Textiles -- Qualitative and quantitative proteomic analysis of some animal hair fibres

This document specifies a qualitative and quantitative procedure to determine the composition of animal hair fibre blends by MALDI-TOF MS. The composition of non-animal hair fibres can be measured by methods described in the ISO 1833 series. Both results are then combined to determine the whole composition of fibres. The method is based on a preliminary identification, by light microscopy, of all fibres in a blend on the basis of their morphology, according to ISO/TR 11827. In case fibres of the same animal species are present (e.g. blends of cashmere and mohair), the method is not applicable and the quantitative analysis can be performed using microscopical analysis (e.g. as described in ISO 17751 series).

Textiles -- Analyse protéomique qualitative et quantitative de certaines fibres animales

Le présent document spécifie une méthode qualitative et quantitative pour déterminer la composition des mélanges de fibres animales par MALDI-TOF MS. La composition de fibres non animales peut ętre déterminée par les méthodes décrites dans la série ISO 1833. Les deux résultats sont ensuite combinés pour déterminer la composition globale des fibres. La méthode repose sur une identification préliminaire par microscopie optique de toutes les fibres présentes dans le mélange sur la base de leur morphologie conformément ŕ l'ISO/TR 11827. En présence de fibres de la męme espčce animale (telles que des mélanges de cachemire et de mohair), la méthode ne peut pas ętre appliquée et l'analyse quantitative peut ętre réalisée par microscopie (tel que décrit dans la série ISO 17751 par exemple).

General Information

Status
Published
Publication Date
29-Aug-2018
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
10-Aug-2018
Completion Date
30-Aug-2018
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ISO 20418-2:2018 - Textiles -- Qualitative and quantitative proteomic analysis of some animal hair fibres
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ISO 20418-2:2018 - Textiles -- Analyse protéomique qualitative et quantitative de certaines fibres animales
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20418-2
First edition
2018-09
Textiles — Qualitative and
quantitative proteomic analysis of
some animal hair fibres —
Part 2:
Peptide detection using MALDI-TOF MS
Textiles — Analyse protéomique qualitative et quantitative de
certaines fibres animales —
Partie 2: Détection des peptides par MALDI-TOF MS
Reference number
ISO 20418-2:2018(E)
ISO 2018
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ISO 20418-2:2018(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2018

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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ISO 20418-2:2018(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Abbreviated terms .............................................................................................................................................................................................. 2

5 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

6 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 2

7 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 5

8 Test methods ............................................................................................................................................................................................................. 6

8.1 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 6

8.2 Protein extraction ................................................................................................................................................................................. 6

8.3 Partial purification of extracted proteins using SDS-PAGE ............................................................................... 6

8.4 Trypsin digestion of the extracted proteins ................................................................................................................... 7

8.5 MALDI-TOF MS analysis of the tryptic peptides ......................................................................................................... 7

8.6 Calculation of the weight percentages ................................................................................................................................ 7

8.7 Calibration curves ................................................................................................................................................................................ 8

8.8 Calculation of the content (%) of each animal hair in binary mixtures ................................................. 8

8.9 Calculation of the content (%) of each animal hair in ternary mixtures .............................................. 8

9 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 9

10 Interlaboratory trial ......................................................................................................................................................................................... 9

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 9

Annex A (informative) Example of SDS-PAGE image of extracted proteins ...............................................................10

Annex B (informative) Animal species-specific peaks in MALDI-TOF MS analysis ............................................11

Annex C (informative) Animal species-specific peaks in MALDI-TOF MS analysis .............................................12

Annex D (informative) Calibration curve for the cashmere-wool blend ......................................................................14

Annex E (informative) Calibration curve for the cashmere-yak blend ..........................................................................15

Annex F (informative) Repeatability and reproducibility ...........................................................................................................16

Annex G (informative) Analysis of blind test samples using MALDI-TOF MS method .....................................18

Annex H (informative) Results of interlaboratory trial .................................................................................................................19

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................23

© ISO 2018 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20418-2:2018(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles.
A list of all parts in the ISO 20418 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20418-2:2018(E)
Introduction

Animal hair fibres have been used for fabrics or furs. In general, fibres from different animals show

distinct colours and morphologies, and in most cases can be distinguished to the species level under

microscopic observation. In the textile industries, the identification and quantification of animal hair

fibres are very important to guarantee the quality of textile products. Currently, the only practical

way to identify animal hair fibres is the microscopic method. However, microscopic identification of

animal species from hair fibres can be difficult in certain cases of highly processed fibres or ambiguous

samples. Thus, microscopists in testing laboratories require vast experience and a high skill level.

In order to overcome the difficulties of the microscope method, some novel objective methods such as

DNA method have been developed to identify animal hair fibres. This method is very sensitive and can

be used for qualitative analysis. However, it has been reported that the quantitative analysis of some

highly processed samples remains difficult with the DNA method.

It is well known that animal hairs are mostly composed of proteins, and that the amino acid sequences

of these proteins are slightly different among different animal species. In the early 2000s, mass

spectrometry (MS) was shown to be a very useful method for identifying protein structures. MS of

the small peptides obtained by enzyme digestion of proteins can be used to clarify the differences in

amino acid sequences among proteins. A particularly efficient qualitative and quantitative method was

developed using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS in 2014.

The method has been shown to be useful even for highly processed samples and is applicable to various

types of animal hairs such as goat (cashmere or mohair), wool and yak.
© ISO 2018 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20418-2:2018(E)
Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis
of some animal hair fibres —
Part 2:
Peptide detection using MALDI-TOF MS
1 Scope

This document specifies a qualitative and quantitative procedure to determine the composition of

animal hair fibre blends by MALDI-TOF MS.

The composition of non-animal hair fibres can be measured by methods described in the ISO 1833

series. Both results are then combined to determine the whole composition of fibres.

The method is based on a preliminary identification, by light microscopy, of all fibres in a blend on the

basis of their morphology, according to ISO/TR 11827. In case fibres of the same animal species are

present (e.g. blends of cashmere and mohair), the method is not applicable and the quantitative analysis

can be performed using microscopical analysis (e.g. as described in ISO 17751 series).

2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
animal hair fibre
type of keratin fibre for textile use: wool, cashmere and yak
EXAMPLE Some animal hair fibres come from camel, alpaca, and angora rabbit.

[SOURCE: ISO 20418-1:2018, 3.1, modified — examples of animal hair fibres have been added.]

3.2
protein
polymers of amino acids that play many critical roles in the body
3.3
peptide
small proteins (3.2) consisting of approximately less than 50 amino acids
© ISO 2018 – All rights reserved 1
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ISO 20418-2:2018(E)
3.4
buffer solution
solution used to keep pH at a desirable value of the reaction solution
3.5
marker

m/z of animal species specific monoisotopic peak used for identification and quantification

Note 1 to entry: See (Clause 4) for an explanation of m/z.
4 Abbreviated terms

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, a method used to separate

proteins according to their molecular size

MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization, a soft ionization method for mass spectrometry

TOF MS time of flight mass spectrometry, a type of mass spectrometry based on the time difference

of ions to reach the target plate according to molecular mass

m/z dimensionless quantity formed by dividing the ratio of the mass of an ion to the unified

atomic mass unit, by its charge number (regardless of sign)
5 Principle

Proteins in animal hair fibres are extracted using SDS/dithiothreitol (DTT)/phosphate buffer. The

extracted proteins are partially purified using SDS-PAGE. The proteins in the gel are enzymatically

digested by trypsin. The ratios of animal species-specific peptides are analysed by MALDI-TOF MS. The

percent composition of each animal hair fibre is calculated using the calibration curve.

6 Reagents

All reagents shall be of high enough quality suitable for biochemical analysis. Some of the media are

available on the market.
6.1 Water, Grade 3 quality as specified in ISO 3696.
6.2 Sodium dihydrogen phosphate dihydrate, 99 % or higher in purity.
6.3 Disodium hydrogen phosphate, 99 % or higher in purity.
6.4 Sodium dihydrogen phosphate solution (0,2 mol/l).
— sodium dihydrogen phosphate dihydrate 31,2 g
Make up to 1 l by dissolving in water.
6.5 Disodium hydrogen phosphate solution (0,2 mol/l).
— disodium hydrogen phosphate 28,4 g
Make up to 1 l by dissolving in water.
2 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 20418-2:2018(E)
6.6 Phosphate buffer (pH 7,8 and 0,2 mol/l).
— 0,2 mol/l sodium dihydrogen phosphate solution (6.4)
— 0,2 mol/l disodium hydrogen phosphate solution (6.5) 100 ml

Add 0,2 mol/l sodium dihydrogen phosphate solution (6.4) to 0,2 mol/l disodium hydrogen phosphate

solution (6.5) to adjust the pH to 7,8.
6.7 Sodium dodecyl sulfate (SDS), 99,5 % or higher in purity.
6.8 Dithiothreitol (DTT), 97 % or higher in purity.
6.9 SDS-buffer solution.
— 0,2 mol/l phosphate buffer (pH 7,8) (6.6) 50 ml
— SDS 4,0 g
Make up to 100 ml by adding water.
6.10 Extraction buffer.
— SDS-buffer solution (6.9) 0,25 ml
— DTT 1,9 mg
Dissolve the DTT in SDS-buffer solution just prior to use.
6.11 Iodoacetamide (IAA) solution.
— IAA, 98 % or higher in purity 4,7 mg
Dissolve in 50 μl water just prior to use.
6.12 DTT solution.
— DTT 1,9 mg
Dissolve in 10 μl water just prior to use.
6.13 Polyacrylamide gels of mini size.
6.14 Tris(hydroxymethyl)amino methane (Tris), 99,9 % or higher in purity.
6.15 MOPS (3-Morpholinopropanesulfonic acid), 99,5 % or higher in purity.
© ISO 2018 – All rights reserved 3
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ISO 20418-2:2018(E)
6.16 Tris-MOPS buffer.
— Tris 6,06 g
— MOPS 10,46 g
— SDS 1,0 g
— EDTA 0,3 g
— Water 900 ml
Make up to 1 l by adding water.
6.17 Tris buffer (0,5 mol/l).
— Tris 6,05 g
— Water 80 ml
Adjust the pH of the solution to 6,8 by adding 1 mol/l hydrochloric acid.
Make up to 100 ml by adding water.
6.18 Sample buffer.
— 0,5 mol/l Tris buffer (pH 6,8) (6.17) 4 ml
— 10 % SDS 1 ml
— Glycerol, 99 % or higher in purity 4 ml
Make up to 10 ml by adding water.
6.19 Coomassie brilliant blue (CBB) solution.
6.20 Ammonium bicarbonate (NH HCO ), 96 % or higher in purity.
4 3
6.21 Ammonium bicarbonate (100 mmol/l).
— Ammonium bicarbonate (6.20) 7,91 g
— Pure water 900 ml
Make up to 1 l by adding pure water.
6.22 Acetonitrile, 99,8 % or higher in purity.
6.23 Washing buffer.
— 100 mmol/l ammonium bicarbonate (6.21) 50 ml
— Acetonitrile 50 ml

1) AE-1340 EzStain Aqua is an example of a suitable product available commercially. This information is given for

the convenience of users and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

4 © ISO 2018 – All rights reserved
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ISO 20418-2:2018(E)

6.24 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside (CYMAL-5), a detergent that stabilizes trypsin and

decreases the adsorption of tryptic peptides on the surface of the microplate well.

6.25 Sequencing-grade modified trypsin.
6.26 Digestion buffer.
— 100 mmol/l ammonium bicarbonate (6.21) 50 ml
— CYMAL-5 10 mg
Make up to 100 ml by adding water.
6.27 Trypsin solution.
— Sequencing-grade modified trypsin (6.25) 20 μg
— 0,01 mol/l hydrochloric acid 300 μl
— Digestion buffer (6.26) 4 ml

Cool the digestion buffer on ice and add 100 μl of trypsin dissolved in 0,01 mol/l hydrochloric acid

prior to use.
6.28 Trifluoroacetic acid (TFA), 99,8 % or higher in purity.

6.29 α-cyano-4-hyroxycinnamic acid (CHCA), 99,5 % or higher in purity, used as a matrix for peptides

in MALDI MS analyses.
6.30 Matrix solution.
— CHCA 25 mg
— Acetonitrile/0,1 % TFA (7:3) 5 ml
7 Apparatus
7.1 Ball mill, to grind materials into an extremely fine powder.

7.2 Aluminium block bath, to keep the reaction temperature constant, +30 °C to +100 °C.

7.3 Vortex mixer, to mix small vials of liquid.
7.4 Mini-slab size electrophoresis system.

7.5 Gel cutter or razor blade, for cutting out the part of the gels containing the target proteins.

A 200 μl pipette with pipette tip, and whose tip is cut about 2 cm may be used as gel spot cutter

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20418-2
Première édition
2018-09
Textiles — Analyse protéomique
qualitative et quantitative de certaines
fibres animales —
Partie 2:
Détection des peptides par MALDI-TOF
Textiles — Qualitative and quantitative proteomic analysis of some
animal hair fibres —
Part 2: Peptide detection using MALDI-TOF MS
Numéro de référence
ISO 20418-2:2018(F)
ISO 2018
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ISO 20418-2:2018(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2018

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
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Tél.: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
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ISO 20418-2:2018(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Termes abrégés ...................................................................................................................................................................................................... 2

5 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 2

6 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 2

7 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 5

8 Méthodes d’essai .................................................................................................................................................................................................. 6

8.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 6

8.2 Extraction des protéines ................................................................................................................................................................. 6

8.3 Purification partielle des protéines extraites par SDS-PAGE .......................................................................... 6

8.4 Digestion à la trypsine des protéines extraites ........................................................................................................... 7

8.5 Analyse des peptides tryptiques par MALDI-TOF MS ............................................................................................ 7

8.6 Calcul des pourcentages pondéraux ..................................................................................................................................... 7

8.7 Courbes d’étalonnage ........................................................................................................................................................................ 8

8.8 Calcul de la teneur (%) de chaque type de poil animal dans les mélanges binaires .................. 8

8.9 Calcul de la teneur (%) de chaque type de poil animal dans les mélanges ternaires ................ 8

9 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 9

10 Essai interlaboratoires ................................................................................................................................................................................... 9

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 9

Annexe A (informative) Exemple d’image de protéines extraites par SDS-PAGE ................................................11

Annexe B (informative) Pics spécifiques à chaque espèce animale dans le cadre de l’analyse

par MALDI-TOF MS ...........................................................................................................................................................................................12

Annexe C (informative) Pics spécifiques à chaque espèce animale dans le cadre de l’analyse

par MALDI-TOF MS ...........................................................................................................................................................................................13

Annexe D (informative) Courbe d’étalonnage du mélange cachemire-laine ...........................................................15

Annexe E (informative) Courbe d’étalonnage du mélange cachemire-yack .............................................................16

Annexe F (informative) Répétabilité et reproductibilité ..............................................................................................................17

Annexe G (informative) Analyse d’échantillons d’essai à l’aveugle à l’aide de la méthode

MALDI-TOF MS ......................................................................................................................................................................................................19

Annexe H (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires ..............................................................................................20

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................24

© ISO 2018 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 20418-2:2018(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 38, Textiles.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 20418 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20418-2:2018(F)
Introduction

Les fibres animales sont utilisées pour produire des étoffes ou des fourrures. En général, les fibres

issues de différents animaux présentent des couleurs et des morphologies distinctes et peuvent être

différenciées jusqu’au niveau de l’espèce par observation au microscope. Dans le secteur du textile,

l’identification et la quantification de fibres animales jouent un rôle clé pour garantir la qualité des

produits textiles. À l’heure actuelle, le seul moyen pratique de reconnaître les fibres animales est la

méthode microscopique. Cependant, l’identification par microscopie des espèces animales à partir de

fibres peut s’avérer difficile en présence de fibres hautement transformées ou en cas d’échantillons

ambigus. Par conséquent, les microscopistes des laboratoires d’analyse doivent avoir une grande

expérience et un niveau de compétence élevé.

Afin de surmonter les difficultés de la méthode microscopique, plusieurs nouvelles méthodes objectives,

telles que la méthode fondée sur l’ADN, ont été développées afin d’identifier les fibres animales. Cette

méthode est très sensible et peut être utilisée pour l’analyse qualitative. Toutefois, l’analyse quantitative

de certains échantillons hautement transformés reste difficile avec la méthode fondée sur l’ADN.

Il est établi que les poils animaux sont principalement composés de protéines et que les séquences

d’acides aminés de ces protéines présentent de légères différences selon l’espèce animale. Au début des

années 2000, la spectrométrie de masse s’est révélée être une méthode très utile pour l’identification

des structures protéiques. La spectrométrie de masse des petits peptides obtenus par digestion

enzymatique des protéines permet de clarifier les différences de séquences d’acides aminés entre les

protéines. Une méthode qualitative et quantitative particulièrement efficace a été développée en 2014

à l’aide de la spectrométrie de masse couplant une désorption-ionisation laser assistée par matrice

(MALDI-TOF MS) et un analyseur à temps de vol. Cette méthode s’est avérée très utile même pour

analyser des échantillons hautement transformés et peut être appliquée à différents types de poils

animaux, tels que les poils de chèvre (cachemire ou mohair), la laine ou le yack.

© ISO 2018 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 20418-2:2018(F)
Textiles — Analyse protéomique qualitative et quantitative
de certaines fibres animales —
Partie 2:
Détection des peptides par MALDI-TOF MS
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode qualitative et quantitative pour déterminer la composition

des mélanges de fibres animales par MALDI-TOF MS.

La composition de fibres non animales peut être déterminée par les méthodes décrites dans la série

ISO 1833. Les deux résultats sont ensuite combinés pour déterminer la composition globale des fibres.

La méthode repose sur une identification préliminaire par microscopie optique de toutes les fibres

présentes dans le mélange sur la base de leur morphologie conformément à l’ISO/TR 11827. En présence

de fibres de la même espèce animale (telles que des mélanges de cachemire et de mohair), la méthode

ne peut pas être appliquée et l’analyse quantitative peut être réalisée par microscopie (tel que décrit

dans la série ISO 17751 par exemple).
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
fibre animale
type de fibre de kératine pour usage textile: laine, cachemire et yack

EXEMPLE Certaines fibres animales proviennent du chameau, de l’alpaga et du lapin angora.

[SOURCE: ISO 20418-1:2018, 3.1, modifiée — Des exemples de fibres animales ont été ajoutés.]

3.2
protéines
polymères d’acides aminés qui jouent de nombreux rôles essentiels dans le corps
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3.3
peptides
petites protéines (3.2) composées de moins de 50 acides aminés environ
3.4
solution tampon

solution utilisée pour maintenir le pH à la valeur souhaitée pour la solution de réaction

3.5
marqueur

m/z d’un pic monoisotopique spécifique à une espèce animale utilisé pour l’identification et la

quantification
Note 1 à l'article: Voir (Article 4) pour obtenir une explication de m/z.
4 Termes abrégés

SDS-PAGE méthode d’électrophorèse utilisant un gel de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate

de sodium permettant de séparer les protéines en fonction de leur taille moléculaire

MALDI méthode d’ionisation utilisée en spectrométrie de masse, ionisation/désorption laser

assistée par matrice

TOF MS spectrométrie de masse à analyseur de temps de vol, type de spectrométrie de masse fon-

dée sur la différence de temps mis par les ions pour atteindre la plaque cible en fonction de

leur masse moléculaire

m/z grandeur, sans dimension, obtenue en divisant le rapport de la masse d’un ion sur l’unité de

masse atomique unifiée, par son nombre de charges (quel que soit son signe)
5 Principe

Les protéines contenues dans les fibres animales sont extraites à l’aide d’une solution tampon de SDS/

dithiothréitol (DTT)/phosphate. Les protéines extraites sont partiellement purifiées par SDS-PAGE. Les

protéines contenues dans le gel sont digérées enzymatiquement par des trypsines. Les ratios de peptides

propres à chaque espèce animale sont analysés par MALDI-TOF MS. La composition en pourcentage de

chaque fibre animale est calculée en utilisant la courbe d’étalonnage.
6 Réactifs

Tous les réactifs doivent être de qualité suffisante, adaptée aux analyses biochimiques. Certains milieux

de culture sont disponibles dans le commerce.
6.1 Eau, de qualité 3 tel que spécifié dans l’ISO 3696.

6.2 Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté, d’une pureté égale ou supérieure à 99 %.

6.3 Hydrogénophosphate disodique, d’une pureté égale ou supérieure à 99 %.
6.4 Solution de dihydrogénophosphate de sodium (0,2 mol/l).
— Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté 31,2 g
Compléter à 1 l en le dissolvant dans de l’eau.
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6.5 Solution d’hydrogénophosphate disodique (0,2 mol/l).
— Hydrogénophosphate disodique 28,4 g
Compléter à 1 l en le dissolvant dans de l’eau.
6.6 Tampon phosphate (pH 7,8 et 0,2 mol/l).
— Solution de dihydrogénophosphate de sodium à 0,2 mol/l (6.4)
— Solution d’hydrogénophosphate disodique à 0,2 mol/l (6.5) 100 ml

Ajouter la solution de dihydrogénophosphate de sodium à 0,2 mol/l (6.4) à la solution

d’hydrogénophosphate disodique à 0,2 mol/l (6.5) pour ajuster le pH à 7,8.
6.7 Dodécysulfate de sodium (SDS), d’une pureté égale ou supérieure à 99,5 %.
6.8 Dithiothréitol (DTT), d’une pureté égale ou supérieure à 97 %.
6.9 Solution tampon SDS.
— Tampon phosphate à 0,2 mol/l (pH 7,8) (6.6) 50 ml
— SDS 4,0 g
Compléter à 100 ml en ajoutant de l’eau.
6.10 Tampon d’extraction.
— Solution tampon SDS (6.9) 0,25 ml
— DTT 1,9 mg
Dissoudre le DTT dans la solution tampon SDS juste avant emploi.
6.11 Solution d’iodoacétamide (IAA).
— IAA, d’une pureté égale ou supérieure à 98 % 4,7 mg
Dissoudre dans 50 μl d’eau juste avant emploi.
6.12 Solution DTT.
— DTT 1,9 mg
Dissoudre dans 10 μl d’eau juste avant emploi.
6.13 Gels de polyacrylamide de petite taille.

6.14 Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris), d’une pureté égale ou supérieure à 99,9 %.

6.15 MOPS (acide 3-Morpholinopropanesulfonique), d’une pureté égale ou supérieure à 99,5 %.

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6.16 Tampon Tris-MOPS.
— Tris 6,06 g
— MOPS 10,46 g
— SDS 1,0 g
— EDTA 0,3 g
— Eau 900 ml
Compléter à 1 l en ajoutant de l’eau.
6.17 Tampon Tris (0,5 mol/l).
— Tris 6,05 g
— Eau 80 ml

Ajuster le pH de la solution à 6,8 en ajoutant de l’acide chlorhydrique à 1 mol/l.

Compléter à 100 ml en ajoutant de l’eau.
6.18 Tampon de dosage.
— Tampon Tris à 0,5 mol/l (pH 6,8) (6.17) 4 ml
— SDS 10 % 1 ml
— Glycérol, d’une pureté égale ou supérieure à 99 % 4 ml
Compléter à 10 ml en ajoutant de l’eau.
6.19 Solution de bleu brillant de Coomassie (CBB).
6.20 Bicarbonate d’ammonium (NH HCO ), d’une pureté égale ou supérieure à 96 %.
4 3
6.21 Bicarbonate d’ammonium (100 mmol/l).
— Bicarbonate d’ammonium (6.20) 7,91 g
— Eau pure 900 ml
Compléter à 1 l en ajoutant de l’eau pure.
6.22 Acétonitrile, d’une pureté égale ou supérieure à 99,8 %.
6.23 Tampon de lavage.
— Bicarbonate d’ammonium à 100 mmol/l (6.21) 50 ml
— Acétonitrile 50 ml

1) L’AE-1340 EzStain Aqua est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information

est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou

recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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6.24 5-Cyclohexyl-1-pentyl-β-D-maltoside (CYMAL-5), un détergent qui stabilise la trypsine et

diminue l’adsorption des peptides tryptiques sur la surface du puits de la microplaque.

6.25 Trypsine modifiée de qualité séquençage.
6.26 Tampon de digestion.
— Bicarbonate d’ammonium à 100 mmol/l (6.21) 50 ml
— CYMAL-5 10 mg
Compléter à 100 ml en ajoutant de l’eau.
6.27 Solution de trypsine.
— Trypsine modifiée de qualité séquençage (6.25) 20 μg
— Acide chlorhydrique à 0,01 mol/l 300 μl
— Tampon de digestion (6.26) 4 ml

Laisser refroidir le tampon de digestion sur de la glace et ajouter 100 μl de trypsine dissoute dans de

l’acide chlorhydrique à 0,01 mol/l avant emploi.
6.28 Acide trifluoroacétique (TFA), d’une pureté égale ou supérieure à 99,8 %.

6.29 Acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA), d’une pureté égale ou supérieure à 99,5 %, utilisé

comme matrice pour les peptides dans le cadre des analyses par MALDI MS.
6.30 Solution de matrice.
— CHCA 25 mg
— Acétonitrile/TFA 0,1 % (7:3) 5 ml
7 Appareillage

7.1 Broyeur à billes, utilisé pour moudre les matériaux en une poudre extrêmement fine.

7.2 Bain à blocs en aluminium, utilisé pour maintenir une température de réaction constante, +30 °C

à +100 °C.
7.3 Vortex, utilisé pour mélanger des microtubes de liquide.
7.4 Mini-cuve d’électrophorèse.

2) La trypsine modifiée de qualité séquençage est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce.

Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO

approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
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7.5 Couteau à gel ou lame de rasoir, utilisés pour couper la partie du gel contenant les protéines

cible
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