ISO 23611-4:2022
(Main)Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes
Soil quality — Sampling of soil invertebrates — Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting nematodes
This document specifies a method for sampling and handling free-living nematodes from terrestrial field soils as a prerequisite for using them as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a habitat for organisms). This document applies to all terrestrial biotopes in which nematodes occur. The sampling design of field studies in general is specified in ISO 18400-101. This document is not applicable to aquatic nematodes because of differences in the sample matrix (e.g. water column). Methods for some other soil organism groups such as earthworms, collembolans enchytraeids or macro-invertebrates are covered in ISO 23611-1, ISO 23611-2, ISO 23611-3 and ISO 23611-5. This document does not cover the pedological characterization of the site which is highly recommendable when sampling soil invertebrates. ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461 and ISO 11465 include suitable procedures for measuring pH, particle size distribution, C/N ratio, organic carbon content and water-holding capacity.
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol — Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du sol
Le présent document spécifie une méthode pour échantillonner et manipuler les nématodes du sol en tant que condition préalable pour les utiliser comme bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la qualité d’un sol en tant qu’habitat pour des organismes). Le présent document s’applique à tous les biotopes terrestres dans lesquels des nématodes sont présents. Le mode opératoire d’échantillonnage pour les études de terrain est spécifié de façon générale dans l’ISO 18400-101. Le présent document n’est pas applicable aux nématodes aquatiques en raison des différences dans la matrice d’échantillonnage (par exemple, la colonne d’eau). Des méthodes destinées à certains autres groupes d’organismes tels que les vers de terre, les collemboles, les enchytréides ou les macro-invertébrés, sont décrites dans l’ISO 23611-1, l’ISO 23611-2, l’ISO 23611-3 et l’ISO 23611-5. Le présent document ne couvre pas la caractérisation pédologique du site qui est particulièrement recommandée lors du prélèvement d’invertébrés du sol. L’ISO 10390, l’ISO 10694, l’ISO 11272, l’ISO 11274, l’ISO 11277, l’ISO 11461 et l’ISO 11465 décrivent des modes opératoires appropriés pour mesurer le pH, la répartition granulométrique, le rapport C/N, la teneur en carbone organique et la capacité de rétention en eau.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23611-4
Second edition
2022-08
Soil quality — Sampling of soil
invertebrates —
Part 4:
Sampling, extraction and
identification of soil-inhabiting
nematodes
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 4: Prélèvement, extraction et identification des nématodes du
sol
Reference number
© ISO 2022
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 3
6 Apparatus . 3
6.1 Sampling . 3
6.2 Extraction . 4
6.3 Counting . 4
6.4 Fixation and preparation of mass slides . 5
6.5 Identification . 5
7 Procedure .5
7.1 General . 5
7.2 Sampling . 5
7.3 Extraction . 6
7.4 Counting . 7
7.5 Fixation and preparation of mass slides . 8
7.6 Identification . 8
8 Data assessment .8
9 Test report . 9
Annex A (informative) Figures of equipment and methods for nematological research .11
Annex B (informative) Information about the availability of the Oostenbrink elutriator .14
Annex C (informative) Information about the Baermann funnel/tray extraction method .17
Annex D (informative) Examples of the use of soil invertebrates in soil monitoring
programmes (including presentation of their results) .19
Bibliography .24
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/
iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with
the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 23611-4:2007), which has been
technically revised. The main changes are as follows:
— examples of the use of nematodes in soil monitoring programmes have been added (including
presentation of their results) as an informative annex (see Annex D).
A list of all parts in the ISO 23611 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
This document has been drawn up since there is a growing need for the standardization of terrestrial
zoological field methods. Such methods, mainly covering the sampling, extraction and handling of soil
invertebrates, are necessary for the following purposes:
[37],[42],[57]
— biological classification of soils including soil quality assessment ;
[25],[28],[31],[50]
— terrestrial bio-indication and long-term monitoring ;
[4]
— evaluation of the effects of chemicals on soil animals in the field (see ISO 11268-3 ).
Data for these purposes are gained by standardized methods since they can form the basis for far-
reaching decisions (e.g. whether a given site should be remediated or not). In fact, the lack of such
standardized methods is one of the most important reasons why bio-classification and bio-assessment
in terrestrial (i.e. soil) habitats has so far been relatively rarely used in comparison to aquatic sites.
Nematodes are an important and major part of the soil fauna. Some authors estimate that this group
[52]
is probably the most dominant one of the multicellular organisms (Metazoa) on earth . Nematodes
occur from the Antarctic to the tropics and from deep sea sediments to mountain regions. They are
active in every place with sufficient water and organic material. The species diversity and functional
[14]
variety are impressive . Nematodes are commonly known as parasites of animals and plants, but the
major part of the nematode fauna participates in decomposition processes by feeding on bacteria and
fungi.
6 -2 6 -2
Nematodes occur in high numbers (0,2 × 10 m to 9 × 10 m ) and with a high (10 to 100 species)
[12]
diversity in almost every soil sample . Moreover, there is a broad ecological spectrum of feeding types
and food web relations among the nematodes such as bacterivores, fungivores, herbivores, predators
[57],[58]
and omnivores . These factors make the group highly suitable as indicators for ecological soil
[56]
quality , but standardization of methods is urgently needed for comparison and combination of
results.
In the past 100 years, nematology has developed strongly from the viewpoint of agriculture, advisory
sampling and phytosanitary regulations because some terrestrial nematodes cause a lot of damage in
crops. With respect to methods, there are several “schools” in different parts of the world with their own
[14]
history, practical advantages and disadvantages. A comprehensive overview is given by Oostenbrink
[48],[49]
and Southey . The more recently described methods (or variants) are often developed with special
interest to certain plant parasitic species. Within the past 20 years new methods have evolved that
[21],[34],[54].
allow a DNA-based taxonomic identification of nematode species This opens the taxonomic
analysis of nematodes to a broader community of non-specialists.
[16]
Since Bongers introduced the Maturity Index, the use of nematodes in bio-indication for soil quality
[56]
has increased rapidly . Nematodes are now used for ecological soil research and monitoring in
several countries all over the world. Monitoring activities make special demands on methodology, for
instance, that a large number of soil samples is processed on a routine basis against reasonable costs.
Some of the methods originally developed for advisory sampling in agriculture are very suitable for
ecological research. They form the basis for specific variants described in this document.
The nematodes that are characterized by the proposed procedure are all the free-living forms of
nematodes found in soil. They include non-plant-feeding nematodes as well as ectoparasitic plant-
feeding nematodes and free-living stage of endoparasitic nematodes. The quantification of obligate
plant-feeding nematodes in roots requires specific methods. Basic information on the ecology of
nematodes and their use as bio-indicators can be found in the bibliography.
v
INTERNATIONAL STANDARD ISO 23611-4:2022(E)
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 4:
Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting
nematodes
1 Scope
This document specifies a method for sampling and handling free-living nematodes from terrestrial
field soils as a prerequisite for using them as bio-indicators (e.g. to assess the quality of a soil as a
habitat for organisms).
This document applies to all terrestrial biotopes in which nematodes occur. The sampling design of
field studies in general is specified in ISO 18400-101.
This document is not applicable to aquatic nematodes because of differences in the sample matrix
(e.g. water column). Methods for some other soil organism groups such as earthworms, collembolans
enchytraeids or macro-invertebrates are covered in ISO 23611-1, ISO 23611-2, ISO 23611-3 and
ISO 23611-5.
This document does not cover the pedological characterization of the site which is highly recommendable
when sampling soil invertebrates. ISO 10390, ISO 10694, ISO 11272, ISO 11274, ISO 11277, ISO 11461
and ISO 11465 include suitable procedures for measuring pH, particle size distribution, C/N ratio,
organic carbon content and water-holding capacity.
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp/
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
nematode
small, non-segmented free-living worm (up to a few millimetres in length) belonging to the class
Nematoda
Note 1 to entry: Nematodes without a soil-inhabiting stage are not included in this context.
3.2
location
study area or plot that is characterized based on the composition of (among others) the nematode fauna
3.3
bulk-sample
composite soil sample made out of many small soil cores to get an impression of the average nematode
composition
3.4
soil sampler
tool to collect soil material in a quick and standardized way
3.5
mass slide
microscopic slide on which 300 to 400 nematodes are mounted for species identification (3.7)
3.6
identification
determination of the species, genus or family of an individual based on morphological characteristics
(mouth parts, sexual organs, body ratios) with an identification key
3.7
colonizer–persister (cp) scale
ecological classification of nematodes
[16],[17]
Note 1 to entry: Proposed by Bongers .
Note 2 to entry: The principle is analogous to the r-K life strategies during succession, distinguished in
fundamental ecology. Non-plant-feeding nematode families are classified to one of the five cp-groups. This is also
the basis for the calculation of the Maturity Index.
4 Principle
Nematodes are collected in soil samples with a small cylindrical core (diameter: approximately 2 cm;
length: 10 cm or 15 cm) or an auger (see Figure A.2). For monitoring purposes, the soil samples are
combined in a bulk-sample from a homogeneous area. The total number of samples to be taken depends
on the investigated surface area and its homogeneity (e.g. pedology, land use, crop). The individual
samples can be gathered in the field in a standard plastic bag or plastic bucket. The combined bulk-
sample is too large for direct examination and therefore it is mixed and subsampled. In the field and
during transport to the laboratory, the soil samples shall be protected against strong fluctuations in
temperature, water-loss and heavy mechanical disturbance. They can be stored for at most four weeks
at 4 °C.
[49]
NOTE 1 The sampling method described above is derived from “the Dutch Method” for determining
the infestation of a field with potato-cyst nematodes, and has been used for many years in several European
countries.
The Oostenbrink funnel method is recommended for routine extractions of soil samples, for instance
in a monitoring network. The Oostenbrink method is not the simplest one that can be used under any
circumstance. However, it has several advantages: it is highly standardized and constant in extraction
efficiency. The Oostenbrink wet funnel method combines three basic means that can be used for the
separation of nematodes from soils: washing, sieving, active movement. Therefore, it obtains better
results than any one of the basic methods individually. Further advantages are given below:
— relatively large soil samples of any soil type can be treated at once (100 g to 500 g);
— clean nematode suspensions;
— isolation of most living and active nematodes;
— there are many years of experience with enormous amounts of routine soil extractions;
— it is used in many places around the world.
1)
After sampling, the nematodes are extracted from the soil using the Oostenbrink elutriator (model III)
(see Figure A.3 and Annex B). In this technique, an upward current of water separates the nematodes
[10],[33],[44],[49]
from soil particles and holds them in suspension while the heavier particles sink . This
suspension of nematodes and small particles passes through three sieves (mesh width: 45 μm). The
catch is washed from the sieves onto a cotton-wool filter (milk filter). The cotton-wool filter is mounted
on a supporting sieve and is placed in a dish with 100 ml of tap water. For three days, through their
active downwards movement, the nematodes separate themselves from the debris on the filter. Thus,
the living nematodes actively crawl through the filter in a dish with tap water.
After extraction, the nematodes are counted in 2 times 10 ml of the 100 ml suspension, then
concentrated, preserved and mounted on mass slides. Finally, at least 150 individuals or a fixed
percentage of the total number in the sample is identified under the microscope.
Mature nematodes can be identified to species level. However, populations in the soil are often
dominated by juveniles and the genera level of taxonomy is a practical (but less sensitive) way of
distinction.
[44]
Alternative extraction methods such as the Seinhorst elutriator , Baermann funnel (see Annex C)
can be useful under special circumstances, but are not recommended as general procedures because
the Oostenbrink elutriator is robust, easy to operate and usually quantitatively superior to most other
techniques. For preserved samples containing non-living organisms, the Oostenbrink elutriator method
is not suitable. Here, flotation/centrifugation methods using colloidal silica are recommended as they
[26]
allow the extraction of all the forms of nematodes .
NOTE 2 This document is not applicable for aquatic nematodes because these nematodes do not pass through
the filter. Special centrifugation techniques are available for sediment samples.
NOTE 3 Identification with a light microscope is based on morphological characteristics. In some cases, it is
not possible to recognize the specimen on species or even genus level, e.g. juveniles. New techniques, such as
[40],[54]
DNA barcoding or metabarcoding, offer a morphology-independent taxonomy, so that also juveniles can be
identified to genus or species level.
NOTE 4 The sampling of nematodes is often included in much broader monitoring programmes which try to
cover the whole soil fauna or parts of it (e.g. the mesofauna). Examples of the use of soil invertebrates are given in
Annex D. The design of such programmes is not included in this document.
5 Reagents
5.1 Formalin [formaldehyde solution, 60 ml/l].
5.2 Paraffin, with melting point near 60 °C.
6 Apparatus
Use standard laboratory equipment and the following.
6.1 Sampling
6.1.1 Soil sampler, of an open, closed or split-tube type.
EXAMPLE Grass plot sampler (diameter: 23 mm) or soil auger (see Figure A.2); commercially available.
6.1.2 Plastic bucket (collection of soil samples in the field).
1) Oostenbrink elutriator is the trade name of a product supplied e.g. by MEKU Erich Pollähne GmbH (https://
www .meku -pollaehne .de/ Nematologie/ Oostenbrink -Elutriator/ oostenbrink -elutriator .html). This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product
named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
6.1.3 Plastic container, for mixing of the bulk-sample.
6.1.4 Sieve, with 8 mm apertures.
6.1.5 Coated bags or plastic bags or glass vessels (transport and storage).
6.1.6 Permanent marker or pre-printed labels.
6.2 Extraction
6.2.1 Beaker, of capacity 100 ml to 250 ml.
6.2.2 Balance, able to weigh 1 kg to 25 kg, for weighing the total sample mass.
1)
6.2.3 Oostenbrink elutriator (see also Figure A.3, Annex B), metal funnel with an upward water
flow to separate nematodes from larger soil particles.
6.2.4 Three sieves, with 45 µm apertures and 30 cm diameters.
6.2.5 One sieve, with 250 µm apertures and a 10 cm diameter.
6.2.6 Plastic bowl, of capacity approximately 2 l.
6.2.7 Clamping ring.
6.2.8 Extraction sieve, with 1 000 µm apertures and 16 cm diameter.
6.2.9 Milk- or cotton-wool filters.
6.2.10 Shallow trays (Petri dishes) or special extraction dishes.
6.2.11 Glass vessel, of capacity 100 ml, with a screw-cap.
6.3 Counting
6.3.1 Dissecting microscope, 10× to 50× magnification.
6.3.2 Small counting dish with grid or glass slide with grid.
NOTE Counting dishes in several sizes and different grids are available from the manufacturers of laboratory
equipment. They can also be made out of small plastic Petri dishes by scratching a grid on the bottom with a
needle.
6.3.3 Simple hand counting device.
6.3.4 Aquarium pump, for mixing nematode suspensions.
6.3.5 Pipette (drop glass), with adjustable volume.
6.3.6 Handling needle.
6.3.7 Bottle, of volume 100 ml.
6.4 Fixation and preparation of mass slides
6.4.1 Water jet pump, for concentration of suspension.
6.4.2 Glass slides, 50 mm × 76 mm.
6.4.3 Cover glasses, 45 mm × 45 mm.
6.4.4 Electric heating plate.
6.4.5 Metal stamp, 40 mm × 40 mm, for paraffin seal on glass slides.
6.5 Identification
6.5.1 Microscope, magnification 400× to 1 000×.
6.5.2 Ocular micrometer indicator.
[15]
6.5.3 Identification keys .
6.5.4 Standard form, to list the identification results.
7 Procedure
7.1 General
For quality assurance, each sample shall be given a unique code from the moment it is taken in the
field. This code (label) shall stay with the sample during all the processing and analysis steps. Standard
(electronic) form(s) should be used to follow the routing of the samples and collection of analysis
results. These basic data may be combined in a spreadsheet or database file for further calculations and
statistical testing.
7.2 Sampling
While the density and diversity of soil nematodes are the highest in the top 10 cm of the mineral
soil, a grass plot sampler (6.1.1) with a 10 cm or 15 cm long sampling-tube is appropriate for most
biomonitoring purposes. It is recommended to use a closed tube with a fixed length and diameter.
EXAMPLE 1 A grass plot sampler consists of a stainless-steel gouge auger (available in different dimensions)
consisting of a steel auger pipe, a collecting bucket (6.1.2) and a stick with a steel handle. Because of the conical
shape of the pipe, the sample is easily pushed toward the collecting bucket when the next sample is taken. The
sample depth is constant and soil cores can be collected easily over a large area (see Figure A.1). This device can
be used in many situations.
EXAMPLE 2 Alternatively, a soil auger can be used as a simple, cheap and quick working device. Augers are
available in different diameters. Soil samples collected with an auger are less compressed. The disadvantage is
that soil material can be lost more easily (see Figure A.2).
EXAMPLE 3 When accurate separation of soil layers is required, a split-tube sampler can be used. This
sampling device needs more handling time and is less suited for large numbers of samples and large areas (see
Figure A.2).
Samples from deeper layers can be taken with an auger to avoid excessive soil compression, or special
split-tube samplers (see Figure A.2). Organic or litter material can be included in the samples, but it
increases the numbers of nematodes found, sometimes considerably. Organic layers may be sampled
independently. In this case, a wider split-tube corer (5 cm to 10 cm) is preferred in order to separate
the organic horizons from the mineral material. Small amounts of litter can also be treated in an
Oostenbrink elutriator (6.2.3) to extract the nematodes. Extraction efficiency can be enhanced by
[41],[43]
soaking and blending the organic parts .
When a representative sample is required from a specific type of ecosystem, a typical area of at least
2 2
5 000 m , and preferably 10 000 m , shall be selected. It is recommended to select an area which is
(more or less) homogeneous in terms of soil properties, vegetation and soil-use. The studied surface is
reported as part of the location information. As a rule of thumb, 100 soil cores shall be combined from
2 2
10 000 m . For smaller areas (e.g. 100 m ), approximately 25 cores are sufficient to get an impression
of the average nematode composition and to collect enough soil material. A denser sampling pattern
results in a higher accuracy in the estimation of nematode abundance and species composition. However,
there is a trade-off with the amount of subsample that is finally analysed from the homogenized
bulk soil sample. So, a very large bulk-sample does not give more information because only a small
part is analysed and homogenization cannot be completely perfect. Three hundred samples with a
grass plot sampler (diameter 23 mm) are recommended as a maximum for a composite bulk-sample.
In a biomonitoring programme, the sample density per surface area should preferably be equal in all
locations. The mass of the bulk-sample and the number of soil cores in it need to be known.
The sampling plan may be regular (grid), according to a pattern or random. For larger locations, it is
most practical to walk a zigzag pattern and take arbitrary samples along this route. In the case that a
location consists of different parcels, the number of soil samples shall be distributed over the parcels
based on their area. Samples from very atypical parts of the location such as ditches, tracks or pathways
shall be avoided.
The collected bulk-sample is homogenized in a plastic container (6.1.3). This can be done in the field
or laboratory, depending on the most practical way of working and transport. Mixing starts with
crumbling of the cores through an 8 mm aperture sieve (6.1.4). Subsequently, the soil is gently mixed
until the mass is uniform in colour and consistency. Mixing and preparation of the sample can take
more than an hour for bulk-samples from clay soils or densely rooted top soils. However, this step is
essential to all the analyses that are based on it and should be given enough attention. Coarse organic
material, roots and stones shall be removed. The final choice for details of working shall be specified in
the field sampling protocol, and again shall be uniform for the entire biomonitoring programme.
When the bulk-sample is homogenized, approximately one litre is taken out for further examination.
This can be done by several spoonful from different parts of the bulk to obtain a representative
subsample. Put the sample in a labelled plastic bag or glass vessel (6.1.5). At this point, more subsamples
can be taken from the bulk for other biotic and abiotic analyses. Soil samples for nematode analysis
shall be stored at 4 °C prior to extraction. The storage period should be kept as short as possible, four
weeks at the maximum. This temperature may not be optimal for all nematodes (e.g. Aphelenchoididae,
Anguinidae; see Reference [13]). In any case, the appropriate temperature shall be checked beforehand
when sampling outside of the holarctic region (e.g. in the tropics).
7.3 Extraction
Mix the soil (sub)sample from the field again before extraction and fill a beaker (6.2.1) with 100 ml
to 250 ml of soil. Weigh the sample in order to convert the results to a fresh-weight basis. In another
sub-part of the same soil sample, measure the soil humidity to express final density as a unit of soil dry-
weight. Store the remaining sample for abiotic analysis, unless material was collected separately in the
field from the same bulk-sample.
Prepare the Oostenbrink elutriator (6.2.3). Put the sample in the top sieve and wash the soil in the
elutriator. Specific water flow speeds depend on the type of funnel used. A detailed description of the
apparatus and the way to use it is given in References [10] and [49]. The latest version of the Oostenbrink
funnel has larger dimensions and is fully automated (see Figure A.5). It is suited for routine extraction
of large numbers of samples. The soil sample is washed into the funnel through the top sieve. When
the funnel is filled by the upward stream of water, the nematodes are separated from the heavier soil
particles.
NOTE 1 If for whatever reason an Oostenbrink elutriator is not available, the Baermann funnel/tray method
can be an alternative. Details concerning its use are given in Annex C.
Unplug the funnel when the water has reached the edge and catch the water flow on a pile of three
sieves with 45 µm pore size (6.2.4). An additional top sieve (6.2.5) can be mounted on the three sieves
(6.2.4) to catch large nematodes that do not pass the final cotton-wool filter step. This sieve (6.2.5) shall
be placed directly in an extraction dish (shallow tray filled with water) (6.2.10) and stored in a cabinet
for three days. At higher ambient temperatures, the cabinet should be humidified and kept away from
heat sources. The sieves (6.2.4) are rinsed with a gentle stream of water which is caught in a plastic
bowl (6.2.6). The suspension with the nematodes can be set aside for 15 min to 30 min, during which
time the nematodes settle to the bottom. It has the advantage that the supernatant water in the plastic
bowl can be poured out more quickly. Pour the content of the bowl over a double filter [e.g. cotton-wool
(milk)] (6.2.9), which is clipped onto an extraction sieve (6.2.8) with a clamping ring (6.2.7). Place the
extraction sieve (6.2.8) with debris in an extraction dish (6.2.10). The active nematodes in the debris
crawl through the filter (6.2.9) in the extraction dish (6.2.10) with 100 ml of tap water during a period
of three days. It is important that the filter (6.2.9) stays in contact with the water in the extraction dish
(6.2.10). If necessary, add tap water during the three-day period. After three days, both the 250 µm
pore size sieve (6.2.5) and the sieve with cotton-wool filters (6.2.9) are removed and the content of the
extraction dishes (6.2.10) can be poured into a glass vessel of 100 ml (6.2.11). Label the vessels with the
correct sample codes. Subsequently, the nematodes can be counted.
NOTE 2 Other filter material than a cotton-wool filter is acceptable as long as it has been shown that its
properties equal those of cotton wool with respect to nematode extraction (i.e. no change in pore size after
absorption of water).
NOTE 3 This method allows the user to extract only mobile forms. Therefore, the count does not take into
account the motionless forms (eggs, dead organisms in the soil). This type of extraction does not give the exact
value of the number of nematodes (at any stage of development) at the time of the extraction. For preserved
samples containing non-living organisms, this method is not suitable (see Clause 4).
NOTE 4 The last extraction phase lasts for a period of three days. In this step, the cotton-wool filters (in a
supporting sieve) are placed in a shallow dish with 100 ml tap water. Experimental results show that 59 % of
[53]
the nematodes crawl out during the first 24 h, 73 % after two days, and 82 % are caught after three days .
These numbers are based on a comparison with the nematodes found after seven days. For practical reasons, a
standard extraction period of three days is chosen. A longer extraction time has the disadvantages that the water
in the dishes evaporates, nematodes can die, and eggs present in the debris possibly hatch.
7.4 Counting
Before counting, combine the contents of the two vessels (6.2.11) containing the nematodes from one
soil sample. Wait at least 2 h to be sure that the nematodes have sunk to the bottom. Concentrate the
suspensions (decanting or suction) so that suspensions fit in one 100-ml bottle (6.3.7 or 6.2.11). If
necessary, add tap water to the vessel until it contains exactly 100 ml. Mix the suspension with air
(6.3.4) thoroughly (3 min to 5 min). Immediately afterwards, take out 10 ml mixed suspension with
a pipette (6.3.5) and put it in a counting dish (6.3.2). Do this in duplicate. Count the number (6.3.3)
of nematodes under a stereomicroscope (6.3.1) while moving the counting dish slowly around. The
result of the two counts shall be within 10 % difference. Otherwise, the suspension was probably not
homogenous enough and the counting procedure shall be repeated. Note the number of nematodes in
each counting dish on a standard form. The average number of the duplicate count, scaled up to 100 ml
suspension, is the estimation of the nematode abundance in the extracted amount (volume or weight)
of soil. Put the counted subsample back in the 100-ml bottle (6.3.7). Next, the nematodes shall be heat
killed and fixed with formalin (5.1).
The volume of the suspension in the vessels and the volume of the mixed suspension taken out with
the pipette for counting depend on the density of the nematodes in the vessels. Although a suspension
volume of 100 ml and the amount taken out for counting (10 ml) work well in most cases, this can be
changed. Almost all nematodes from the soil sample should be counted if the nematode density is very
low, while only 1 % of suspension may include already too many nematode individuals if the original
density in the soil is very high.
WARNING — Appropriate precautions should be taken when dealing with formalin to avoid
danger from inhalation or skin exposure (such as wearing gloves and handling the samples
in a fume cupboard). According to the “Material Safety Data Sheet” for formaldehyde 370 ml/l
solution as published by producing companies, the compound is a skin sensitizer and is
considered to be a carcinogen (humans: limited evidence; animals: sufficient evidence). It is
notified in industrialized countries and is allowed for scientific use.
7.5 Fixation and preparation of mass slides
If recently counted, let the nematodes sink to the bottom of the vessel for several hours. Meanwhile, the
suspension may be kept in a refrigerator at 4 °C. Concentrate the suspension until about 5 mm of water
is left in the vessel. This can be done with a small pipette (6.3.5) connected to a (water flow) vacuum
pump (6.4.1). A piece of plankton gauze, (10 µm pore size) stretched over the opening of the pipette,
prevents the loss of nematodes. Add approximately 10 ml of boiling water to the concentrated sample
to kill and stretch the nematodes. Add approximately 30 ml formalin (5.1) to preserve the sample.
The sample can then be kept for a reasonably long period (i.e. several months) and mass slides can be
prepared for species identification.
Concentrate the sample again before the preparation of mass slides. Prepare the slides (6.4.2) by adding
a small paraffin square (ridge) (5.2) with a heated stamp (6.4.5). Press the stamp briefly on the paraffin
so that it can melt and stick to the stamp. Then put the stamp on the glass slide. Make two slides for
every sample. Add two drops of (shaken) suspension to each slide. Put a cover glass (6.4.3) over the
paraffin square of approximately 40 mm by 40 mm and the nematodes in the drops of fixative. Heat the
slide on a hot plate (6.4.4) to 65 °C so that the paraffin melts again. Remove the slides directly otherwise
the nematodes can be damaged. The paraffin becomes solid and the nematodes are mounted in the
slides. Mark the slides with the number of the sample and A or B. The slides can be stored for several
months.
NOTE The selection of the fixation method depends on the objective of the study. For a taxonomic description,
[45]
holotypes are prepared by dehydration of the animals followed by a transfer to anhydrous glycerol . For
monitoring purposes, heat fixation and temporal mounts (weeks to several months) as described above are
enough and are practically feasible.
7.6 Identification
The A and B slides (see 7.5) of the same sample are analysed, if possible, by different persons. Use a
light microscope (6.5.1) for identification. Special optic techniques, like interference contrast (6.5.2),
can be useful to make structures visible. In each slide, 75 specimens are identified, using a nematode
identification key (6.5.3). Alternatively, a constant fraction (%) of the total number in the sample can be
identified in order to maintain a constant level of identification-resolution.
Write down the taxon name (family, genus or species name) of each specimen and characterize it as a
male, female or juvenile. The identification keys in Reference [15] cover most of the European free-living
species. Other standard works are the books of References [11] and [46]. For a few groups, specific
publications shall be used in order to identify the species. Juveniles without fully grown sex-organs and
other morphologic structures can only be identified to genus level in most of the cases. Resting stages
(dauerlarvae) are counted as a separate group.
Results of the identifications and proportions between taxa are used to estimate the numbers per
species in the original soil sample. Calculations can be performed in a spreadsheet computer program.
8 Data assessment
The results of nematode counts and identifications are stored in an electronic database (spreadsheet or
database program). The basic data of the analyses are converted to unit of soil fresh-weight, dry-weight
2 2
and surface area (dm or m ). The “per unit area” values can be calculated from the diameter of the soil
core, the number of cores in the bulk-sample, the total weight of the bulk-sample and the weight of the
extracted amount of soil. Taxon composition is assigned to feeding groups according to Reference [58].
Use the colonizer – persister (cp) scale for ecological characterization (see Reference [17]). After this,
[16],[17]
the Maturity Index and proportions of feeding groups can be calculated beside standard diversity
indices.
The following measurement endpoints can be used for the bio-classification of a soil, as well as the
evaluation of effects of chemical or anthropogenic stress:
— total abundance;
— number of species;
— number of species in feeding groups and cp-classes;
— nematode channel ratio, see Formula (1):
B
R = (1)
NC
BF+
()
where
R is the nematode channel ratio;
NC
B is the fraction bacterial feeding;
F is the fraction fungal feeding.
— Maturity Index.
The total number of nematodes and taxonomic diversity gives a first (rough) indication of the ecological
condition of a soil type. Enrichment (eutrophication) can be recognized by high numbers, often with
the dominance of a few opportunistic species. Pollution and very harsh abiotic conditions cause low
nematode abundance, but can coincide with a diverse fauna.
The Maturity Index, proportion of cp-classes and feeding groups give good insight into processes and
disturbance in the soil ecosystem. Bacterial and fungal dominated decomposition routes in the soil
can be recognized as well as mature soil ecosystems and excessive manuring or nutrient exhaustion.
These integrated indicators are more stable and robust due to the higher level of organization that is
represented.
Knowledge about the soil-inhabiting nematodes has emerged to such a level that habitat-response
[31]
models can be made for the chance of occurrence in relation to abiotic factors . In the near future, it
will be possible to use this for prognostic purposes. However, these ecological applications are based
on systematic and reliable monitoring data. Field observations contain a certain amount of natural
variation. The level of variation in an ecosystem-type depends on temporal and geographical factors
and human influence. For bio-classification, it is important to know the variance around the ecological
characteristic. Therefore, sufficient replicates of a certain habitat type (10 to 20) should be present
in a monitoring system, if necessary, with geographical/geological categories or differentiation. The
definition of ecological indicator values in an original or undisturbed situation opens the possibility of
ecological soil quality assessment.
9 Test report
The test report shall contain a summary of the results obtained along with the methods and variables
used during the study. It shall provide the following information:
a) a reference to this document, i.e. ISO 23611-4:2022;
b) full description of the experiment design and procedures (extraction method, e.g. Oostenbrink
elutriator);
c) description and characterization of the study site (especially soil properties);
d) sampling method with specification of corer type, number of samples, and sampled area;
e) description of the sampling conditions, including date and duration of sampling in the field and
climatic parameters, e.g. air temperature;
f) details of fixation and preservation of the biological material;
g) values recalculated to different units (fresh-weight, dry-weight and area);
h) discussion of the results;
i) spreadsheet or database file with raw data and calculations;
j) all information, including measured raw data and all problems which might have occurred during
all phases of the stud
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 23611-4
Deuxième édition
2022-08
Qualité du sol — Prélèvement des
invertébrés du sol —
Partie 4:
Prélèvement, extraction et
identification des nématodes du sol
Soil quality — Sampling of soil invertebrates —
Part 4: Sampling, extraction and identification of soil-inhabiting
nematodes
Numéro de référence
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Réactifs . 3
6 Appareillage . 4
6.1 Échantillonnage . 4
6.2 Extraction . 4
6.3 Comptage . 4
6.4 Fixation et préparation des lames d’ensemble . 5
6.5 Identification . 5
7 Mode opératoire . 5
7.1 Généralités . 5
7.2 Échantillonnage . 5
7.3 Extraction . 7
7.4 Comptage . 8
7.5 Fixation et préparation de lames d’ensemble . 8
7.6 Identification . 9
8 Analyse des données . 9
9 Rapport d’essai .10
Annexe A (informative) Illustrations du matériel et des méthodes utilisés pour la recherche
nématologique .12
Annexe B (informative) Informations relatives à la disponibilité de l’élutriateur
Oostenbrink .15
Annexe C (informative) Informations relatives à la méthode d’extraction avec l’entonnoir/
plateau de Baermann .18
Annexe D (informative) Exemples d’utilisation des invertébrés du sol dans le cadre
de programmes de surveillance du sol (avec présentation des résultats
correspondants) .20
Bibliographie .25
iii
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Caractérisation
environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 23611-4:2007), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Les principales modifications sont les suivantes:
— ajout d’exemples d’utilisation des nématodes dans le cadre de programmes de surveillance du sol
(notamment présentation de leurs résultats) en tant qu’annexe informative (voir l’Annexe D).
Une liste de toutes les parties de la série ISO 23611 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Le présent document a été établi en raison du besoin croissant de normalisation des méthodes de
prélèvement et d’analyse des organismes du sol. Ces méthodes couvrent principalement le prélèvement,
l’extraction et la manipulation des invertébrés du sol et sont nécessaires pour les applications suivantes:
[37],[42],[57]
— la classification biologique des sols, notamment l’évaluation de leur qualité ;
[25],[28],[31],[50]
— la bio-indication terrestre et la surveillance à long terme ;
— l’évaluation des effets des substances chimiques sur les animaux du sol sur le terrain
[4]
(voir l’ISO 11268-3 ).
Les données utilisables pour ces applications sont obtenues par des méthodes normalisées car elles
peuvent servir de base pour des décisions de grande portée (par exemple la décision de décontamination
d’un site). En fait, l’absence de telles méthodes normalisées est l’une des principales raisons pour
lesquelles la classification et l’évaluation biologiques dans les habitats terrestres (c’est-à-dire les sols)
ont été assez rarement utilisées à ce jour par rapport aux sites aquatiques.
Les nématodes constituent une partie importante de la faune du sol. Certains auteurs estiment que
ce groupe est probablement le plus important parmi les organismes pluricellulaires (métazoaires) sur
[52]
terre . Les nématodes sont présents de l’Antarctique aux tropiques et des sédiments en eau profonde
aux régions montagneuses. Ils sont actifs en tout lieu présentant suffisamment d’eau et de matières
[14]
organiques. Leur diversité spécifique et fonctionnelle est impressionnante . Les nématodes sont
généralement connus en tant que parasites des animaux et des plantes, mais la majeure partie de la
nématofaune participe aux processus de décomposition du fait du régime trophique de certains d’entre
eux: bactérivores ou fongivores.
6 −2 6 −2
Les nématodes sont présents en grand nombre (0,2 × 10 m à 9 × 10 m ) et avec une diversité élevée
[12]
(10 à 100 espèces) dans pratiquement chaque échantillon de sol . De plus, ils présentent un spectre
écologique large de régimes trophiques et de places dans la chaîne alimentaire; il existe des nématodes
[57],[58]
bactérivores, fongivores, herbivores, prédateurs et omnivores . Ces facteurs rendent ce groupe
[56]
particulièrement adapté en tant qu’indicateur de la qualité écologique du sol , mais une normalisation
des méthodes est urgemment nécessaire pour la comparaison et le regroupement des résultats.
Au cours des 100 dernières années, la nématologie s’est fortement développée dans les domaines
de l’agriculture, l’échantillonnage en vue de produire des recommandations et les réglementations
phytosanitaires parce que certains nématodes phytoparasites causent des dégâts importants sur les
cultures. En ce qui concerne les méthodes, il existe plusieurs «écoles» dans différentes parties du monde
avec leurs propres histoires, avantages pratiques et inconvénients. Une vue d’ensemble est présentée
[14] [48],[49]
par Oostenbrink et Southey . Les méthodes (ou variantes) décrites plus récemment ont souvent
été développées avec un intérêt particulier pour certaines espèces de nématodes phytoparasites. Ces
20 dernières années, de nouvelles méthodes ont été développées pour permettre une identification
[21],[34],[54]
taxonomique des espèces de nématodes basée sur l’ADN . Cela ouvre l’analyse taxonomique
des nématodes à une plus large communauté de non-spécialistes.
[16]
Depuis que Bongers a introduit l’indice de maturité, l’utilisation des nématodes dans la bio-
[56]
indication pour la qualité des sols s’est rapidement développée . Les nématodes sont désormais
utilisés pour l’étude et la surveillance écologique des sols dans plusieurs pays du monde entier. Les
activités de surveillance présentent certaines exigences méthodologiques. Par exemple, un grand
nombre d’échantillons de sol sont traités en routine pour un coût raisonnable. Certaines des méthodes
initialement développées pour l’échantillonnage en vue de produire des recommandations en
agriculture sont particulièrement adaptées pour la recherche écologique. Elles constituent la base de
variantes spécifiques décrites dans le présent document.
Les nématodes qui sont caractérisés avec le mode opératoire proposé sont toutes les formes
libres de nématodes trouvées dans le sol. Ils comprennent les nématodes non phytophages ainsi
que les nématodes phytophages ectoparasitaires et les stades libres des nématodes phytophages
endoparasitaires. La quantification des nématodes strictement phytophages dans les racines requiert
v
des méthodes spécifiques. Des informations de base sur l’écologie des nématodes et leur utilisation en
tant que bio-indicateurs peuvent être trouvées dans la Bibliographie.
vi
NORME INTERNATIONALE ISO 23611-4:2022(F)
Qualité du sol — Prélèvement des invertébrés du sol —
Partie 4:
Prélèvement, extraction et identification des nématodes du
sol
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour échantillonner et manipuler les nématodes du sol
en tant que condition préalable pour les utiliser comme bio-indicateurs (par exemple pour évaluer la
qualité d’un sol en tant qu’habitat pour des organismes).
Le présent document s’applique à tous les biotopes terrestres dans lesquels des nématodes sont
présents. Le mode opératoire d’échantillonnage pour les études de terrain est spécifié de façon générale
dans l’ISO 18400-101.
Le présent document n’est pas applicable aux nématodes aquatiques en raison des différences dans
la matrice d’échantillonnage (par exemple, la colonne d’eau). Des méthodes destinées à certains
autres groupes d’organismes tels que les vers de terre, les collemboles, les enchytréides ou les macro-
invertébrés, sont décrites dans l’ISO 23611-1, l’ISO 23611-2, l’ISO 23611-3 et l’ISO 23611-5.
Le présent document ne couvre pas la caractérisation pédologique du site qui est particulièrement
recommandée lors du prélèvement d’invertébrés du sol. L’ISO 10390, l’ISO 10694, l’ISO 11272,
l’ISO 11274, l’ISO 11277, l’ISO 11461 et l’ISO 11465 décrivent des modes opératoires appropriés pour
mesurer le pH, la répartition granulométrique, le rapport C/N, la teneur en carbone organique et la
capacité de rétention en eau.
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp/ ;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
nématode
petit ver libre non segmenté (jusqu’à quelques millimètres de longueur) appartenant à la classe des
nématodes
Note 1 à l'article: Les nématodes dont aucun stade n’habite dans le sol ne sont pas inclus dans cette définition.
3.2
situation
zone ou point d’étude caractérisé sur la base de la composition de la nématofaune (entre autres)
3.3
échantillon composite
échantillon de sol constitué de nombreuses petites carottes de sol pour obtenir un échantillon
représentatif de la nématofaune
3.4
outil de prélèvement de sol
outil utilisé pour collecter le sol d’une manière rapide et normalisée
3.5
lame d’ensemble
lame de microscope sur laquelle 300 à 400 nématodes sont montés en vue de l’identification (3.7) des
espèces
3.6
identification
détermination de l’espèce, du genre ou de la famille d’un individu sur la base de caractéristiques
morphologiques (cavité buccale, organes sexuels, mensurations) avec une clé d’identification
3.7
échelle colonisateur – persistant (cp)
classification écologique des nématodes
[16],[17]
Note 1 à l'article: Proposée par Bongers .
Note 2 à l'article: Le principe est analogue aux stratégies démographiques r-K, largement acceptées en écologie
fondamentale. Les familles de nématodes non phytophages sont classées dans l’un des cinq groupes cp.
Cette classification sert également de base de calcul pour l’indice de maturité.
4 Principe
Les échantillons de sol contenant les nématodes sont collectés avec une petite carotte cylindrique
(diamètre: environ 2 cm, longueur: 10 cm ou 15 cm) ou une tarière (voir la Figure A.2). Pour les
applications de surveillance, les échantillons de sol sont mélangés dans un échantillon composite
représentatif d’une zone homogène. Le nombre total d’échantillons à prélever dépend de la surface
étudiée et de son homogénéité (pédologie, utilisation du sol, par exemple). Les échantillons individuels
peuvent être collectés sur le terrain dans des sacs ou seaux en plastique. L’échantillon composite est
trop volumineux pour un examen direct et il est par conséquent mélangé et sous-échantillonné. Sur
le terrain et durant le transport au laboratoire, les échantillons de sol doivent être protégés contre les
fortes fluctuations de température, la perte d’eau et les perturbations mécaniques violentes. Ils peuvent
être conservés pendant quatre semaines au maximum à 4 °C.
[49]
NOTE 1 La méthode d’échantillonnage décrite ci-dessus est dérivée de la «Dutch Method» destinée à
déterminer l’infestation par les nématodes à kystes de parcelles cultivées en pomme de terre, et est utilisée
depuis de nombreuses années dans plusieurs pays européens.
La méthode de l’entonnoir Oostenbrink est recommandée pour les extractions de routine d’échantillons
de sol, dans un réseau de surveillance, par exemple. La méthode Oostenbrink n’est pas la plus simple
qui peut être utilisée en toutes circonstances. Elle présente toutefois plusieurs avantages: elle est très
normalisée et présente une efficacité d’extraction constante. La méthode de l’entonnoir Oostenbrink
combine trois moyens de base qui peuvent être utilisés pour la séparation des nématodes des sols:
le lavage, le tamisage et le mouvement actif. Par conséquent, elle permet d’obtenir de meilleurs résultats
que n’importe quelle méthode de base prise individuellement. Ses autres avantages sont:
— des échantillons de sol relativement importants, quel que soit le type de sol, peuvent être traités en
une seule fois (100 g à 500 g);
— des suspensions de nématodes limpides;
— l’isolement de la plupart des nématodes vivants et actifs;
— il existe de nombreuses années d’expérience avec un nombre extrêmement élevé d’extractions de
sol en routine;
— elle est utilisée dans de nombreux pays du monde entier.
1)
Après l’échantillonnage, les nématodes sont extraits du sol en utilisant l’élutriateur Oostenbrink
(modèle III) (voir la Figure A.3 et l’Annexe B). Dans cette technique, un courant ascendant d’eau sépare
les nématodes des particules du sol et les maintient en suspension tandis que les particules plus lourdes
[10],[33],[44],[49]
décantent au fond . Cette suspension de nématodes et de petites particules traverse trois
tamis (taille de maille: 45 μm). Les particules retenues sur les tamis sont lavées et recueillies sur un
filtre en ouate (filtre pour lait). Le filtre en ouate est monté sur un tamis et l’ensemble est placé dans
une boîte avec 100 ml d’eau courante. Pendant trois jours, les nématodes se séparent des débris sur le
filtre par leur mouvement actif vers le bas. Ainsi, les nématodes vivants traversent activement le filtre
et se retrouvent dans la boîte contenant l’eau.
Après l’extraction, les nématodes sont comptés dans 2 fois 10 ml des 100 ml de suspension, puis
concentrés, traités à l’aide d’une méthode de conservation (étape résumée ci-après par le terme
«conservés»), puis montés sur des lames d’ensemble. Au moins 150 individus ou un pourcentage fixe du
nombre total de nématodes dans l’échantillon sont ensuite identifiés au microscope.
Les nématodes adultes peuvent être identifiés au niveau de l’espèce. Cependant, les populations dans le
sol sont souvent dominées par des juvéniles et le genre est un seuil taxonomique pratique (mais moins
sensible).
[44]
D’autres méthodes d’extraction telles que l’élutriateur Seinhorst ou l’entonnoir Baerman
(voir l’Annexe C) peuvent être utiles dans des cas particuliers, mais ne sont pas recommandées en tant
que mode opératoire général parce que l’élutriateur Oostenbrink est robuste, facile à utiliser et donne
généralement des résultats quantitatifs de meilleure qualité que la plupart des autres techniques.
La méthode basée sur l’élutriateur Oostenbrink ne convient pas aux échantillons additionnés d’un
agent de conservation contenant des organismes non vivants. Ici, les méthodes de mise en suspension/
centrifugation à l’aide de silice colloïdale sont recommandées car elles permettent d’extraire toutes les
[26]
formes de nématodes .
NOTE 2 Le présent document ne s’applique pas aux nématodes aquatiques car ces derniers ne traversent pas
le filtre. Il existe des techniques de centrifugation spécifiques pour les échantillons de sédiments.
NOTE 3 L’identification au microscope optique repose sur des caractères morphologiques. Dans certains
cas, il n’est pas possible de reconnaître un spécimen au niveau de l’espèce, voire du genre, par exemple des
jeunes. Les nouvelles techniques, telles que le code-barres ADN («DNA barcoding») ou le métacode-barres ADN
[40],[54]
(«DNA metabarcoding») , offrent une taxonomie indépendante de la morphologie, de sorte que même les
jeunes peuvent être identifiés jusqu’au niveau du genre ou de l’espèce.
NOTE 4 Le prélèvement de nématodes est souvent inclus dans des programmes de surveillance bien plus
vastes visant à couvrir tout ou partie de la faune du sol (par exemple, la mésofaune). Des exemples d’utilisation
d’invertébrés du sol sont donnés à l’Annexe D. La conception de tels programmes n’est pas traitée dans le présent
document.
5 Réactifs
5.1 Formol [solution de formaldéhyde, à 60 ml/l].
5.2 Paraffine, avec un point de fusion proche de 60 °C.
1) L’élutriateur Oostenbrink est l’appellation commerciale d’un produit distribué, par exemple, par la société
MEKU Erich Pollähne GmbH (https:// www .meku -pollaehne .de/ Nematologie/ Oostenbrink -Elutriator/ oostenbrink
-elutriator .html). Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie
nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
6 Appareillage
Utiliser du matériel de laboratoire standard ainsi que ce qui suit.
6.1 Échantillonnage
6.1.1 Outil de prélèvement d’échantillon de sol, de type à tube ouvert, fermé ou divisé.
EXEMPLE Dispositif de prélèvement d’échantillon de sol (diamètre: 23 cm) ou tarière (voir la Figure A.2);
disponible dans le commerce.
6.1.2 Seau en plastique, pour la collecte d’échantillons de sol sur le terrain.
6.1.3 Récipient en plastique, pour le mélange de l’échantillon composite.
6.1.4 Tamis, de 8 mm de taille de pore.
6.1.5 Sacs enduits, sacs en plastique ou récipients en verre (transport et stockage).
6.1.6 Marqueur permanent ou étiquettes préimprimées.
6.2 Extraction
6.2.1 Bécher, ayant un volume de 100 ml à 250 ml.
6.2.2 Balance, pouvant peser de 1 kg à 25 kg, pour peser la masse d’échantillon totale.
1)
6.2.3 Élutriateur Oostenbrink (voir aussi la Figure A.3 et l’Annexe B), entonnoir en métal avec un
flux d’eau de bas en haut permettant de séparer les nématodes des plus grosses particules de sol.
6.2.4 Trois tamis, de 45 µm de taille de maille et de 30 cm de diamètre.
6.2.5 Un tamis, de 250 µm de taille de maille et de 10 cm de diamètre.
6.2.6 Bassine en plastique, d’environ 2 l de capacité.
6.2.7 Bague de fixation.
6.2.8 Tamis d’extraction, de 1 000 µm de taille de maille et de 16 cm de diamètre.
6.2.9 Filtres à lait ou en ouate.
6.2.10 Plateaux peu profonds (boîtes de Petri) ou boîtes d’extraction spéciales.
6.2.11 Flacon en verre, de 100 ml de capacité, avec bouchon à vis.
6.3 Comptage
6.3.1 Microscope à dissection, avec un grossissement de × 10 à × 50.
6.3.2 Petite plaque de comptage avec une grille, ou lame de verre avec une grille.
NOTE Des plaques de comptage de différentes tailles et de différents pas de grille sont disponibles auprès
des fabricants de matériel de laboratoire. Elles peuvent également être préparées à partir de boîtes de Petri en
gravant une grille au fond à l’aide d’une aiguille.
6.3.3 Compteur à main.
6.3.4 Pompe d’aquarium, pour mélanger les suspensions de nématodes.
6.3.5 Pipette (goutte à goutte en verre), de volume réglable.
6.3.6 Aiguille permettant de manipuler les nématodes.
6.3.7 Flacon, d’un volume de 100 ml.
6.4 Fixation et préparation des lames d’ensemble
6.4.1 Trompe à eau, pour concentrer les suspensions.
6.4.2 Lames de verre, de 50 mm × 76 mm.
6.4.3 Lamelles couvre-objet, de 45 mm × 45 mm.
6.4.4 Plaque chauffante électrique.
6.4.5 Poinçon en métal, de 40 mm × 40 mm, pour le joint de paraffine sur les lames de verre.
6.5 Identification
6.5.1 Microscope, avec un grossissement de × 400 à × 1 000.
6.5.2 Indicateur micrométrique oculaire.
[15]
6.5.3 Clés d’identification .
6.5.4 Formulaire normalisé, pour répertorier les résultats d’identification.
7 Mode opératoire
7.1 Généralités
Pour s’assurer de la qualité de l’analyse, chaque échantillon doit recevoir un code unique dès qu’il est
prélevé sur le terrain. Ce code (étiquette) doit rester avec l’échantillon durant toutes les étapes de
traitement et d’analyse. Il convient d’utiliser un ou plusieurs formulaires normalisés électroniques
pour suivre l’acheminement des échantillons et la collecte des résultats d’analyse. Ces données de base
peuvent être combinées dans un fichier de tableur ou de base de données pour les calculs et analyses
statistiques réalisées.
7.2 Échantillonnage
Étant donné que la densité et la diversité des nématodes du sol sont les plus élevées dans les 10 cm
supérieurs du sol minéral, un dispositif de prélèvement d’échantillon de sol (6.1.1) avec un tube
de prélèvement de 10 cm ou 15 cm de longueur est approprié pour la plupart des applications de
surveillance biologique. Il est recommandé d’utiliser un tube fermé à longueur et diamètre fixes.
EXEMPLE 1 Un dispositif de prélèvement d’échantillon de sol consiste en une tarière à gouge en acier
inoxydable (disponible dans différentes dimensions) constituée d’un tuyau de tarière en acier, d’un seau de
collecte (6.1.2) et d’une tige avec une poignée en acier. En raison de la forme conique du tuyau, l’échantillon est
aisément poussé vers le seau de collecte lorsque l’échantillon suivant est prélevé. La profondeur d’échantillonnage
est constante et les carottes de sol peuvent être aisément collectées dans une grande parcelle (voir la Figure A.1).
Ce dispositif peut être utilisé dans de nombreuses situations.
EXEMPLE 2 En variante, une tarière pour les sols peut être utilisée en tant qu’outil simple, économique
et rapide d’utilisation. Des tarières sont disponibles dans différentes dimensions. Les échantillons de sol
collectés avec une tarière sont moins comprimés. L’inconvénient est que du sol peut être perdu plus aisément
(voir la Figure A.2).
EXEMPLE 3 Lorsqu’une séparation précise des couches du sol est requise, un dispositif de prélèvement à tube
divisé peut être utilisé. Cet outil d’échantillonnage requiert plus de temps de manipulation et est moins adapté
pour un grand nombre d’échantillons et de grandes surfaces (voir la Figure A.2).
Des échantillons de couches plus profondes peuvent être prélevés avec une tarière pour éviter une
compression excessive du sol ou avec des dispositifs de prélèvement à tube divisé (voir la Figure A.2).
De la matière organique ou de la litière peuvent être incluses dans les échantillons, mais cela augmente
les nombres de nématodes observés, parfois considérablement. Les couches organiques peuvent être
prélevées indépendamment. Dans ce cas, un dispositif de carottage à tube divisé plus large (5 cm à
10 cm) est préférable afin de séparer les horizons organiques du matériau minéral. De faibles quantités
de litière peuvent également être traitées dans un élutriateur Oostenbrink (6.2.3) pour extraire
les nématodes. L’efficacité d’extraction peut être améliorée par trempage et mélange des fractions
[41],[43]
organiques .
Lorsqu’un échantillon représentatif d’un type spécifique d’écosystème est requis, une surface type
2 2
d’au moins 5 000 m , et de préférence de 10 000 m , doit être choisie. Il est recommandé de sélectionner
une surface qui est (plus ou moins) homogène en matière de propriétés du sol, de végétation et
d’utilisation du sol. La surface étudiée est indiquée dans les informations concernant la situation
étudiée. En règle générale, 100 carottes de sol doivent être regroupées par surface de 10 000 m . Pour
les surfaces plus petites (par exemple 100 m ), environ 25 carottes sont suffisantes pour obtenir une
estimation de la composition moyenne de nématodes et collecter suffisamment de sol. Un modèle
d’échantillonnage plus dense conduit à une meilleure estimation de l’abondance et de la composition
spécifique de la nématofaune. Cependant, un compromis est nécessaire avec la quantité du sous-
échantillon qui est finalement analysé à partir de l’échantillon composite homogénéisé. En effet, un
échantillon composite très grand ne donne pas plus d’informations parce que seule une petite partie
est analysée et l’homogénéisation ne peut pas être parfaite. Un maximum de trois cents échantillons
obtenus avec un dispositif de prélèvement d’échantillon de sol (diamètre: 23 mm) sont recommandés
pour constituer un échantillon composite. Dans un programme de surveillance biologique, il convient
que la densité d’échantillon par unité de surface soit égale pour toutes les situations. La masse de
l’échantillon composite et le nombre de carottes de sol qui le composent doivent être connus.
Le plan d’échantillonnage peut être régulier (grille), selon un plan particulier ou aléatoire. Pour les
situations très grandes, il est plus pratique de parcourir le site en zigzag et de prélever arbitrairement
des échantillons le long de ce chemin. Dans le cas où la situation est constituée de différentes parcelles,
le nombre d’échantillons de sol par parcelle doit être déterminé sur la base de leur superficie. Les
échantillons provenant de parties atypiques de la situation, telles que des fossés, des pistes ou des
chemins, doivent être évités.
L’échantillon composite collecté est homogénéisé dans un récipient en plastique (6.1.3). Cette opération
peut être effectuée sur le terrain ou au laboratoire, suivant la méthode de travail et de transport la
plus pratique. Le mélange commence par la désagrégation des carottes à travers un tamis de 8 mm
de taille de maille (6.1.4). Ensuite, le sol est doucement mélangé jusqu’à ce que la masse soit uniforme
en couleur et en consistance. Le mélange et la préparation de l’échantillon peuvent prendre plus d’une
heure pour des échantillons composites de sols argileux ou de couches superficielles riches en racines.
Cependant, cette étape est essentielle pour toutes les analyses ultérieures et il convient d’y apporter
toute l’attention nécessaire. Le matériau organique grossier, les racines et les pierres doivent être
éliminés. Le choix final des détails opératoires doit être spécifié dans le protocole d’échantillonnage de
terrain et doit également être uniforme pour l’ensemble du programme de surveillance biologique.
Lorsque l’échantillon composite est homogénéisé, environ un litre est prélevé en vue d’un examen
ultérieur. Cela peut être effectué en prélevant plusieurs cuillerées dans différentes parties de
l’échantillon composite pour obtenir un sous-échantillon représentatif. Placer l’échantillon dans un sac
en plastique ou un récipient en verre étiqueté (6.1.5). À ce stade, des sous-échantillons supplémentaires
peuvent être prélevés dans l’échantillon composite pour d’autres analyses biotiques et abiotiques.
Les échantillons de sol pour l’analyse des nématodes doivent être conservés à 4 °C avant l’extraction.
Il convient que la période de conservation soit aussi courte que possible, quatre semaines au
maximum. Cette température peut ne pas être optimale pour tous les nématodes (par exemple pour les
Aphelenchoididées, les Anguinidées; voir la Référence [13]). Dans tous les cas, la température appropriée
doit être contrôlée au préalable lors du prélèvement hors de la région holarctique (par exemple dans les
tropiques).
7.3 Extraction
Mélanger le (sous-)échantillon de sol prélevé sur le terrain à nouveau avant l’extraction et remplir
un bêcher (6.2.1) avec 100 ml à 250 ml de sol. Peser l’échantillon afin de convertir les résultats en
fonction du poids frais. Dans une autre sous-partie du même échantillon de sol, mesurer l’humidité du
sol pour exprimer la densité finale en unité de poids sec de sol. Conserver l’échantillon résiduel pour
analyse abiotique si aucun sous-échantillon n’a été collecté séparément sur le terrain à partir du même
échantillon composite.
Préparer l’élutriateur Oostenbrink (6.2.3). Placer l’échantillon dans le tamis supérieur et laver le sol
dans l’élutriateur. Les débits d’écoulement d’eau spécifiques dépendent du type d’entonnoir utilisé.
L’appareillage et son utilisation sont décrits en détail dans les Références [10] et [49]. La dernière
version de l’entonnoir Oostenbrink a des dimensions plus grandes et un fonctionnement complètement
automatisé (voir la Figure A.5). Elle est adaptée pour l’extraction en routine de grands nombres
d’échantillons. L’échantillon de sol est lavé dans l’entonnoir à travers le tamis supérieur. Lorsque
l’entonnoir est rempli par le courant ascendant d’eau, les nématodes sont séparés des particules de sol
plus lourdes.
NOTE 1 Si, pour une raison quelconque, un élutriateur Oostenbrink n’est pas disponible, la méthode avec
l’entonnoir/plateau de Baermann peut être une alternative. Des détails concernant son utilisation sont présentés
dans l’Annexe C.
Déboucher l’entonnoir lorsque l’eau a atteint le bord supérieur et capter la suspension sur une pile de
trois tamis de 45 µm de maille (6.2.4). Un tamis supplémentaire (6.2.5) peut être monté sur les trois
tamis (6.2.4) pour capturer les grands nématodes qui ne passent pas l’étape finale de filtration sur
ouate. Ce tamis (6.2.5) doit être placé directement dans une boîte d’extraction (remplie d’eau) (6.2.10)
et conservé dans une armoire pendant trois jours. À des températures ambiantes élevées, il convient
que l’armoire soit humidifiée et maintenue éloignée des sources de chaleur. Les tamis (6.2.4) sont rincés
avec un courant d’eau léger et la suspension obtenue est collectée dans une bassine en plastique (6.2.6).
Cette suspension contenant les nématodes peut être laissée au repos pendant 15 min à 30 min, période
pendant laquelle les nématodes décantent au fond. Cela présente l’avantage que le surnageant d’eau dans
la bassine en plastique peut être versé plus rapidement. Verser le contenu de la bassine sur un double
filtre [par exemple en ouate (filtre à lait)] (6.2.9), qui est fixé sur un tamis d’extraction (6.2.8) avec une
bague de fixation (6.2.7). Placer le tamis d’extraction (6.2.8) avec les débris dans une boîte d’extraction
(6.2.10). Les nématodes actifs dans les débris migrent à travers le filtre (6.2.9) dans la boîte d’extraction
(6.2.10) remplie de 100 ml d’eau courante pendant une période de trois jours. Il est important que le
filtre (6.2.9) reste toujours en contact avec l’eau dans la boîte d’extraction (6.2.10). Si nécessaire, ajouter
de l’eau au cours des trois jours. Après trois jours, le tamis de 250 µm de maille (6.2.5) et le tamis avec
les filtres en ouate (6.2.9) sont enlevés et le contenu des boîtes d’extraction (6.2.10) peut être versé
dans un flacon en verre de 100 ml (6.2.11). Étiqueter les flacons avec les codes d’échantillon corrects.
Ensuite, les nématodes peuvent être comptés.
NOTE 2 Un matériau de filtre autre que la ouate est acceptable dans la mesure où il a été démontré que ses
propriétés sont égales à celles de la ouate en ce qui concerne l’extraction des nématodes (c’est-à-dire pas de
changement de la taille de pore après l’absorption d’eau).
NOTE 3 Cette méthode permet uniquement à l’utilisateur d’extraire des formes mobiles. Par conséquent,
le comptage ne tient pas compte des formes immobiles (œufs, organismes morts dans le sol). Ce type d’extraction
ne donne pas la valeur exacte du nombre de nématodes (quel que soit leur stade de développement) lors de
l’extraction. Cette méthode ne convient pas aux échantillons additionnés d’un agent de conservation contenant
des organismes non vivants (voir l’Article 4).
NOTE 4 La dernière phase d’extraction dure trois jours. À cette étape, les filtres en ouate (sur un tamis de
support) sont placés dans une boîte peu profonde avec 100 ml d’eau courante. Les résultats expérimentaux
montrent que 59 % des nématodes traversent durant les premières 24 h, 73 % après deux jours, et 82 % sont
[53]
récupérés après trois jours . Ces valeurs sont basées sur une comparaison avec les nématodes observés après
sept jours. Pour des raisons pratiques, une durée d’extraction standard de trois jours est choisie. Une durée
d’extraction plus longue présente un inconvénient en ce que l’eau dans la boîte s’évapore, les nématodes peuvent
mourir et les œufs présents dans les débris peuvent éclore.
7.4 Comptage
Avant le comptage, combiner le contenu des deux flacons (6.2.11) contenant les nématodes d’un
échantillon de sol. Attendre au moins 2 h pour s’assurer que les nématodes ont décanté au fond.
Concentrer les suspensions (par décantation et aspiration) de sorte que les suspensions tiennent
dans un seul flacon de 100 ml (6.3.7 ou 6.2.11). Si nécessaire, ajouter de l’eau courante dans le flacon
jusqu’à ce qu’il contienne exactement 100 ml. Mélanger soigneusement (3 min à 5 min) les suspensions
avec l’air (6.3.4). Immédiatement après, prélever 10 ml de suspension mélangée avec une pipette
(6.3.5) et les placer dans une boîte de comptage (6.3.2). Effectuer cette opération en double. Compter
le nombre (6.3.3) de nématodes sous une loupe binoculaire (6.3.1) tout en déplaçant lentement et de
façon systématique la plaque de comptage. Le résultat des deux comptages ne doit pas différer de plus
de 10 %. Sinon, la suspension n’est probablement pas suffisamment homogène et le mode opératoire
de comptage doit être répété. Noter le nombre de nématodes dans chaque plaque de comptage sur
un formulaire normalisé. Le nombre moyen du comptage en double, ramené à 100 ml de suspension,
est l’estimation de l’abondance des nématodes dans la quantité extraite (volume ou masse) de sol.
Replacer le sous-échantillon compté dans un flacon de 100 ml (6.3.7). Ensuite, les nématodes doivent
être tués par la chaleur et fixés avec du formol (5.1).
Le volume de la suspension dans les flacons et le volume de suspension mélangée prélevé avec la
pipette pour le comptage dépendent de la densité des nématodes dans les flacons. Bien qu’un volume
de suspension de 100 ml et la quantité prélevée pour le comptage (10 ml) soient adéquats dans la
plupart des cas, ceux-ci peuvent être modifiés. Il convient que pratiquement tous les nématodes de
l’échantillon de sol soient comptés si la densité de nématodes est très faible, tandis que seulement 1 %
de la suspension peut déjà contenir trop de nématodes individuels si la densité initiale dans le sol est
très élevée.
AVERTISSEMENT — Il convient de prendre des précautions appropriées lors de la manipulation
de formol afin d’éviter tout risque d’inhalation ou d’exposition de la peau (par exemple, en
portant des gants et en manipulant les échantillons dans une hotte aspirante). Conformément
à la fiche de données de sécurité des solutions de formaldéhyde à 370 ml/l publiées par les
fabricants, le composé est un sensibilisant cutané et est considéré comme cancérigène (chez
l’homme: données limitées; chez l’animal: données suffisantes). Il est réglementé dans les pays
industrialisés et est autorisé pour usage scientifique.
7.5 Fixation et préparation de lames d’ensemble
S’ils ont été récemment comptés, laisser les nématodes décanter au fond du flacon pendant plusieurs
heures. La suspension peut être conservée dans un réfrigérateur à 4 °C. Concentrer la suspension
jusqu’à ce qu’il reste environ 5 mm d’eau dans le flacon. Cela peut être effectué avec une petite pipette
(6.3.5) raccordée à une pompe à vide (à eau) (6.4.1). Une pièce de toile filtrante à plancton (taille de
pore: 10 µm) tendue sur l’ouverture de la pipette évite la perte de nématodes. Ajouter environ 10 ml
d’eau bouillante à l’échantillon concentré pour tuer et dilater les nématodes. Ajouter environ 30 ml de
...
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