Textiles — Determination of reduction activity of specific proteins derived from pollen, mite and other sources on textile products

This document specifies a test method for the determination of reduction activity of textile products against specific proteins which shows antigen-antibody reaction. This document only specifies the reduction activity against those proteins on the surface of textile products. It does not specify a testing method to evaluate the allergenic reaction against human beings. Specific proteins which show antigen-antibody reaction are proteins derived from pollen, mite and other sources. Other specific proteins can be used after appropriate validation described in this document. Enzyme-linked immunosorbent assay is used to quantify the amount of those proteins in this document. This document is applicable to textile products include woven, knitted and nonwoven fabrics, fibres, yarns, braids, etc.

Textiles — Détermination de l’activité de réduction des protéines spécifiques provenant du pollen, des acariens et d’autres sources sur les produits textiles

Le présent document spécifie une méthode d’essai visant à déterminer l’activité de réduction des produits textiles vis-à-vis de protéines spécifiques qui présentent une réaction antigène-anticorps. Le présent document ne spécifie que l’activité de réduction basée sur ces protéines à la surface des produits textiles. Il ne s’agit pas d’une méthode d’essai visant à évaluer la réaction allergène des êtres humains. Les protéines spécifiques qui présentent une réaction antigène-anticorps sont celles issues du pollen, des acariens et d’autres sources. D’autres protéines spécifiques peuvent être utilisées après une validation appropriée décrite dans le présent document. Le dosage d’immunoadsorption par enzyme liée est utilisé pour quantifier ces protéines dans le présent document. Le présent document est applicable aux tissus, aux tricots, aux fibres, aux fils, aux tresses, aux matériaux non tissés, etc.

General Information

Status
Published
Publication Date
07-Jul-2022
Current Stage
6060 - International Standard published
Due Date
06-Feb-2023
Completion Date
08-Jul-2022
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Standard
ISO 4333:2022 - Textiles — Determination of reduction activity of specific proteins derived from pollen, mite and other sources on textile products Released:8. 07. 2022
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ISO 4333:2022 - Textiles — Determination of reduction activity of specific proteins derived from pollen, mite and other sources on textile products Released:8. 07. 2022
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 4333
First edition
2022-07
Textiles — Determination of reduction
activity of specific proteins derived
from pollen, mite and other sources
on textile products
Textiles — Détermination de l’activité de réduction des protéines
spécifiques provenant du pollen, des acariens et d’autres sources sur
les produits textiles
Reference number
ISO 4333:2022(E)
© ISO 2022
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 4333:2022(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on

the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below

or ISO’s member body in the country of the requester.
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
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---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 4333:2022(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ..................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions .................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 2

5 Specific proteins ................................................................................................................................................................................................... 2

6 Apparatus .................................................................................................................................................................................................................... 2

7 Reagents and media .........................................................................................................................................................................................3

8 Preparation ............................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Preparation of test specific protein suspension ....................................................................................................... 4

8.2 Preparation of test specimens .................................................................................................................................................. 4

8.3 Control test ................................................................................................................................................................................................ 5

8.3.1 General ........................................................................................................................................................................................ 5

8.3.2 Procedure of verification of the sensitivity of ELISA ......................................................................... 5

8.3.3 Requirement for verification of the sensitivity of ELISA ................................... ............................. 5

9 Preparation of the specific protein calibration curve ................................................................................................. 6

10 Test procedure .......................................................................................................................................................................................................6

10.1 Preparation of test specimen ........................................................................................................................................... .......... 6

10.2 Deposit of specific protein to the test specimens .................................................................................................... 6

10.3 Contacting time ...................................................................................................................................................................................... 6

10.4 Recovery of specific protein from the test specimens ........................................................................................ 6

11 Determination of the specific protein concentration ................................................................................................... 7

12 Calculation of the specific protein concentration and reduction rate .......................................................7

13 Repeatability and reproducibility ....................................................................................................................................................7

14 Test report .................................................................................................................................................................................................................. 7

Annex A (informative) Specific protein derived from pollen and mite .......................................................................... 9

Annex B (informative) ELISA assay reagents, reagents and buffer solutions .......................................................10

Annex C (informative) Enzyme-linked immunosorbent assay — Sandwich ELISA test

procedure .................................................................................................................................................................................................................12

Annex D (informative) Specific protein calibration curve ........................................................................................................13

Annex E (informative) Recovery rate ...............................................................................................................................................................14

Annex F (informative) Interlaboratory test result ............................................................................................................................15

Annex G (informative) Repeatability and reproducibility ........................................................................................................18

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................20

iii
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ISO 4333:2022(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to

the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see

www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 38, Textiles.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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ISO 4333:2022(E)
Introduction

Specialty textile products which can have the positive effect on human comfortable and hygienic life,

such as antibacterial, antifungal, antiviral treated textiles, have been introduced in the market and are

expanding year by year in various applications.

Now, contamination on textile products with specific proteins which show antigen-antibody reaction

also can have the negative effect on human comfortable and hygienic life. There are high performance

textile products which can reduce the amount of those specific proteins on textile products.

Because those products are relatively new and include the technical aspects of textile and biological

technology, the testing methods have been developed by the individual procedures to evaluate the

product performance. That has resulted in inexistence of a unified test method, hindering for both

consumers and producers a true explanation or understanding of those functional products.

The demand to establish an international standard has been growing in the consumers, retailers,

producers, etc. as stakeholders in the market.

This document provides a quantitative test method by using enzyme-linked immunosorbent assay to

assess the reduction activity of the specific proteins on textile products by taking proteins derived

from pollen and mite-faeces or carcass as an example.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 4333:2022(E)
Textiles — Determination of reduction activity of specific
proteins derived from pollen, mite and other sources on
textile products

WARNING — This document calls for use of the antigen-antibody reactive derived-protein

or substances/procedures that can be injurious to the health/environment if appropriate

conditions are not observed. It refers only to technical suitability and does not absolve the user

from legal obligations relating to health and safety/environment at any stage.
1 Scope

This document specifies a test method for the determination of reduction activity of textile products

against specific proteins which shows antigen-antibody reaction. This document only specifies the

reduction activity against those proteins on the surface of textile products. It does not specify a testing

method to evaluate the allergenic reaction against human beings.

Specific proteins which show antigen-antibody reaction are proteins derived from pollen, mite and

other sources. Other specific proteins can be used after appropriate validation described in this

document.

Enzyme-linked immunosorbent assay is used to quantify the amount of those proteins in this document.

This document is applicable to textile products include woven, knitted and nonwoven fabrics, fibres,

yarns, braids, etc.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
antigen

substance that is recognized as foreign by the immune system and elicits an immune response through

stimulating antibody production
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.12]
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ISO 4333:2022(E)
3.2
antibody

protein (immunoglobulin) produced and secreted by B lymphocytes in response to a molecule

recognised as foreign (antigen) and which is capable of binding to that specific antigen

Note 1 to entry: Immunoglobulin is the common synonym for antibody.
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.10]
3.3
specific protein

proteins which act as antigen and are derived from pollen, mite and other sources

3.4
reduction activity of specific protein
reduction rate of specific protein (3.3) concentration
3.5
specific protein reduction agents
inorganic or organic chemicals able to reduce the specific protein concentration
3.6
untreated fabric
fabric of the testing sample without treatment by antigen reduction agent
3.7
negative control
blank test to confirm the effect of an empty plastic bag
3.8
control test

test to confirm that the extract chemicals from test sample do not affect to the sensitivity of ELISA

measurement
3.9
enzyme-linked immunosorbent assay
ELISA
method that used antibodies (3.2) or antigens (3.1) covalently bound to enzyme
4 Principle

The suspension of specific protein from pollen, mite and others are deposited onto a test specimen.

After specified contact time, the remaining antigen-antibody reactive specific proteins from pollen,

mite and others is measured by using the ELISA method, and the reduction activity is calculated by the

comparison between the concentration of the test specimen and the negative control.

5 Specific proteins

Examples of specific proteins derived from pollen and mite are shown in Annex A. Other specific

proteins from other species can be used after appropriate validations. If the other species are used, the

name of the species and the specific reason for their use shall be described in the test report.

6 Apparatus
6.1 Measuring flask, with capacity of 1 l.

6.2 Balance, with the available range of 0,001 g to 100 g with accuracy of 1,0 %.

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ISO 4333:2022(E)

6.3 Micropipette, having the most suitable volume for each use, with a tip made of glass or plastic,

and with an accuracy of 0,5 % or less.
6.4 Freezer, capable of operating at a temperature of (-20 ± 2) °C.
6.5 Refrigerator, capable of operating at a temperature between 2 °C and 8 °C.

6.6 pH meter, with a glass electrode, with a resolution of at least ±0,01 pH unit

NOTE The pH meter are described in ISO 3071.
6.7 Biological safety cabinet, class II.

6.8 Incubator, capable of maintaining at a temperature of (25 ± 1) °C and (37 ± 1) °C.

6.9 Microplate reader, capable of measuring at a 450 nm to 620 nm in wavelength.
6.10 Polyethylene bag with zipper, with (60 ± 2) mm × (85 ± 2) mm.
6.11 Culture container, made of glass bottle

6.12 Specific protein antibody coated plate, having 96 wells coated with specific protein antibody

on bottom of wells.
6.13 Gel filtration columns.
7 Reagents and media

All reagents shall have the quality suitable for biological needs. Some of the media are available in the

market.

7.1 Water, which shall be analytical-grade water for microbiological media preparation, which is ion-

exchanged and/or freshly distilled and/or ultra–filtered and/or filtered with reverse osmosis (RO) or

ISO 3696 grade 3.
7.2 Phosphate buffered saline PBS (-)

7.2.1 Prepare a measuring flask of 1 l, and put the following chemicals into a flask (6.1):

— sodium chloride (NaCl), 8 g;
— potassium chloride (KCl), 0,2 g;
— disodium hydrogen phosphate 12H O (Na HPO , 12H O), 2,9 g;
2 2 4 2
— potassium dihydrogen phosphate (KH PO ), 0,2 g.
2 4
7.2.2 Add water (7.1) and make up a whole amount to 1 000 ml. Dissolve well.
7.2.3 Transfer the solution (7.2.2) to a culture container (6.11).
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ISO 4333:2022(E)
7.3 Suspension solution of specific protein

7.3.1 Put the polysorbate 20 (7.7), 0,5 g, in the phosphate buffered saline PBS (-) prepared at 7.2,

approximately 700 ml to 800 ml and dissolve well.

7.3.2 Add the solution (7.2) by making up whole amount to 1 000 ml and mixed well.

7.3.3 Then, transfer the solution (7.3.2) to a culture container (6.11).
7.4 ELISA assay reagents, reagents and buffer solutions

ELISA assay reagents, reagents and buffer solutions can be obtained from commercial suppliers which

shall be prepared for use in accordance with the manufacturer’s instructions.

Examples of ELISA assay reagents, reagents and buffer solutions are shown in Annex B.

7.5 Sodium hydroxide solution.
7.6 Hydrochloric acid solution.
7.7 Polysorbate 20.
8 Preparation
8.1 Preparation of test specific protein suspension

Adjust the concentration of specific protein extract to 10 ng/ml to 20 ng/ml by using suspension

solution of specific protein (7.3).

The default concentration of specific protein extract shall be to 10 ng/ml to 20 ng/ml, however, the

concentration of specific protein extract can be allowed to increase up to 100 ng/ml according to the

experience of the laboratories.

Specific protein extracts are available in the market. The storage of the specific protein extracts shall

be in the freezer (6.4) with the temperature below -20 °C and all operation to handle specific protein

extracts shall be done in the biological safety cabinet (6.7).
8.2 Preparation of test specimens

8.2.1 Prepare the test specimens of specific protein reduction test sample as specified in Table 1.

Table 1 — Dimension or mass of specimen
Kind of sample Mass Specimen
0,40 g or more (50 ± 2) mm × (50 ± 2) mm
Fabrics (woven, knitted, nonwoven)
less than 0,40 g 0,40 g ± 0,05 g
Yarns, braid, fibres, wadding and
0,40 g ± 0,05 g
feather
Mass of the fabric specimen with a dimension of (50 ± 2) mm × (50 ± 2) mm.

8.2.2 Prepare six (6) test specimens of the specific protein reduction test sample.

Three (3) specific protein reduction test specimens are used for the control test.

The remaining 3 specific protein reduction test specimens are used for the main test of this document.

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ISO 4333:2022(E)

If untreated fabrics are used for the main test instead of negative control, prepare 6 test specimens

of the untreated fabric. Three untreated fabric test specimens are used for the control test and the

remaining 3 untreated fabric test specimens used for the main test.
8.3 Control test
8.3.1 General
The p
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 4333
Première édition
2022-07
Textiles — Détermination de l’activité
de réduction des protéines spécifiques
provenant du pollen, des acariens
et d’autres sources sur les produits
textiles
Textiles — Determination of reduction activity of specific proteins
derived from pollen, mite and other sources on textile products
Numéro de référence
ISO 4333:2022(F)
© ISO 2022
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ISO 4333:2022(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Tél.: +41 22 749 01 11
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Publié en Suisse
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ISO 4333:2022(F)
Sommaire Page

Avant-propos .............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction .................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ..................................................................................................................................................................................1

3 Termes et définitions ...................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe.......................................................................................................................................................................................................................... 2

5 Protéines spécifiques ...................................................................................................................................................................................... 2

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 2

7 Réactifs et milieux de culture ................................................................................................................................................................3

8 Préparation ............................................................................................................................................................................................................... 4

8.1 Préparation de la suspension de protéines spécifiques pour essai ......................................................... 4

8.2 Préparation des éprouvettes ..................................................................................................................................................... 4

8.3 Essai témoin .............................................................................................................................................................................................. 5

8.3.1 Généralités ............................................................................................................................................................................... 5

8.3.2 Mode opératoire de vérification de la sensibilité de l’essai ELISA ......................................... 5

8.3.3 Exigence de vérification de la sensibilité de l’essai ELISA ............................................................. 5

9 Préparation de la courbe étalon de protéine spécifique .......................................................................................... 6

10 Mode opératoire d’essai ...............................................................................................................................................................................6

10.1 Préparation des éprouvettes ..................................................................................................................................................... 6

10.2 Dépôt de la protéine spécifique sur les éprouvettes ............................................................................................. 6

10.3 Durée de contact ................................................................................................................................................................................... 7

10.4 Récupération des protéines spécifiques des éprouvettes................................................................................ 7

11 Détermination de la concentration en protéines spécifiques ............................................................................. 7

12 Calcul de la concentration en protéines spécifiques et du taux de réduction ....................................7

13 Répétabilité et reproductibilité ........................................................................................................................................... ................7

14 Rapport d’essai ...................................................................................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Protéine spécifique issue du pollen et des acariens..........................................................9

Annexe B (informative) Réactifs pour essai ELISA, réactifs et solutions tampons .........................................10

Annexe C (informative) Dosage d’immunoadsorption par enzyme liée — Mode opératoire

d’essai ELISA en sandwich ......................................................................................................................................................................12

Annexe D (informative) Courbe étalon de protéine spécifique ...........................................................................................13

Annexe E (informative) Taux de récupération .......................................................................................................................................14

Annexe F (informative) Résultat d’essai interlaboratoires ......................................................................................................15

Annexe G (informative) Répétabilité et reproductibilité ...........................................................................................................18

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................20

iii
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 4333:2022(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.

L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents

critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a

été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir

www.iso.org/directives).

L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion

de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 38, Textiles.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
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ISO 4333:2022(F)
Introduction

Des produits textiles spéciaux qui peuvent avoir un effet positif sur le confort et l’hygiène de vie

humaine, tels que les textiles avec traitement antibactérien, antifongique ou antiviral, ont été introduits

sur le marché et se développent d’année en année dans diverses applications.

Néanmoins, la contamination des produits textiles par certaines protéines spécifiques qui présentent

une réaction antigène-anticorps peut également avoir un effet négatif sur le confort et l’hygiène de vie.

Il existe des produits textiles à haute performance qui peuvent réduire la quantité de ces protéines

spécifiques sur lesdits produits.

Ces produits sont relativement nouveaux et bénéficient des avancées techniques réalisées dans

le domaine des technologies textiles et biologiques; en outre, les fabricants ont individuellement

développé des méthodes d’essai afin d’évaluer les performances des produits. Cependant, aucune

méthode d’essai unifiée n’a été élaborée et les consommateurs et les fabricants ne disposent à ce jour

d’aucune information claire sur ces produits fonctionnels.

Dans ce contexte, la nécessité d’élaborer une Norme internationale s’impose aux consommateurs,

distributeurs, fabricants ou autres intervenants en tant que parties prenantes de ce marché.

Le présent document fournit une méthode d’essai quantitative en utilisant le dosage d’immunoadsorption

par enzyme liée ELISA (acronyme issu de l’anglais Enzymed-Linked Immunosorbent Assay) pour évaluer

l’activité de réduction des protéines spécifiques sur les produits textiles en prenant, par exemple,

des protéines provenant du pollen, des fèces d’acariens ou des carcasses.
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 4333:2022(F)
Textiles — Détermination de l’activité de réduction des
protéines spécifiques provenant du pollen, des acariens et
d’autres sources sur les produits textiles

AVERTISSEMENT — Le présent document nécessite l’utilisation de protéines ou substances

issues d’une réaction antigène-anticorps/modes opératoires qui peuvent être préjudiciables à la

santé et à l’environnement si les conditions appropriées ne sont pas respectées. Il fait uniquement

référence à l’aptitude technique et ne dispense aucunement l’utilisateur de satisfaire, à tout

moment, aux obligations légales en matière de santé, de sécurité et d’environnement.

1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode d’essai visant à déterminer l’activité de réduction des

produits textiles vis-à-vis de protéines spécifiques qui présentent une réaction antigène-anticorps.

Le présent document ne spécifie que l’activité de réduction basée sur ces protéines à la surface des

produits textiles. Il ne s’agit pas d’une méthode d’essai visant à évaluer la réaction allergène des êtres

humains.

Les protéines spécifiques qui présentent une réaction antigène-anticorps sont celles issues du pollen,

des acariens et d’autres sources. D’autres protéines spécifiques peuvent être utilisées après une

validation appropriée décrite dans le présent document.

Le dosage d’immunoadsorption par enzyme liée est utilisé pour quantifier ces protéines dans le présent

document.

Le présent document est applicable aux tissus, aux tricots, aux fibres, aux fils, aux tresses, aux matériaux

non tissés, etc.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/ .
3.1
antigène

substance qui est reconnue comme étrangère par le système immunitaire et qui déclenche une réponse

immunitaire en stimulant la production d’anticorps
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.12]
© ISO 2022 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 4333:2022(F)
3.2
anticorps

protéine (immunoglobuline) produite et sécrétée par les lymphocytes B en réponse à une molécule

reconnue comme étrangère (antigène), et qui est capable de se lier à cet antigène spécifique

Note 1 à l'article: Immunoglobuline est le synonyme courant d’anticorps.
[SOURCE: ISO 16577:2016, 3.10]
3.3
protéine spécifique

protéine qui agit en tant qu’antigène et qui est dérivée du pollen, des acariens et d’autres sources

3.4
activité de réduction des protéines spécifiques
taux de réduction de la concentration en une protéine spécifique (3.3)
3.5
agents de réduction des protéines spécifiques

produits chimiques inorganiques ou organiques capables de réduire la concentration en protéines

spécifiques
3.6
étoffe non traitée

étoffe de l’échantillon d’essai sans traitement par agent de réduction de l’antigène

3.7
témoin négatif
essai à blanc visant à confirmer l’effet d’un sac en plastique vide
3.8
essai témoin

essai visant à confirmer que les produits chimiques extraits à partir de l’échantillon d’essai n’ont aucune

influence sur la sensibilité du mesurage ELISA
3.9
dosage d’immunoadsorption par enzyme liée
ELISA

méthode utilisant des anticorps (3.2) ou des antigènes (3.1) liés de manière covalente avec une enzyme

4 Principe

La suspension de protéines spécifiques obtenue à partir de pollen, d’acariens et d’autres sources

est déposée sur une éprouvette. Après une durée de contact spécifique, les protéines spécifiques

restantes du pollen, des acariens et d’autres sources, à l’issue d’une réaction antigènes-anticorps,

sont mesurées à l’aide de la méthode ELISA et l’activité de réduction est calculée par comparaison entre

la concentration dans l’éprouvette et le témoin négatif.
5 Protéines spécifiques

Des exemples de protéines spécifiques dérivées des pollens et des acariens sont présentés à l’Annexe A.

D’autres protéines spécifiques provenant d’autres espèces peuvent être utilisées après des validations

appropriées. Si d’autres espèces sont utilisées, le nom de l’espèce et la raison spécifique de son utilisation

doivent être décrits dans le rapport d’essai.
6 Appareillage
6.1 Fiole jaugée d’une capacité de 1 l.
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6.2 Balance offrant une plage de mesure de 0,001 g à 100 g avec une précision de 1,0 %.

6.3 Micropipette de volume parfaitement adapté à chaque utilisation, à extrémité en verre ou

en plastique, avec une précision inférieure ou égale à 0,5 %.
6.4 Congélateur capable de fonctionner à une température de (−20 ± 2) °C.

6.5 Réfrigérateur capable de fonctionner à une température comprise entre 2 °C et 8 °C.

6.6 pH-mètre équipé d’une électrode en verre, avec une résolution d’au moins ± 0,01 unité de pH.

NOTE Les pH-mètres sont décrits dans l’ISO 3071.
6.7 Poste de sécurité biologique de classe II.

6.8 Incubateur capable de maintenir une température de (25 ± 1) °C et (37 ± 1) °C.

6.9 Lecteur de microplaque capable de mesurer une longueur d’onde comprise entre 450 nm

et 620 nm.

6.10 Sac en polyéthylène avec fermeture à glissière de (60 ± 2) mm × (85 ± 2) mm.

6.11 Boîte de culture cellulaire fabriquée à partir d’une bouteille en verre

6.12 Plaque enduite d’anticorps de protéine spécifique disposant de 96 puits dont le fond

est recouvert d’anticorps de protéine spécifique.
6.13 Colonnes de filtration sur gel.
7 Réactifs et milieux de culture

Tous les réactifs doivent être d’une qualité adaptée aux besoins biologiques. Certains milieux de culture

sont disponibles dans le commerce.

7.1 Eau qui doit être de qualité analytique pour la préparation de milieux de culture microbiologiques,

qui est fraîchement distillée ou traitée par échange d’ions, par ultrafiltration ou par osmose inverse

ou toute combinaison de ces méthodes, ou de grade 3 selon l’ISO 3696.
7.2 Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (-).

7.2.1 Préparer une fiole jaugée de 1 l puis y ajouter les produits chimiques suivants (6.1):

— chlorure de sodium (NaCl), 8 g;
— chlorure de potassium (KCl), 0,2 g;
— hydrogénophosphate disodique 12H O (Na HPO , 12H O), 2,9 g;
2 2 4 2
— dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ), 0,2 g.
2 4
7.2.2 Ajouter de l’eau (7.1) pour remplir jusqu’à 1 000 ml. Bien dissoudre.

7.2.3 Transférer la solution (7.2.2) dans une boîte de culture cellulaire (6.11).

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7.3 Solution de suspension de protéine spécifique

7.3.1 Ajouter 0,5 g de polysorbate 20 (7.7) dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (-)

préparée en 7.2, environ 700 ml à 800 ml et bien faire dissoudre.

7.3.2 Ajouter la solution (7.2) pour compléter le volume total à 1 000 ml et bien mélanger.

7.3.3 Transférer ensuite la solution (7.3.2) dans une boîte de culture cellulaire (6.11).

7.4 Réactifs pour essai ELISA, réactifs et solutions tampons

Les réactifs pour essai ELISA, les réactifs et les solutions tampons peuvent être obtenus auprès

de fournisseurs commerciaux qui doivent être préparés en vue d’une utilisation conformément aux

instructions du fabricant.

Des exemples de réactifs pour essai ELISA, de réactifs et de solutions tampons sont disponible dans

l’Annexe B.
7.5 Solution d’hydroxyde de sodium.
7.6 Solution d’acide chlorhydrique.
7.7 Polysorbate 20.
8 Préparation
8.1 Préparation de la suspension de protéines spécifiques pour essai

Ajuster la concentration de l’extrait de protéine spécifique à une valeur comprise entre 10 ng/ml

et 20 ng/ml en utilisant une solution de suspension de protéine spécifique (7.3).

La concentration par défaut de l’extrait de protéine spécifique doit être de 10 ng/ml à 20 ng/ml,

cependant, la concentration de l’extrait de protéine spécifique peut augmenter jusqu’à 100 ng/ml selon

l’expérience des laboratoires.

Des extraits de protéines spécifiques sont disponibles sur le marché. Les extraits de protéine spécifique

doivent être stockés dans un congélateur (6.4) à une température inférieure à −20 °C et toutes les

opérations de manipulation des extraits de protéine spécifique doivent être effectuées à l’intérieur

du poste de sécurité biologique (6.7).
8.2 Préparation des éprouvettes

8.2.1 Préparer les éprouvettes de l'échantillon d'essai de réduction protéique spécifique

conformément au Tableau 1.
Tableau 1 — Dimension ou masse d’éprouvette
Type d’échantillon Masse Éprouvette
0,40 g ou plus (50 ± 2) mm × (50 ± 2) mm
Étoffes (tissu, tricot, non-tissé)
moins de 0,40 g 0,40 g ± 0,05 g
Fils, tresses, fibres, ouate et plumes 0,40 g ± 0,05 g
Masse de l’éprouvette d’étoffe avec une dimension de (50 ± 2) mm × (50 ± 2) mm.
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8.2.2 Obtenir six (6) éprouvettes de l’échantillon d’essai de réduction des protéines spécifiques.

Trois (3) éprouvettes de réduction des protéines spécifiques sont utilisées pour l’essai témoin.

Les 3 éprouvettes restantes de réduction des protéines spécifiques sont utilisées pour l’essai principal

du présent document.

Si des étoffes non traitées sont utilisées pour l’essai principal au lieu du témoin négatif,

obtenir 6 spécimens de l’étoffe non traitée. Trois (3) spécimens d’étoffes non traitées sont utilisés

pour l’essai témoin et les 3 autres spécimens d’étoffes non traitées sont utilisés pour l’essai principal.

8.3 Essai témoin
8.3.1 Généralités

L’objectif de l’essai témoin est de confirmer que les produits chimiques de l’éprouvette ne réduisent pas

la sensibilité de l’essai ELISA. En cas d’utilisation d’un kit commercial, se reporter à la fiche technique.

8.3.2 Mode opératoire de vérification de la sensibilité de l’essai ELISA

8.3.2.1 Mettre 3 éprouvettes de réduction des protéines spécifiques dans chaque sac avec fermeture

à glissière (6.10) et ajouter 1 ml de solution de suspension de protéine spécifique (7.3).

8.3.2.2 Plier l’éprouvette en quatre ou plus dans le sac et la presser immédiatement dans le sac

tel quel.

8.3.2.3 Recueillir la solution dans le sac, prélever 0,1 ml de la solution à l’aide d’une micropipette (6.3).

Introduire la solution dans les 2 puits de la plaque d’enduction d’anticorps de protéine spécifique (6.12).

En outre, prélever 0,1 ml de la solution de suspension de protéine spécifique (7.3) à l’aide d’une

micropipette (6.3) en tant que témoin négatif et l’introduire dans les 2 puits de la plaque (6.12).

8.3.2.4 Maintenir à 25 °C dans un incubateur (6.8) pendant (30 ± 5) min. Ensuite, retirer la solution

du puits et laver le puits trois fois avec 300 μl de solution de suspension de protéine spécifique (7.3).

8.3.2.5 Déterminer la concentration de la suspension de protéines spécifiques de l’essai par la

méthode d’essai ELISA en utilisant la plaque (voir 8.3.2.4) décrite à l’Annexe C.

8.3.3 Exigence de vérification de la sensibilité de l’essai ELISA

Calculer les concentrations en protéines spécifiques pour le témoin négatif et l’éprouvette. Obtenir

les valeurs en utilisant la Formule (1). Les exigences relatives à la vérification de la sensibilité de

l’essai ELISA doivent satisfaire à la Formule (1).
| (S - S ) /S × 100 |< 20 % (1)
n t n

S est la moyenne de la concentration en protéines spécifiques (ng/ml) obtenue à partir de 3 témoins

négatifs;

S est la moyenne de la concentration en protéines spécifiques (ng/ml) obtenue à partir des

3 éprouvettes de réduction des protéines spécifiques.
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Si des étoffes non traitées sont utilisées pour l’essai principal au lieu du témoin négatif, les exigences

relatives à la vérification de la sensibilité de l’essai ELISA doivent également satisfaire à la Formule (2).

| (S - S )/S × 100 |< 20 % (2)
n u n

où S est la moyenne de la concentration en protéines spécifiques (ng/ml) obtenue à partir

des 3 éprouvettes d’étoffe non traitée.

Si la valeur ci-dessus est ≥ 20 %, il est nécessaire d’éliminer avec précaution le facteur négatif

par rapport à la sensibilité de l’essai ELISA dans la solution (voir 8.3.2.2) en sélectionnant la méthode

suivante en fonction du facteur.

a) Mesurer le pH de la solution à l’aide d’un pH-mètre (6.6). Le pH de la solution (voir 8.3.2.2) doit être

ajusté à un pH de (7,0 ± 0,2) en ajoutant de la solution d’hydroxyde de sodium ou la solution d’acide

chlorhydrique.

b) La solution (voir 8.3.2.2) doit être filtrée à l’aide des colonnes de filtration sur gel (6.13).

Si la solution (voir 8.3.2.2) est modifiée, la même condition doit être appliquée à la solution obtenue

en 10.4.
9 Préparation de la courbe étalon de protéine spécifique

Le mode opératoire de préparation de la courbe étalon de la protéine spécifique est le suivant. La courbe

doit être obtenue avant l’essai à chaque temps d’essai.

Préparer la courbe étalon de protéine spécifique en utilisant 7 points. La plage de concentration doit

être proche de la concentration limite de détection à 20 ng/ml.

a) Diluer l’extrait de protéine spécifique avec la solution de suspension (7.3) pour préparer des

dilutions par un facteur 2 ayant une concentration précise.

b) Mesurer l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaque (6.9) à 450 nm de chaque série de dilution

des protéines spécifiques par essai ELISA.
Un exemple de courbe étalon de protéines spécifiques est présenté à l’Annexe D.

Une autre courbe étalon de protéines spécifiques peut être utilisée après validation appropriée.

En cas d’utilisation d’un kit commercial, se reporter à la fiche technique.
10 Mode opératoire d’essai
10.1 Préparation des éprouvettes

Toutes les éprouvettes sont préparées dans des sacs munis d’une fermeture à glissière (6.10).

10.2 Dépôt de la protéine spécifique sur les éprouvettes

Déposer exactement 1,0 ml de la suspension protéique spécifique préparée en 8.1 sur l’échantillon,

en un point du centre de l’échantillon, dans des sacs avec fermeture à glissière et dans les 3 sacs

avec fermeture à glissière pour le témoin négatif en utilisant une micropipette (6.3). Fermer ensuite

tous les sacs.

Le volume de dépôt par défaut sur l’éprouvette doit être de 1 ml, cependant, s’il est difficile de récupérer

la suspension après avoir déposé la solution sur l’éprouvette, le volume de dépôt peut être augmenté

jusqu’à 5 ml.
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10.3 Durée de contact

Placer les sacs avec fermeture à glissière de 10.2 dans l’incubateur (6.8) et les y conserver pendant une

durée de contact spécifiée de 2 heures à une température de 25 °C.

La durée de contact peut être modifiée à la convenance de la partie intéressée, mais sans

excéder 24 heures.
10.4 Récupération des protéines spécifiques des éprouvettes

Après avoir été mis en contact pendant 2 h en 10.3, plier les éprouvettes en quatre plis ou plus dans le

sac et les extraire du sac pour récupérer les protéines spécifiques.
11 Détermination de la concentration en protéines spécifiques

Déterminer la concentration en protéines spécifiques de la suspension protéique spécifique récupérée

en 10.4 par l’essai ELISA conformément à l’Annexe C.
En cas d’utilisation d’un kit commercial, se reporter à la fiche technique.
12 Calcul de la concentration en protéines spécifiques et du taux de réduction

12.1 Calculer la concentration en protéines spécifiques, exprimée en ng/ml à partir de l’équation de la

courbe étalon.

12.2 Calculer le taux de réduction des protéines spécifiques en comparant la prise d’essai de réduction

des protéines spécifiques et le témoin négatif à l’aide de la Formule (3):
P = (R -R )/R × 100 (3)
n t n
P est le taux de réduction de la concentration en protéines spécifiques en %;

R est la moyenne de la concentration en protéines spécifiques (ng/ml) récupérée sur trois sacs

pour le témoin négatif après 2 h;

R est la moyenne de la concentration en protéines spécifiques (ng/ml) récupérée sur trois prises

d’essai de réduction des protéines spécifiques après 2 h.

Si des étoffes non traitées sont disponibles et que la partie concernée le demande, l’effet des agents de

réduction de protéines spécifiques est calculé par la Formule (4).
P = (R – R ) / R × 100 (4)
u t u

R est la moyenne de la concentration en protéines spécifiques (ng/ml) récupérée sur trois prises

d’essai non traitées de réduction des protéines spécifiques après 2 h.
13 Répétabilité et reproductibilité

L’essai interlaboratoires a été réalisé avec la participation de 5 laboratoires et les résultats sont

présentés à l’Annexe F. La répétabilité et la reproductibilité ont été calculées sur la base de l’Annexe F

et les résultats sont présentés à l’Annexe G.
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14 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comporter les informations suivantes:
a) une référence au présent document, c’est-à-dire l’ISO 4333:2022;
b) l’identification de l
...

Questions, Comments and Discussion

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