ISO 22186:2020
(Main)Milk and milk products — Determination of nitrofurazone
Milk and milk products — Determination of nitrofurazone
This document specifies a liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC?MS/MS) method for the quantification of the inhibitory substance, nitrofurazone, in milk and milk products. The method has been validated for measuring trace levels of intact nitrofurazone to levels down to 1 ng/g in fluid milk and powdered dairy products on a whole product (i.e. powder) basis. While the method is expected to apply to other dairy matrices, additional validation will be required to demonstrate this.
Lait et produits laitiers — Détermination de la nitrofurazone
Le présent document spécifie une méthode de chromatographie en phase liquide avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CL?SM/SM) permettant de quantifier la substance inhibitrice, la nitrofurazone, dans le lait et les produits laitiers. La méthode a été validée pour la mesure des traces de nitrofurazone intacte à des niveaux bas allant jusqu'à 1 ng/g dans le lait liquide et les produits laitiers en poudre sur la base du produit entier (c'est-à-dire de la poudre). Bien que la méthode soit censée s'appliquer à d'autres matrices de produits laitiers, une validation supplémentaire est exigée pour le démontrer.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22186
IDF 245
First edition
2020-09
Milk and milk products —
Determination of nitrofurazone
Lait et produits laitiers — Détermination de la nitrofurazone
Reference numbers
IDF 245:2020(E)
©
ISO and IDF 2020
IDF 245:2020(E)
© ISO and IDF 2020
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address
below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office International Dairy Federation
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Geneva B-1030 Brussels
Phone: +41 22 749 01 11 Phone: +32 2 325 67 40
Fax: +32 2 325 67 41
Email: copyright@iso.org Email: info@fil-idf.org
Website: www.iso.org Website: www.fil-idf.org
Published in Switzerland
ii © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
IDF 245:2020(E)
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents and reference substances . 2
5.1 Reagents and materials . 2
5.2 Reference substances . 3
6 Apparatus . 5
7 Sampling . 5
8 Procedure. 6
8.1 Test portion . 6
8.1.1 Liquid milk . 6
8.1.2 Powdered dairy products . 6
8.2 Extraction procedure . 6
8.3 Reagent blank. 6
8.4 Positive quality control . 7
8.4.1 General. 7
8.4.2 Liquid milk . 7
8.4.3 Powdered dairy products . 7
8.4.4 Calculations . 7
8.5 Matrix-matched calibration curves . 7
8.5.1 General. 7
8.5.2 Matrix-matched calibration samples for fluid milk . 8
8.5.3 Matrix-matched calibration samples for powdered dairy products . 8
8.6 LC–MS/MS conditions. 8
8.6.1 General. 8
8.6.2 Chromatographic conditions . 8
8.6.3 MS/MS conditions. 9
8.7 Sequence set-up .10
9 Calculation and expression of results .10
9.1 General .10
9.2 Peak integration .10
9.3 Calibration curves .11
9.3.1 External calibration curve from external calibration standards .11
9.3.2 Matrix-matched calibration curve from matrix-matched calibration standards .11
9.4 Identification and confirmation .11
9.5 Calculation using external calibration curve .11
9.6 Calculation using matrix-matched calibration curve .12
9.7 Expression of results .12
10 Precision .12
10.1 General .12
10.2 Repeatability .13
10.3 Reproducibility .13
11 Test report .13
Annex A (informative) Examples of chromatograms .14
Annex B (informative) Precision data .15
IDF 245:2020(E)
Bibliography .19
iv © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
IDF 245:2020(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
IDF 245:2020(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products. It is being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the ISO/IDF Action Team A13 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leaders, Dr J.G. Bendall (NZ) and
Dr J.M. Evers (NZ).
vi © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
IDF 245:2020(E)
Introduction
Nitrofurazone (see Figure 1) is an inhibitory substance that, because of its cancer-causing properties,
has been prohibited for use on agricultural animals by many jurisdictions. It is one of the nitrofuran
class of inhibitory substances, along with furazolidone, furaltadone and nitrofurantoin, which are
similarly prohibited for use on agricultural animals. Whereas analysis of furazolidone, furaltadone
and nitrofurantoin may be accomplished through highly specific marker metabolites, in the case
of nitrofurazone, its corresponding marker metabolite, semicarbazide, is not specific and can be
formed by oxidative pathways in dairy products produced from cows that have not been treated
with nitrofurazone. While intact nitrofurazone is not stable in meat products, intact nitrofurazone
remains stable in liquid milk and dairy products. This document describes a method for the analysis of
nitrofurazone in fluid milk and dairy products.
Figure 1 — Chemical structure of nitrofurazone
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 245:2020(E)
Milk and milk products — Determination of nitrofurazone
1 Scope
This document specifies a liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) method for
the quantification of the inhibitory substance, nitrofurazone, in milk and milk products.
The method has been validated for measuring trace levels of intact nitrofurazone to levels down to
1 ng/g in fluid milk and powdered dairy products on a whole product (i.e. powder) basis. While
the method is expected to apply to other dairy matrices, additional validation will be required to
demonstrate this.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
nitrofurazone concentration
mass fraction of substance determined by the procedure specified in this document
Note 1 to entry: The nitrofurazone concentration is expressed as nanograms per gram of sample (ng/g).
4 Principle
[1]
Nitrofurazone is extracted using the QuEChERS protocol in accordance with EN 15662:2018 with
some modifications.
Liquid milk sample or milk powder sample (first reconstituted with water) is supplemented with
13 15
C N -nitrofurazone (labelled internal standard) and further extracted with acetonitrile. A liquid–
liquid partition is then performed using a mixture of magnesium sulfate (MgSO ) and sodium chloride
(NaCl). After centrifugation, the resulting supernatant is cleaned by dispersive solid phase extraction
(d-SPE) using a mixture of MgSO /PSA/C18 sorbents. An aliquot of the extract is evaporated to dryness
and reconstituted in methanol before LC–MS/MS analysis in scheduled multiple reaction monitoring
(MRM) mode by negative electrospray ionization (ESI).
Positive identification of nitrofurazone in the sample is conducted according to the confirmation
[2]
criteria defined in EU Commission Decision 2002/657/EC . Quantification is performed by isotopic
13 15
dilution using C N -nitrofurazone as labelled internal standard. There are two equally acceptable
ways to achieve calibration:
a) by the external calibration curve approach;
b) by the matrix-matched calibration curve approach.
IDF 245:2020(E)
5 Reagents and reference substances
5.1 Reagents and materials
All reagents shall be of recognized analytical grade, unless otherwise specified. Water shall be purified
to a resistivity of at least 18 MΩ·cm.
5.1.1 Acetonitrile, isocratic grade for LC.
5.1.2 Methanol, isocratic grade for LC.
5.1.3 N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous, ≥ 99 %.
5.1.4 Ammonium acetate, for mass spectrometry.
1)
5.1.5 Natural abundance nitrofurazone, purity ≥ 99 % .
13 15 2)
5.1.6 C N -Nitrofurazone, purity > 99 %, isotopic purity ≥ 97 % .
3)
5.1.7 Magnesium sulfate (MgSO ), anhydrous, purity ≥ 98 % .
4)
5.1.8 Sodium chloride (NaCl), purity ≥ 99 % .
5)
5.1.9 C-18-sorbent (Octadecylsilyl-modified silica gel), bulk material .
6)
5.1.10 Primary secondary amine (PSA) sorbent, bulk material .
7)
5.1.11 QuEChERS partition salts .
Into each 15 ml polypropylene tube, weigh 4,0 g ± 0,2 g MgSO (5.1.7) and 1,00 g ± 0,05 g NaCl (5.1.8).
1) Nitrofurazone from Sigma Aldrich (PHR1196) is an example of a suitable product available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by either
ISO or IDF of this product.
13 15
2) C N -Nitrofurazone from Witega (NF019-25) is an example of a suitable product available commercially.
This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by
either ISO or IDF of this product.
3) Magnesium sulfate anhydrous from Sigma Aldrich (63136) is an example of a suitable product available
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by either ISO or IDF of this product.
4) Sodium chloride from Merck (106404) is an example of a suitable product available commercially. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by either
ISO or IDF of this product. ®
5) Discovery DSC-18 SPE Bulk Packing from Sigma Aldrich (52600-U) is an example of a suitable product available
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by either ISO or IDF of this product.
6) Supelclean™ PSA SPE Bulk Packing from Sigma Aldrich (52738-U) is an example of a suitable product available
commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an
endorsement by either ISO or IDF of this product.
7) Ready-to-use MgSO –NaCl (4 + 1) salt mixtures from Agilent (Agilent 5982-7550) is an example of a suitable
product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does
not constitute an endorsement by either ISO or IDF of this product.
2 © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
IDF 245:2020(E)
8)
5.1.12 Dispersive-SPE (d-SPE) salts .
Into each 15 ml polypropylene tube, weigh 1 200 mg ± 20 mg MgSO (5.1.7), 400 mg ± 10 mg C-18-
sorbent (5.1.9), and 400 mg ± 10 mg PSA-sorbent (5.1.10).
5.2 Reference substances
If necessary, different sized glassware may be substituted for specific volumes listed during the
preparation of standard solutions as long as final concentrations are maintained.
5.2.1 Natural abundance nitrofurazone stock solution, mass concentration ρ = 1 mg/ml in N,N-
dimethylformamide (DMF).
Into a 10 ml glass volumetric flask, weigh 10,0 mg ± 0,1 mg natural abundance nitrofurazone (5.1.5).
Record the mass to 0,1 mg.
Dissolve and then dilute to volume with DMF (5.1.3). Ensure complete solubility of the solution by
vortexing and sonication for at least 5 min.
Aliquot into 2 ml microcentrifuge polypropylene tubes. This avoids reiterated freezing and thawing
which could lead to an accelerated degradation of analytes in solution.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
Allow warming at room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
5.2.2 Natural abundance nitrofurazone working solution, ρ = 5 µg/ml in methanol.
Into a 10 ml volumetric flask, pipette 50 μl of the natural abundance nitrofurazone stock solution
(5.2.1). Dilute to volume with methanol (5.1.2). Mix thoroughly.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
Allow warming to room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
5.2.3 Natural abundance nitrofurazone working solution, ρ = 250 ng/ml in methanol.
Into a 10 ml volumetric flask, pipette 500 μl of the natural abundance nitrofurazone working solution
(5.2.2). Dilute to volume with methanol. Mix thoroughly.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
Allow warming at room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
13 15
5.2.4 C N -Nitrofurazone stock solution, ρ = 1 mg/ml in N,N-dimethylformamide (DMF).
13 15
Into a 10 ml glass volumetric flask, weigh 10,0 mg ± 0,1 mg C N -nitrofurazone (5.1.6). Record the
mass to 0,1 mg.
Dissolve and then dilute to volume with DMF (5.1.3). Ensure complete solubility of the solution by
vortexing and sonication for at least 5 min.
Aliquot into 2 ml microcentrifuge polypropylene tubes. This avoids reiterated freezing and thawing
which could lead to an accelerated degradation of analytes in solution.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
8) Ready-to-use MgSO –C18–PSA (3 + 1 + 1) salt mixtures from Agilent (Agilent 5982-5158) is an example of a
suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and
does not constitute an endorsement by either ISO or IDF of this product.
IDF 245:2020(E)
Allow warming at room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
13 15
5.2.5 C N -Nitrofurazone working solution, ρ = 5 µg/ml in methanol.
13 15
Into a 10 ml volumetric flask, pipette 50 μl of the C N -nitrofurazone stock solution (5.2.4). Dilute to
volume with methanol (5.1.2). Mix thoroughly.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
Allow warming at room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
13 15
5.2.6 C N -Nitrofurazone working solution, ρ = 250 ng/ml in methanol.
13 15
Into a 10 ml volumetric flask, pipette 500 μl of the C N -nitrofurazone working solution (5.2.5).
Dilute to volume with methanol (5.1.2). Mix thoroughly.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
Allow warming at room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
5.2.7 Standard solutions for calibration by the external calibration curve approach.
Into six separate 5 ml glass volumetric flasks, add both natural abundance nitrofurazone working
13 15
solution (5.2.3) and C N -nitrofurazone working solution (5.2.6) in the volumes described in Table 1.
Dilute to 5 ml volume with methanol (5.1.2).
Aliquot into 2 ml microcentrifuge polypropylene tubes. This avoids reiterated freezing and thawing
which could lead to an accelerated degradation of analytes in solution.
Store at −20 °C for up to 1 year protected from light.
Allow warming at room temperature, vortex and sonicate for at least 5 min before use.
Table 1 — Standard solutions for external calibration curve
Calibration Volume Volume Volume to Corresponding Corresponding Corresponding Corresponding
13 15
standard added added be made nitrofurazone C N - equivalent-in- equivalent-in-
13 15
solution solution up with concentration nitrofurazone sample sample C N -
(5.2.3) (5.2.6) methanol concentration nitrofurazone nitrofurazone
concentration concentration
ng/ml ng/ml ng/g ng/g
Dilute to
Cal 0 0 µl 200 µl 0 10 0 2,5
5 ml
Dilute to
Cal 1 40 µl 200 µl 2 10 0,5 2,5
5 ml
Dilute to
Cal 2 80 µl 200 µl 4 10 1 2,5
5 ml
Dilute to
Cal 3 160 µl 200 µl 8 10 2 2,5
5 ml
Dilute to
Cal 4 400 µl 200 µl 20 10 5 2,5
5 ml
Dilute to
Cal 5 800 µl 200 µl 40 10 10 2,5
5 ml
5.2.8 Solutions for LC–MS/MS.
5.2.8.1 Mobile phase A, water containing 1 mmol/l ammonium acetate (NH CH CO ).
4 3 2
Into a weighing boat, weigh 77 mg ± 5 mg ammonium acetate (5.1.4). Transfer the salt into a 1 l bottle,
and dilute with water to 1 l volume. Mix well. Store at room temperature for no longer than 1 week.
4 © ISO and IDF 2020 – All rights reserved
IDF 245:2020(E)
5.2.8.2 Mobile phase B, methanol.
Use gradient grade methanol for LC (5.1.2).
5.2.8.3 Injection flush port, mixture of water and methanol (1 + 1).
Into a 1 l volumetric flask, add 500 ml of methanol (5.1.2) by means of a measuring cylinder. Dilute to
volume with water. Transfer into a LC bottle. Store at room temperature for no longer than 3 months.
6 Apparatus
Standard laboratory apparatus may be used and, in particular, the following.
9)
6.1 Horizontal shaker , capable of shaking at 300 r/min.
10)
6.2 Ceramic homogenizer , with angled ends that assist with shearing the sample matrix to provide
good homogeneity to the extracted sample.
11)
6.3 Nylon syringe filter , able to capture fine particles with a high flow rate.
12)
6.4 LC–MS/MS equipment .
6.4.1 Gradient pumping system, capable of operating at a speed of 1,0 ml/min.
6.4.2 Autosampler, capable of being temperature controlled at 10 °C and injecting volumes of 5 μl.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and has not been damaged
or changed during transport or storage.
Powdered samples shall be homogenized before taking test portions. Transfer the whole sample into a
container of capacity about twice that of the laboratory sample volume. Close the container immediately.
Mix thoroughly by repeatedly shaking and inverting the container. Alternatively, mix well the powdered
laboratory sample directly into its original container by means of a spoon before taking a test portion.
9) IKA Labortechnik KS 501 is an example of a suitable product available commercially. This information is given
for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by either ISO or IDF of this
product.
10) QuEChERS Ceramic Homogenizers from Agilent (Agilent 5982-9313) are an example of a suitable product
available commercially. This information is given for the convenience of users of this document and does not
constitute an endorsement by eit
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 22186
FIL 245
Première édition
2020-09
Lait et produits laitiers —
Détermination de la nitrofurazone
Milk and milk products — Determination of nitrofurazone
Numéros de référence
FIL 245:2020(F)
©
ISO et FIL 2020
FIL 245:2020(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO et FIL 2020
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8 Silver Building • Bd Auguste Reyers 70/B
CH-1214 Vernier, Genève B-1030 Brussels
Tél.: +41 22 749 01 11 Tél.: + 32 2 325 67 40
Fax: + 32 2 325 67 41
E-mail: copyright@iso.org E-mail: info@fil-idf.org
Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
ii © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs et substances de référence . 2
5.1 Réactifs et matériel . 2
5.2 Substances de référence . 3
6 Appareillage . 5
7 Échantillonnage . 6
8 Mode opératoire. 6
8.1 Prise d’essai . 6
8.1.1 Lait liquide . 6
8.1.2 Produits laitiers en poudre . 7
8.2 Mode opératoire d’extraction . 7
8.3 Blanc réactifs . 7
8.4 Contrôle qualité positif . 7
8.4.1 Généralités . 7
8.4.2 Lait liquide . 8
8.4.3 Produits laitiers en poudre . 8
8.4.4 Calculs . 8
8.5 Droites d’étalonnage adaptées à la matrice . 8
8.5.1 Généralités . 8
8.5.2 Échantillons d’étalonnage adaptés à la matrice pour le lait liquide . 9
8.5.3 Échantillons d’étalonnage adaptés à la matrice pour les produits laitiers
en poudre . 9
8.6 Conditions de CL-SM/SM . 9
8.6.1 Généralités . 9
8.6.2 Conditions chromatographiques . 9
8.6.3 Conditions SM/SM .10
8.7 Montage de la séquence .11
9 Calcul et expression des résultats .11
9.1 Généralités .11
9.2 Intégration des pics .11
9.3 Droites d’étalonnage .12
9.3.1 Droite d’étalonnage externe obtenue à partir de solutions d’étalonnage
externe .12
9.3.2 Droite d’étalonnage adaptée à la matrice obtenue à partir de solutions
d’étalonnage adaptées à la matrice.12
9.4 Identification et confirmation .12
9.5 Calcul à l’aide de la droite d’étalonnage externe .12
9.6 Calcul utilisant la droite d’étalonnage adaptée à la matrice .13
9.7 Expression des résultats .13
10 Fidélité .13
10.1 Généralités .13
10.2 Répétabilité .14
10.3 Reproductibilité .14
11 Rapport d’essai .14
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés iii
FIL 245:2020(F)
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes .15
Annexe B (informative) Données relatives à la fidélité .16
Bibliographie .20
iv © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers et la Fédération internationale du lait (FIL). Il est publié conjointement par
l’ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés v
FIL 245:2020(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l'industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d'analyse et d'échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent chargé des Méthodes d’analyse des additifs
et contaminants de la Fédération internationale du lait (FIL) et le comité technique ISO/TC 34, Produits
alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l'ISO et la FIL.
Les travaux ont été confiés à l’équipe d’action mixte ISO/FIL A13 du Comité permanent chargé des
Méthodes d’analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de ses chefs de projet, Dr J. G. Bendall
(Nouvelle-Zélande) et Dr J. M. Evers (Nouvelle-Zélande).
vi © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
Introduction
La nitrofurazone (voir Figure 1) est une substance inhibitrice dont l’utilisation sur les animaux d’élevage
a été interdite par de nombreuses autorités en raison de ses propriétés cancérigènes. Elle fait partie
de la famille de substances inhibitrices du nitrofurane, de même que la furazolidone, la furaltadone et
la nitrofurantoïne, dont l’utilisation est également prohibée sur les animaux d’élevage. L’analyse de la
furazolidone, la furaltadone et la nitrofurantoïne peut être réalisée à l’aide de métabolites constituant
des marqueurs très spécifiques; toutefois, dans le cas de la nitrofurazone, le semicarbazide, son
marqueur métabolique correspondant, n’est pas spécifique et peut se former par des voies oxydatives
dans les produits laitiers issus de vaches n’ayant pas été traitées par la nitrofurazone. Alors que la
nitrofurazone intacte est instable dans les produits carnés, elle reste stable dans le lait liquide et les
produits laitiers. Le présent document décrit une méthode pour l’analyse de la nitrofurazone dans le
lait liquide et les produits laitiers.
Figure 1 — Structure chimique de la nitrofurazone
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés vii
NORME INTERNATIONALE
FIL 245:2020(F)
Lait et produits laitiers — Détermination de la
nitrofurazone
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de chromatographie en phase liquide avec détection par
spectrométrie de masse en tandem (CL–SM/SM) permettant de quantifier la substance inhibitrice, la
nitrofurazone, dans le lait et les produits laitiers.
La méthode a été validée pour la mesure des traces de nitrofurazone intacte à des niveaux bas allant
jusqu’à 1 ng/g dans le lait liquide et les produits laitiers en poudre sur la base du produit entier (c’est-à-
dire de la poudre). Bien que la méthode soit censée s’appliquer à d’autres matrices de produits laitiers,
une validation supplémentaire est exigée pour le démontrer.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
concentration en nitrofurazone
fraction massique de la substance, déterminée par le mode opératoire spécifié dans le présent document
Note 1 à l'article: La concentration en nitrofurazone est exprimée en nanogrammes par gramme d’échantillon
(ng/g).
4 Principe
[1]
La nitrofurazone est extraite selon le protocole QuEChERS conformément à l’EN 15662:2018 avec
l’application de certaines modifications.
13 15
De la C N -nitrofurazone (étalon interne marqué) est ajoutée à l’échantillon de lait liquide ou à
l’échantillon de lait en poudre (préalablement reconstitué avec de l’eau) puis une extraction est réalisée
avec de l’acétonitrile. Une séparation liquide-liquide est ensuite effectuée à l’aide d’un mélange de
sulfate de magnésium (MgSO ) et de chlorure de sodium (NaCl). Après centrifugation, le surnageant
ainsi obtenu est purifié par extraction en phase solide dispersive (d-SPE) à l’aide d’un mélange de
sorbants C18/PSA/MgSO . Un aliquote de l’extrait est évaporé à sec, puis reconstitué dans du méthanol
avant analyse CL-SM/SM par ionisation électrospray négative (ESI) en mode surveillance de réactions
multiples (MRM).
L’identification positive de la nitrofurazone dans l’échantillon est réalisée conformément aux critères de
[2]
confirmation définis dans la décision 2002/657/CE de la Commission européenne . La quantification
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 1
FIL 245:2020(F)
13 15
est effectuée par dilution isotopique en utilisant de la C N -nitrofurazone comme étalon interne
marqué. Il existe deux manières, tout aussi acceptables l’une que l’autre, de réaliser l’étalonnage:
a) à l’aide d’une droite d’étalonnage externe;
b) à l’aide d’une droite d’étalonnage adaptée à la matrice.
5 Réactifs et substances de référence
5.1 Réactifs et matériel
Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être de qualité analytique reconnue. L’eau doit être
purifiée jusqu’à une résistivité d’au moins 18 MΩ·cm.
5.1.1 Acétonitrile, de qualité isocratique pour CL.
5.1.2 Méthanol, de qualité isocratique pour CL.
5.1.3 N,N-Diméthylformamide (DMF), anhydre, d’une pureté ≥ 99 %.
5.1.4 Acétate d’ammonium, pour spectrométrie de masse.
1)
5.1.5 Nitrofurazone à teneur isotopique naturelle, d’une pureté ≥ 99 % .
13 15 2)
5.1.6 C N -Nitrofurazone, d’une pureté > 99 % et d’une pureté isotopique ≥ 97 % .
3)
5.1.7 Sulfate de magnésium (MgSO ), anhydre, d’une pureté ≥ 98 % .
4)
5.1.8 Chlorure de sodium (NaCl), d’une pureté ≥ 99 % .
5)
5.1.9 Sorbant en C18 (gel de silice octadécylsilylé), en vrac .
6)
5.1.10 Sorbant à amines primaires et secondaires (PSA), en vrac .
1) La nitrofurazone de Sigma Aldrich (PHR1196) est un exemple de produit approprié disponible dans le
commerce. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
13 15
2) La C N -Nitrofurazone de Witega (NF019-25) est un exemple de produit approprié disponible dans le
commerce. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
3) Le sulfate de magnésium anhydre de Sigma Aldrich (63136) est un exemple de produit approprié disponible
dans le commerce. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie
nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
4) Le chlorure de sodium de Merck (106404) est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL
approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. ®
5) Discovery DSC-18 SPE Bulk Packing de Sigma Aldrich (52600-U) est un exemple de produit approprié
disponible dans le commerce. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
6) Supelclean™ PSA SPE Bulk Packing de Sigma Aldrich (52738-U) est un exemple de produit approprié disponible
dans le commerce. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie
nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
2 © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
7)
5.1.11 Sels de séparation QuEChERS .
Introduire dans chaque tube de polypropylène de 15 ml 4,0 g ± 0,2 g de MgSO (5.1.7) et 1,00 g ± 0,05 g
de NaCl (5.1.8).
8)
5.1.12 Sels de SPE dispersive (d-SPE) .
Introduire dans chaque tube de polypropylène de 15 ml 1 200 mg ± 20 mg de MgSO (5.1.7),
400 mg ± 10 mg de sorbant en C18 (5.1.9) et 400 mg ± 10 mg de sorbant PSA (5.1.10).
5.2 Substances de référence
Si nécessaire, il est permis d’employer de la verrerie de volumes différents de ceux spécifiquement
indiqués lors de la préparation des solutions étalons, à condition que les concentrations finales restent
identiques.
5.2.1 Solution mère de nitrofurazone à teneur isotopique naturelle, d’une concentration massique
ρ = 1 mg/ml dans du N,N-diméthylformamide (DMF).
Introduire dans une fiole jaugée de 10 ml en verre 10,0 mg ± 0,1 mg de nitrofurazone à teneur isotopique
naturelle (5.1.5). Enregistrer la masse à 0,1 mg près.
Dissoudre et compléter au volume avec du DMF (5.1.3). Dissoudre complètement la solution en la
mélangeant avec un agitateur de type vortex puis en la passant aux ultrasons pendant au moins 5 min.
Prélever des aliquotes et les introduire dans des tubes de microcentrifugeuse en polypropylène de 2 ml.
Cela permet d’éviter les cycles répétés de congélation-décongélation susceptibles de provoquer une
dégradation accélérée des analytes en solution.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
5.2.2 Solution de travail de nitrofurazone à teneur isotopique naturelle, d’une concentration
massique ρ = 5 µg/ml dans du méthanol.
Dans une fiole jaugée de 10 ml, introduire à l’aide d’une pipette 50 μl de la solution mère de nitrofurazone
à teneur isotopique naturelle (5.2.1). Compléter au volume avec du méthanol (5.1.2). Mélanger
soigneusement.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
7) Les mélanges de sels MgSO –NaCl (4 + 1) prêts à l’emploi de Agilent (Agilent 5982-7550) sont des exemples
de produits appropriés disponibles sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
8) Les mélanges de sels MgSO –C18–PSA (3 + 1 + 1) prêts à l’emploi d’Agilent (Agilent 5982-5158) sont des
exemples de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs
du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du
produit ainsi désigné.
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 3
FIL 245:2020(F)
5.2.3 Solution de travail de nitrofurazone à teneur isotopique naturelle, d’une concentration
massique ρ = 250 ng/ml dans du méthanol.
Dans une fiole jaugée de 10 ml, introduire à l’aide d’une pipette 500 μl de la solution de travail de
nitrofurazone à teneur isotopique naturelle (5.2.2). Compléter au volume avec du méthanol. Mélanger
soigneusement.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
13 15
5.2.4 Solution mère de C N -nitrofurazone, d’une concentration massique ρ = 1 mg/ml dans du
N,N-diméthylformamide (DMF).
13 15
Introduire dans une fiole jaugée de 10 ml en verre 10,0 mg ± 0,1 mg de C N -nitrofurazone (5.1.6).
Enregistrer la masse à 0,1 mg près.
Dissoudre et compléter au volume avec du DMF (5.1.3). Dissoudre complètement la solution en la
mélangeant avec un agitateur de type vortex puis en la passant aux ultrasons pendant au moins 5 min.
Prélever des aliquotes et les introduire dans des tubes de microcentrifugeuse en polypropylène de 2 ml.
Cela permet d’éviter les cycles répétés de congélation-décongélation susceptibles de provoquer une
dégradation accélérée des analytes en solution.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
13 15
5.2.5 Solution de travail de C N -nitrofurazone, d’une concentration massique ρ = 5 µg/ml dans
du méthanol.
13 15
Dans une fiole jaugée de 10 ml, introduire à l’aide d’une pipette 50 μl de la solution mère de C N -
nitrofurazone (5.2.4). Compléter au volume avec du méthanol (5.1.2). Mélanger soigneusement.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
13 15
5.2.6 Solution de travail de C N -nitrofurazone, d’une concentration massique ρ = 250 ng/ml
dans du méthanol.
Dans une fiole jaugée de 10 ml, introduire à l’aide d’une pipette 500 μl de la solution de travail de
13 15
C N -nitrofurazone (5.2.5). Compléter au volume avec du méthanol (5.1.2). Mélanger soigneusement.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
5.2.7 Solutions étalons pour l’étalonnage par une droite d’étalonnage externe.
Introduire la solution de travail de nitrofurazone à teneur isotopique naturelle (5.2.3) et la solution
13 15
de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6) conformément aux volumes décrits dans le Tableau 1 dans
six différentes fioles jaugées en verre de 5 ml. Compléter jusqu’à un volume de 5 ml avec du méthanol
(5.1.2).
4 © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
Prélever des aliquotes et les introduire dans des tubes de microcentrifugeuse en polypropylène de 2 ml.
Cela permet d’éviter les cycles répétés de congélation-décongélation susceptibles de provoquer une
dégradation accélérée des analytes en solution.
Conserver à −20 °C pendant 1 an maximum et à l’abri de la lumière.
Laisser réchauffer à température ambiante, mélanger avec un agitateur de type vortex et passer aux
ultrasons pendant au moins 5 minutes avant utilisation.
Tableau 1 — Solutions étalons pour la droite d’étalonnage externe
Solution Volume Volume Volume Concentra- Concentra- Concentra- Concentra-
d’étalon- de de final à tion corres- tion corres- tion corres- tion corres-
nage solution solution at- pondante en pondante en pondante en pondante en
13 15 13 15
(5.2.3) (5.2.6) teindre nitrofura- C N -ni- nitrofurazone C N -nitro-
2 2
ajouté ajouté en com- zone trofurazone équivalente furazone équi-
plétant ng/ml ng/ml dans l’échan- valente dans
avec du tillon l’échantillon
métha- ng/g ng/g
nol
Complé-
Étalon 0 0 µl 200 µl 0 10 0 2,5
ter à 5 ml
Complé-
Étalon 1 40 µl 200 µl 2 10 0,5 2,5
ter à 5 ml
Complé-
Étalon 2 80 µl 200 µl 4 10 1 2,5
ter à 5 ml
Complé-
Étalon 3 160 µl 200 µl 8 10 2 2,5
ter à 5 ml
Complé-
Étalon 4 400 µl 200 µl 20 10 5 2,5
ter à 5 ml
Complé-
Étalon 5 800 µl 200 µl 40 10 10 2,5
ter à 5 ml
5.2.8 Solutions pour la CL–SM/SM.
5.2.8.1 Phase mobile A, eau contenant 1 mmol/l d’acétate d’ammonium (NH CH CO ).
4 3 2
Introduire dans une cupule de pesée 77 mg ± 5 mg d’acétate d’ammonium (5.1.4). Transférer le sel
dans un flacon de 1 l, puis compléter avec de l’eau jusqu’à un volume de 1 l. Bien mélanger. Conserver à
température ambiante pendant 1 semaine maximum.
5.2.8.2 Phase mobile B, méthanol.
Utiliser du méthanol de qualité gradient pour CL (5.1.2).
5.2.8.3 Orifice de rinçage d’injection, mélange d’eau et de méthanol (1 + 1).
Dans une fiole jaugée de 1 l, introduire 500 ml de méthanol (5.1.2) à l’aide d’une éprouvette graduée.
Compléter au volume avec de l’eau. Transférer le tout dans un flacon de CL. Conserver à température
ambiante pendant 3 mois maximum.
6 Appareillage
Du matériel de laboratoire courant peut être employé, et en particulier les éléments suivants.
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 5
FIL 245:2020(F)
9)
6.1 Agitateur horizontal , capable d’assurer une agitation de 300 r/min.
10)
6.2 Homogénéiseur en céramique à extrémités coudées qui facilite le cisaillement de la matrice
de l’échantillon pour bien homogénéiser l’échantillon extrait.
11)
6.3 Filtre-seringue en nylon capable de retenir les particules fines à un débit élevé.
12)
6.4 Équipement pour CL–SM/SM .
6.4.1 Système de pompage à gradient, capable de fonctionner à un débit de 1,0 ml/min.
6.4.2 Passeur automatique d’échantillons, capable de réguler la température à 10 °C près et
d’injecter des volumes de 5 μl.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et du stockage.
Les échantillons en poudre doivent être homogénéisés avant de procéder au prélèvement des prises
d’essai. Transférer l’ensemble de l’échantillon dans un récipient dont la capacité correspond à environ
deux fois celle du volume de l’échantillon de laboratoire. Fermer immédiatement le récipient. Mélanger
soigneusement en agitant de manière répétée et en renversant le récipient. Sinon, bien mélanger
l’échantillon de laboratoire en poudre directement dans son contenant d’origine à l’aide d’une cuillère
avant de prélever une prise d’essai.
8 Mode opératoire
8.1 Prise d’essai
8.1.1 Lait liquide
Introduire dans des tubes de 50 ml en polypropylène 10,00 g ± 0,10 g de lait liquide.
13 15
Ajouter 100 μl de la solution de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6). Mélanger soigneusement. Cet
ajout dosé (dopage) correspond à une concentration équivalente dans l’échantillon de 2,5 ng/g.
9) Le Labortechnik KS 501 d’Ika est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve
ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
10) Les homogénéiseurs en céramique QuEChERS d’Agilent (5982-9313) sont des exemples de produit approprié
disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne
signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
11) Le filtre-seringue en nylon du type Millex, 0,45 µm, 13 mm est un exemple de produit approprié disponible sur
le marché. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
12) La colonne SB-Phenyl Agilent ZORBAX RRHT (haute résolution, haut débit) remplie de particules de 1,8 μm, de
dimensions 100 mm × 4,6 mm ; la cartouche C Phenomenex SecurityGuard™ ; le système de CL binaire Agilent 1290
Infinity ; et le spectromètre de masse à triple quadripôle AB Sciex 5500 avec une interface ESI à turbo-spray ESI, sont
tous des exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve ou recommande l’emploi
exclusif des produits ainsi désignés.
6 © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
8.1.2 Produits laitiers en poudre
Introduire dans des tubes de 50 ml en polypropylène 2,50 g ± 0,10 g d’échantillon de produit laitier
en poudre.
13 15
Ajouter 25 μl de la solution de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6). Cet ajout dosé (dopage)
correspond à une concentration équivalente dans l’échantillon de 2,5 ng/g. Mélanger soigneusement
et veiller à ce que le volume de l’ajout dosé soit totalement absorbé par la matrice. Attendre 5 min, puis
ajouter 10 ml d’eau. Agiter vigoureusement manuellement jusqu’à complète dispersion de l’échantillon
dans la solution. Ajouter un homogénéisateur en céramique.
8.2 Mode opératoire d’extraction
Ajouter 10 ml d’acétonitrile (5.1.1) à l’échantillon dopé avec ajout dosé dans les tubes en polypropylène
(voir 8.1.1 ou 8.1.2) puis agiter manuellement pendant quelques secondes.
Agiter sur un agitateur horizontal à 300 r/min pendant 10 min.
Ajouter du mélange salin QuEChERS (5.1.11) dans chaque tube. Fermer le tube et agiter immédiatement
à la main la suspension ainsi obtenue en la renversant, ou en la mélangeant avec un agitateur de type
vortex, pour empêcher la formation d’agglomérats.
Agiter sur un agitateur horizontal à 300 r/min pendant 10 min.
Centrifuger à 4 000g à température ambiante pendant 5 min.
Transférer le surnageant (7 ml) dans un tube en polypropylène de 15 ml contenant déjà des sels de
d-SPE (5.1.12). Fermer le tube et agiter immédiatement à la main en renversant la suspension, ou en la
mélangeant avec un agitateur de type vortex, pour empêcher la formation d’agglomérats.
Agiter sur un agitateur horizontal à 300 r/min pendant 10 min.
Centrifuger à 4 000g à température ambiante pendant 5 min.
Transférer le surnageant de l’extrait (1 ml pour un échantillon de lait liquide, ou 4 ml pour un échantillon
de produit laitier en poudre) dans un nouveau tube en polypropylène de 15 ml puis évaporer à sec sous
courant d’azote léger à 40 °C ± 2 °C.
Dissoudre le résidu dans 250 µl de méthanol (5.1.2). Mélanger avec un agitateur de type vortex pendant
quelques secondes, passer aux ultrasons pendant au moins 1 min, puis mélanger à nouveau avec un
agitateur de type vortex.
Filtrer la solution à l’aide d’un filtre-seringue en nylon de 0,45 µm (6.3) et la transférer dans un flacon
de CLHP en vue d’une analyse CL-SM/SM.
8.3 Blanc réactifs
Afin de vérifier la présence d’éventuelles contaminations au cours du traitement des échantillons,
un blanc réactifs doit être analysé en parallèle de chaque série d’échantillons de routine. Suivre
scrupuleusement les étapes de 8.1 et 8.2 sans ajouter de prise d’essai.
8.4 Contrôle qualité positif
8.4.1 Généralités
Il est recommandé d’inclure un contrôle qualité positif dans chaque série, en utilisant un échantillon
dont l’absence de nitrofurazone a été démontrée précédemment.
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 7
FIL 245:2020(F)
8.4.2 Lait liquide
Introduire dans un tube de 50 ml en polypropylène 10,00 g ± 0,10 g de lait liquide.
Ajouter 40 μl de la solution de travail de nitrofurazone à teneur isotopique naturelle (5.2.3). Mélanger
soigneusement. Cet ajout dosé (dopage) correspond à une concentration équivalente dans l’échantillon
de 1,0 ng/g.
13 15
Ajouter 100 µl de la solution de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6). Mélanger soigneusement. Cet
ajout dosé (dopage) correspond à une concentration équivalente dans l’échantillon de 2,5 ng/g.
Suivre le mode opératoire décrit en 8.2.
8.4.3 Produits laitiers en poudre
Introduire dans des tubes de 50 ml en polypropylène 2,50 g ± 0,10 g d’échantillon de produit laitier
en poudre.
Ajouter 10 μl de la solution de travail de nitrofurazone à teneur isotopique naturelle (5.2.3). Mélanger
soigneusement. Cet ajout dosé (dopage) correspond à une concentration équivalente dans l’échantillon
de 1,0 ng/g.
13 15
Ajouter 25 µl de la solution de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6). Cet ajout dosé (dopage)
correspond à une concentration équivalente dans l’échantillon de 2,5 ng/g.
Mélanger soigneusement et veiller à ce que les volumes d’ajout dosé soient totalement absorbés par la
matrice. Attendre 5 min.
Ajouter 10 ml d’eau. Agiter vigoureusement manuellement jusqu’à complète dispersion de l’échantillon
dans la solution. Ajouter un homogénéisateur en céramique.
Suivre le mode opératoire décrit en 8.2.
8.4.4 Calculs
Calculer le recouvrement après correction par l’étalon interne (R ) de l’échantillon de CQ (contrôle
corr
qualité) positif à l’aide de la Formule (1):
ρ
T
R =×100 (1)
corr
ρ
Dopé
où
ρ est la concentration totale du composé mesurée dans l’échantillon dopé par ajout dosé (ng/g);
T
ρ est la concentration du composé ajouté à l’échantillon par ajout dosé (ng/g) (c’est-à-dire
Dopé
1,0 ng/g).
Il convient que les recouvrements se situent entre 70 % et 110 % au cours des analyses de routine
[2]
réalisées conformément aux exigences de la décision 2002/657/CE .
8.5 Droites d’étalonnage adaptées à la matrice
8.5.1 Généralités
Afin de s’affranchir des interférences dues aux composés présents dans les échantillons, soit par
l’amélioration du signal soit par sa suppression, il est permis de réaliser une quantification par la
méthode utilisant un étalonnage adapté à la matrice, en utilisant un ensemble d’échantillons d’étalonnage
adaptés à la matrice. Cette approche est tout aussi acceptable que l’approche par étalonnage externe qui
s’appuie sur une droite d’étalonnage externe (5.2.7).
8 © ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés
FIL 245:2020(F)
8.5.2 Échantillons d’étalonnage adaptés à la matrice pour le lait liquide
Préparer un ensemble de solutions d’étalonnage à l’aide de sept tubes en polypropylène de 50 ml.
Introduire dans chaque tube 10,00 g ± 0,10 g de lait liquide (dont l’absence de nitrofurazone a
précédemment été démontrée).
Ajouter ensuite 0 μl, 20 μl, 40 μl, 80 μl, 200 μl, 400 μl et 800 μl de la solution de travail de nitrofurazone
à teneur isotopique naturelle (5.2.3) aux sept tubes différents, pour obtenir des concentrations
équivalentes dans l’échantillon de 0 ng/g, 0,5 ng/g, 1 ng/g, 2 ng/g, 5 ng/g, 10 ng/g et 20 ng/g. Mélanger
chaque tube minutieusement.
13 15
Ajouter ensuite dans chaque tube 100 µl de la solution de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6).
Mélanger chaque tube minutieusement. Cet ajout dosé (dopage) correspond à une concentration
équivalente dans l’échantillon de 2,5 ng/g.
Suivre le mode opératoire décrit en 8.2.
8.5.3 Échantillons d’étalonnage adaptés à la matrice pour les produits laitiers en poudre
Préparer un ensemble de solutions d’étalonnage à l’aide de sept tubes en polypropylène de 50 ml.
Introduire dans chaque tube 2,50 g ± 0,10 g d’échantillon de produit laitier en poudre (dont l’absence de
nitrofurazone a précédemment été démontrée).
Ajouter ensuite 0 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl, 100 μl et 200 μl de la solution de travail de nitrofurazone
à teneur isotopique naturelle (5.2.3) aux sept tubes différents, pour obtenir des concentrations
équivalentes dans l’échantillon de 0 ng/g, 0,5 ng/g, 1 ng/g, 2 ng/g, 5 ng/g, 10 ng/g et 20 ng/g. Mélanger
chaque tube minutieusement.
13 15
Ajouter ensuite dans chaque tube 25 µl de la solution de travail de C N -nitrofurazone (5.2.6).
Mélanger chaque tube minutieusement. Cet ajout dosé (dopage) correspond à une concentration
équivalente dans l’échantillon de 2,5 ng/g.
Mélanger soigneusement et veiller à ce que les volumes d’ajout dosé soient totalement absorbés par la
matrice. Attendre 5 min.
Ajouter 10 ml d’eau. Agiter vigoureusement manuellement jusqu’à complète dispersion de l’échantillon
dans la solution. Ajouter un homogénéisateur en céramique.
Suivre le mode opératoire décrit en 8.2.
8.6 Conditions de CL-SM/SM
8.6.1 Généralités
En raison de légères différences entre les instruments de CL– SM/SM, même pour un même modèle d’un
même fabricant, il peut être nécessaire de modifier légèrement les conditions indiquées ci-dessous pour
optimiser les performances. L’utilisation de conditions différentes sur le système chromatographique
(notamment des températures différentes, un type de colonne différent ou d’autres différences)
ne donnera pas nécessairement des résultats faux ou moins sensibles, mais exigera une validation
minutieuse des éventuels effets de ces changements.
8.6.2 Conditions chromatographiques
Les conditions suggérées pour la séparation chromatographique sont les suivantes:
© ISO et FIL 2020 – Tous droits réservés 9
FIL 245:2020(F)
— Phase mobile A: solution aqueuse d’acétate d’ammonium (NH CH CO ) (5.2.8.1);
4 3 2
— Phase mobile B: méthanol (5.1.2);
— Volume d’injection: 5 µl;
— Temp. du four de la colonne: 60 °C;
— Débit: 0,9 ml/min;
— Rinçage de l’aiguille: dans l’orifice de rinçage pendant 15 s avec un mélange eau-mé-
thanol (1+1) (5.2.8.3);
— Vanne de dérivation: l’é
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.