
demi)
maire, contenant un volume de chlorure de lithium et
un demi-volume d’acriflavine et d’acide nalidixique
Voir article B.1.
(bouillon Fraser-demi), qui est également utilisé
comme diluant pour la prise d’essai (9.1).
5.3 Milieu d’enrichissement sélectif
secondaire avec concentration complète en
Incubation de la prise d’essai à 30 OC pendant 24 h.
agents sélectifs (bouillon Fraser)
Voir article B.2.
4.2 Enrichissement secondaire dans un
milieu d’enrichissement sélectif liquide avec
5.4 Milieux d’isolement sélectifs solides
concentration complète en agents sélectifs
(bouillon Fraser)
5.4.1 Premier milieu: gélose Oxford
Inoculation du milieu d’enrichissement secondaire
Voir article 8.3.
liquide complet (bouillon Fraser) avec une culture
obtenue comme indiqué en 4.1.
54.2 Deuxième milieu: gélose PALCAM
Incubation du bouillon Fraser à 35 OC ou 37 “C pen-
dant 48 h.
Voir article B.4.
5.5 Milieu de culture solide: Tryptone de
4.3 Isolement et identification
soja - extrait de levure (TSYEA)
À partir des cultures obtenues en 4.1 et 4.2, isolement
sur les deux milieux sélectifs solides: Voir article 8.5.
a) gélose Oxford;
5.6 Milieu de culture liquide: Tryptone de
b) gélose PALCAM.
soja - extrait de levure (TSYEB)
Incubation à 30 OC, 35 OC ou 37 OC et examen après
Voir article B.6.
24 h et, si nécessaire, après 48 h, pour détecter la
présence de colonies caractéristiques présumées être
des L. monocytogenes.
5.7 Gélose au sang de mouton
Voir article B.7.
4.4 Confirmation
5.8 Bouillon pour l’utilisation des glucides
Repiquage des colonies présumées être des L. mono-
(rhamnose, xylose)
cytogenes, isolées comme décrit en 4.3, et confirma-
tion au moyen
des essais biochimiques,
physiologiques et morphologiques appropriés. Voir article 8.8.
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ISO 112904 : 1996(F)
@ ISO
6.8 Éprouvettes graduées, de 50 ml à 1 000 ml de
5.9 Gélose motilité (facultatif)
capacité, pour la préparation des dilutions et des mi-
lieux complets.
Voir article B.9.
5.10 Milieu et cultures de CAMP (Christie,
6.9 Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml
Atkins, Munch-Petersen)
à 10 ml de capacités nominales, graduées respecti-
vement en 0,l ml et 0,5 ml.
Voir article B.10.
6.10 Boîtes de Petri, de 90 mm à 100 mm de dia-
5.11 Solution de peroxyde d’hydrogène mètre.
Voir article B.11.
6.11 Jarres, pour l’incubation en atmosphère micro-
aérobie (facultatif).
5.12 Tampon (PBS)
6.12 Mélange gazeux (facultatif), de composition
Voir article B.12.
spécifiée pour l’incubation en atmosphère microaéro-
5% à 12% de CO*, 5% à 15% de O2 et 75%
de N,.
6 Appareillage et verrerie
6.13 Dispositif pour le test d’illumination de
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir
Henry (facultatif).
I’ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
Voir l’annexe C.
6.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sè-
che (four) ou en chaleur humide (autoclave)
6.14 Microscope, de préférence à contraste de
phase et avec lame et lamelle.
Voir I’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, réglable entre
25 OC + 1 OC et 50 OC $- 1 OC.
7 Échantillonnage
6.3 Étuves, permettant de maintenir les milieux ino-
culés, les boîtes et les flacons à l’intérieur des plages
Il est important que le laboratoire reçoive un échan-
de températures suivantes:
tillon réellement représentatif, non endommagé ou
modifié lors du transport et de l’entreposage.
a) 25 OC + 1 OC;
b) 30 OC + 1 “C;
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode
spécifiée dans la présente partie de I’SO 11290. S’il
c) 35 OC IL 1 “C ou 37 “C + 1 OC.
n’existe aucune Norme internationale spécifique sur
l’échantillonnage du produit concerné, il est recom-
6.4
Bains d’eau, réglables à 47 OC & 2 OC.
mandé que les parties concernées se mettent d’ac-
cord à ce sujet.
6.5 Anse bouclée, d’environ 3 mm de diamètre, et
fil droit en platine irridié ou en nickel-chrome, ou
pipette Pasteur ou anse bouclée à usage unique.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
6.6 pH-mètre, ayant une précision de lecture de
Z!I 0,Ol unité pH à 25 OC, permettant de réaliser des
mesures précises à -t 0,l unité pH. Préparer l’échantillon pour essai conformément à la
Norme internationale spécifique du produit concerné.
S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il
6.7 Tubes à essai, flacons ou fioles, de capacités
est recommandé que les parties concernées se met-
appropriées, pour la stérilisation et la conservation des
tent d’accord à ce sujet.
milieux de culture et l’incubation des milieux liquides.
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ISO 11290-I : 1996(F) 0 KO
.
9.4.2 À partir du milieu d’enrichissement secondaire,
9 Mode opératoire
incubé pendant 48 h + 2 h à 35 OC ou 37 OC (9.3.2),
répéter le mode opératoire décrit en 94.1 avec les
9.1 Prise d’essai et suspension mère
deux milieux d’isolement sélectifs.
Voir I’ISO 6887 et la Norme internationale spécifique
9.4.3 Retourner les boîtes obtenues en 9.4.1 et 94.2
traitant du produit concerné.
et les incuber dans une étuve (6.3) réglée à 30 OC,
35 OC ou 37 OC. Les boîtes de gélose PALCAM sont
Pour la préparation de la suspension mère, utiliser
incubées soit en atmosphère microaérobie dans une
comme diluant le milieu d’enrichissement primaire sé-
jarre (6.11) contenant le mélange gazeux (6.12), soit
lectif spécifié en 5.2.
en atmosphère aérobie.
En général, pour préparer la suspension mère, ajouter
NOTE 6 Une incubation de la gélose Oxford à 30 OC con-
une prise d’essai de x g ou x ml dans 9x ml ou 9x g du
vient pour des aliments peu contaminés par une flore an-
milieu d’enrichissement sélectif primaire (5.2), de
nexe. Pour des produits fortement contaminés par une flore
un rapport prise d’essai/milieu
façon à obtenir
annexe, il est préférable d’incuber la gélose Oxford à 35 OC
d’enrichissement de I/l 0 (rapport masse/volume ou ou 37 OC, car les Listeria spp. tendent à se développer en
même temps que la flore annexe. Dans tous les cas, il
volume/volume).
convient que la température d’incubation de la gélose soit
fixée par les parties concernées et indiquée dans le rapport
d’essai.
9.2 Enrichissement primaire
9.4.4 Après incubation pendant 24 h, et 18 h à 24 h
Incuber à l’étuve [6.3 b)] la suspension mère, préparée
supplémentaires (si le développement est faible ou si
selon 9.1, à 30 OC pendant 24 h + 2 h.
aucune colonie n’est observée après 24 h d’incuba-
tion), examiner les boîtes (9.4.3), afin de rechercher la
NOTE 3 Une coloration noire peut se développer au cours
présence de colonies présumées être des Listeria
de l’incubation.
SPP.
9.4.4.1 Gélose Oxford: les colonies typiques de Lis-
9.3 Enrichissement secondaire
teria spp., cultivées sur gélose Oxford pendant 24 h,
sont de petites colonies (1 mm) de couleur grisâtre,
9.3.1 Après incubation de la suspension mère
entourées d’un halo noir. Après 48 h, les colonies de-
(enrichissement primaire) pendant 24 h + 2 h (9.2),
viennent plus foncées avec éventuellement des reflets
transférer 0,l ml de la culture obtenue en 9.2 (quelle
verdâtres, présentent un diamètre d’environ 2 mm,
que soit sa coloration) dans un tube à essai (6.7)
sont entourées d’un halo noir et présentent une dé-
contenant 10 ml du milieu d’enrichissement (bouillon
pression centrale.
Fraser) (5.3).
9.4.4.2 Gélose PALCAM: dans le cas d’une incuba-
9.3.2 Incuber le milieu inoculé (9.3.1) pendant
tion en atmosphère microaérobie, après incubation,
48 h r.fr 2 h à 35 “C ou 37 OC.
laisser les boîtes de gélose PALCAM retrouver leur
couleur pourpre en exposant le milieu à l’air libre pen-
NOTE 4 II convient que la température d’incubation du mi-
dant 1 h. Après 24 h, les Listeria spp. se présentent
lieu inoculé soit fixée par les parties concernées et indiquée
sous forme de petites ou très petites colonies vertes
dans le rapport d’essai.
avec des reflets grisâtres, ou vert olive, de 1,5 mm à
2 mm de diamètre, avec parfois un centre noir mais
9.4 Isolement et identification toujours entourées d’un halo noir. Après 48 h, les Lis-
teria spp. se présentent sous forme de colonies vertes
de 1,5 mm à 2 mm de diamètre, avec une dépression
9.4.1 À partir de la culture d’enrichissement primaire,
centrale, et entourées d’un halo noir.
incubée pendant 24 h + 2 h à 30 OC (9.2), ensemen-
cer, à l’aide d’une anse bouclée ou d’une pipette
Pasteur (6.5), la surface du premier milieu d’isolement
9.5 Confirmation du genre Listeria spp.
sélectif (gélose Oxford) (5.4.1) pour obtenir des colo-
nies bien séparées.
9.51 Sélection des colonies pour la confirmation
Procéder de la même façon avec le deuxième milieu
951.1 Pour la confirmation, prélever, à partir de
d’isolement sélectif (gélose PALCAM) (5.4.2).
chaque boîte de chacun des milieux sélectifs (voir
9.4.4.1 et 9.4.4.2), cinq colonies présumées être des
NOTE 5 Cet isolement est pratiqué quelle que soit la
coloration du milieu d’enrichissement. Listeria spp.
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@ ISO
ISO 112904 : 1996(F)
Si une boîte présen te moi ns de cinq colonies présu- lame et lamelle. Les Listeria spp. apparaissent sous
mées, retenir les col oni es présu mées. forme de bacilles minces et courts, et sont animées
toutes
d’une mobilité en <).
9.5.1.2 Ensemencer en stries les colonies sélection-
nées sur la surface des boîtes de gélose tryptone de Ce type de phénomène n’est parfois pas constaté
soja - extrait de levure (TSYEA) (5.5), préalablement pour les cultures développées à une température su-
séchées, de façon à permettre le développement de périeure à 25 OC. Comparer toujours le résultat avec
colonies bien isolées. une culture connue. Les coques, les bacilles longs ou
les bacilles qui se déplacent rapidement ne sont pas
Placer les boîtes dans l’étuve [6.3 c)] réglée à 35 OC
des Listeria spp.
ou 37 OC pendant 18 h à 24 h ou jusqu’à un dévelop-
pement satisfaisant. En alternative, il est également possible d’examiner la
mobilité, en ensemençant par piqûre avec le fil droit
NOTE 7 II convient que la température d’incubation du mi-
(6.5) la gélose motilité (5.9) à partir d’une culture d’une
lieu inoculé soit fixée par les parties concernées et indiquée
colonie typique sur gélose TSYEA (9.5.1.2). Incuber à
dans le rapport d’essai.
l’étuve [6.3 a)] à 25 OC pendant 48 h.
Les colonies typiques, de 1 mm à 2 mm de diamètre,
Examiner le développement autour de la piqûre. Les
sont convexes, incolores, translucides à bords régu-
Listeria spp. sont mobiles et donnent une culture typi-
liers. Si les colonies ne sont pas bien isolées, repiquer
que en forme de parapluie. Si la culture n’est pas suf-
une colonie typique de Listeria spp. sur une nouvelle
fisante, incuber jusqu’à 5 jours supplémentaires et
boîte de TSYEA. Effectuer les essais suivants à partir
observer à nouveau la piqûre.
de colonies d’une culture pure sur TSYEA.
NOTE 8 Le test d’illumination de Henry (voir l’annexe C)
9.6 Confirmation de l’espèce
peut être réalisé si nécessaire. Pour ce test, il est important
L. monocytogenes
que la couche du milieu gélosé (15 ml/boîte) soit mince.
9.6.1 Recherche de I’hémolyse
9.5.2 Réaction de la catalase
Si les caractéristiques physiologiques et morphologi-
Prélever une colonie isolée en 9.5.1.2 et la mettre en
ques, ainsi que la réaction de la catalase, indiquent la
suspension sur une lame dans une goutte de la solu-
présence éventuelle de Listeria spp., inoculer les boî-
tion de peroxyde d’hydrogène (5.11). La formation de
tes de gélose au sang de mouton (5.7) pour observer
bulles indique une réaction positive.
la réaction hémolytique.
9.5.3 Coloration de Gram
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement la surface
de la gélose. Prélever une colonie isolée en 9.5.1.2 et
Effectuer une coloration de Gram d’une colonie isolée
inoculer par piqûre chaque culture à l’aide d’un fil droit
en 9.5.1.2. Les Listeria spp. apparaissent sous forme
(6.5). Inoculer simultanément par piqûre les cultures
de petits et minces bacilles Gram positif.
témoins positif (L. monocytogenes) et négatif (L. inno-
9.5.4 Examen de la mobilité (si nécessaire)‘) ma).
Après incubation à 35 OC ou 37 OC pendant 24 h rt 2 h,
Prélever une colonie isolée en 9.5.1.2 et la mettre en
examiner les souches d’essai et les souches témoins.
suspension dans un tube contenant le bouillon TSYEB
Les L. monocytogenes montrent des zones étroites,
. .
(5 6)
claires et légères de P-hémolyse*) (voir figure 1). On
n’observe pas de zone claire autour de la piqûre pour
Incuber à l’étuve [6.3 a)] à 25 OC pendant 8 h à 24 h,
les L. innocua. Les L. seeligeri montrent une faible
jusqu’à ce qu’un trouble soit observé.
zone d’hémolyse. Les L. ivanovii forment habituelle-
Déposer une goutte de la culture précédente, à l’aide ment de larges zones de P-hémolyse nettement dé-
d’une anse bouclée (6.5), sur une lame propre de limitées. Examiner les boîtes à la lumière blanche pour
microscope et examiner au microscope (6.14) entre comparer les cultures d’essai et les témoins.
1) Cet examen n’est pas nécessaire dans tous les cas si l’analyse est effectuée par un microbiologiste pratiquant régulière-
ment la recherche de L. monocytogenes.
2) Cela est mieux observé en enlevant toute colonie qui s’est développée à la surface de la gélose autour de la piqûre d’ino-
culation.
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ISO 112904 :1996(F)
L.monocytogenes
L. innocua
Bande étroitedep-hémolyse J
1. ivanovii
Pas d'hémolyse
Largebandedep-hémolyse
NOTES
Ensemencer les boîtes de gélose au sang (5.7 ou B.10.3) comme illustré sur le diagramme. Les lignes verticales représen-
1
tent les stries de S. aureus (S) et de R. equi (R). Les lignes horizontales représentent les stries des cultures d’essai. Les par-
ties hachurées indiquent les zones d’hémolyse développée.
2 La partie en pointillés délimite la zone d’influente de la culture de S. aureus.
Figure 1 - Inoculation et interprétation des boîtes de test de CAMP
NOTE 9 La réaction hémolytique peut également être dé- métralement opposées (voir figure 1). II est nécessaire
terminée en pratiquant le test à l’aide d’hématies. Émul-
que I’inoculum soit étroit et régulier. Pour cela, pen-
sionner la colonie dans 150 ~1 de bouillon TSYEB (5.6);
dant l’ensemencement, maintenir le fil d’ensemence-
incuber à 35 OC ou 37 OC pendant 2 h. Ajouter 150 ~1 d’hé-
ment ou l’anse (6.5) perpendiculaire à la gélose.
maties de mouton en solution PBS à 2 %O (5.12). Incuber à
35 OC ou 37 OC pendant 15 min à 60 min, puis réfrigérer à
De façon similaire et perpendiculairement à ces cultu-
3 OC - + 2 OC pendant 2 h environ. Examiner alors la pré-
res, ensemencer la souche d’essai isolée en 9.5.1.2
sente ou l’absence d’hémolyse. Si la réaction est douteuse,
de manière à ce que la culture d’essai et les cultures
laisser à 3 OC k 2 OC jusqu’à 24 h.
de Staphylococcus aureus et de Rhodococcus equi
ne se touchent pas, mais ne soient séparées que
d’environ 1 mm à 2 mm. Plusieurs souches d’essai
9.6.2 Utilisation des glucides
peuvent être déposées sur la même boîte.
Inoculer à l’aide d’une anse bouclée (6.5) chaque
Ensemencer en même temps des cultures témoins de
bouillon pour l’utilisation des glucides (5.8), à partir
L. monocytogenes, L. innocua et L. ivanovii. Si la gé-
d’une culture à partir de TSYEB (95.4). Incuber à
lose au sang (5.7) est utilisée, incuber les boîtes à
35 OC ou 37 OC jusqu’à 5 jours. La formation d’une
35 OC ou 37 “C pendant 18 h à 24 h. Si des boîtes à
coloration jaune indique une réaction positive
double couches (B.10.3) sont utilisées, les incuber à
(formation d’acide) qui se produit généralement au
35 OC ou 37 OC pendant 12 h à 18 h.
bout de 24 h à 48 h.
Considérer la réaction comme positive s’il y a une
augmentation de la zone de P-hémolyse à I’intersec-
9.6.3 Test de CAMP
tion de la souche d’essai avec chacune des cultures
de Staphylococcus aureus et de Rhodococcus equi.
Ensemencer par strie simple chacune des cultures de
Staphylococcus aureus et de Rhodococcus equi
La réaction positive avec Rhodococcus equi se traduit
(8.10.4) sur la gélose au sang de mouton (5.7 ou par la présence d’une large zone d’hémojyse (5 mm à
B.10.3). Les deux stries doivent être parallèles et dia-
10 mm) en <
6
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@ ISO ISO 11290-l :1996(F)
1 mm, de faible hémolyse à l’intersection de la souche 9.8 Confirmation définitive
d’essai avec la zone de diffusion de la culture de Rho-
dococcus equi sont considérées comme des réponses
Les souches considérées comme étant des L. mono-
négatives.
cytogenes (9.7) peuvent être envoyées à un labora-
toire de référence reconnu pour l’identification des
Listeria, en vue d’une détermination du sérotype et,
Une réaction positive avec Staphylococcus aureus
éventuellement, du lysotype.
apparaît sous forme d’une petite zone d’hémolyse ac-
centuée le long de la strie de culture, ne s’étendant Dans ce cas, l’envoi doit être accompagné de toutes
qu’à 2 mm environ de la souche d’essai et dans la les informations disponibles concernant la ou les
zone légèrement hémolytique due à la croissance de
souche(s).
la culture de Staphylococcus aureus. II ne se produit
pas de larges zones d’hémolyse dans la zone de
9.9 Cultures témoins
proximité entre Staphylococcus aureus et L. monocy-
togenes.
Afin de contrôler l’aptitude des milieux d’enrichisse-
ment et d’identification à permettre le développement
sélectif des L. monocytogenes, introduire une dilution
de la culture de référence, composée de souches ré-
cemment isolées de L. monocytogenes et de souches
témoins négatifs (par exemple Lactobacilles, Strepto-
9.7 Interprétation des propriétés
CO~CUS), dans un flacon témoin contenant le milieu
morphologiques et physiologiques et des
d’enrichissement primaire (voir 9.2). Ajouter 10 à 100
réactions biochimiques
cellules de L. monocytogenes ou de souches témoins
négatifs par flacon.
Toutes les Listeria spp. se présentent sous forme de
petits bacilles Gram positif qui sont mobiles. Leur
Procéder avec les flacons témoins de la même façon
réaction à la catalase est positive. Les L. monocyto-
qu’avec les cultures d’essai pour démontrer que la
genes se distinguent des autres espèces selon les ca-
culture témoin positif est retrouvée.
ractéristiques présentées dans le tableau 1.
Tableau 1 - Réactions pour l’identification des Lisferia spp.
Production d’acide Test de CAMP
Espèce Hémolyse
Xylose S. aureus R. equi
Rhamnose
- -
+ + +
L. monocytogenes
- - - -
v
L. innocua
-
-
+ + +
L. ivanovii
-
-
+ + +
( )
L. seeligeri ( )
- - -
v +
L. welshimeri
- - - - -
L. grayi subsp. grayi
- - - -
v
L. grayi subsp. murrayi
V: réaction variable
(+): réaction faible
+: réaction positive à plus de 90 %
-: absence de réaction
NOTE - II existe de rares souches de L. monocytogenes qui ne présentent pas de P-hémolyse, ni de réaction positive au test de CAMP,
dans les conditions décrites dans la présente partie de I’ISO 11290.
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10 Expression des résultats
11 Rapport d’essai
Selon l’interprétation des résultats, indiquer la pré- Le rapport d’essai doit indiquer la méthode utilisée, les
températures d’incubation et les résultats obtenus. II
sence ou l’absence de L. monocytogenes dans la
prise d’essai, en précisant la masse, en grammes, ou doit, en outre, mentionner tous les détails opératoires
le volume, en millilitres, de l’échantillon pour essai. non prévus dans la présente partie de NS0 11290, ou
facultatifs, ainsi que les incidents éventuels suscepti-
NOTE 10 Si d’autres espèces de /Aeh sont isolées,
bles d’avoir agi sur les résultats.
elles peuvent être notées dans le rapport d’essai, en cas
d’accord entre les parties concernées.
Le rapport d’essai doit donner tous les renseigne-
ments nécessaires à l’identification complète de
l’échantillon.
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ISO 11290=1:1996(F)
Annexe A
(normative)
Représentation schématique du mode opératoire
Prise d'essai
xgou x ml
Milieu d'enrichissement sélectif primaire (Fraser-demi) (5.2)
incubation à 30 "C pendant24 h 22 h
0,lmlde culture dans10 mlde milieu
gélose Oxford (54.1)"
d
...
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