ISO 21676:2018
(Main)Water quality — Determination of the dissolved fraction of selected active pharmaceutical ingredients, transformation products and other organic substances in water and treated waste water — Method using high performance liquid chromatography and mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection
Water quality — Determination of the dissolved fraction of selected active pharmaceutical ingredients, transformation products and other organic substances in water and treated waste water — Method using high performance liquid chromatography and mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection
This document specifies a method for the determination of the dissolved fraction of selected active pharmaceutical ingredients and transformation products, as well as other organic substances (see Table 1) in drinking water, ground water, surface water and treated waste water. The lower application range of this method can vary depending on the sensitivity of the equipment used and the matrix of the sample. For most compounds to which this document applies, the range is ≥ 0,025 µg/l for drinking water, ground water and surface water, and ≥ 0,050 µg/l for treated waste water. The method can be used to determine further organic substances or in other types of water (e.g. process water) provided that accuracy has been tested and verified for each case, and that storage conditions of both samples and reference solutions have been validated. Table 1 shows the substances for which a determination was tested in accordance with the method. Table E.1 provides examples of the determination of other organic substances.
Qualité de l'eau — Détermination de la fraction dissoute des principes actifs pharmaceutiques sélectionnés, de leurs produits de transformation et d'autres substances organiques dans les eaux et les eaux résiduaires — Méthode par chromatographie en phase liquide haute performance et détection par spectrométrie de masse (HPLC-MS/MS ou -HRMS) après injection directe
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute des principes actifs pharmaceutiques sélectionnés et de leurs produits de transformation, ainsi que d'autres substances organiques (voir Tableau 1), dans l'eau potable, les eaux souterraines, les eaux de surface et les eaux usées traitées. La gamme d'application basse de la présente méthode peut varier selon la sensibilité de l'équipement utilisé et la matrice de l'échantillon. Pour la plupart des composés concernés par le présent document, la gamme est ≥ 0,025 µg/l pour l'eau potable, les eaux souterraines et les eaux de surface, et ≥ 0,050 µg/l pour les eaux usées traitées. La présente méthode peut être utilisée pour déterminer d'autres substances organiques ou pour d'autres types d'eaux (par exemple, l'eau de process), à condition que l’exactitude ait été testée et vérifiée dans chaque cas, et que les conditions de conservation des échantillons et des solutions de référence aient été validées. Le Tableau 1 indique les substances pour lesquelles la présente méthode a été appliquée. Le Tableau E.1 fournit d’autres exemples de substances organiques pour lesquelles la présente méthode peut être utilisée.
Kakovost vode - Določevanje raztopljenih frakcij izbranih aktivnih farmacevtskih učinkovin, produktov razgradnje in drugih organskih spojin v vodi in obdelani odpadni vodi - Metoda tekočinske kromatografije visoke ločljivosti in masne spektrometrije (HPLC-MS/MS ali -HRMS) po neposrednem injiciranju
Ta dokument določa metodo za določevanje raztopljenih frakcij izbranih aktivnih farmacevtskih učinkovin, produktov razgradnje ter drugih organskih spojin (glej preglednico 1) v pitni vodi, podtalnici, površinski vodi in prečiščeni odpadni vodi.
Spodnje območje uporabe te metode se lahko razlikuje glede na občutljivost uporabljene opreme in matrico vzorca. Pri večini spojin, za katere se ta dokument uporablja, je območje ≥ 0,025 μg/l za pitno vodo, podtalnico in površinsko vodo ter ≥ 0,050 μg/l za prečiščeno odpadno vodo.
Metodo je mogoče uporabiti za določevanje nadaljnjih organskih spojin ali v drugih vrstah vode (npr. procesna voda) pod pogojem, da je bila natančnost preskušena in preverjena za vsak primer ter so bili pogoji skladiščenja obeh vzorcev in referenčnih raztopin potrjeni. V preglednici 1 so prikazane spojine, za katere je bilo preskušeno določevanje v skladu z metodo. V preglednici E.1 so podani primeri določevanja drugih organskih spojin.
General Information
Standards Content (Sample)
SLOVENSKI STANDARD
01-maj-2019
.DNRYRVWYRGH'RORþHYDQMHUD]WRSOMHQLKIUDNFLML]EUDQLKDNWLYQLKIDUPDFHYWVNLK
XþLQNRYLQSURGXNWRYUD]JUDGQMHLQGUXJLKRUJDQVNLKVSRMLQYYRGLLQREGHODQL
RGSDGQLYRGL0HWRGDWHNRþLQVNHNURPDWRJUDILMHYLVRNHORþOMLYRVWLLQPDVQH
VSHNWURPHWULMH +3/&0606DOL+506 SRQHSRVUHGQHPLQMLFLUDQMX
Water quality - Determination of the dissolved fraction of selected active pharmaceutical
ingredients, transformation products and other organic substances in water and treated
waste water - Method using high performance liquid chromatography and mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection
Qualité de l'eau - Détermination des ingrédients pharmaceutiques actifs sélectionnés,
des produits de la transformation et d'autres substances organiques dans l'eau et dans
l'eau résiduaire - Méthode par chromatographie en phase liquide à haute performance et
détection par spectrométrie de masse (CLHP-MS/MS ou - HRSM) après l'injection
directe
Ta slovenski standard je istoveten z: ISO 21676:2018
ICS:
13.060.50 3UHLVNDYDYRGHQDNHPLþQH Examination of water for
VQRYL chemical substances
71.040.50 Fizikalnokemijske analitske Physicochemical methods of
metode analysis
2003-01.Slovenski inštitut za standardizacijo. Razmnoževanje celote ali delov tega standarda ni dovoljeno.
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21676
First edition
2018-10
Water quality — Determination of
the dissolved fraction of selected
active pharmaceutical ingredients,
transformation products and
other organic substances in
water and treated waste water —
Method using high performance
liquid chromatography and mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS
or -HRMS) after direct injection
Qualité de l'eau — Détermination de la fraction dissoute des
ingrédients pharmaceutiques actifs sélectionnés, des produits de la
transformation et d'autres substances organiques dans l'eau et dans
l'eau résiduaire — Méthode par chromatographie en phase liquide à
haute performance et détection par spectrométrie de masse (CLHP-
MS/MS ou -HRSM) après l'injection directe
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 4
3 Terms and definitions . 4
4 Principle . 4
5 Interferences . 4
5.1 During sample preparation . 4
5.2 During high performance liquid chromatography and mass spectrometry . 4
6 Reagents . 5
6.1 General . 5
6.2 Preparation of solutions . 5
7 Apparatus . 7
8 Sampling . 8
9 Procedure. 8
9.1 General . 8
9.2 Sample preparation . 8
9.3 High performance liquid chromatography (HPLC) . 9
9.4 Detection . 9
9.4.1 General. 9
9.4.2 Tandem mass spectrometry (MS/MS) .10
9.4.3 High-resolution mass spectrometry (HRMS) .10
9.5 Blank value measurements .10
10 Calibration .10
10.1 General .10
10.2 Calibration with external standard .12
10.3 Calibration with internal standard .12
11 Calculation of recovery .13
11.1 General .13
11.2 Calculation of analyte recovery using samples .13
11.3 Recovery of internal standards .14
12 Evaluation .14
12.1 Verification of individual substances .14
12.2 Calculation of the individual results using calibration with an external standard .15
12.3 Calculation of the individual results using calibration with an internal standard .15
13 Expression of results .16
14 Test report .16
Annex A (informative) Performance data .17
Annex B (informative) Examples of recovery .22
Annex C (informative) Examples of HPLC columns and chromatograms .24
Annex D (informative) Examples of detection .30
Annex E (informative) Examples of extension of the method .33
Bibliography .34
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2,
Physical, chemical and biochemical methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
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Introduction
Pharmaceutical ingredients are essential for human and animal health. Through application or improper
disposal, active pharmaceutical ingredients enter the water cycle unchanged or transformed. This can
happen via municipal waste water, treated at treatment plants. There, some active pharmaceutical
ingredients and transformation products cannot be removed completely from the waste water by
conventional treatment techniques. Active pharmaceutical ingredients and their transformation
products also travel through sludge to the soil and subsequently enter water bodies via leachate,
depending on the nature of the ground and the active ingredients. Active pharmaceutical ingredients
and their transformation products are therefore found in treated waste water, as well as in surface
and ground water. This document specifies a liquid chromatography method with mass spectrometric
detection for the determination of selected active pharmaceutical ingredients and their transformation
products in the dissolved fraction.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21676:2018(E)
Water quality — Determination of the dissolved fraction of
selected active pharmaceutical ingredients, transformation
products and other organic substances in water and
treated waste water — Method using high performance
liquid chromatography and mass spectrometric detection
(HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the dissolved fraction of selected active
pharmaceutical ingredients and transformation products, as well as other organic substances
(see Table 1) in drinking water, ground water, surface water and treated waste water.
The lower application range of this method can vary depending on the sensitivity of the equipment used
and the matrix of the sample. For most compounds to which this document applies, the range is ≥ 0,025 µg/l
for drinking water, ground water and surface water, and ≥ 0,050 µg/l for treated waste water.
The method can be used to determine further organic substances or in other types of water (e.g.
process water) provided that accuracy has been tested and verified for each case, and that storage
conditions of both samples and reference solutions have been validated. Table 1 shows the substances
for which a determination was tested in accordance with the method. Table E.1 provides examples of
the determination of other organic substances.
Table 1 — Substances for which a determination was tested in accordance with this method
b
Common name Molecular Molar CAS-RN
a
Chemical name (IUPAC ) formula mass
g/mol
4-Acetylaminoantipyrine
C H N O 245,28 83-15-8
13 15 3 2
N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)acetamide
N4-Acetyl sulfamethoxazole
C H N O S 295,32 21312-10-7
12 13 3 4
N-{4-[(5-Methyl-1,2-oxazol-3-yl)sulfamoyl]phenyl}-acetamide
Diatrizoic acid (amidotricoic acid)
C H I N O 613,91 117-96-4
11 9 3 2 4
3,5-Bis(acetamido)-2,4,6-triiodobenzoic acid
Atenolol
C H N O 266,34 29122-68-7
14 22 2 3
(RS)-2-[4-[2-Hydroxy-3-(1-methylethylamino) propoxy]phenyl]
ethanamide
a
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry.
b
CAS-RN: Chemical Abstracts System Registration Number.
Table 1 (continued)
b
Common name Molecular Molar CAS-RN
a
Chemical name (IUPAC ) formula mass
g/mol
Bezafibrate
C H ClNO 361,80 41859-67-0
19 20 4
2-{4-[2-(4-Chlorbenzamido)ethyl]phenoxyl}-2-
methylpropanoic acid
Bisoprolol
C H NO 325,45 66722-44-9
18 31 4
(RS)-1-[4-(2-Isopropoxyethoxymethyl)phenoxy]-3-
isopropylamino-2-propanol
Carbamazepine
C H N O 236,27 298-46-4
15 12 2
5H-Dibenzo[b,f]azepine-5-carbamide
Clarithromycin
(2R,3R,4S,5R,8R,9S,10S,11R,12R,14R)-11-[(2S,3R,4S,6R)-4-
(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-ethyl-
C H NO 747,95 81103-11-9
38 69 13
3,4-dihydroxy-9-[(2R,4R,5S,6S)-5-hydroxy-4-methoxy-4,6-
dimethyl-oxan-2-yl]oxy-12-methoxy-2,4,8,10,12,14-hexa-
methyl-6-oxacyclotetradecane-1,7-dione
Clofibric acid
C H ClO 214,70 882-09-7
10 11 3
2-(4-Chlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid
Dehydrato-Erythromycin (anhydro-erythromycin)
(2R,3R,4S,5S,8R,9S,10S,11R,12R)-11-{[4-(dimethylamino)-3-hy-
C H NO 715,91 23893-13-2
37 65 12
droxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}-5-ethyl-3-hydroxy-9-[(5-hydroxy-
4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl)oxy]-2,4,8,10,12,14-hexame-
thyl-6,15,16-trioxatricyclo[10.2.1.1{1,4}]hexadecane-7-one
Diazepam
C H ClN O 284,74 439-14-5
16 13 2
(RS)-7-Chlor-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4-
benzodiazepine-2-on
Diclofenac
C H Cl NO 296,15 15307-86-5
14 11 2 2
2-[2-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]acetic acid
10,11-Dihydro-10,11-dihydroxy carbamazepine
C H N O 270,29 58955-93-4
15 14 2 3
(5S,6S)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydrobenzo[b][1]benzazepie-
11-carboxamide
Erythromycin
6-(4-Dimethylamino-3-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl)oxy-
C H NO 733,93 114-07-8
37 67 13
14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-4-(5-hydroxy-4-methoxy-4,6-
dimethyl-oxan-2-yl)-oxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-1-oxacyclo-
tetradecane-2,10-dione
4-Formylaminoantipyrine
C H N O 231,25 1672-58-8
12 13 3 2
N-(2,3-Dihydro-1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-1H-pyrazol-4-yl)
formamide
Gemfibrozil
C H O 250,34 25812-30-0
15 22 3
5-(2,5-Chlorophenoxy)-2,2-methylpropanoic acid
Ibuprofen
C H O 206,28 15687-27-1
13 18 2
(RS)-2-[4-(2-Methylpropyl)phenyl]propanoic acid
a
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry.
b
CAS-RN: Chemical Abstracts System Registration Number.
2 © ISO 2018 – All rights reserved
Table 1 (continued)
b
Common name Molecular Molar CAS-RN
a
Chemical name (IUPAC ) formula mass
g/mol
Iomeprol
C H I N O 777,09 78649-41-9
17 22 3 3 8
(±)-N,N′-Bis-(2,3-dihydroxypropyl)-5-[(2-hydroxy-acetyl)
methylamino]-2,4,6-triiodo isophthalamide
Iopamidol
C H I N O 777,08 60166-93-0
17 22 3 3 3
(S)-N,N′-Bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-[(2-hy-
droxypropanoyl)amino]-2,4,6-triiodobenzene-1,3-dicarbamide
Iopromide
C H I N O 791,12 73334-07-3
18 24 3 3 8
(±)-N,N′-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo-5-
(2-methoxyacetamido)-N-methylisophthalamide
Metoprolol
C H NO 267,36 37350-58-6
15 25 3
(RS)-1-(Isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl) phenoxy]
propan-2-ol
Naproxen
C H O 230,26 22204-53-1
14 14 3
(S)-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propanoic acid
Oxazepam
C H ClN O 286,71 604-75-1
15 11 2 2
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4-
benzodiazepin-2-on
Phenazone
C H N O 188,23 60-80-0
11 12 2
1,5-Dimethyl-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-3-on
Primidone
C H N O 218,25 125-33-7
12 14 2 2
5-Ethyl-5-phenylhexahydropyrimidin-4,6-dione
Propyphenazone
C H N O 230,31 479-92-5
14 18 2
1,5-Dimethyl-4-(1-methylethyl)-2-phenyl-1,2-dihydro-3H-
pyrazol-3-one
Roxithromycin
(3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S,14R)-6-{[(2S,3R,4S,6R)-
4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]
C H N O 837,05 80214-83-1
41 76 2 15
oxy}-14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-4-{[(2R,4R,5S,6S)-5-hy-
droxy-4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy}-3,5,7,9,11,13-
hexamethyl-10-(2,4,7-trioxa-1-azaoctan-1-ylidene)-1-
oxacyclotetradecane-2-one
Sotalol
C H N O S 272,36 3930-20-9
12 20 2 3
(RS)-4′-(1-Hydroxy-2-isopropylaminoethyl)
methanesulfonanilide
Sulfamethoxazole
C H N O S 253,28 723-46-6
10 11 3 3
4-Amino-N-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzene-sulfonamide
Temazepam
C H ClN O 300,74 846-50-4
16 13 2 2
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-
1,4-benzodiazepin-2-one
Trimethoprim
C H N O 290,32 738-70-5
14 18 4 3
2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)pyrimidine
a
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry.
b
CAS-RN: Chemical Abstracts System Registration Number.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 4796-2, Laboratory glassware — Bottles — Part 2: Conical neck bottles
ISO 5667-4, Water quality — Sampling — Part 4: Guidance on sampling from lakes, natural and man-made
ISO 5667-5, Water quality — Sampling — Part 5: Guidance on sampling of drinking water from treatment
works and piped distribution systems
ISO 5667-6, Water quality — Sampling — Part 6: Guidance on sampling of rivers and streams
ISO 5667-10, Water quality — Sampling — Part 10: Guidance on sampling of waste waters
ISO 5667-11, Water quality — Sampling — Part 11: Guidance on sampling of groundwaters
ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of
performance characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
4 Principle
The water sample is injected directly into the analysis system. The identification and quantitative
determination is performed using high performance liquid chromatography coupled with mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS, HPLC-HRMS).
5 Interferences
5.1 During sample preparation
Loss of analytes can occur during filtration of the sample as a result of sorption.
5.2 During high performance liquid chromatography and mass spectrometry
Peak tailing, peak fronting and/or wide peaks are indications of a malfunctioning of HPLC and/or
interferences occurring during chromatography. However, some compounds tend to show more signal
tailing than others depending on the chromatographic conditions.
Interferences from accompanying substances (matrix) can occur in both positive and negative
ionization modes depending on the measured compound (e.g. diclofenac in negative ESI mode).
Accompanying substances (matrix) can affect the ionization of the target substances (e.g. ion suppression
or signal enhancement). This can result in underestimation or overestimation of concentration during
4 © ISO 2018 – All rights reserved
quantification. These interferences can be detected and corrected for as needed using analyte recovery
(11.2 and Annex B) and/or internal standardization (10.3 and Table D.3).
6 Reagents
6.1 General
If available, reagents of purity grade “for analysis” or “for residue analysis” are used. The amount of
impurities contributing to the blank value or causing signal interference shall be negligible. This shall
be checked regularly (see 9.5).
Solvents, water and reagents intended for use as elution agents shall be compatible with HPLC and mass
spectrometry.
NOTE High purity grades of solvent applicable for use are available commercially.
6.1.1 Water, complying with the requirements of ISO 3696, grade 1 or equivalent without any interfering
blank values.
6.1.2 Methanol, CH OH.
6.1.3 Acetonitrile, CH CN.
6.1.4 Acetic acid, w(CH COOH) = 100 % mass fraction.
6.1.5 Formic acid, w(HCOOH) not less than 98 % mass fraction.
6.1.6 Ammonium acetate, w(CH COONH ) not less than 99 % mass fraction.
3 4
6.1.7 Ammonium formate, w(HCOONH ) not less than 99 % mass fraction.
6.1.8 Sodium thiosulfate pentahydrate, Na S O ·5H O.
2 2 3 2
6.1.9 Operating gases for the mass spectrometer, in accordance with the specifications of the
instrument manufacturer.
6.1.10 Reference substances, as listed in Table 1, with known mass fraction.
6.1.11 Internal standard substances, preferably isotope-labelled compounds of reference substances
(see Table D.3).
The internal standards shall not lead to analyte interferences (see 9.5).
6.2 Preparation of solutions
6.2.1 General
Solutions of internal standard substances are needed only once calibration and evaluation have been
performed in accordance with 10.3 and 12.3.
Test the accuracy of the reference substance solutions against a control standard (see 6.2.9), e.g. during
calibration (see 10.1).
NOTE Reference substance solutions and internal standard substances are available commercially.
6.2.2 Stock solutions (reference substances/internal standard substances)
Prepare solutions with a mass concentration of, for example, 0,1 mg/ml of each substance.
For this, use, for example, a 5 mg amount of a substance (6.1.10) in separate 50 ml volumetric flasks
(7.2), dissolve them in acetonitrile (6.1.3) or methanol (6.1.2), and then add solvent to solution until it
reaches the mark.
NOTE Alternatively, commercially available (or custom made) stock solutions of individual reference
substances (or internal standard substances) in organic solvent can be used for preparing further dilutions.
Store the solutions at temperatures below −15 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions they are stable for one year.
6.2.3 Intermediate dilution A (reference substances)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 1 µg/ml each.
This involves transferring, for example, 0,5 ml of each reference substance stock solution (see 6.2.2) to
a 50 ml volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with acetonitrile (6.1.3) to
the mark.
Store the solution at temperatures below −15 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one year.
6.2.4 Intermediate dilution B (reference substances)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 50 ng/ml each.
This involves transferring, for example, 0,5 ml of the intermediate dilution A (see 6.2.3) to a 10 ml
volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with water (6.1.1) to the mark.
Store the solution at between 2 °C and 8 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one month.
Use the solution to spike analytes to the samples to determine the recovery (see 11.2).
6.2.5 Intermediate dilution C (reference substances)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 5 ng/ml each.
This involves transferring, for example, 0,25 ml of the intermediate dilution A (see 6.2.3) to a 50 ml
volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with water (6.1.1) to the mark.
Store the solution at between 2 °C and 8 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one month.
6.2.6 Intermediate dilution D (internal standards)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 1 µg/ml each.
This involves transferring, for example, 0,5 ml of each internal standard substance stock solution (see
6.2.2) to a 50 ml volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with acetonitrile
(6.1.3) to the mark.
Store the solution at temperatures below −15 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one year.
6.2.7 Intermediate dilution E (internal standards)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 50 ng/ml each.
6 © ISO 2018 – All rights reserved
This involves transferring, for example, 0,5 ml of the intermediate dilution D (see 6.2.6) to a 10 ml
volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with water (6.1.1) to the mark.
Store the solution at between 2 °C and 8 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one month.
Use the solution for generating calibration samples and for spiked samples.
6.2.8 Calibration samples
Prepare calibration samples from the corresponding dilutions of the intermediate dilution C (see 6.2.5).
For calibration with an internal standard (see 10.3), apply the same amount of internal standards to
each calibration sample.
Prepare calibration samples, e.g. solutions in which the mass concentrations of the substances to be
determined correspond to 0,025 µg/l and those of the internal standard substances correspond to
0,250 µg/l (see 10.1).
This involves transferring, for example, 50 µl of the intermediate dilution C (see 6.2.5) to a 10 ml
volumetric flask, mixing 50 µl of the intermediate dilution E (see 6.2.7) and then making the solution up
to the mark with, for example, water (6.1.1).
If possible, the composition of the calibration samples should be similar to that of the samples to be
examined and shall not result in interfering peak broadening. When using calibration samples in
drinking, ground or surface water, ensure that the substances to be determined are not present.
NOTE When calibration samples are prepared in ultrapure water, this can lead to lower findings of
macrolides. In these cases, the use of ultrapure water is not preferred, but matrix matched calibration instead.
Prepare new calibration samples for each new measurement sequence if their stability cannot be
verified.
6.2.9 Control standard
The control standard is a reference substance solution produced independently of the stock solutions,
e.g. a solution from an alternative batch or manufacturer. The solution should contain all of the
substances to be determined.
7 Apparatus
Equipment or parts of equipment that come into contact with the water sample shall have no blank
values for the compounds measured within this method. All equipment used should preferably be made
of glass, stainless steel or polytetrafluoroethylene (PTFE).
7.1 Narrow-neck flat-bottomed bottles, preferably of brown glass conical joint with glass stoppers,
e.g. laboratory bottles, volume of 250 ml, as per ISO 4796-2 — NS 250.
7.2 Volumetric flasks, nominal volume 10 ml, 25 ml, 50 ml, e.g. volumetric flasks, as per
ISO 1042 — A50-C.
7.3 Microsyringes.
7.4 Syringe filters, with low dead volume, e.g. diameter of 13 mm with a regenerated cellulose
membrane.
Filtration should not lead to significant losses of individual substances, and the type of filter used shall
be selected by testing this. Verify no contamination or significant loss from filtering by passing blanks
and reference substance solutions through the same filters.
7.5 Sample vials, appropriate for the automated sample injector, e.g. crimp-top vial, nominal volume
1,5 ml with crimp cap and septum of rubber/PTFE.
NOTE Sample vials of polyethylene (PE) can be used in an additional run to minimize losses of macrolides.
7.6 HPLC column, preferably with precolumn, suitable for chromatography of the selected substances.
See Annex C for examples.
7.7 High performance liquid chromatograph, coupled to mass spectrometer, consisting of the
following.
7.7.1 Degasser unit, e.g. vacuum degasser.
7.7.2 Analytical pumping systems, low-pulsation, suitable for binary gradient elution.
7.7.3 Manual or automated sample injector.
7.7.4 Apparatus for thermostat control of the separation column, e.g. column thermostat.
7.7.5 Mass spectrometry detector (MS/MS, HRMS), preferably with electrospray ionization (ESI).
8 Sampling
Take the samples in accordance with the specifications given in ISO 5667-4, ISO 5667-5, ISO 5667-6,
ISO 5667-10 and ISO 5667-11.
Use flat-bottomed bottles (7.1) for sampling and fill the bottles with the water to be examined.
When taking drinking water that may contain oxidants, also add approximately 50 mg of sodium
thiosulfate pentahydrate (6.1.8) per litre.
Analyse the water sample as soon as possible after it is sampled.
Store the sample at temperatures of (3 ± 2) °C, protected from light, for a maximum of three weeks.
NOTE If longer storage times are necessary and/or in case of presumed or validated instability of individual
substances, suitable measures can be implemented (e.g. preservation by freezing of samples).
9 Procedure
9.1 General
The implementation of the method depends on the type of calibration and the measures planned to
recognize and, if necessary, correct for matrix effects.
9.2 Sample preparation
If the sample is not visibly absent of particles, filter the sample through a syringe filter (7.4).
During filtration of the sample, sorption may cause loss of analytes, particularly hydrophobic substances
(e.g. macrolides). In this case, do not filter the sample before chromatography, but use an in-line filter as
an alternative to protect the separation column from particles.
When calibrating with an external standard (see 10.2), obtain an aliquot of the sample to determine the
recovery if necessary (see 11.2).
8 © ISO 2018 – All rights reserved
When calibrating with an internal standard (see 10.3), add the internal standards so that the mass
concentrations of the internal standards in the sample are equal to those in the calibration samples
(see 6.2.8).
Take into account the dilution of the sample caused by the addition of reagents when calculating the
individual results (see 12.2) if it amounts to more than 1 %.
Monitor an early eluter, e.g. metformin (see Table E.1), in terms of retention time and peak shape. The
level of organic solvents in a prepared sample shall not result in any additional peak broadening.
9.3 High performance liquid chromatography (HPLC)
Operate the HPLC instrumentation in accordance with the instructions provided by the manufacturer.
Use a suitable HPLC column (7.6) for chromatographic separation and optimize the separation of the
analytes with gradient elution.
Select the chromatographic conditions to achieve optimal sensitivity for mass spectrometric detection
(see Annex C for examples).
NOTE 1 The use of gradient programmes with acetonitrile/water/acetic acid is advantageous in terms of
sensitivity for most substances.
NOTE 2 At the same linear flow rate of the eluent, columns with a lower internal diameter exhibit better
sensitivities than those with wider diameter.
Complete separation of the substances is not necessary provided that interference of the quantitative
determination does not occur during peak overlapping.
The shortest retention time shall correspond to a minimum of three times the HPLC column dead
volume time.
Use chromatography to separate substances that cannot be completely separated from each other using
spectrometry. In these cases, chromatographic resolution R should be a minimum of R = 1,2.
Choose an appropriate injection volume so that no interfering peak widening or interference of the
quantitative determination occur.
NOTE 3 For larger injection volumes, e.g. 1 ml, column switching techniques with suitable enrichment columns
is possible but is outside the scope of this method.
Check retention time standard deviation once during initial assessment. It shall not exceed 0,03 min for
six consecutive chromatograms.
9.4 Detection
9.4.1 General
Operate the mass spectrometer in accordance with the manufacturer’s instructions and select the
correct settings for the device.
The ESI mode is typically preferred when ionizing substances. This usually produces quasi-molecular
+ ⎺ + +
ions of the type [M+H] or [M-H] . In isolated cases, adduct ions, e.g. [M+NH ] or [M+Na] , can also be
formed under certain chromatographic conditions.
Most substances listed in Table 1 can be detected using the positive ESI mode. Substances that are to be
detected in the negative ESI mode can be analysed in a single run by switching polarity or tested in a
separate run (see Table D.1).
When performing simultaneous detection of negative and positive ions, choose switch times for
changing polarity that are short enough to preserve a sufficient number of data points.
Each peak shall be registered with a minimum of eight data points.
Identify and set the method-specific settings for the source parameters and the MS parameters using
less sensitive substances, e.g. ibuprofen.
NOTE The signal is usually smoothed prior to peak integration. Depending on the algorithm used this
can result in a disproportionately high loss of signal intensity when the number of data points is too low.
Reproducibility of peak integration can also be affected, especially for low peak values and peak areas, if there
are too few data points.
Use chromatography to separate substances that cannot be completely separated from each other using
mass spectrometry (see 9.3).
9.4.2 Tandem mass spectrometry (MS/MS)
Identify the optimal settings for ionization under the specified chromatographic conditions for each
substance in positive or negative mode depending on its chemical properties.
Select the substance-specific settings so that two product ions can be preserved for each substance
if possible. Optimize a second mass transfer relative to the isotopic mass of, for example, Cl (see
Table D.1) for substances that fragment into only one detectable product ion, if possible. In order to
avoid interferences during quantification in these cases, only use internal standards for which the
relative molar masses are at least four mass units higher than those of the target substances. Examples
are given in Table D.3.
9.4.3 High-resolution mass spectrometry (HRMS)
When using a high-resolution mass spectrometer in full scan mode the complete mass spectrum is
available at each point in time during chromatography.
Ensure and check that mass accuracy (see 12.1) and resolution are maintained over the mass area and
the entire chromatogram.
Select the resolution to achieve sufficient differentiation of matrix signals.
Set the measuring method so that for each analyte at least one product ion is retained for confirmation
(see 12.1), if possible.
When selecting isotope-marked standards, ensure that the mass difference to the non-marked analytes
is a minimum of three mass units in order to avoid any interferences with the isotope signals of the
analyte. Examples are given in Table D.3.
9.5 Blank value measurements
Perform blank value measurements for the complete method on a regular basis to check there is no
interference from either the instrument or the reagents.
Inject, for example, water (6.1.1) to perform the blank value measurements.
If interfering blank values occur (over 50 % of the lowest reporting level), identify the cause using
systematic examination and eliminate the sources of contamination.
10 Calibration
10.1 General
The calibration of the method of determination is to be performed under specified chromatographic
conditions. The retention times of the individual analytes and possibly of the internal standard
substances shall be determined beforehand. They can be determined by injecting multi-component
10 © ISO 2018 – All rights reserved
mixtures, or solutions of individual substances using the mass of the product ions or the quasi-
molecular ions under the specified chromatographic conditions.
Proceed as follows.
— Design the complete method of determination to produce a linear relationship between the
measured signal and the concentration for each of the substances to be determined.
— For this, determine the linear working range of the instrument by injecting at least five calibration
samples (see 6.2.8) of various concentrations for each of the substances to be determined
(see ISO 8466-1).
— Select a linear calibration range that covers the actual concentrations, e.g. a calibration range of
0,025 µg/l to 1 µg/l for the examination of drinking, ground and surface water.
The lowest concentration level within the calibration shall be higher or equal to the limit of
quantification. The identification of the detection limit and the limit of quantification are performed in
accordance with documented methods, e.g. in accordance with ISO 8466-1.
— For routine operation, it is sufficient to perform multiple-point calibration using at least three
concentration levels.
— For multiple-point calibration, distribute the concentration levels evenly over the calibration range
and perform the calibration in accordance with ISO 8466-1.
— Keep the injection volume constant for calibration and sample measurement.
The calibration function determined for a particular substance is valid only for the applicable
concentration range. It is also dependent on the operating status of the measurement system and shall
be tested in each measurement series.
Two procedures are described for setting up the calibration functions:
a) calibration with external standard;
b) calibration with internal standard.
Internal standard calibration is preferred and highly recommended where labelled standards are
available.
When examining drinking, ground and surface water, calibration with an external standard (see 10.2)
leads to results that will not deviate by more than 25 % from their true value for most of the substances
in Table 1 without corrections made by the recovery. There can be exceptions, especially with polar
substances that exhibit low retention, e.g. some X-ray contrast agents, for which higher systematic
deviations can occur due to matrix effects. In these instances, it can be necessary to use internal
standards (see 10.3) or corrections with sample-specific recovery (see 11.2).
Matrix effects can occur, especially in treated
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21676
First edition
2018-10
Water quality — Determination of
the dissolved fraction of selected
active pharmaceutical ingredients,
transformation products and
other organic substances in
water and treated waste water —
Method using high performance
liquid chromatography and mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS
or -HRMS) after direct injection
Qualité de l'eau — Détermination de la fraction dissoute des
ingrédients pharmaceutiques actifs sélectionnés, des produits de la
transformation et d'autres substances organiques dans l'eau et dans
l'eau résiduaire — Méthode par chromatographie en phase liquide à
haute performance et détection par spectrométrie de masse (CLHP-
MS/MS ou -HRSM) après l'injection directe
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Fax: +41 22 749 09 47
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 4
3 Terms and definitions . 4
4 Principle . 4
5 Interferences . 4
5.1 During sample preparation . 4
5.2 During high performance liquid chromatography and mass spectrometry . 4
6 Reagents . 5
6.1 General . 5
6.2 Preparation of solutions . 5
7 Apparatus . 7
8 Sampling . 8
9 Procedure. 8
9.1 General . 8
9.2 Sample preparation . 8
9.3 High performance liquid chromatography (HPLC) . 9
9.4 Detection . 9
9.4.1 General. 9
9.4.2 Tandem mass spectrometry (MS/MS) .10
9.4.3 High-resolution mass spectrometry (HRMS) .10
9.5 Blank value measurements .10
10 Calibration .10
10.1 General .10
10.2 Calibration with external standard .12
10.3 Calibration with internal standard .12
11 Calculation of recovery .13
11.1 General .13
11.2 Calculation of analyte recovery using samples .13
11.3 Recovery of internal standards .14
12 Evaluation .14
12.1 Verification of individual substances .14
12.2 Calculation of the individual results using calibration with an external standard .15
12.3 Calculation of the individual results using calibration with an internal standard .15
13 Expression of results .16
14 Test report .16
Annex A (informative) Performance data .17
Annex B (informative) Examples of recovery .22
Annex C (informative) Examples of HPLC columns and chromatograms .24
Annex D (informative) Examples of detection .30
Annex E (informative) Examples of extension of the method .33
Bibliography .34
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 2,
Physical, chemical and biochemical methods.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved
Introduction
Pharmaceutical ingredients are essential for human and animal health. Through application or improper
disposal, active pharmaceutical ingredients enter the water cycle unchanged or transformed. This can
happen via municipal waste water, treated at treatment plants. There, some active pharmaceutical
ingredients and transformation products cannot be removed completely from the waste water by
conventional treatment techniques. Active pharmaceutical ingredients and their transformation
products also travel through sludge to the soil and subsequently enter water bodies via leachate,
depending on the nature of the ground and the active ingredients. Active pharmaceutical ingredients
and their transformation products are therefore found in treated waste water, as well as in surface
and ground water. This document specifies a liquid chromatography method with mass spectrometric
detection for the determination of selected active pharmaceutical ingredients and their transformation
products in the dissolved fraction.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 21676:2018(E)
Water quality — Determination of the dissolved fraction of
selected active pharmaceutical ingredients, transformation
products and other organic substances in water and
treated waste water — Method using high performance
liquid chromatography and mass spectrometric detection
(HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection
WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted in accordance with this document
be carried out by suitably qualified staff.
1 Scope
This document specifies a method for the determination of the dissolved fraction of selected active
pharmaceutical ingredients and transformation products, as well as other organic substances
(see Table 1) in drinking water, ground water, surface water and treated waste water.
The lower application range of this method can vary depending on the sensitivity of the equipment used
and the matrix of the sample. For most compounds to which this document applies, the range is ≥ 0,025 µg/l
for drinking water, ground water and surface water, and ≥ 0,050 µg/l for treated waste water.
The method can be used to determine further organic substances or in other types of water (e.g.
process water) provided that accuracy has been tested and verified for each case, and that storage
conditions of both samples and reference solutions have been validated. Table 1 shows the substances
for which a determination was tested in accordance with the method. Table E.1 provides examples of
the determination of other organic substances.
Table 1 — Substances for which a determination was tested in accordance with this method
b
Common name Molecular Molar CAS-RN
a
Chemical name (IUPAC ) formula mass
g/mol
4-Acetylaminoantipyrine
C H N O 245,28 83-15-8
13 15 3 2
N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)acetamide
N4-Acetyl sulfamethoxazole
C H N O S 295,32 21312-10-7
12 13 3 4
N-{4-[(5-Methyl-1,2-oxazol-3-yl)sulfamoyl]phenyl}-acetamide
Diatrizoic acid (amidotricoic acid)
C H I N O 613,91 117-96-4
11 9 3 2 4
3,5-Bis(acetamido)-2,4,6-triiodobenzoic acid
Atenolol
C H N O 266,34 29122-68-7
14 22 2 3
(RS)-2-[4-[2-Hydroxy-3-(1-methylethylamino) propoxy]phenyl]
ethanamide
a
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry.
b
CAS-RN: Chemical Abstracts System Registration Number.
Table 1 (continued)
b
Common name Molecular Molar CAS-RN
a
Chemical name (IUPAC ) formula mass
g/mol
Bezafibrate
C H ClNO 361,80 41859-67-0
19 20 4
2-{4-[2-(4-Chlorbenzamido)ethyl]phenoxyl}-2-
methylpropanoic acid
Bisoprolol
C H NO 325,45 66722-44-9
18 31 4
(RS)-1-[4-(2-Isopropoxyethoxymethyl)phenoxy]-3-
isopropylamino-2-propanol
Carbamazepine
C H N O 236,27 298-46-4
15 12 2
5H-Dibenzo[b,f]azepine-5-carbamide
Clarithromycin
(2R,3R,4S,5R,8R,9S,10S,11R,12R,14R)-11-[(2S,3R,4S,6R)-4-
(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-ethyl-
C H NO 747,95 81103-11-9
38 69 13
3,4-dihydroxy-9-[(2R,4R,5S,6S)-5-hydroxy-4-methoxy-4,6-
dimethyl-oxan-2-yl]oxy-12-methoxy-2,4,8,10,12,14-hexa-
methyl-6-oxacyclotetradecane-1,7-dione
Clofibric acid
C H ClO 214,70 882-09-7
10 11 3
2-(4-Chlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid
Dehydrato-Erythromycin (anhydro-erythromycin)
(2R,3R,4S,5S,8R,9S,10S,11R,12R)-11-{[4-(dimethylamino)-3-hy-
C H NO 715,91 23893-13-2
37 65 12
droxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}-5-ethyl-3-hydroxy-9-[(5-hydroxy-
4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl)oxy]-2,4,8,10,12,14-hexame-
thyl-6,15,16-trioxatricyclo[10.2.1.1{1,4}]hexadecane-7-one
Diazepam
C H ClN O 284,74 439-14-5
16 13 2
(RS)-7-Chlor-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4-
benzodiazepine-2-on
Diclofenac
C H Cl NO 296,15 15307-86-5
14 11 2 2
2-[2-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]acetic acid
10,11-Dihydro-10,11-dihydroxy carbamazepine
C H N O 270,29 58955-93-4
15 14 2 3
(5S,6S)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydrobenzo[b][1]benzazepie-
11-carboxamide
Erythromycin
6-(4-Dimethylamino-3-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl)oxy-
C H NO 733,93 114-07-8
37 67 13
14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-4-(5-hydroxy-4-methoxy-4,6-
dimethyl-oxan-2-yl)-oxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-1-oxacyclo-
tetradecane-2,10-dione
4-Formylaminoantipyrine
C H N O 231,25 1672-58-8
12 13 3 2
N-(2,3-Dihydro-1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-1H-pyrazol-4-yl)
formamide
Gemfibrozil
C H O 250,34 25812-30-0
15 22 3
5-(2,5-Chlorophenoxy)-2,2-methylpropanoic acid
Ibuprofen
C H O 206,28 15687-27-1
13 18 2
(RS)-2-[4-(2-Methylpropyl)phenyl]propanoic acid
a
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry.
b
CAS-RN: Chemical Abstracts System Registration Number.
2 © ISO 2018 – All rights reserved
Table 1 (continued)
b
Common name Molecular Molar CAS-RN
a
Chemical name (IUPAC ) formula mass
g/mol
Iomeprol
C H I N O 777,09 78649-41-9
17 22 3 3 8
(±)-N,N′-Bis-(2,3-dihydroxypropyl)-5-[(2-hydroxy-acetyl)
methylamino]-2,4,6-triiodo isophthalamide
Iopamidol
C H I N O 777,08 60166-93-0
17 22 3 3 3
(S)-N,N′-Bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-[(2-hy-
droxypropanoyl)amino]-2,4,6-triiodobenzene-1,3-dicarbamide
Iopromide
C H I N O 791,12 73334-07-3
18 24 3 3 8
(±)-N,N′-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo-5-
(2-methoxyacetamido)-N-methylisophthalamide
Metoprolol
C H NO 267,36 37350-58-6
15 25 3
(RS)-1-(Isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl) phenoxy]
propan-2-ol
Naproxen
C H O 230,26 22204-53-1
14 14 3
(S)-2-(6-Methoxy-2-naphthyl)propanoic acid
Oxazepam
C H ClN O 286,71 604-75-1
15 11 2 2
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4-
benzodiazepin-2-on
Phenazone
C H N O 188,23 60-80-0
11 12 2
1,5-Dimethyl-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-3-on
Primidone
C H N O 218,25 125-33-7
12 14 2 2
5-Ethyl-5-phenylhexahydropyrimidin-4,6-dione
Propyphenazone
C H N O 230,31 479-92-5
14 18 2
1,5-Dimethyl-4-(1-methylethyl)-2-phenyl-1,2-dihydro-3H-
pyrazol-3-one
Roxithromycin
(3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S,14R)-6-{[(2S,3R,4S,6R)-
4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]
C H N O 837,05 80214-83-1
41 76 2 15
oxy}-14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-4-{[(2R,4R,5S,6S)-5-hy-
droxy-4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy}-3,5,7,9,11,13-
hexamethyl-10-(2,4,7-trioxa-1-azaoctan-1-ylidene)-1-
oxacyclotetradecane-2-one
Sotalol
C H N O S 272,36 3930-20-9
12 20 2 3
(RS)-4′-(1-Hydroxy-2-isopropylaminoethyl)
methanesulfonanilide
Sulfamethoxazole
C H N O S 253,28 723-46-6
10 11 3 3
4-Amino-N-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzene-sulfonamide
Temazepam
C H ClN O 300,74 846-50-4
16 13 2 2
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-
1,4-benzodiazepin-2-one
Trimethoprim
C H N O 290,32 738-70-5
14 18 4 3
2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)pyrimidine
a
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry.
b
CAS-RN: Chemical Abstracts System Registration Number.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 4796-2, Laboratory glassware — Bottles — Part 2: Conical neck bottles
ISO 5667-4, Water quality — Sampling — Part 4: Guidance on sampling from lakes, natural and man-made
ISO 5667-5, Water quality — Sampling — Part 5: Guidance on sampling of drinking water from treatment
works and piped distribution systems
ISO 5667-6, Water quality — Sampling — Part 6: Guidance on sampling of rivers and streams
ISO 5667-10, Water quality — Sampling — Part 10: Guidance on sampling of waste waters
ISO 5667-11, Water quality — Sampling — Part 11: Guidance on sampling of groundwaters
ISO 8466-1, Water quality — Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of
performance characteristics — Part 1: Statistical evaluation of the linear calibration function
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
4 Principle
The water sample is injected directly into the analysis system. The identification and quantitative
determination is performed using high performance liquid chromatography coupled with mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS, HPLC-HRMS).
5 Interferences
5.1 During sample preparation
Loss of analytes can occur during filtration of the sample as a result of sorption.
5.2 During high performance liquid chromatography and mass spectrometry
Peak tailing, peak fronting and/or wide peaks are indications of a malfunctioning of HPLC and/or
interferences occurring during chromatography. However, some compounds tend to show more signal
tailing than others depending on the chromatographic conditions.
Interferences from accompanying substances (matrix) can occur in both positive and negative
ionization modes depending on the measured compound (e.g. diclofenac in negative ESI mode).
Accompanying substances (matrix) can affect the ionization of the target substances (e.g. ion suppression
or signal enhancement). This can result in underestimation or overestimation of concentration during
4 © ISO 2018 – All rights reserved
quantification. These interferences can be detected and corrected for as needed using analyte recovery
(11.2 and Annex B) and/or internal standardization (10.3 and Table D.3).
6 Reagents
6.1 General
If available, reagents of purity grade “for analysis” or “for residue analysis” are used. The amount of
impurities contributing to the blank value or causing signal interference shall be negligible. This shall
be checked regularly (see 9.5).
Solvents, water and reagents intended for use as elution agents shall be compatible with HPLC and mass
spectrometry.
NOTE High purity grades of solvent applicable for use are available commercially.
6.1.1 Water, complying with the requirements of ISO 3696, grade 1 or equivalent without any interfering
blank values.
6.1.2 Methanol, CH OH.
6.1.3 Acetonitrile, CH CN.
6.1.4 Acetic acid, w(CH COOH) = 100 % mass fraction.
6.1.5 Formic acid, w(HCOOH) not less than 98 % mass fraction.
6.1.6 Ammonium acetate, w(CH COONH ) not less than 99 % mass fraction.
3 4
6.1.7 Ammonium formate, w(HCOONH ) not less than 99 % mass fraction.
6.1.8 Sodium thiosulfate pentahydrate, Na S O ·5H O.
2 2 3 2
6.1.9 Operating gases for the mass spectrometer, in accordance with the specifications of the
instrument manufacturer.
6.1.10 Reference substances, as listed in Table 1, with known mass fraction.
6.1.11 Internal standard substances, preferably isotope-labelled compounds of reference substances
(see Table D.3).
The internal standards shall not lead to analyte interferences (see 9.5).
6.2 Preparation of solutions
6.2.1 General
Solutions of internal standard substances are needed only once calibration and evaluation have been
performed in accordance with 10.3 and 12.3.
Test the accuracy of the reference substance solutions against a control standard (see 6.2.9), e.g. during
calibration (see 10.1).
NOTE Reference substance solutions and internal standard substances are available commercially.
6.2.2 Stock solutions (reference substances/internal standard substances)
Prepare solutions with a mass concentration of, for example, 0,1 mg/ml of each substance.
For this, use, for example, a 5 mg amount of a substance (6.1.10) in separate 50 ml volumetric flasks
(7.2), dissolve them in acetonitrile (6.1.3) or methanol (6.1.2), and then add solvent to solution until it
reaches the mark.
NOTE Alternatively, commercially available (or custom made) stock solutions of individual reference
substances (or internal standard substances) in organic solvent can be used for preparing further dilutions.
Store the solutions at temperatures below −15 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions they are stable for one year.
6.2.3 Intermediate dilution A (reference substances)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 1 µg/ml each.
This involves transferring, for example, 0,5 ml of each reference substance stock solution (see 6.2.2) to
a 50 ml volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with acetonitrile (6.1.3) to
the mark.
Store the solution at temperatures below −15 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one year.
6.2.4 Intermediate dilution B (reference substances)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 50 ng/ml each.
This involves transferring, for example, 0,5 ml of the intermediate dilution A (see 6.2.3) to a 10 ml
volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with water (6.1.1) to the mark.
Store the solution at between 2 °C and 8 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one month.
Use the solution to spike analytes to the samples to determine the recovery (see 11.2).
6.2.5 Intermediate dilution C (reference substances)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 5 ng/ml each.
This involves transferring, for example, 0,25 ml of the intermediate dilution A (see 6.2.3) to a 50 ml
volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with water (6.1.1) to the mark.
Store the solution at between 2 °C and 8 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one month.
6.2.6 Intermediate dilution D (internal standards)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 1 µg/ml each.
This involves transferring, for example, 0,5 ml of each internal standard substance stock solution (see
6.2.2) to a 50 ml volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with acetonitrile
(6.1.3) to the mark.
Store the solution at temperatures below −15 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one year.
6.2.7 Intermediate dilution E (internal standards)
Prepare an intermediate solution with substance mass concentrations of, for example, 50 ng/ml each.
6 © ISO 2018 – All rights reserved
This involves transferring, for example, 0,5 ml of the intermediate dilution D (see 6.2.6) to a 10 ml
volumetric flask (7.2) and then making the solution up to the mark with water (6.1.1) to the mark.
Store the solution at between 2 °C and 8 °C and protected from light and evaporation. Under these
conditions it is stable for one month.
Use the solution for generating calibration samples and for spiked samples.
6.2.8 Calibration samples
Prepare calibration samples from the corresponding dilutions of the intermediate dilution C (see 6.2.5).
For calibration with an internal standard (see 10.3), apply the same amount of internal standards to
each calibration sample.
Prepare calibration samples, e.g. solutions in which the mass concentrations of the substances to be
determined correspond to 0,025 µg/l and those of the internal standard substances correspond to
0,250 µg/l (see 10.1).
This involves transferring, for example, 50 µl of the intermediate dilution C (see 6.2.5) to a 10 ml
volumetric flask, mixing 50 µl of the intermediate dilution E (see 6.2.7) and then making the solution up
to the mark with, for example, water (6.1.1).
If possible, the composition of the calibration samples should be similar to that of the samples to be
examined and shall not result in interfering peak broadening. When using calibration samples in
drinking, ground or surface water, ensure that the substances to be determined are not present.
NOTE When calibration samples are prepared in ultrapure water, this can lead to lower findings of
macrolides. In these cases, the use of ultrapure water is not preferred, but matrix matched calibration instead.
Prepare new calibration samples for each new measurement sequence if their stability cannot be
verified.
6.2.9 Control standard
The control standard is a reference substance solution produced independently of the stock solutions,
e.g. a solution from an alternative batch or manufacturer. The solution should contain all of the
substances to be determined.
7 Apparatus
Equipment or parts of equipment that come into contact with the water sample shall have no blank
values for the compounds measured within this method. All equipment used should preferably be made
of glass, stainless steel or polytetrafluoroethylene (PTFE).
7.1 Narrow-neck flat-bottomed bottles, preferably of brown glass conical joint with glass stoppers,
e.g. laboratory bottles, volume of 250 ml, as per ISO 4796-2 — NS 250.
7.2 Volumetric flasks, nominal volume 10 ml, 25 ml, 50 ml, e.g. volumetric flasks, as per
ISO 1042 — A50-C.
7.3 Microsyringes.
7.4 Syringe filters, with low dead volume, e.g. diameter of 13 mm with a regenerated cellulose
membrane.
Filtration should not lead to significant losses of individual substances, and the type of filter used shall
be selected by testing this. Verify no contamination or significant loss from filtering by passing blanks
and reference substance solutions through the same filters.
7.5 Sample vials, appropriate for the automated sample injector, e.g. crimp-top vial, nominal volume
1,5 ml with crimp cap and septum of rubber/PTFE.
NOTE Sample vials of polyethylene (PE) can be used in an additional run to minimize losses of macrolides.
7.6 HPLC column, preferably with precolumn, suitable for chromatography of the selected substances.
See Annex C for examples.
7.7 High performance liquid chromatograph, coupled to mass spectrometer, consisting of the
following.
7.7.1 Degasser unit, e.g. vacuum degasser.
7.7.2 Analytical pumping systems, low-pulsation, suitable for binary gradient elution.
7.7.3 Manual or automated sample injector.
7.7.4 Apparatus for thermostat control of the separation column, e.g. column thermostat.
7.7.5 Mass spectrometry detector (MS/MS, HRMS), preferably with electrospray ionization (ESI).
8 Sampling
Take the samples in accordance with the specifications given in ISO 5667-4, ISO 5667-5, ISO 5667-6,
ISO 5667-10 and ISO 5667-11.
Use flat-bottomed bottles (7.1) for sampling and fill the bottles with the water to be examined.
When taking drinking water that may contain oxidants, also add approximately 50 mg of sodium
thiosulfate pentahydrate (6.1.8) per litre.
Analyse the water sample as soon as possible after it is sampled.
Store the sample at temperatures of (3 ± 2) °C, protected from light, for a maximum of three weeks.
NOTE If longer storage times are necessary and/or in case of presumed or validated instability of individual
substances, suitable measures can be implemented (e.g. preservation by freezing of samples).
9 Procedure
9.1 General
The implementation of the method depends on the type of calibration and the measures planned to
recognize and, if necessary, correct for matrix effects.
9.2 Sample preparation
If the sample is not visibly absent of particles, filter the sample through a syringe filter (7.4).
During filtration of the sample, sorption may cause loss of analytes, particularly hydrophobic substances
(e.g. macrolides). In this case, do not filter the sample before chromatography, but use an in-line filter as
an alternative to protect the separation column from particles.
When calibrating with an external standard (see 10.2), obtain an aliquot of the sample to determine the
recovery if necessary (see 11.2).
8 © ISO 2018 – All rights reserved
When calibrating with an internal standard (see 10.3), add the internal standards so that the mass
concentrations of the internal standards in the sample are equal to those in the calibration samples
(see 6.2.8).
Take into account the dilution of the sample caused by the addition of reagents when calculating the
individual results (see 12.2) if it amounts to more than 1 %.
Monitor an early eluter, e.g. metformin (see Table E.1), in terms of retention time and peak shape. The
level of organic solvents in a prepared sample shall not result in any additional peak broadening.
9.3 High performance liquid chromatography (HPLC)
Operate the HPLC instrumentation in accordance with the instructions provided by the manufacturer.
Use a suitable HPLC column (7.6) for chromatographic separation and optimize the separation of the
analytes with gradient elution.
Select the chromatographic conditions to achieve optimal sensitivity for mass spectrometric detection
(see Annex C for examples).
NOTE 1 The use of gradient programmes with acetonitrile/water/acetic acid is advantageous in terms of
sensitivity for most substances.
NOTE 2 At the same linear flow rate of the eluent, columns with a lower internal diameter exhibit better
sensitivities than those with wider diameter.
Complete separation of the substances is not necessary provided that interference of the quantitative
determination does not occur during peak overlapping.
The shortest retention time shall correspond to a minimum of three times the HPLC column dead
volume time.
Use chromatography to separate substances that cannot be completely separated from each other using
spectrometry. In these cases, chromatographic resolution R should be a minimum of R = 1,2.
Choose an appropriate injection volume so that no interfering peak widening or interference of the
quantitative determination occur.
NOTE 3 For larger injection volumes, e.g. 1 ml, column switching techniques with suitable enrichment columns
is possible but is outside the scope of this method.
Check retention time standard deviation once during initial assessment. It shall not exceed 0,03 min for
six consecutive chromatograms.
9.4 Detection
9.4.1 General
Operate the mass spectrometer in accordance with the manufacturer’s instructions and select the
correct settings for the device.
The ESI mode is typically preferred when ionizing substances. This usually produces quasi-molecular
+ ⎺ + +
ions of the type [M+H] or [M-H] . In isolated cases, adduct ions, e.g. [M+NH ] or [M+Na] , can also be
formed under certain chromatographic conditions.
Most substances listed in Table 1 can be detected using the positive ESI mode. Substances that are to be
detected in the negative ESI mode can be analysed in a single run by switching polarity or tested in a
separate run (see Table D.1).
When performing simultaneous detection of negative and positive ions, choose switch times for
changing polarity that are short enough to preserve a sufficient number of data points.
Each peak shall be registered with a minimum of eight data points.
Identify and set the method-specific settings for the source parameters and the MS parameters using
less sensitive substances, e.g. ibuprofen.
NOTE The signal is usually smoothed prior to peak integration. Depending on the algorithm used this
can result in a disproportionately high loss of signal intensity when the number of data points is too low.
Reproducibility of peak integration can also be affected, especially for low peak values and peak areas, if there
are too few data points.
Use chromatography to separate substances that cannot be completely separated from each other using
mass spectrometry (see 9.3).
9.4.2 Tandem mass spectrometry (MS/MS)
Identify the optimal settings for ionization under the specified chromatographic conditions for each
substance in positive or negative mode depending on its chemical properties.
Select the substance-specific settings so that two product ions can be preserved for each substance
if possible. Optimize a second mass transfer relative to the isotopic mass of, for example, Cl (see
Table D.1) for substances that fragment into only one detectable product ion, if possible. In order to
avoid interferences during quantification in these cases, only use internal standards for which the
relative molar masses are at least four mass units higher than those of the target substances. Examples
are given in Table D.3.
9.4.3 High-resolution mass spectrometry (HRMS)
When using a high-resolution mass spectrometer in full scan mode the complete mass spectrum is
available at each point in time during chromatography.
Ensure and check that mass accuracy (see 12.1) and resolution are maintained over the mass area and
the entire chromatogram.
Select the resolution to achieve sufficient differentiation of matrix signals.
Set the measuring method so that for each analyte at least one product ion is retained for confirmation
(see 12.1), if possible.
When selecting isotope-marked standards, ensure that the mass difference to the non-marked analytes
is a minimum of three mass units in order to avoid any interferences with the isotope signals of the
analyte. Examples are given in Table D.3.
9.5 Blank value measurements
Perform blank value measurements for the complete method on a regular basis to check there is no
interference from either the instrument or the reagents.
Inject, for example, water (6.1.1) to perform the blank value measurements.
If interfering blank values occur (over 50 % of the lowest reporting level), identify the cause using
systematic examination and eliminate the sources of contamination.
10 Calibration
10.1 General
The calibration of the method of determination is to be performed under specified chromatographic
conditions. The retention times of the individual analytes and possibly of the internal standard
substances shall be determined beforehand. They can be determined by injecting multi-component
10 © ISO 2018 – All rights reserved
mixtures, or solutions of individual substances using the mass of the product ions or the quasi-
molecular ions under the specified chromatographic conditions.
Proceed as follows.
— Design the complete method of determination to produce a linear relationship between the
measured signal and the concentration for each of the substances to be determined.
— For this, determine the linear working range of the instrument by injecting at least five calibration
samples (see 6.2.8) of various concentrations for each of the substances to be determined
(see ISO 8466-1).
— Select a linear calibration range that covers the actual concentrations, e.g. a calibration range of
0,025 µg/l to 1 µg/l for the examination of drinking, ground and surface water.
The lowest concentration level within the calibration shall be higher or equal to the limit of
quantification. The identification of the detection limit and the limit of quantification are performed in
accordance with documented methods, e.g. in accordance with ISO 8466-1.
— For routine operation, it is sufficient to perform multiple-point calibration using at least three
concentration levels.
— For multiple-point calibration, distribute the concentration levels evenly over the calibration range
and perform the calibration in accordance with ISO 8466-1.
— Keep the injection volume constant for calibration and sample measurement.
The calibration function determined for a particular substance is valid only for the applicable
concentration range. It is also dependent on the operating status of the measurement system and shall
be tested in each measurement series.
Two procedures are described for setting up the calibration functions:
a) calibration with external standard;
b) calibration with internal standard.
Internal standard calibration is preferred and highly recommended where labelled standards are
available.
When examining drinking, ground and surface water, calibration with an external standard (see 10.2)
leads to results that will not deviate by more than 25 % from their true value for most of the substances
in Table 1 without corrections made by the recovery. There can be exceptions, especially with polar
substances that exhibit low retention, e.g. some X-ray contrast agents, for which higher systematic
deviations can occur due to matrix effects. In these instances, it can be necessary to use internal
standards (see 10.3) or corrections with sample-specific recovery (see 11.2).
Matrix effects can occur, especially in treated waste water samples, and exert an interfering influence
throughout the further course of chromatography on the quantitative determination as a result of ion
suppression or enhancement. The matrix effects can be lessened by diluting the sample.
NOTE 1 Performing correction using sample-specific recovery (see 11.2) and applying internal standardization
(see 10.3) both increase the amount of deviation contributing to measurement uncertainty. The correction can
also result in artificially high values. To confirm the quantitative results, the method of standard addition can be
applied with several spiking steps.
Matrix effects can depend on the working conditions or the type and condition of the equipment, and
shall be identified, e.g. by determination of the recovery, when applying the method for the sample
types of interest. If possible, the composition of the calibration samples (see 6.2.8) should be similar to
that of the samples to be examined.
NOTE 2 Matrix effects can also be detected through post-column infusion of analytes or internal standards
over the complete time used for chromatography of the real samples based on a reduction in intensity.
Table 2 gives an explanation of the subscripts used in the following formulae and text.
Table 2 — Definition of subscripts
Index Meaning
i identity of substance
j consecutive figure for pairs of values
e measuring variables for the calibration
a measuring variables for addition
I internal standard
M measurement solution
P sample
A addition
10.2 Calibration with external standard
Inject the calibration samples (see 6.2.8) to perform calibration.
Chart the calibration function graphically. For this, plot the measurement values y for each substance i
ie
on the y-axis and the corresponding mass concentration ρ on the x-axis.
ie
Determine the reference function
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21676
Première édition
2018-10
Qualité de l'eau — Détermination
de la fraction dissoute des principes
actifs pharmaceutiques sélectionnés,
de leurs produits de transformation
et d'autres substances organiques
dans les eaux et les eaux résiduaires
— Méthode par chromatographie
en phase liquide haute performance
et détection par spectrométrie de
masse (HPLC-MS/MS ou -HRMS) après
injection directe
Water quality — Determination of the dissolved fraction of selected
active pharmaceutical ingredients, transformation products and
other organic substances in water and treated waste water —
Method using high performance liquid chromatography and mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct
injection
Numéro de référence
©
ISO 2018
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© ISO 2018
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 4
3 Termes et définitions . 4
4 Principe . 5
5 Interférences . 5
5.1 Pendant la préparation de l'échantillon . 5
5.2 Pendant la chromatographie en phase liquide haute performance et la
spectrométrie de masse . 5
6 Réactifs . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Préparation des solutions . 6
7 Appareillage . 8
8 Échantillonnage . 9
9 Mode opératoire. 9
9.1 Généralités . 9
9.2 Préparation des échantillons . 9
9.3 Chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) .10
9.4 Détection .10
9.4.1 Généralités .10
9.4.2 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) .11
9.4.3 Spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) .11
9.5 Détermination des valeurs de blanc .11
10 Étalonnage .11
10.1 Généralités .11
10.2 Étalonnage avec un étalon externe .13
10.3 Étalonnage avec un étalon interne .13
11 Calcul du taux de récupération .14
11.1 Généralités .14
11.2 Calcul du taux de récupération avec des échantillons .15
11.3 Rendement d'extraction des étalons internes .15
12 Évaluation .15
12.1 Vérification des substances individuelles .15
12.2 Calcul des résultats individuels en utilisant l'étalonnage avec un étalon externe.17
12.3 Calcul des résultats individuels en utilisant l'étalonnage avec un étalon interne .17
13 Expression des résultats.17
14 Rapport d'essai .18
Annexe A (informative) Données de performance .19
Annexe B (informative) Exemples de taux de récupération .25
Annexe C (informative) Exemples de colonnes HPLC et de chromatogrammes .27
Annexe D (informative) Exemples de détection .33
Annexe E (informative) Exemples d'extension de la méthode .36
Bibliographie .37
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 2, Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
Introduction
Les composés pharmaceutiques sont essentiels pour la santé humaine et animale. Au moment de
l'application ou du fait d'une élimination inappropriée, les principes actifs pharmaceutiques pénètrent le
cycle de l'eau, avec ou sans transformation. Cela peut se produire par le biais des eaux usées municipales,
traitées dans les stations de traitement. En effet, certains principes actifs pharmaceutiques et leurs
produits de transformation ne sont pas complètement éliminés des eaux usées par les traitements
classiques. Les principes actifs pharmaceutiques et leurs produits de transformation sont ainsi
transférés dans le sol par les boues, et pénètrent ensuite les masses d'eau par lessivage, en fonction
de la nature du sol et des principes actifs. Des principes actifs pharmaceutiques et leurs produits de
transformation se trouvent ainsi dans les eaux usées traitées, ainsi que dans les eaux de surface et
souterraines. Le présent document spécifie une méthode par chromatographie en phase liquide avec
détection par spectrométrie de masse pour la détermination de la fraction dissoute des principes actifs
pharmaceutiques sélectionnés et de leurs produits de transformation.
NORME INTERNATIONALE ISO 21676:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la fraction dissoute
des principes actifs pharmaceutiques sélectionnés, de
leurs produits de transformation et d'autres substances
organiques dans les eaux et les eaux résiduaires —
Méthode par chromatographie en phase liquide haute
performance et détection par spectrométrie de masse
(HPLC-MS/MS ou -HRMS) après injection directe
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les
pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les
problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de
l'utilisateur de mettre en place des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais effectués conformément au présent
document soient réalisés par du personnel ayant reçu une qualification appropriée.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute des principes actifs
pharmaceutiques sélectionnés et de leurs produits de transformation, ainsi que d'autres substances
organiques (voir Tableau 1), dans l'eau potable, les eaux souterraines, les eaux de surface et les eaux
usées traitées.
La gamme d'application basse de la présente méthode peut varier selon la sensibilité de l'équipement
utilisé et la matrice de l'échantillon. Pour la plupart des composés concernés par le présent document, la
gamme est ≥ 0,025 µg/l pour l'eau potable, les eaux souterraines et les eaux de surface, et ≥ 0,050 µg/l
pour les eaux usées traitées.
La présente méthode peut être utilisée pour déterminer d'autres substances organiques ou pour
d'autres types d'eaux (par exemple, l'eau de process), à condition que l’exactitude ait été testée et
vérifiée dans chaque cas, et que les conditions de conservation des échantillons et des solutions de
référence aient été validées. Le Tableau 1 indique les substances pour lesquelles la présente méthode
a été appliquée. Le Tableau E.1 fournit d’autres exemples de substances organiques pour lesquelles la
présente méthode peut être utilisée.
Tableau 1 — Substances pour lesquelles la présente méthode a été appliquée
b
Nom commun Formule Masse Numéro CAS
a
Nom chimique (IUPAC ) brute molaire
g/mol
4-Acétylaminoantipyrine
C H N O 245,28 83-15-8
13 15 3 2
N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)acetamide
N4-Acétyl sulfaméthoxazole
C H N O S 295,32 21312-10-7
12 13 3 4
N-{4-[(5-Methyl-1,2-oxazol-3-yl)sulfamoyl]phenyl}-acetamide
Acide diatrizoïque (acide amidotrizoïque)
C H I N O 613,91 117-96-4
11 9 3 2 4
3,5-Bis(acetamido)-2,4,6-triiodobenzoic acid
Aténolol
C H N O 266,34 29122-68-7
(RS)-2-[4-[2-Hydroxy-3-(1-methylethylamino) propoxy]phenyl] 14 22 2 3
ethanamide
Bézafibrate
C H ClNO 361,80 41859-67-0
19 20 4
2-{4-[2-(4-Chlorbenzamido)ethyl]phenoxyl}-2-
methylpropanoic acid
Bisoprolol
C H NO 325,45 66722-44-9
(RS)-1-[4-(2-Isopropoxyethoxymethyl)phenoxy]-3- 18 31 4
isopropylamino-2-propanol
Carbamazépine
C H N O 236,27 298-46-4
15 12 2
5H-Dibenzo[b,f]azepine-5-carbamide
Clarithromycine
(2R,3R,4S,5R,8R,9S,10S,11R,12R,14R)-11-[(2S,3R,4S,6R)-4-
(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-ethyl-
C H NO 747,95 81103-11-9
38 69 13
3,4-dihydroxy-9-[(2R,4R,5S,6S)-5-hydroxy-4-methoxy-4,6-di-
methyl-oxan-2-yl]oxy-12-methoxy-2,4,8,10,12,14-hexa-
methyl-6-oxacyclotetradecane-1,7-dione
Acide clofibrique
C H ClO 214,70 882-09-7
10 11 3
2-(4-Chlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid
Déhydro-érythromycine (anhydro-érythromycine) (érythro-
mycine-H2O)
(2R,3R,4S,5S,8R,9S,10S,11R,12R)-11-{[4-(dimethylamino)-3-
C H NO 715,91 23893-13-2
hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}-5-ethyl-3-hydroxy-9-[(5-hy- 37 65 12
droxy-4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl)oxy]-2,4,8,10,12,14-
hexamethyl-6,15,16-trioxatricyclo[10.2.1.1{1,4}]hexadecane-
7-one
Diazépam
C H ClN O 284,74 439-14-5
(RS)-7-Chlor-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4- 16 13 2
benzodiazepine-2-on
Diclofénac
C H Cl NO 296,15 15307-86-5
14 11 2 2
2-[2-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]acetic acid
10,11-Dihydro-10,11-dihydroxy carbamazépine
C H N O 270,29 58955-93-4
(5S,6S)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydrobenzo[b][1]benzazepie- 15 14 2 3
11-carboxamide
a
IUPAC: Union internationale de chimie pure et appliquée.
b
Numéro CAS: Numéro de registre du Chemical Abstracts Service.
2 © ISO 2018 – Tous droits réservés
Tableau 1 (suite)
b
Nom commun Formule Masse Numéro CAS
a
Nom chimique (IUPAC ) brute molaire
g/mol
Érythromycine
6-(4-Dimethylamino-3-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl)oxy-
C H NO 733,93 114-07-8
14-ethyl-7,12,13-trihydroxy-4-(5-hydroxy-4-methoxy-4,6- 37 67 13
dimethyl-oxan-2-yl)-oxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-1-oxacyclote-
tradecane-2,10-dione
4-Formylaminoantipyrine
C H N O 231,25 1672-58-8
N-(2,3-Dihydro-1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-1H-pyrazol-4-yl) 12 13 3 2
formamide
Gemfibrozil
C H O 250,34 25812-30-0
15 22 3
5-(2,5-Chlorophenoxy)-2,2-methylpropanoic acid
Ibuprofène
C H O 206,28 15687-27-1
13 18 2
(RS)-2-[4-(2-Methylpropyl)phenyl]propanoic acid
Ioméprol
C H I N O 777,09 78649-41-9
17 22 3 3 8
(±)-N,N′-Bis-(2,3-dihydroxypropyl)-5-[(2-hydroxy-acetyl)
methylamino]-2,4,6-triiodo isophtalamide
Iopamidol
C H I N O 777,08 60166-93-0
(S)-N,N′-Bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-[(2-hy- 17 22 3 3 3
droxypropanoyl)amino]-2,4,6-triiodobenzene-1,3-dicarbamide
Iopromide
C H I N O 791,12 73334-07-3
(±)-N,N′-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo-5- 18 24 3 3 8
(2-methoxyacetamido)-N-methylisophtalamide
Métoprolol
C H NO 267,36 37350-58-6
(RS)-1-(Isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl) phenoxy] 15 25 3
propan-2-ol
Naproxène
C H O 230,26 22204-53-1
14 14 3
(S)-2-(6-Methoxy-2-naphtyl)propanoic acid
Oxazépam
C H ClN O 286,71 604-75-1
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4- 15 11 2 2
benzodiazepin-2-on
Phénazone
C H N O 188,23 60-80-0
11 12 2
1,5-Dimethyl-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-3-on
Primidone
C H N O 218,25 125-33-7
12 14 2 2
5-Ethyl-5-phenylhexahydropyrimidin-4,6-dione
Propyphénazone
C H N O 230,31 479-92-5
1,5-Dimethyl-4-(1-methylethyl)-2-phenyl-1,2-dihydro-3H- 14 18 2
pyrazol-3-one
Roxithromycine
(3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S,14R)-6-{[(2S,3R,4S,6R)-4-
(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}-14-ethyl-
C H N O 837,05 80214-83-1
7,12,13-trihydroxy-4-{[(2R,4R,5S,6S)-5-hydroxy-4-methoxy- 41 76 2 15
4,6-dimethyloxan-2-yl]oxy}-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-10-(2,4,7-
trioxa-1-azaoctan-1-ylidene)-1-
oxacyclotetradecane-2-one
a
IUPAC: Union internationale de chimie pure et appliquée.
b
Numéro CAS: Numéro de registre du Chemical Abstracts Service.
Tableau 1 (suite)
b
Nom commun Formule Masse Numéro CAS
a
Nom chimique (IUPAC ) brute molaire
g/mol
Sotalol
C H N O S 272,36 3930-20-9
(RS)-4′-(1-Hydroxy-2-isopropylaminoethyl) 12 20 2 3
methanesulfonanilide
Sulfaméthoxazole
C H N O S 253,28 723-46-6
10 11 3 3
4-Amino-N-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzene-sulfonamide
Témazépam
C H ClN O 300,74 846-50-4
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H- 16 13 2 2
1,4-benzodiazepin-2-one
Triméthoprime
C H N O 290,32 738-70-5
14 18 4 3
2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)pyrimidine
a
IUPAC: Union internationale de chimie pure et appliquée.
b
Numéro CAS: Numéro de registre du Chemical Abstracts Service.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu'ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 4796-2, Verrerie de laboratoire — Flacons — Partie 2: Flacons à col conique
ISO 5667-4, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 4: Lignes directrices pour l'échantillonnage des
eaux des lacs naturels et des lacs artificiels
ISO 5667-5, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 5: Lignes directrices pour l'échantillonnage de
l'eau potable des usines de traitement et du réseau de distribution
ISO 5667-6, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour l'échantillonnage des
rivières et des cours d'eau
ISO 5667-10, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 10: Lignes directrices pour l'échantillonnage des
eaux résiduaires
ISO 5667-11, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 11: Lignes directrices pour l'échantillonnage des
eaux souterraines
ISO 8466-1, Qualité de l’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d’analyse et estimation des
caractères de performance — Partie 1: Évaluation statistique de la fonction linéaire d’étalonnage
3 Termes et définitions
Aucun terme n'est défini dans le présent document.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp
4 © ISO 2018 – Tous droits réservés
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse https:// www .electropedia .org/
4 Principe
L'échantillon d'eau est injecté directement dans le système d'analyse. L'identification et la détermination
quantitative sont réalisées en associant la chromatographie en phase liquide haute performance et la
détection par spectrométrie de masse (HPLC-MS/MS ou HPLC-HRMS).
5 Interférences
5.1 Pendant la préparation de l'échantillon
Des pertes d'analytes peuvent avoir lieu pendant la filtration de l'échantillon à cause de la sorption.
5.2 Pendant la chromatographie en phase liquide haute performance et la
spectrométrie de masse
Les traînées de pics, les diffusions frontales et/ou les pics larges indiquent un dysfonctionnement du
système HPLC et/ou la présence d'interférences pendant l'analyse chromatographique. Toutefois,
certains composés ont tendance à présenter davantage de traînées de pics que d'autres, en fonction des
conditions chromatographiques.
Des interférences dues aux substances concomitantes (matrice) peuvent se produire à la fois avec
l'ionisation positive et négative, selon le composé analysé (par exemple, le diclofénac en mode ESI
négatif).
Les substances concomitantes (matrice) peuvent affecter l'ionisation des substances cibles (par
exemple, suppression d'ions ou exaltation du signal). Cela peut donner lieu à une sous-estimation ou à
une surestimation de la concentration lors de la quantification. Ces interférences peuvent être détectées
et corrigées de manière adéquate en utilisant le taux de récupération de l'analyte (11.2 et Annexe B) et/
ou un étalonnage interne (10.3 et Tableau D.3).
6 Réactifs
6.1 Généralités
S'ils sont disponibles, des réactifs de qualité «pour analyse» ou «pour analyse de résidus» sont utilisés.
La quantité d'impuretés contribuant à la valeur de blanc ou à l'origine d'une interférence dans le signal
doit être négligeable. Cela doit être vérifié régulièrement (voir 9.5).
Les solvants, l'eau et les réactifs prévus comme agents d'élution doivent être compatibles avec la HPLC
et la spectrométrie de masse.
NOTE Les qualités de solvants ultra purs applicables pour cette utilisation sont disponibles dans le
commerce.
6.1.1 Eau, respectant les exigences de l'ISO 3696, de qualité 1 ou équivalente, exempte d'interférence
dans le blanc.
6.1.2 Méthanol, CH OH.
6.1.3 Acétonitrile, CH CN.
6.1.4 Acide acétique, w(CH COOH) = 100 % de la fraction massique.
6.1.5 Acide formique, w(HCOOH) au moins 98 % de la fraction massique.
6.1.6 Acétate d'ammonium, w(CH COONH ) au moins 99 % de la fraction massique.
3 4
6.1.7 Formiate d'ammonium, w(HCOONH ) au moins 99 % de la fraction massique.
6.1.8 Thiosulfate de sodium pentahydraté, Na S O ·5H O.
2 2 3 2
6.1.9 Gaz pour le spectromètre de masse, conformes aux spécifications du fabricant de l'instrument.
6.1.10 Étalons de référence, selon les indications du Tableau 1, avec une fraction massique connue.
6.1.11 Étalons internes, de préférence les composés marqués avec un isotope (voir Tableau D.3) des
étalons de référence.
Les étalons internes ne doivent pas provoquer d'interférences avec les analytes (voir 9.5).
6.2 Préparation des solutions
6.2.1 Généralités
Les solutions des étalons internes sont nécessaires seulement une fois que l'étalonnage et l'évaluation
ont été réalisés conformément au 10.3 et au 12.3.
Tester la justesse des solutions d’étalon de référence en les comparant à un étalon de contrôle (voir
6.2.9), par exemple pendant l'étalonnage (voir 10.1).
NOTE Des solutions d’étalon de référence et des étalons internes sont disponibles dans le commerce.
6.2.2 Solutions mères (étalons de référence/étalons internes)
Préparer les solutions avec une concentration massique de 0,1 mg/ml de chaque substance, par exemple.
Pour cela, utiliser, par exemple, 5 mg d'une substance (6.1.10) dans différentes fioles jaugées
de 50 ml (7.2), les dissoudre dans l'acétonitrile (6.1.3) ou le méthanol (6.1.2), puis ajouter du solvant
jusqu'à la marque.
NOTE Sinon, il est possible d'utiliser des solutions mères des étalons de référence (ou des étalons internes)
individuelles du commerce (ou sur mesure) dans un solvant organique, pour préparer les dilutions nécessaires.
Stocker les solutions à une température inférieure à −15 °C et les protéger de la lumière et de
l'évaporation. Dans ces conditions, elles sont stables pendant un an.
6.2.3 Dilution intermédiaire A (étalons de référence)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 1 µg/ml de chaque
substance, par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de chaque solution mère d’étalon de référence (voir
6.2.2) dans une fiole jaugée de 50 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'acétonitrile (6.1.3) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température inférieure à −15 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle reste stable pendant un an.
6.2.4 Dilution intermédiaire B (étalons de référence)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 50 ng/ml de chaque
substance, par exemple.
6 © ISO 2018 – Tous droits réservés
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de la dilution intermédiaire A (voir 6.2.3) dans une fiole
jaugée de 10 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'eau (6.1.1) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température entre 2 °C et 8 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un mois.
Utiliser cette solution pour doper les échantillons avec les analytes, pour déterminer les taux de
récupération (voir 11.2).
6.2.5 Dilution intermédiaire C (étalons de référence)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 5 ng/ml de chaque
substance, par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,25 ml de la dilution intermédiaire A (voir 6.2.3) dans une
fiole jaugée de 50 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'eau (6.1.1) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température entre 2 °C et 8 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un mois.
6.2.6 Dilution intermédiaire D (étalons internes)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 1 µg/ml de chaque
substance, par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de chaque solution mère d'étalon interne (voir 6.2.2)
dans une fiole jaugée de 50 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'acétonitrile (6.1.3) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température inférieure à −15 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un an.
6.2.7 Dilution intermédiaire E (étalons internes)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 50 ng/ml de chaque
substance, par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de la dilution intermédiaire D (voir 6.2.6) dans une fiole
jaugée de 10 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'eau (6.1.1) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température entre 2 °C et 8 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un mois.
Utiliser cette solution pour préparer les solutions d'étalonnage et les échantillons dopés.
6.2.8 Solutions d'étalonnage
Préparer les solutions d'étalonnage à partir des dilutions correspondantes de la dilution intermédiaire C
(voir 6.2.5). Pour l'étalonnage interne (voir 10.3), ajouter la même quantité d'étalons internes à chaque
solution d'étalonnage.
Préparer les solutions d'étalonnage, par exemple des solutions dans lesquelles les substances à
déterminer ont une concentration massique de 0,025 µg/l et les étalons internes une concentration
massique de 0,250 µg/l (voir 10.1).
Cela implique de transférer, par exemple, 50 µl de la dilution intermédiaire C (voir 6.2.5) dans une fiole
jaugée de 10 ml, d'y ajouter 50 µl de la dilution intermédiaire E (voir 6.2.7), puis de remplir la fiole
jusqu'à la marque avec, par exemple, de l'eau (6.1.1).
Si possible, il convient que la composition des solutions d'étalonnage soit semblable à celle des
échantillons à analyser et elle ne doit pas entraîner d'élargissement parasite des pics. En cas d'utilisation
d'eau potable, d’eaux souterraines ou de surface pour la préparation des solutions d'étalonnage, vérifier
qu’elles ne contiennent aucune des substances à analyser.
NOTE Si les solutions d'étalonnage sont préparés dans de l'eau ultra pure, les résultats des macrolides
peuvent être plus faibles. Dans ce cas, l'utilisation d'eau ultra pure n'est pas privilégiée, utiliser plutôt un
étalonnage en matrice.
Préparer des nouvelles solutions d'étalonnage pour chaque nouvelle séquence de mesure, si leur
stabilité ne peut pas être vérifiée.
6.2.9 Étalon de contrôle
L'étalon de contrôle est une solution d’étalon de référence produite indépendamment des solutions
mères, par exemple une solution provenant d'un autre lot ou d'un autre fabricant. Il convient que la
solution contienne toutes les substances à déterminer.
7 Appareillage
L'équipement ou les parties d'équipements en contact avec l'échantillon d'eau ne doivent présenter
aucune valeur de blanc pour les composés mesurés selon la présente méthode. Il convient que tout
l'équipement utilisé soit de préférence en verre, en acier inoxydable ou en polytétrafluoroéthylène
(PTFE).
7.1 Flacons à fond plat et à col étroit, de préférence en verre brun à joint conique avec bouchon en
verre, par exemple des flacons de laboratoire d'un volume de 250 ml, conformément à l'ISO 4796-2 —
NS 250.
7.2 Fioles jaugées, d'un volume nominal de 10 ml, 25 ml, 50 ml, par exemple des fioles jaugées selon
l'ISO 1042 — A50-C.
7.3 Microseringues
7.4 Filtres à seringue, avec un faible volume mort, par exemple avec un diamètre de 13 mm et une
membrane en cellulose régénérée.
Il convient que la filtration n'entraîne pas de perte significative des substances individuelles et le type
de filtre utilisé doit être choisi selon ce critère. Vérifier qu'aucune contamination ou perte significative
n'a lieu pendant la filtration en filtrant des blancs et des solutions d’étalon de référence avec les mêmes
filtres.
7.5 Flacons, appropriés pour un passeur d'échantillons automatique, par exemple un flacon à sertir
d'un volume nominal de 1,5 ml avec un bouchon serti et un septum en caoutchouc/PTFE.
NOTE Des flacons en polyéthylène (PE) peuvent être utilisés pour réduire autant que possible les pertes de
macrolides, dans une séquence analytique supplémentaire.
7.6 Colonne HPLC, de préférence avec une précolonne, adaptée à l'analyse chromatographique des
substances d’intérêt. Voir l'Annexe C pour des exemples.
7.7 Système de chromatographie en phase liquide haute performance, couplé à un spectromètre
de masse, constitué des éléments suivants.
7.7.1 Unité de dégazage, par exemple un appareil de dégazage par le vide.
7.7.2 Systèmes de pompage de qualité analytique, faibles pulsations, adéquats pour un gradient
d'élution binaire.
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7.7.3 Passeur d’échantillons manuel ou automatique.
7.7.4 Appareil de contrôle du thermostat de la colonne de séparation, par exemple un thermostat
de colonne.
7.7.5 Détecteur par spectrométrie de masse (MS/MS, HRMS), de préférence avec ionisation par
électrospray (ESI).
8 Échantillonnage
Prélever les échantillons selon les spécifications de l'ISO 5667-4, ISO 5667-5, ISO 5667-6, ISO 5667-10 et
ISO 5667-11.
Utiliser des flacons à fond plat (7.1) pour l'échantillonnage et remplir les flacons avec l'eau à analyser.
En cas de prélèvement d'eau potable pouvant contenir des oxydants, ajouter aussi environ 50 mg de
thiosulfate de sodium pentahydraté (6.1.8) par litre.
Analyser l'échantillon d'eau le plus tôt possible après l'échantillonnage.
Conserver l'échantillon à une température de (3 ± 2) °C, à l'abri de la lumière, pendant trois semaines au
maximum.
NOTE Si une durée de conservation plus longue est nécessaire et/ou en cas d'instabilité présumée ou validée
des substances individuelles, des mesures adéquates peuvent être appliquées (par exemple, conservation par
congélation des échantillons).
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
L'application de la méthode dépend du type d'étalonnage et des mesures prévues pour identifier et, si
nécessaire, corriger les effets matrice.
9.2 Préparation des échantillons
Si l'échantillon n'est pas visiblement exempt de particules, filtrer l'échantillon avec un filtre à
seringue (7.4).
Pendant la filtration de l'échantillon, la sorption peut provoquer une perte d'analytes, en particulier
pour les substances hydrophobes (par exemple, les macrolides). Dans ce cas, ne pas filtrer l'échantillon
avant l'analyse, mais utiliser un filtre en ligne comme alternative pour protéger la colonne de séparation
contre les particules.
Si l'étalonnage est effectué au moyen d'un étalon externe, (voir 10.2), utiliser une aliquote de l'échantillon
pour déterminer le taux de récupération si nécessaire (voir 11.2).
Si l'étalonnage est effectué au moyen d'un étalon interne (voir 10.3), ajouter les étalons internes de telle
manière que les concentrations massiques des étalons internes dans l'échantillon soient égales à celles
présentes dans les solutions d'étalonnage (voir 6.2.8).
Tenir compte de la dilution de l'échantillon provoquée par l'ajout de réactifs, lors du calcul des résultats
individuels (voir 12.2) si cet ajout s'élève à plus de 1 %.
Surveiller les substances dont l'élution est rapide, par exemple la metformine (voir Tableau E.1), pour en
observer le temps de rétention et la forme du pic. La quantité de solvants organiques dans un échantillon
préparé ne doit pas provoquer d'élargissement supplémentaire des pics.
9.3 Chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC)
Utiliser l’équipement HPLC conformément aux instructions du fabricant.
Utiliser une colonne HPLC (7.6) pour la séparation chromatographique et optimiser la séparation des
analytes avec un gradient d’élution.
Choisir les conditions chromatographiques qui permettent d'optimiser la sensibilité pour la détection
par spectrométrie de masse (voir exemples à l'Annexe C).
NOTE 1 L'utilisation de gradients avec acétonitrile/eau/acide acétique est avantageuse en termes de
sensibilité, pour la plupart des substances.
NOTE 2 Pour un même débit linéaire de l'éluant, les colonnes dont le diamètre intérieur est faible présentent
une meilleure sensibilité que celles dont le diamètre est plus élevé.
La séparation complète des substances n'est pas nécessaire si le chevauchement de pics n’interfère pas
sur la détermination quantitative des substances.
Le temps de rétention le plus court doit correspondre au minimum à trois fois le temps du volume mort
de la colonne HPLC.
Utiliser la chromatographie pour séparer les substances qui ne peuvent pas être séparées complètement
les unes des autres par la spectrométrie. Dans ce cas, il convient que la résolution chromatographique R
soit de R = 1,2 au minimum.
Choisir un volume d'injection approprié pour empêcher tout élargissement parasite des pics ou toute
interférence sur la détermination quantitative.
NOTE 3 Pour les grands volumes d'injection, par exemple 1 ml, il est possible de recourir à des techniques de
commutation de colonne avec des colonnes d'enrichissement adaptées, mais celles-ci sont en dehors du domaine
d'application de la présente méthode.
Vérifier l'écart-type du temps de rétention, une fois pendant l'évaluation initiale. Il ne doit pas dépasser
0,03 min pour six chromatogrammes consécutifs.
9.4 Détection
9.4.1 Généralités
Utiliser le spectromètre de masse conformément aux instructions du fabricant et choisir les réglages
adéquats pour l'appareil.
Le mode ESI est privilégié pour l’ionisation des substances. Il produit habituellement des ions quasi-
+ ⎺ +
moléculaires de type [M+H] ou [M-H] . Dans des cas isolés, des ions adduits, par exemple [M+NH ] ou
+
[M+Na] , peuvent aussi se former dans certaines conditions chromatographiques.
La plupart des substances du Tableau 1 peuvent être détectées en mode ESI positif. Les substances à
détecter en mode ESI négatif peuvent être analysées en une seule séquence analytique en commutant la
polarité, ou dans une séquence séparée (voir Tableau D.1).
Lorsque la détection des ions négatifs et positifs a lieu simultanément, choisir des temps de commutation
pour le changement de polarité suffisamment courts pour conserver un nombre suffisant de points
d’acquisition.
Chaque pic doit être enregistré avec un minimum de huit points.
10 © ISO 2018 – Tous droits réservés
Identifier et établir les réglages spécifiques à la méthode pour les paramètres de la source et les
paramètres du MS, en utilisant les substances les moins sensibles, par exemple l'ibuprofène.
NOTE Le signal est habituellement lissé avant l'intégration des pics. Suivant l'algorithme utilisé, cela peut
entraîner une perte d'intensité du signal anormalement importante lorsque le nombre de points d’acquisition est
trop faible. La reproductibilité de l'intégration des pics peut aussi être affectée, en particulier pour les pics dont
la valeur et l'aire sont faibles, si le nombre de points d’acquisition est trop faible.
Utiliser la chromatographie pour séparer les substances qui ne peuvent pas être complètement séparées
les unes des autres par la spectrométrie (voir 9.3).
9.4.2 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)
Identifier les réglages optimaux pour l'ionisation dans les conditions chromatographiques spécifiées
pour chaque substance, en mode positif ou négatif selon ses propriétés chimiques.
Choisir les réglages spécifiques aux substances de manière à ce que deux ions produits puissent être
conservés pour chaque substance, si possible. Optimiser une deuxième transition par rapport à la
masse isotopique de, par exemple Cl (voir Tableau D.1), pour les substances qui ne se fragmentent
qu’en un seul ion produit détectable, si possible. Pour éviter les interférences lors de la quantification
dans les cas précités, utiliser seulement des étalons internes pour lesquels les masses moléculaires
relatives dépassent celles des substances cibles d'au moins quatre unités de masse. Des exemples sont
donnés dans le Tableau D.3.
9.4.3 Spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS)
Lorsqu'un spectromètre de masse à haute résolution est utilisé en mode balayage complet, le spectre de
masse complet est disponible à chaque point pendant la chromatographie.
Faire en sorte et vérifier que la précision de masse (voir 12.1) et la résolution soient maintenues sur la
gamme de masse et sur tout le chromatogramme.
Choisir la résolution permettant d'obtenir une différenciation suffisante des signaux correspondant à
la matrice.
Régler la méthode de mesure de manière à ce que pour chaque analyte, au moins un ion produit soit
retenu pour la confirmation (voir 12.1), si possible.
En choisissant des étalons marqués avec un isotope, vérifier que la différence de masse par rapport
à l'analyte non marqué soit d'au moins trois unités de masse pour éviter toute interférence avec les
signaux correspondant à l'isotope de l'analyte. Des exemples sont donnés dans le Tableau D.3.
9.5 Détermination des valeurs de blanc
Analyser régulièrement des blancs pour la méthode complète, afin de vérifier l'absence d'interférence
provenant de l'instrument ou des réactifs.
Injecter, par exemple, de l'eau (6.1.1) pour mesurer les valeurs de blanc.
En présence de valeurs de blanc positives (plus de 50 % du niveau rapporté le plus bas), identifier la
cause par un examen systématique et éliminer les sources de contamination.
10 Étalonnage
10.1 Généralités
L'étalonnage de la méthode doit être réalisé dans les conditions chromatographiques spécifiées.
Les temps de rétention des substances individuelles et potentiellement des étalons internes doivent
être déterminés préalablement. Ils peuvent être déterminés en injectant des mélanges de plusieurs
composés ou des solutions des substances individuelles, en utilisant la masse des ions produits ou des
ions quasi-moléculaires, dans les conditions chromatographiques spécifiées.
Procéder comme suit:
— concevoir la méthode de quantification complète de façon à obtenir une relation linéaire entre le
signal mesuré et la concentration pour chacune des substances à déterminer;
— pour cela, déterminer le domaine de travail linéaire de l'instrument en injectant au moins cinq
solutions d'étalonnage (voir 6.2.8) de différentes concentrations, pour chacune des substances à
déterminer (voir l'ISO 8466-1);
— choisir un domaine de travail linéai
...
ISO/TC 147/SC 2
Date : 2018-10
Date: 2018-10
ISO/TC 147/SC 2
ISO/TC 147/SC 2
Secrétariat : DIN
Qualité de l'eau — Détermination de la fraction dissoute des principes actifs
pharmaceutiques sélectionnés, de leurs produits de transformation et d'autres
substances organiques dans les eaux et les eaux résiduaires — Méthode par
chromatographie en phase liquide haute performance et détection par
spectrométrie de masse (HPLC-MS/MS ou -HRMS) après injection directe
Water quality — Determination of the dissolved fraction of selected active pharmaceutical
ingredients, transformation products and other organic substances in water and treated
waste water — Method using high performance liquid chromatography and mass
spectrometric detection (HPLC-MS/MS or -HRMS) after direct injection
ICS : 13.060.50
Type du document: Norme internationale
Sous-type du document:
Stade du document: (60) Publication
Langue du document: F
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œuvre, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme
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demandeur.
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Web : www.iso.org
Publié en Suisse
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos . viii
Introduction . ix
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 4
3 Termes et définitions . 4
4 Principe . 5
5 Interférences . 5
5.1 Pendant la préparation de l'échantillon . 5
5.2 Pendant la chromatographie en phase liquide haute performance et la
spectrométrie de masse . 5
6 Réactifs . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Préparation des solutions. 6
7 Appareillage . 8
8 Échantillonnage . 9
9 Mode opératoire . 9
9.1 Généralités . 9
9.2 Préparation des échantillons . 10
9.3 Chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) . 10
9.4 Détection . 11
9.4.1 Généralités . 11
9.4.2 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) . 11
9.4.3 Spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) . 12
9.5 Détermination des valeurs de blanc. 12
10 Étalonnage . 12
10.1 Généralités . 12
10.2 Étalonnage avec un étalon externe . 14
10.3 Étalonnage avec un étalon interne. 14
11 Calcul du taux de récupération . 15
11.1 Généralités . 15
11.2 Calcul du taux de récupération avec des échantillons . 16
11.3 Rendement d'extraction des étalons internes . 16
12 Évaluation . 16
12.1 Vérification des substances individuelles . 16
12.2 Calcul des résultats individuels en utilisant l'étalonnage avec un étalon externe . 18
12.3 Calcul des résultats individuels en utilisant l'étalonnage avec un étalon interne . 18
13 Expression des résultats . 18
14 Rapport d'essai . 19
Annexe A (informative) Données de performance . 20
Annexe B (informative) Exemples de taux de récupération . 26
Annexe C (informative) Exemples de colonnes HPLC et de chromatogrammes . 28
Annexe D (informative) Exemples de détection . 34
Annexe E (informative) Exemples d'extension de la méthode . 37
Bibliographie . 39
Avant-propos . viii
Introduction . ix
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 4
3 Termes et définitions . 4
4 Principe . 5
5 Interférences . 5
5.1 Pendant la préparation de l'échantillon . 5
5.2 Pendant la chromatographie en phase liquide haute performance et la
spectrométrie de masse . 5
6 Réactifs . 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Préparation des solutions . 6
7 Appareillage . 8
8 Échantillonnage . 9
9 Mode opératoire . 9
9.1 Généralités . 9
9.2 Préparation des échantillons . 10
9.3 Chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) . 10
9.4 Détection . 11
9.4.1 Généralités . 11
9.4.2 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) . 11
9.4.3 Spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) . 12
9.5 Détermination des valeurs de blanc . 12
10 Étalonnage . 12
10.1 Généralités . 12
10.2 Étalonnage avec un étalon externe . 14
10.3 Étalonnage avec un étalon interne . 14
11 Calcul du taux de récupération . 15
11.1 Généralités . 15
11.2 Calcul du taux de récupération avec des échantillons . 16
11.3 Rendement d'extraction des étalons internes . 16
12 Évaluation . 16
12.1 Vérification des substances individuelles . 16
12.2 Calcul des résultats individuels en utilisant l'étalonnage avec un étalon externe . 18
12.3 Calcul des résultats individuels en utilisant l'étalonnage avec un étalon interne . 18
13 Expression des résultats. 18
14 Rapport d'essai . 19
Annexe A (informative) Données de performance . 20
Annexe B (informative) Exemples de taux de récupération . 26
vi © ISO 2018 – Tous droits réservés
Annexe C (informative) Exemples de colonnes HPLC et de chromatogrammes . 28
Annexe D (informative) Exemples de détection . 34
Annexe E (informative) Exemples d'extension de la méthode . 37
Bibliographie . 39
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en
général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit
de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales
et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la
normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l'élaboration
du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de brevets reçues par
l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
le lien suivant : www.iso.org/iso/fr/avant-
techniques au commerce (OTC), voir
proposwww.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 2,
Méthodes physiques, chimiques et biochimiques.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse www.iso.org/fr/members.html.
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Introduction
Les composés pharmaceutiques sont essentiels pour la santé humaine et animale. Au moment de
l'application ou du fait d'une élimination inappropriée, les principes actifs pharmaceutiques pénètrent le
cycle de l'eau, avec ou sans transformation. Cela peut se produire par le biais des eaux usées municipales,
traitées dans les stations de traitement. En effet, certains principes actifs pharmaceutiques et leurs
produits de transformation ne sont pas complètement éliminés des eaux usées par les traitements
classiques. Les principes actifs pharmaceutiques et leurs produits de transformation sont ainsi transférés
dans le sol par les boues, et pénètrent ensuite les masses d'eau par lessivage, en fonction de la nature du
sol et des principes actifs. Des principes actifs pharmaceutiques et leurs produits de transformation se
trouvent ainsi dans les eaux usées traitées, ainsi que dans les eaux de surface et souterraines. Le présent
document spécifie une méthode par chromatographie en phase liquide avec détection par spectrométrie
de masse pour la détermination de la fraction dissoute des principes actifs pharmaceutiques sélectionnés
et de leurs produits de transformation.
NORME INTERNATIONALE ISO 21676:2018(F)
Qualité de l'eau — Détermination de la fraction dissoute des
principes actifs pharmaceutiques sélectionnés, de leurs
produits de transformation et d'autres substances organiques
dans les eaux et les eaux résiduaires — Méthode par
chromatographie en phase liquide haute performance et
détection par spectrométrie de masse (HPLC--MS/MS ou -
HRMS) après injection directe
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur du présent document connaisse bien les pratiques
courantes de laboratoire. Le présent document n'a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité
qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il est de la responsabilité de l'utilisateur de mettre en place
des mesures de sécurité et d'hygiène appropriées.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais effectués conformément au présent document
soient réalisés par du personnel ayant reçu une qualification appropriée.
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la fraction dissoute des principes actifs
pharmaceutiques sélectionnés et de leurs produits de transformation, ainsi que d'autres substances
organiques (voir Tableau 1), dans l'eau potable, les eaux souterraines, les eaux de surface et les eaux
usées traitées.
La gamme d'application basse de la présente méthode peut varier selon la sensibilité de l'équipement
utilisé et la matrice de l'échantillon. Pour la plupart des composés concernés par le présent document, la
gamme est ≥ 0,025 µg/l pour l'eau potable, les eaux souterraines et les eaux de surface, et ≥ 0,050 µg/l
pour les eaux usées traitées.
La présente méthode peut être utilisée pour déterminer d'autres substances organiques ou pour d'autres
types d'eaux (par exemple, l'eau de process), à condition que l’exactitude ait été testée et vérifiée dans
chaque cas, et que les conditions de conservation des échantillons et des solutions de référence aient été
validées. Le Tableau 1 indique les substances pour lesquelles la présente méthode a été appliquée. Le
Tableau E.1 fournit d’autres exemples de substances organiques pour lesquelles la présente méthode
peut être utilisée.
NORME INTERNATIONALE ISO 21676:2018(F)
Tableau 1 — Substances pour lesquelles la présente méthode a été appliquée
b
Nom commun Formule Masse Numéro CAS
a
Nom chimique (IUPAC ) brute molaire
g/mol
4-Acétylaminoantipyrine
C H N O 245,28 83-15-8
13 15 3 2
N-(2,3-Dimethyl-5-oxo-1-phenyl-3-pyrazolin-4-yl)acetamide
N4-Acétyl sulfaméthoxazole
C H N O S 295,32 21312-10-7
12 13 3 4
N-{4-[(5-Methyl-1,2-oxazol-3-yl)sulfamoyl]phenyl}-acetamide
Acide diatrizoïque (acide amidotrizoïque)
C H I N O 613,91 117-96-4
11 9 3 2 4
3,5-Bis(acetamido)-2,4,6-triiodobenzoic acid
Aténolol
C H N O 266,34 29122-68-7
(RS)-2-[4-[2-Hydroxy-3-(1-methylethylamino) 14 22 2 3
propoxy]phenyl]ethanamide
Bézafibrate
C19H20ClNO4 361,80 41859-67-0
2-{4-[2-(4-Chlorbenzamido)ethyl]phenoxyl}-2-
methylpropanoic acid
Bisoprolol
C H NO 325,45 66722-44-9
(RS)-1-[4-(2-Isopropoxyethoxymethyl)phenoxy]-3- 18 31 4
isopropylamino-2-propanol
Carbamazépine
C H N O 236,27 298-46-4
15 12 2
5H-Dibenzo[b,f]azepine-5-carbamide
Clarithromycine
(2R,3R,4S,5R,8R,9S,10S,11R,12R,14R)-11-[(2S,3R,4S,6R)-4-
(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-ethyl-3,4-
C H NO 747,95 81103-11-9
38 69 13
dihydroxy-9-[(2R,4R,5S,6S)-5-hydroxy-4-methoxy-4,6-dimethyl-
oxan-2-yl]oxy-12-methoxy-2,4,8,10,12,14-hexa-
methyl-6-oxacyclotetradecane-1,7-dione
Acide clofibrique
C H ClO 214,70 882-09-7
10 11 3
2-(4-Chlorophenoxy)-2-methylpropanoic acid
Déhydro-érythromycine (anhydro-érythromycine)
(érythromycine-H2O)
(2R,3R,4S,5S,8R,9S,10S,11R,12R)-11-{[4-(dimethylamino)-3-
C H NO 715,91 23893-13-2
hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}-5-ethyl-3-hydroxy-9-[(5- 37 65 12
hydroxy-4-methoxy-4,6-dimethyloxan-2-yl)oxy]-2,4,8,10,12,14-
hexamethyl-6,15,16-trioxatricyclo[10.2.1.1{1,4}]hexadecane-7-
one
Diazépam
C H ClN O 284,74 439-14-5
16 13 2
(RS)-7-Chlor-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4-
benzodiazepine-2-on
Diclofénac
C14H11Cl2NO2 296,15 15307-86-5
2-[2-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]acetic acid
10,11-Dihydro-10,11-dihydroxy carbamazépine
C H N O 270,29 58955-93-4
(5S,6S)-5,6-Dihydroxy-5,6-dihydrobenzo[b][1]benzazepie-11- 15 14 2 3
carboxamide
Érythromycine C37H67NO13 733,93 114-07-8
6-(4-Dimethylamino-3-hydroxy-6-methyl-oxan-2-yl)oxy-14-
ethyl-7,12,13-trihydroxy-4-(5-hydroxy-4-methoxy-4,6-
dimethyl-oxan-2-yl)-oxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-1-
oxacyclotetradecane-2,10-dione
4-Formylaminoantipyrine
C H N O 231,25 1672-58-8
N-(2,3-Dihydro-1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-1H-pyrazol-4- 12 13 3 2
yl)formamide
Gemfibrozil
C H O 250,34 25812-30-0
15 22 3
5-(2,5-Chlorophenoxy)-2,2-methylpropanoic acid
Ibuprofène
C H O 206,28 15687-27-1
13 18 2
(RS)-2-[4-(2-Methylpropyl)phenyl]propanoic acid
Ioméprol
C H I N O 777,09 78649-41-9
17 22 3 3 8
(±)-N,N′-Bis-(2,3-dihydroxypropyl)-5-[(2-hydroxy-
acetyl)methylamino]-2,4,6-triiodo isophthalamideisophtalamide
Iopamidol
(S)-N,N′-Bis[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-[(2-
C H I N O 777,08 60166-93-0
17 22 3 3 3
hydroxypropanoyl)amino]-2,4,6-triiodobenzene-1,3-
dicarbamide
Iopromide
(±)-N,N′-Bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodo-5-
C H I N O 791,12 73334-07-3
18 24 3 3 8
(2-methoxyacetamido)-N-
methylisophthalamidemethylisophtalamide
Métoprolol
C15H25NO3 267,36 37350-58-6
(RS)-1-(Isopropylamino)-3-[4-(2-methoxyethyl)
phenoxy]propan-2-ol
Naproxène
C H O 230,26 22204-53-1
14 14 3
(S)-2-(6-Methoxy-2-naphthylnaphtyl)propanoic acid
Oxazépam
C H ClN O 286,71 604-75-1
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-5-phenyl-1,3-dihydro-2H-1,4- 15 11 2 2
benzodiazepin-2-on
Phénazone
C H N O 188.,23 60-80-0
11 12 2
1,5-Dimethyl-2-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrazol-3-on
Primidone
C H N O 218,25 125-33-7
12 14 2 2
5-Ethyl-5-phenylhexahydropyrimidin-4,6-dione
Propyphénazone
C H N O 230,31 479-92-5
1,5-Dimethyl-4-(1-methylethyl)-2-phenyl-1,2-dihydro-3H- 14 18 2
pyrazol-3-one
Roxithromycine
(3R,4S,5S,6R,7R,9R,11S,12R,13S,14R)-6-{[(2S,3R,4S,6R)-4-
(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}-14-ethyl-
C41H76N2O15 837,05 80214-83-1
7,12,13-trihydroxy-4-{[(2R,4R,5S,6S)-5-hydroxy-4-methoxy-4,6-
dimethyloxan-2-yl]oxy}-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-10-(2,4,7-
trioxa-1-azaoctan-1-ylidene)-1-
oxacyclotetradecane-2-one
Sotalol C H N O S 272,36 3930-20-9
12 20 2 3
(RS)-4′-(1-Hydroxy-2-isopropylaminoethyl)
methanesulfonanilide
Sulfaméthoxazole
C H N O S 253,28 723-46-6
10 11 3 3
4-Amino-N-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzene-sulfonamide
Témazépam
C H ClN O 300,74 846-50-4
(RS)-7-Chloro-3-hydroxy-1-methyl-5-phenyl-1,3-dihydro-2H- 16 13 2 2
1,4-benzodiazepin-2-one
Triméthoprime
C H N O 290,32 738-70-5
14 18 4 3
2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)pyrimidine
a
IUPAC : Union internationale de chimie pure et appliquée.
b
Numéro CAS : Numéro de registre du Chemical Abstracts Service.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu'ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
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éventuels amendements).
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 4796--2, Verrerie de laboratoire — Flacons — Partie 2 : Flacons à col conique
ISO 5667--4, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 4 : Lignes directrices pour l'échantillonnage
des eaux des lacs naturels et des lacs artificiels
ISO 5667--5, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 5 : Lignes directrices pour l'échantillonnage de
l'eau potable des usines de traitement et du réseau de distribution
ISO 5667--6, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 6 : Lignes directrices pour l'échantillonnage
des rivières et des cours d'eau
ISO 5667--10, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 10 : Lignes directrices pour l'échantillonnage
des eaux résiduaires
ISO 5667--11, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 11 : Lignes directrices pour l'échantillonnage
des eaux souterraines
ISO 8466--1, Qualité de l'eaul’eau — Étalonnage et évaluation des méthodes d'analysed’analyse et
estimation des caractères de performance — Partie 1 : Évaluation statistique de la fonction linéaire
d'étalonnaged’étalonnage
3 Termes et définitions
Aucun terme n'est défini dans le présent document.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes :
— ISO Online browsing platform : disponible à l'adresse https://www.iso.org/obp
— IEC Electropedia : disponible à l'adresse
http://www.electropedia.org/https://www.electropedia.org/
4 Principe
L'échantillon d'eau est injecté directement dans le système d'analyse. L'identification et la détermination
quantitative sont réalisées en associant la chromatographie en phase liquide haute performance et la
détection par spectrométrie de masse (HPLC-MS/MS ou HPLC-HRMS).
5 Interférences
5.1 Pendant la préparation de l'échantillon
Des pertes d'analytes peuvent avoir lieu pendant la filtration de l'échantillon à cause de la sorption.
5.2 Pendant la chromatographie en phase liquide haute performance et la spectrométrie
de masse
Les traînées de pics, les diffusions frontales et/ou les pics larges indiquent un dysfonctionnement du
système HPLC et/ou la présence d'interférences pendant l'analyse chromatographique. Toutefois,
certains composés ont tendance à présenter davantage de traînées de pics que d'autres, en fonction des
conditions chromatographiques.
Des interférences dues aux substances concomitantes (matrice) peuvent se produire à la fois avec
l'ionisation positive et négative, selon le composé analysé (par exemple, le diclofénac en mode ESI
négatif).
Les substances concomitantes (matrice) peuvent affecter l'ionisation des substances cibles (par exemple,
suppression d'ions ou exaltation du signal). Cela peut donner lieu à une sous-estimation ou à une
surestimation de la concentration lors de la quantification. Ces interférences peuvent être détectées et
corrigées de manière adéquate en utilisant le taux de récupération de l'analyte (11.2 et Annexe B) et/ou
un étalonnage interne (10.3 et Tableau D.3).
6 Réactifs
6.1 Généralités
S'ils sont disponibles, des réactifs de qualité « pour analyse » ou « pour analyse de résidus » sont utilisés.
La quantité d'impuretés contribuant à la valeur de blanc ou à l'origine d'une interférence dans le signal
doit être négligeable. Cela doit être vérifié régulièrement (voir 9.5).
Les solvants, l'eau et les réactifs prévus comme agents d'élution doivent être compatibles avec la HPLC et
la spectrométrie de masse.
NOTE Les qualités de solvants ultra purs applicables pour cette utilisation sont disponibles dans le commerce.
6.1.1 Eau, respectant les exigences de l'ISO 3696, de qualité 1 ou équivalente, exempte d'interférence
dans le blanc.
6.1.2 Méthanol, CH OH.
6.1.3 Acétonitrile, CH CN.
6.1.4 Acide acétique, w(CH COOH) = 100 % de la fraction massique.
6.1.5 Acide formique, w(HCOOH) au moins 98 % de la fraction massique.
6.1.6 Acétate d'ammonium, w(CH COONH ) au moins 99 % de la fraction massique.
3 4
6.1.7 Formiate d'ammonium, w(HCOONH ) au moins 99 % de la fraction massique.
6.1.8 Thiosulfate de sodium pentahydraté, Na S O ·5H O.
2 2 3 2
6.1.9 Gaz pour le spectromètre de masse, conformes aux spécifications du fabricant de l'instrument.
6.1.10 Étalons de référence, selon les indications du Tableau 1, avec une fraction massique connue.
6.1.11 Étalons internes, de préférence les composés marqués avec un isotope (voir Tableau D.3) des
étalons de référence.
Les étalons internes ne doivent pas provoquer d'interférences avec les analytes (voir 9.5).
6.2 Préparation des solutions
6.2.1 Généralités
Les solutions des étalons internes sont nécessaires seulement une fois que l'étalonnage et l'évaluation
ont été réalisés conformément au 10.3 et au 12.3.
Tester la justesse des solutions d’étalon de référence en les comparant à un étalon de contrôle (voir 6.2.9),
par exemple pendant l'étalonnage (voir 10.1).
NOTE Des solutions d’étalon de référence et des étalons internes sont disponibles dans le commerce.
6.2.2 Solutions mères (étalons de référence/étalons internes)
Préparer les solutions avec une concentration massique de 0,1 mg/ml de chaque substance, par exemple.
Pour cela, utiliser, par exemple, 5 mg d'une substance (6.1.10) dans différentes fioles jaugées
de 50 ml (7.2), les dissoudre dans l'acétonitrile (6.1.3) ou le méthanol (6.1.2), puis ajouter du solvant
jusqu'à la marque.
NOTE Sinon, il est possible d'utiliser des solutions mères des étalons de référence (ou des étalons internes)
individuelles du commerce (ou sur mesure) dans un solvant organique, pour préparer les dilutions nécessaires.
Stocker les solutions à une température inférieure à -−15 °C et les protéger de la lumière et de
l'évaporation. Dans ces conditions, elles sont stables pendant un an.
6.2.3 Dilution intermédiaire A (étalons de référence)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 1 µg/ml de chaque substance,
par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de chaque solution mère d’étalon de référence (voir
6.2.2) dans une fiole jaugée de 50 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'acétonitrile (6.1.3) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température inférieure à -−15 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle reste stable pendant un an.
6.2.4 Dilution intermédiaire B (étalons de référence)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 50 ng/ml de chaque
substance, par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de la dilution intermédiaire A (voir 6.2.3) dans une fiole
jaugée de 10 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'eau (6.1.1) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température entre 2 °C et 8 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un mois.
Utiliser cette solution pour doper les échantillons avec les analytes, pour déterminer les taux de
récupération (voir 11.2).
6.2.5 Dilution intermédiaire C (étalons de référence)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 5 ng/ml de chaque substance,
par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,25 ml de la dilution intermédiaire A (voir 6.2.3) dans une fiole
jaugée de 50 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'eau (6.1.1) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température entre 2 °C et 8 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un mois.
6.2.6 Dilution intermédiaire D (étalons internes)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 1 µg/ml de chaque substance,
par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de chaque solution mère d'étalon interne (voir 6.2.2)
dans une fiole jaugée de 50 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'acétonitrile (6.1.3) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température inférieure à -−15 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un an.
6.2.7 Dilution intermédiaire E (étalons internes)
Préparer une solution intermédiaire avec des concentrations massiques de 50 ng/ml de chaque
substance, par exemple.
Cela implique de transférer, par exemple, 0,5 ml de la dilution intermédiaire D (voir 6.2.6) dans une fiole
jaugée de 10 ml (7.2), puis de remplir la fiole d'eau (6.1.1) jusqu'à la marque.
Stocker la solution à une température entre 2 °C et 8 °C et la protéger de la lumière et de l'évaporation.
Dans ces conditions, elle est stable pendant un mois.
Utiliser cette solution pour préparer les solutions d'étalonnage et les échantillons dopés.
6.2.8 Solutions d'étalonnage
Préparer les solutions d'étalonnage à partir des dilutions correspondantes de la dilution intermédiaire C
(voir 6.2.5). Pour l'étalonnage interne (voir 10.3), ajouter la même quantité d'étalons internes à chaque
solution d'étalonnage.
Préparer les solutions d'étalonnage, par exemple des solutions dans lesquelles les substances à
déterminer ont une concentration massique de 0,025 µg/l et les étalons internes une concentration
massique de 0,250 µg/l (voir 10.1).
Cela implique de transférer, par exemple, 50 µl de la dilution intermédiaire C (voir 6.2.5) dans une fiole
jaugée de 10 ml, d'y ajouter 50 µl de la dilution intermédiaire E (voir 6.2.7), puis de remplir la fiole jusqu'à
la marque avec, par exemple, de l'eau (6.1.1).
Si possible, il convient que la composition des solutions d'étalonnage soit semblable à celle des
échantillons à analyser et elle ne doit pas entraîner d'élargissement parasite des pics. En cas d'utilisation
d'eau potable, d’eaux souterraines ou de surface pour la préparation des solutions d'étalonnage, vérifier
qu’elles ne contiennent aucune des substances à analyser.
NOTE Si les solutions d'étalonnage sont préparés dans de l'eau ultra pure, les résultats des macrolides peuvent
être plus faibles. Dans ce cas, l'utilisation d'eau ultra pure n'est pas privilégiée, utiliser plutôt un étalonnage en
matrice.
Préparer des nouvelles solutions d'étalonnage pour chaque nouvelle séquence de mesure, si leur stabilité
ne peut pas être vérifiée.
6.2.9 Étalon de contrôle
L'étalon de contrôle est une solution d’étalon de référence produite indépendamment des solutions
mères, par exemple une solution provenant d'un autre lot ou d'un autre fabricant. Il convient que la
solution contienne toutes les substances à déterminer.
7 Appareillage
L'équipement ou les parties d'équipements en contact avec l'échantillon d'eau ne doivent présenter
aucune valeur de blanc pour les composés mesurés selon la présente méthode. Il convient que tout
l'équipement utilisé soit de préférence en verre, en acier inoxydable ou en polytétrafluoroéthylène
(PTFE).
7.1 Flacons à fond plat et à col étroit, de préférence en verre brun à joint conique avec bouchon en
verre, par exemple des flacons de laboratoire d'un volume de 250 ml, conformément à l'ISO 4796-2 —
NS 250.
7.2 Fioles jaugées, d'un volume nominal de 10 ml, 25 ml, 50 ml, par exemple des fioles jaugées selon
l'ISO 1042 — A50-C.
7.3 Microseringues
7.4 Filtres à seringue, avec un faible volume mort, par exemple avec un diamètre de 13 mm et une
membrane en cellulose régénérée.
Il convient que la filtration n'entraîne pas de perte significative des substances individuelles et le type de
filtre utilisé doit être choisi selon ce critère. Vérifier qu'aucune contamination ou perte significative n'a
lieu pendant la filtration en filtrant des blancs et des solutions d’étalon de référence avec les mêmes
filtres.
7.5 Flacons, appropriés pour un passeur d'échantillons automatique, par exemple un flacon à sertir
d'un volume nominal de 1,5 ml avec un bouchon serti et un septum en caoutchouc/PTFE.
NOTE Des flacons en polyéthylène (PE) peuvent être utilisés pour réduire autant que possible les pertes de
macrolides, dans une séquence analytique supplémentaire.
7.6 Colonne HPLC, de préférence avec une précolonne, adaptée à l'analyse chromatographique des
substances d’intérêt. Voir l'Annexe C pour des exemples.
7.7 Système de chromatographie en phase liquide haute performance, couplé à un spectromètre
de masse, constitué des éléments suivants.
7.7.1 Unité de dégazage, par exemple un appareil de dégazage par le vide.
7.7.2 Systèmes de pompage de qualité analytique, faibles pulsations, adéquats pour un gradient
d'élution binaire.
7.7.3 Passeur d’échantillons manuel ou automatique.
7.7.4 Appareil de contrôle du thermostat de la colonne de séparation, par exemple un thermostat
de colonne.
7.7.5 Détecteur par spectrométrie de masse (MS/MS, HRMS), de préférence avec ionisation par
électrospray (ESI).
8 Échantillonnage
Prélever les échantillons selon les spécifications de l'ISO 5667-4, ISO 5667-5, ISO 5667-6, ISO 5667-10 et
ISO 5667-11.
Utiliser des flacons à fond plat (7.1) pour l'échantillonnage et remplir les flacons avec l'eau à analyser.
En cas de prélèvement d'eau potable pouvant contenir des oxydants, ajouter aussi environ 50 mg de
thiosulfate de sodium pentahydraté (6.1.8) par litre.
Analyser l'échantillon d'eau le plus tôt possible après l'échantillonnage.
Conserver l'échantillon à une température de (3 ± 2) °C, à l'abri de la lumière, pendant trois semaines au
maximum.
NOTE Si une durée de conservation plus longue est nécessaire et/ou en cas d'instabilité présumée ou validée
des substances individuelles, des mesures adéquates peuvent être appliquées (par exemple, conservation par
congélation des échantillons).
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
L'application de la méthode dépend du type d'étalonnage et des mesures prévues pour identifier et, si
nécessaire, corriger les effets matrice.
9.2 Préparation des échantillons
Si l'échantillon n'est pas visiblement exempt de particules, filtrer l'échantillon avec un filtre à
seringue (7.4).
Pendant la filtration de l'échantillon, la sorption peut provoquer une perte d'analytes, en particulier pour
les substances hydrophobes (par exemple, les macrolides). Dans ce cas, ne pas filtrer l'échantillon avant
l'analyse, mais utiliser un filtre en ligne comme alternative pour protéger la colonne de séparation contre
les particules.
Si l'étalonnage est effectué au moyen d'un étalon externe, (voir 10.2), utiliser une aliquote de l'échantillon
pour déterminer le taux de récupération si nécessaire (voir 11.2).
Si l'étalonnage est effectué au moyen d'un étalon interne (voir 10.3), ajouter les étalons internes de telle
manière que les concentrations massiques des étalons internes dans l'échantillon soient égales à celles
présentes dans les solutions d'étalonnage (voir 6.2.8).
Tenir compte de la dilution de l'échantillon provoquée par l'ajout de réactifs, lors du calcul des résultats
individuels (voir 12.2) si cet ajout s'élève à plus de 1 %.
Surveiller les substances dont l'élution est rapide, par exemple la metformine (voir Tableau E.1), pour en
observer le temps de rétention et la forme du pic. La quantité de solvants organiques dans un échantillon
préparé ne doit pas provoquer d'élargissement supplémentaire des pics.
9.3 Chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC)
Utiliser l’équipement HPLC conformément aux instructions du fabricant.
Utiliser une colonne HPLC (7.6) pour la séparation chromatographique et optimiser la séparation des
analytes avec un gradient d’élution.
Choisir les conditions chromatographiques qui permettent d'optimiser la sensibilité pour la détection par
spectrométrie de masse (voir exemples à l'Annexe C).
NOTE 1 L'utilisation de gradients avec acétonitrile/eau/acide acétique est avantageuse en termes de sensibilité,
pour la plupart des substances.
NOTE 2 Pour un même débit linéaire de l'éluant, les colonnes dont le diamètre intérieur est faible présentent
une meilleure sensibilité que celles dont le diamètre est plus élevé.
La séparation complète des substances n'est pas nécessaire si le chevauchement de pics n’interfère pas
sur la détermination quantitative des substances.
Le temps de rétention le plus court doit correspondre au minimum à trois fois le temps du volume mort
de la colonne HPLC.
Utiliser la chromatographie pour séparer les substances qui ne peuvent pas être séparées complètement
les unes des autres par la spectrométrie. Dans ce cas, il convient que la résolution chromatographique R
soit de R = 1,2 au minimum.
Choisir un volume d'injection approprié pour empêcher tout élargissement parasite des pics ou toute
interférence sur la détermination quantitative.
NOTE 3 Pour les grands volumes d'injection, par exemple 1 ml, il est possible de recourir à des techniques de
commutation de colonne avec des colonnes d'enrichissement adaptées, mais celles-ci sont en dehors du domaine
d'application de la présente méthode.
Vérifier l'écart-type du temps de rétention, une fois pendant l'évaluation initiale. Il ne doit pas dépasser
0,03 min pour six chromatogrammes consécutifs.
9.4 Détection
9.4.1 Généralités
Utiliser le spectromètre de masse conformément aux instructions du fabricant et choisir les réglages
adéquats pour l'appareil.
Le mode ESI est privilégié pour l’ionisation des substances. Il produit habituellement des ions quasi-
+ ⎺ +
moléculaires de type [M+H] ou [M-H] . Dans des cas isolés, des ions adduits, par exemple [M+NH ] ou
+
[M+Na] , peuvent aussi se former dans certaines conditions chromatographiques.
La plupart des substances du Tableau 1 peuvent être détectées en mode ESI positif. Les substances à
détecter en mo
...
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