ISO 20184-2:2018

Molecular in vitro diagnostic examinations - Specifications for pre-examination processes for frozen tissue - Part 2: Isolated proteins

This document gives guidelines on the handling, documentation, storage and processing of frozen tissue specimens intended for the examination of isolated proteins during the pre-examination phase before a molecular assay is performed. This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic examination performed by medical laboratories and molecular pathology laboratories that evaluate proteins isolated from frozen tissue. It is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, institutions and commercial organisations performing biomedical research, and regulatory authorities. NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics covered in this document.

Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour les tissus congelés — Partie 2: Protéines extraites

Le présent document fournit des lignes directrices concernant la manipulation, la documentation, le stockage et le traitement de prélèvements de tissus congelés destinés à l'analyse des protéines extraites, durant la phase préanalytique précédant la réalisation d'un essai moléculaire. Le présent document s'applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro réalisées par des laboratoires de biologie médicale et des laboratoires de pathologie moléculaire qui évaluent les protéines extraites de tissus congelés. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs et fabricants de l'industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également s'appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 06-Nov-2018
• ICS: 11.100.10 - In vitro diagnostic test systems
• Technical Committee: ISO/TC 212 - Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems
• Drafting Committee: ISO/TC 212/WG 4 - Microbiology and molecular diagnostics
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 12-Dec-2024
• Completion Date: 13-Dec-2025

Overview

ISO 20184-2:2018 - "Molecular in vitro diagnostic examinations - Specifications for pre-examination processes for frozen tissue - Part 2: Isolated proteins" provides standardized guidance for the pre-examination handling of frozen tissue when the intended downstream assay analyzes isolated proteins. The standard covers the chronology from specimen collection and transport through laboratory reception, freezing, protein isolation, quality/quantity assessment and storage of both frozen tissue and isolated protein analytes. It is explicitly intended for molecular in vitro diagnostic workflows and excludes chemically stabilized tissues and immunohistochemistry.

Key topics and requirements

• Pre-examination workflow: Defines steps that start with the clinical request and end when the analytical assay begins, emphasizing traceability and documented procedures.
• Specimen collection & transport: Guidance on information to capture about the donor/patient and specimen, and precautions to minimize pre-analytical changes (e.g., effects of warm and cold ischemia).
• Reception and pathology evaluation: Requirements for recording specimen reception, pathology assessment and selection of appropriate sample(s) for protein isolation.
• Freezing and storage: Procedures and documentation for freezing tissue and for the storage and long-term archiving of tissue and isolated proteins to preserve protein integrity and stability.
• Protein isolation: Recommendations on isolating total protein using commercial kits or laboratory-developed protocols, including validation/verification considerations.
• Quality and quantity assessment: Requirements for evaluating isolated protein amount and integrity prior to molecular assays.
• Documentation & traceability: Emphasis on recording critical pre-analytical variables that can alter protein profiles (e.g., ischemia, handling) and on meeting regulatory or local requirements.

Practical applications

ISO 20184-2:2018 helps reduce pre-analytical variability that can bias molecular diagnostic results by standardizing how frozen tissue and isolated proteins are handled before analysis. Practical uses include:

• Improving reliability and reproducibility of protein-based molecular assays in clinical diagnostics.
• Defining SOPs in molecular pathology laboratories for specimen management, freezing, and protein extraction.
• Informing biobank protocols for collection, storage and distribution of frozen tissue and isolated protein samples.
• Guiding IVD developers and manufacturers in designing assays and instructions that account for pre-examination variables.
• Supporting regulatory compliance and audit readiness by documenting pre-analytical controls and validations.

Who should use this standard

• Medical laboratories and molecular pathology laboratories
• Biobanks and biomedical research institutions
• In vitro diagnostics (IVD) developers and manufacturers
• Laboratory customers, commercial research organizations, and regulatory authorities

Related standards

• ISO 15189:2012 - Medical laboratories - Requirements for quality and competence (referenced normative standard)
• Other parts of the ISO 20184 series (see ISO website for full list)

Keywords: ISO 20184-2:2018, molecular in vitro diagnostic, pre-examination processes, frozen tissue, isolated proteins, protein isolation, cold ischemia, molecular pathology, biobanking, ISO 15189.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20184-2
First edition
2018-11
Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications for
pre-examination processes for frozen
tissue —
Part 2:
Isolated proteins
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour les tissus congelés —
Partie 2: Protéines extraites
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Fax: [phone]
Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 1
4 General considerations . 4
5 Outside the laboratory . 5
5.1 Specimen collection . 5
5.1.1 General. 5
5.1.2 Information about the specimen donor/patient . 5
5.1.3 Information about the specimen . 6
5.1.4 Specimen processing . 6
5.2 Fresh tissue transport requirements . 6
5.2.1 General. 6
5.2.2 Preparations for the transport . 7
5.2.3 During transport . 7
6 Inside the laboratory . 7
6.1 Information about the reception of the specimen . 7
6.2 Evaluation of the pathology of the specimen and selection of the sample(s) . 7
6.3 Freezing of the specimen or sample(s) . 8
6.4 Storage requirements .10
6.5 Isolation of total protein .10
6.5.1 General.10
6.5.2 Using commercial kits .11
6.5.3 Using the laboratories own protocols .11
6.6 Quantity and quality assessment of isolated proteins .11
6.7 Storage of isolated total protein .12
Annex A (informative) Quantitative protein examination demonstrates changes of protein
amounts during cold ischemia .13
Bibliography .17
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
A list of all parts in the ISO 20184 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
Molecular in vitro diagnostics, including molecular pathology, has enabled a significant progress in
medicine. Further progress is expected with new technologies analysing nucleic acids, proteins, and
metabolites in human tissues and body fluids. However, the profiles and/or integrity of these molecules
can change drastically during specimen collection, transport, storage, and processing thus making the
outcome from diagnostics or research unreliable or even impossible because the subsequent examination
assay will not determine the situation in the patient but an artificial molecular pattern generated during
the pre-examination process. Therefore, a standardization of the entire process from specimen collection
to the protein examination is needed. Studies have been undertaken to determine the important
influencing factors. This document draws upon such work to codify and standardize the steps for frozen
tissue with regard to protein examination in what is referred to as the pre-examination phase.
Protein profiles and protein–protein interactions in tissues can change drastically before, during (e.g.
due to warm ischemia) and after tissue collection (e.g. due to cold ischemia). The changes are caused
by e.g. gene induction, gene down regulation, protein degradation. Protein species amounts can change
differently in different donors’/patients’ tissues. The expression of genes can be influenced by the given
treatment or intervention (surgery, biopsy), or drugs administered for anaesthesia or even treatment of
concomitant disease as well as by the different environmental conditions after the tissue removal from
the body.
Therefore, it is essential to take special measures to minimize the described protein profile changes
and modifications within the tissue for subsequent examination.
Tissues that have undergone chemical stabilization pre-treatment before freezing are not covered in this
document. In addition this document is not applicable to protein examination by immunohistochemistry.
In this document, the following verbal forms are used:
— "shall" indicates a requirement;
— "should" indicates a recommendation;
— "may" indicates a permission;
— "can" indicates a possibility or a capability.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20184-2:2018(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for pre-examination processes for frozen
tissue —
Part 2:
Isolated proteins
1 Scope
This document gives guidelines on the handling, documentation, storage and processing of frozen
tissue specimens intended for the examination of isolated proteins during the pre-examination phase
before a molecular assay is performed.
This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic examination performed by medical
laboratories and molecular pathology laboratories that evaluate proteins isolated from frozen tissue. It
is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers,
biobanks, institutions and commercial organisations performing biomedical research, and regulatory
authorities.
NOTE International, national or regional regulations or requirements can also apply to specific topics
covered in this document.
2  Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189:2012, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
3  Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 15189 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
aliquot
portion of a larger amount of homogenous material, assumed to be taken with negligible sampling error
Note 1 to entry: The term is usually applied to fluids. Tissues are heterogeneous and therefore cannot be
aliquoted.
Note 2 to entry: The definition is derived from the Compendium of Chemical Terminology Gold Book. International
Union of Pure and Applied Chemistry. Version 2.3.3., 2014; the PAC, 1990,62,1193 (Nomenclature for sampling in
analytical chemistry (Recommendations 1990)) p. 1206; and the PAC 1990, 62, 2167 [Glossary of atmospheric
chemistry terms (Recommendations 1990)] p. 2173.
3.2
ambient temperature
unregulated temperature of the surrounding air
3.3
analyte
component represented in the name of a measurable quantity
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2]
3.4
analytical test performance
accuracy, precision, and sensitivity of a test to measure the analyte of interest
Note 1 to entry: Other test performance characteristics such as robustness, repeatability can apply as well.
3.5
cold ischemia
condition after removal of the tissue from the body until stabilization or fixation
3.6
diagnosis
identification of a health or disease state from its signs and/or symptoms, where the diagnostic process
can involve examinations and tests for classification of an individual's condition into separate and
distinct categories or subclasses that allow medical decisions about treatment and prognosis to be made
3.7
examination
analytical test
set of operations having the object of determining the value or characteristics of a property
Note 1 to entry: Processes that start with the isolated analyte and include all kinds of parameter testing or
chemical manipulation for quantitative or qualitative examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modified — The term and definition is used here without the original
notes.]
3.8
grossing
gross examination
inspection of pathology specimens with the bare eye to obtain diagnostic information, while being
processed for further microscopic examination
3.9
homogeneous
uniform in structure and composition
3.10
pre-examination processes
preanalytical phase
preanalytical workflow
processes that start, in chronological order, from the clinician’s request and include the examination
request, preparation and identification of the patient, collection of the primary sample(s), transportation
to and within the medical or pathology laboratory, isolation of analytes, and end when the analytical
examination begins
Note 1 to entry: The pre-examination phase includes preparative processes that influence the outcome of the
intended examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modified — An additional term was added and more detail was
included.]
2 © ISO 2018 – All rights reserved

3.11
primary sample
specimen
discrete portion of a body fluid, breath, hair or tissue taken for examination, study or analysis of one or
more quantities or properties assumed to apply for the whole
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modified — The term and definition is used here without the
original notes.]
3.12
protein
type of biological macromolecules composed of one or more chains with a defined sequence of amino
acids connected through peptide bonds
3.13
protein profile
amounts of the individual protein molecules that are present in a sample and that can be measured in
the absence of any losses, inhibition and interference
3.14
protein species
amounts of a chemically clearly-defined protein corresponding to one spot on a high-performance two-
dimensional gel electrophoresis pattern
[SOURCE: Jungblut et. al.1996]
3.15
PTM
post translational modifications
chemical alterations to a primary protein structure, often crucial for conferring biological activity on
a protein
[SOURCE: Encyclopedia of Psychopharmacology, 2010]
3.16
room temperature
temperature which is defined as 18 °C to 25 °C
Note 1 to entry: Local or national regulations can have different definitions.
3.17
sample
one or more parts taken from a primary sample
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modified — The example was not taken over.]
3.18
stability
ability of a sample material, when stored under specified conditions, to maintain a stated property
value within specified limits for a specified period of time
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.15, modified — The words “reference material” were replaced by
“sample material", “characteristic” has been replaced by “ability” and Note 1 to entry has been changed.]
Note 1 to entry: The analyte for the purpose of this document is isolated protein.
3.19
storage
prolonged interruption of the pre-analytical workflow of a sample or analyte respectively, or of their
derivatives e.g., stained sections or tissue blocks, under appropriate conditions in order to preserve
their properties
Note 1 to entry: Long-term storage typically occurs in laboratory archives or in biobanks.
3.20
validation
confirmation, throughout the provision of objective evidence, that the requirements for a specific
intended use or application have been fulfilled
Note 1 to entry: The term “validated” is used to designate the corresponding status.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modified — Note 1 and Note 3 where not taken over.]
3.21
verification
confirmation, through provision of objective evidence, that specified requirements have been fulfilled
Note 1 to entry: The term “verified” is used to designate the corresponding status.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.12, modified — Note 1 and Note 2 where not taken over.]
Note 2 to entry: Confirmation can comprise activities such as:
— performing alternative calculations;
— comparing a new design specification with a similar proven design specification;
— undertaking tests and demonstrations;
— reviewing documents prior to issue.
3.22
warm ischemia
condition before the tissue is removed from the body, but where it is deprived of its normal blood supply
3.23
workflow
series of activities necessary to complete a task
4 General considerations
For general statements on medical laboratory quality management systems and in particular on
specimen collection, reception, and handling (including avoidance of cross contaminations) see
ISO 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6, or ISO/IEC 17020:2012, Clause 8 and 7.2. The requirements on
laboratory equipment, reagents, and consumables in accordance with ISO 15189:2012, 5.3 shall be
followed; ISO 15189:2012, 5.5.1.2 and 5.5.1.3, and ISO/IEC 17020:2012, 6.2 can also apply.
All steps of a diagnostic workflow can influence the final analytical test result. Thus, the entire
workflow including biomolecule stability and sample storage conditions shall be verified and validated.
Workflow steps which cannot always be controlled (e.g. warm ischemia) shall be documented. A risk
assessment of non-controllable workflow steps including their potential impact on the examination test
performance shall be performed and mitigation measures shall be established to enable the required
examination test performance.
The stability of the specific proteins to be examined and their posttranslational modifications (if
important for the assay) should be investigated throughout the complete pre-examination process
prior to the development and implementation of an examination test (e.g. by performing a time course
experiment or study; see also Annex A and Reference [8]).
4 © ISO 2018 – All rights reserved

Before tissues are stabilized by freezing, protein amounts, conformations and binding status can change
e.g. by protein degradation and altered synthesis following gene induction, gene down regulation, RNA
degradation, and changes of the biochemical pathway and energy status. These effects depend on the
duration of warm and cold ischemia and the ambient temperature before freezing. In addition, the
described effects can vary in different donors’/patients’ tissues.
Generally, the longer the duration of warm and cold ischemia and the higher the ambient temperature
before freezing the tissue specimen, the higher is the risk that changes in the protein profile can occur.
NOTE Prolonged cold ischemia durations result in changes of protein (e.g. cytokeratin 18) and
[8][9] [10]
phosphoprotein (e.g. phospho-p42/44) amounts . Keeping the specimen on wet-ice diminishes this effect .
Protein amounts as well as posttranslational modifications can also vary during the pre-examination phase,
depending on the origin and type of tissue, the underlying disease, the surgical procedure, the drug regimen,
and drugs administered for anaesthesia or treatment of concomitant disease and on the different environmental
conditions after the tissue removal from the body.
As warm ischemia cannot be easily standardized, its duration shall be documented. When it is not
possible to avoid cold ischemia, its duration shall be documented and temperatures of the specimen
container's surroundings shall be documented. Where the specimen is transported to another facility
for freezing, the transport duration shall be documented and the ambient conditions should also be
documented.
Safety regulations on transport and handling shall be followed (see ISO 15189:2012, 5.2.3 and 5.4.5,
and ISO 15190).
During the whole pre-examination process precautions shall be taken to avoid cross contamination
between different specimens/samples, e.g. by using single-use material whenever feasible or
appropriate cleaning procedures between processing of different specimens/samples.
If a commercial product is not used in accordance with the manufacturer’s instructions, responsibility
for its use and performance lies with the user.
5 Outside the laboratory
5.1 Specimen collection
5.1.1 General
For the collection of the specimen, the requirements (e.g. disease condition, specimen size) for intended
molecular examination (see also Clause 6) should be considered.
See also ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2  Information about the specimen donor/patient
The documentation shall include the ID of the specimen donor/patient, which can be in the form of a code.
The documentation should include, but is not limited to:
a) the relevant health status of the specimen donor/patient (e.g. healthy, disease type, concomitant
disease, demographics [e.g. age and gender]);
b) the information about routine medical treatment and special treatment prior to tissue collection
(e.g. anaesthetics, medications, surgical or diagnostic procedures);
c) the appropriate consent from the specimen donor/patient.
5.1.3  Information about the specimen
The documentation shall include, but is not limited to:
a) the start of ischemia within the body (warm ischemia) by documentation of the ischemia-relevant
vessel ligation/clamping time point (usually arterial clamping time);
NOTE Not needed where small tissue biopsy resection for freezing is performed.
b) the time and date when tissue is removed from the body and the method of removal (e.g. core-
needle biopsy, resection, biopsy device used for the collection);
c) the description of tissue type and origin, tissue condition (e.g. diseased, unaffected by the disease)
including references to any marking applied in or outside the operating theatre made by surgeon,
radiologist or pathologist;
If the freezing of the tissue is performed outside the laboratory, the documentation of steps described
under 6.2, where pathology evaluation is required, and 6.3 has to be performed.
The documentation should also include the ID of the responsible person collecting the specimen.
5.1.4 Specimen processing
Tissues that need to be frozen for diagnostic purposes can originate from a large tissue specimen or
can be a small tissue specimen like biopsies e.g. taken by endoscopy or taken from patients during a
surgical procedure where fast frozen section diagnosis is required.
NOTE Post-mortem tissues can be frozen for diagnostic purposes. However, preservation of protein is
dependent on the time interval between death and autopsy and the temperature of storage of the body after death.
Any additions or modifications to the specimen after removal from the body (e.g. labelling for the
orientation of the specimen [e.g. ink-marking, stitches, incision(s)]) shall be documented.
Where a pathology diagnosis is required on the specimen, sampling shall be performed by or under
supervision or guidance of a medically qualified (e.g. board certified) pathologist (see 6.2).
Where the specimen was removed without the requirement of a pathology diagnosis, the evaluation,
selection and documentation of specimens may be done by other qualified persons than pathologists.
The freezing of the specimen or samples taken from the specimen can be performed outside the
laboratory or inside the laboratory.
Cold ischemia can influence the protein profile; therefore direct freezing should be preferred.
a) In case the specimen or sample is frozen outside the laboratory, proceed with 6.2 without delay.
b) In case the specimen or sample is frozen inside the laboratory, fresh tissue specimens need to be
transported to the laboratory. The steps described under 5.2 for fresh tissue transport shall be
performed without delay.
5.2 Fresh tissue transport requirements
5.2.1 General
Where transport of the specimen or sample to the laboratory is required for freezing, the laboratory
in collaboration with the clinical or surgery department shall establish a protocol for the transport
procedure of the tissue.
6 © ISO 2018 – All rights reserved

5.2.2  Preparations for the transport
The following steps shall be performed:
a) the selection and use of containers and packages (e.g. cooling box, box for storing and transportation,
vacuum packaging) according to applicable transport regulations;
b) the selection and use of stabilization procedures (e.g. cooling methods) for transport;
NOTE Accidentally freezing the tissue (e.g. by using cool packs in a wrong manner) can lead to protein
degradation when the tissue thaws. It can also impact the morphological characterization.
c) the labelling of the container (e.g. registration-number, barcode, specimen type, quantity, and
organ tissue of origin) and additional documentation [information as specified in 5.1.2, 5.1.3, 5.1.4
and 5.2.2 a) and b)].
Several specimens from the same patient/donor sharing similar features (macroscopic appearance,
tissue type, disease status, anatomical location) may be put into a single container/container
compartment.
Specimens should be transferred without delay into the container after the removal from the body. The
container should then be kept on wet-ice or at 2 °C to 8 °C in order to minimize protein profile changes.
The temperatures of the container's surroundings during cold ischemia (e.g. temperatures in different
rooms, transport) should be documented. If temperature is not measured, the temperature ranges
should be estimated by classification as ambient temperature, room temperature, or at 2 °C to 8 °C.
5.2.3 During transport
Temperature monitoring should be applied in a suitable manner.
If the specimen is not already frozen, it should be transported on wet-ice or at 2 °C to 8 °C without delay
in order to minimize the changes to the protein profile.
NOTE There is evidence that proteins in tissues can be stabilized in plastic bags under vacuum and when
kept at 0 °C to 4 C° during transport before the samples are frozen for biobanks or use
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20184-2
Première édition
2018-11
Analyses de diagnostic moléculaire in
vitro — Spécifications relatives aux
processus préanalytiques pour les
tissus congelés —
Partie 2:
Protéines extraites
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-
examination processes for frozen tissue —
Part 2: Isolated proteins
Numéro de référence
©
ISO 2018
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Fax: [phone]
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2018 – Tous droits réservés

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3  Termes et définitions . 1
4 Considérations générales . 5
5 Hors du laboratoire . 6
5.1 Recueil des prélèvements . 6
5.1.1 Généralités . 6
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient . 6
5.1.3 Informations relatives au prélèvement . 6
5.1.4 Traitement du prélèvement . . 6
5.2 Exigences relatives au transport de tissus frais . 7
5.2.1 Généralités . 7
5.2.2 Préparation pour le transport . 7
5.2.3 Au cours du transport . 8
6 Dans le laboratoire . 8
6.1 Informations relatives à la réception du prélèvement . 8
6.2 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons . 8
6.3 Congélation du prélèvement, du ou des échantillons . 9
6.4 Exigences relatives au stockage .11
6.5 Extraction des protéines totales .12
6.5.1 Généralités .12
6.5.2 Utilisation de kits commerciaux .12
6.5.3 Utilisation des protocoles propres aux laboratoires .12
6.6 Évaluation quantitative et qualitative de protéines extraites .13
6.7 Stockage des protéines totales extraites .13
Annexe A (informative) L’analyse protéique quantitative démontre les variations de
quantités de protéines pendant l’ischémie froide.15
Bibliographie .19
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d'analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20184 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
iv © ISO 2018 – Tous droits réservés

Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro, y compris la pathologie moléculaire, a permis de faire considérablement
progresser la médecine. D’autres avancées sont attendues avec les nouvelles technologies d’analyse des
acides nucléiques, des protéines et des métabolites dans les tissus humains et les fluides corporels.
Toutefois, les profils et/ou l’intégrité de ces molécules peuvent varier considérablement au cours du
prélèvement des échantillons primaires, du transport, du stockage et du traitement, et engendrer ainsi
un résultat de diagnostic ou de recherche peu fiable, voire impossible, car l’essai analytique subséquent
ne déterminera pas l’état du patient, mais un motif moléculaire artificiel généré pendant le processus
préanalytique. Par conséquent, une normalisation de l’ensemble du processus, allant du prélèvement
des échantillons primaires jusqu’à l’analyse des protéines, est nécessaire. Des études ont été réalisées
afin de définir les facteurs ayant un impact important. Le présent document se fonde sur ces travaux
pour codifier et normaliser les étapes des processus dits de la phase préanalytique pour tissus congelés
au regard de l’analyse des protéines.
Les profils protéiques et les interactions protéine‑protéine dans les tissus peuvent considérablement
varier avant, pendant (par exemple en raison d’une ischémie chaude) et après le prélèvement (par
exemple en raison d’une ischémie froide). Ces variations sont par exemple provoquées par une induction
de gènes, une régulation à la baisse de l’expression de gènes ou une dégradation des protéines. Les
quantités d’espèces protéiques peuvent varier dans les tissus des différents donneurs/patients.
L’expression des gènes peut être influencée par le traitement donné ou l’intervention réalisée (chirurgie,
biopsie) ou par les médicaments administrés pour l’anesthésie, voire pour le traitement d’une maladie
concomitante, ainsi que par les différentes conditions environnementales après le prélèvement des
tissus sur l’organisme.
Il est donc essentiel de prendre des mesures particulières afin de réduire le plus possible, au sein des
tissus, les changements et modifications de profil protéique décrits, pour l’analyse ultérieure.
Le présent document ne couvre pas les tissus ayant subi un prétraitement de stabilisation chimique
avant la congélation. En outre, le présent document n’est pas applicable pour l’analyse des protéines par
immunohistochimie.
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
— «doit» indique une exigence;
— «il convient de/que» indique une recommandation;
— «peut/il est admis/permis» indique une autorisation;
— «peut/il est possible» indique une possibilité ou une capacité.
NORME INTERNATIONALE ISO 20184-2:2018(F)
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro —
Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour
les tissus congelés —
Partie 2:
Protéines extraites
1 Domaine d’application
Le présent document fournit des lignes directrices concernant la manipulation, la documentation, le
stockage et le traitement de prélèvements de tissus congelés destinés à l’analyse des protéines extraites,
durant la phase préanalytique précédant la réalisation d’un essai moléculaire.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro réalisées par des
laboratoires de biologie médicale et des laboratoires de pathologie moléculaire qui évaluent les protéines
extraites de tissus congelés. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des
développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des
institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des
autorités de réglementation.
NOTE Des réglementations ou exigences internationales, nationales ou régionales peuvent également
s’appliquer à des sujets spécifiques traités dans le présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 15189:2012, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
3  Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 15189 ainsi que les
suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
3.1
aliquote
partie d’une quantité plus importante d’un matériau homogène, prélevée avec une erreur
d’échantillonnage supposée négligeable
Note 1 à l'article: Le terme s’applique généralement à des fluides. Les tissus sont hétérogènes et ne peuvent donc
pas être aliquotés.
Note 2 à l'article: La définition est issue du Compendium of Chemical Terminology Gold Book. International
Union of Pure and Applied Chemistry. Version 2.3.3., 2014; the PAC, 1990,62,1193 (Nomenclature for sampling
in analytical chemistry (Recommendations 1990)) p. 1206; et the PAC 1990, 62, 2167 [Glossary of atmospheric
chemistry terms (Recommendations 1990)] p. 2173.
3.2
température ambiante
température non régulée de l’air environnant
3.3
analyte
composant indiqué dans le nom d’une grandeur mesurable
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2]
3.4
performance analytique
l’exactitude, la précision et la sensibilité d’un essai pour mesurer l’analyte concerné
Note 1 à l'article: D’autres caractéristiques de performance d’essai, telles que la robustesse ou la répétabilité,
peuvent également s’appliquer.
3.5
ischémie froide
état d’un tissu suite à son prélèvement de l’organisme jusqu’à sa stabilisation ou sa fixation
3.6
diagnostic
identification d’un état de santé sain ou pathologique à partir de ses signes et/ou symptômes, dans
laquelle le processus de diagnostic peut impliquer des analyses et essais pour la classification de l’état
d’un individu en catégories ou sous-classes distinctes, laquelle permet la prise de décisions médicales
concernant le traitement et le pronostic à établir
3.7
analyse
phase analytique
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 à l'article: Les processus débutent avec l’analyte extrait et comprennent toutes sortes d’essais
paramétriques ou une manipulation chimique en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — La définition est reprise ici sans les notes d’origine; le terme
«examen» a été remplacé par «analyse».]
3.8
macroscopie
analyse macroscopique
contrôle de prélèvements pathologiques à l’œil nu, au cours de leur traitement à des fins d’analyse
microscopique ultérieure, en vue d’obtenir des informations de diagnostic
3.9
homogène
de structure et de composition uniformes
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3.10
processus préanalytiques
phase préanalytique
flux de travail préanalytique
processus commençant chronologiquement par la prescription des analyses par le clinicien, comprenant
la demande d’analyse, la préparation et l’identification du patient, le prélèvement de l’échantillon
primaire, son acheminement jusqu’au laboratoire et au sein du laboratoire médical ou de pathologie,
l’extraction des analytes, et finissant au début de l’analyse
Note 1 à l'article: La phase préanalytique comprend des processus de préparation qui influencent le résultat de
l’analyse prévue.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modifiée — Un terme supplémentaire a été ajouté et des détails
supplémentaires ont été inclus.]
3.11
échantillon primaire
prélèvement
spécimen
partie discrète d’un liquide corporel, d’une haleine, d’un cheveu ou d’un tissu prélevé à des fins
d’examens, d’étude ou d’analyse d’une ou plusieurs grandeurs ou propriétés pour déterminer le
caractère de l’ensemble
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modifiée — Le terme et la définition sont repris ici sans les notes
d’origine]
3.12
protéine
type de macromolécules biologiques composées d’une ou plusieurs chaînes avec une séquence définie
d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques
3.13
profil protéique
quantités de molécules de protéines individuelles qui sont présentes dans un échantillon et qui peuvent
être mesurées en l’absence de toute perte, inhibition et interférence
3.14
espèce protéique
quantités d’une protéine clairement définie d’un point de vue chimique, correspondant à un spot sur
une image d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel à haute performance
[SOURCE: Jungblut et. al.1996]
3.15
PTM
modifications post‑traductionnelles
modifications chimiques d’une structure protéique primaire, souvent cruciales pour conférer une
activité biologique à une protéine
[SOURCE: Encyclopedia of Psychopharmacology, 2010]
3.16
température de laboratoire
température dans la plage de 18 °C à 25 °C
Note 1 à l'article: Des réglementations locales ou nationales peuvent stipuler des définitions différentes.
3.17
échantillon
une ou plusieurs parties prélevées à partir d’un échantillon primaire
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modifiée — Les exemples n’ont pas été repris.]
3.18
stabilité
capacité d’un échantillon, lorsqu’il est entreposé dans des conditions spécifiées, à conserver une valeur
de propriété spécifiée dans des limites spécifiées pendant une période de temps spécifiée
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.15, modifiée — L’expression «matériau de référence» a été remplacée
par «échantillon», «caractéristique» a été remplacée par «capacité» et la Note 1 à l’article a été modifiée.]
Note 1 à l'article: L’analyte pour les besoins du présent document est composé de protéines extraites.
3.19
stockage
interruption prolongée du flux de travail préanalytique d’un échantillon ou d’un analyte,
respectivement, ou de leurs dérivés, par exemple des coupes colorées ou des blocs de tissus, dans des
conditions appropriées afin de préserver leurs propriétés
Note 1 à l'article: Le stockage à long terme a généralement lieu dans les sites d’archivage des laboratoires ou dans
les biobanques.
3.20
validation
confirmation, par des preuves tangibles, que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévue ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme «validé» est utilisé pour désigner l’état correspondant.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modifiée — Les Notes 1 et 3 n’ont pas été reprises.]
3.21
vérification
confirmation, par des preuves tangibles, que les exigences spécifiées ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme «vérifié» est utilisé pour désigner l’état correspondant.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.12, modifiée — Les Notes 1 et 2 n’ont pas été reprises.]
Note 2 à l'article: La confirmation peut couvrir des activités telles que:
— la réalisation d’autres calculs;
— la comparaison d’une spécification de conception nouvelle avec une spécification de conception similaire
éprouvée;
— la réalisation d’essais et de démonstrations;
— la revue des documents avant diffusion.
3.22
ischémie chaude
situation avant que le tissu soit prélevé de l’organisme, mais dans laquelle il est privé de son apport
sanguin normal
3.23
flux de travail
série d’activités nécessaires à la réalisation d’une tâche
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4 Considérations générales
Pour les instructions générales relatives aux systèmes de management de la qualité de laboratoire
de biologie médicale et portant en particulier sur le prélèvement, la réception et la manipulation
d’échantillons primaires (y compris la prévention des contaminations croisées), voir l’ISO 15189:2012,
4.2, 5.4.4, 5.4.6 ou l’ISO/IEC 17020:2012, Article 8 et 7.2. Les exigences relatives aux équipements
de laboratoire, aux réactifs et aux consommables conformément à l’ISO 15189:2012, 5.3 doivent
être respectées; l’ISO 15189:2012, 5.5.1.2 et 5.5.1.3 et l’ISO/IEC 17020, 2012, 6.2 peuvent également
s’appliquer.
Toutes les étapes d’un flux de travail de diagnostic peuvent influencer le résultat final de l’analyse.
Par conséquent, le flux de travail complet, y compris la stabilité des biomolécules et les conditions de
stockage des échantillons, doit être vérifié et validé. Les étapes du flux de travail qui ne peuvent pas
toujours être contrôlées (par exemple l’ischémie chaude) doivent être documentées. Une évaluation des
risques des étapes non contrôlables du flux de travail, incluant leur impact potentiel sur la performance
analytique, doit être réalisée et des mesures d’atténuation doivent être mises en place pour obtenir la
performance analytique requise.
Avant le développement et la mise en œuvre d’une analyse, il convient d’étudier la stabilité des protéines
spécifiques à analyser et leurs modifications post‑traductionnelles (si elles sont importantes pour
l’analyse) durant l’ensemble du processus préanalytique (par exemple en réalisant une expérience ou
une étude cinétique; voir également l’Annexe A et la Référence [8]).
Avant la stabilisation des tissus par congélation, les quantités, les conformations et l’état des liaisons
des protéines peuvent changer, par exemple par dégradation et synthèse modifiée des protéines suite
à l’induction de gènes, la régulation à la baisse de l’expression de gènes, la dégradation de l’ARN, et des
changements de voie biochimique et d’état énergétique. Ces effets dépendent de la durée des ischémies
chaude et froide et de la température ambiante avant la congélation. De plus, les effets décrits peuvent
varier dans les tissus de différents donneurs/patients.
En général, plus la durée des ischémies chaude et froide est longue et plus la température ambiante est
élevée avant la congélation du prélèvement tissulaire, plus le risque est élevé de voir se produire des
modifications du profil protéique.
NOTE Des durées d’ischémie froide prolongées entraînent des modifications des quantités de protéines (par
[8][9]
exemple de la cytokératine 18) et de phosphoprotéines (par exemple phospho-p42/44) . La conservation
[10]
du prélèvement sur un bain de glace atténue cet effet . Les quantités de protéines ainsi que les modifications
post-traductionnelles peuvent également varier au cours de la phase préanalytique, en fonction de l’origine et
du type du tissu, de la maladie sous-jacente, de l’intervention chirurgicale, du traitement et des médicaments
administrés pour l’anesthésie ou pour le traitement d’une maladie concomitante, ainsi qu’en fonction des
différentes conditions environnementales après le prélèvement du tissu sur l’organisme.
Comme une normalisation de l’ischémie chaude n’est pas facilement réalisable, sa durée doit être
documentée. Lorsqu’il n’est pas possible d’éviter l’ischémie froide, sa durée doit être documentée
et il convient de consigner les températures aux abords du récipient du prélèvement. Lorsque le
prélèvement est transporté vers un autre établissement pour la congélation, la durée du transport doit
être documentée et il convient de documenter également les conditions ambiantes.
Les réglementations en matière de sécurité pour le transport et la manipulation doivent être suivies
(voir l’ISO 15189:2012, 5.2.3 et 5.4.5, et l’ISO 15190).
Des précautions doivent être prises au cours de l’ensemble du processus préanalytique afin d’éviter
toute contamination croisée entre les différents prélèvements/échantillons, par exemple en utilisant,
dans la mesure du possible, du matériel à usage unique ou en mettant en place des méthodes de
nettoyage appropriées entre les traitements des différents prélèvements/échantillons.
Si un produit commercial n’est pas utilisé selon les instructions du fabricant, la responsabilité de son
utilisation et de sa performance incombe à l’utilisateur.
5 Hors du laboratoire
5.1 Recueil des prélèvements
5.1.1 Généralités
Pour le recueil du prélèvement, il convient de prendre en compte les exigences (par exemple pathologie,
taille du prélèvement) applicables à l’analyse moléculaire prévue (voir également l’Article 6).
Voir également l’ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2 Informations relatives au donneur/patient
La documentation doit inclure l’identifiant du donneur/patient, lequel peut se présenter sous la forme
d’un code.
Il convient que la documentation comprenne, sans toutefois s’y limiter:
a) l’état de santé correspondant du donneur/patient (par exemple sain, type de maladie, maladie
concomitante, données démographiques [âge et sexe, par exemple]);
b) les informations concernant le traitement médical de routine et le traitement particulier avant le
prélèvement du tissu (par exemple anesthésiques, médicaments, protocoles chirurgicaux ou de
diagnostic);
c) le consentement approprié du donneur/patient.
5.1.3 Informations relatives au prélèvement
La documentation doit mentionner, sans toutefois s’y limiter:
a) le début d’ischémie dans l’organisme (ischémie chaude) établi par une documentation de l’heure
de la ligature/du clampage du vaisseau concerné par l’ischémie (généralement l’heure du clampage
artériel);
NOTE Cela n’est pas nécessaire lorsqu’une résection biopsique de petits tissus pour la congélation est
réalisée.
b) l’heure et la date auxquelles le tissu est prélevé sur l’organisme, ainsi que la méthode de prélèvement
(par exemple microbiopsie au trocart, résection, dispositif de biopsie utilisé pour le prélèvement);
c) la description du type et de l’origine du tissu, de l’état du tissu (par exemple pathologique, exempt
de la maladie), y compris les références de tout marquage réalisé par le chirurgien, le radiologue ou
le pathologiste à l’intérieur ou à l’extérieur du bloc opératoire.
Si la congélation du tissu est réalisée hors du laboratoire, la documentation des étapes décrites en 6.2,
lorsque l’évaluation de la pathologie est requise, et en 6.3, doit être effectuée.
Il convient que la documentation inclue l’identifiant de la personne responsable du prélèvement de
l’échantillon primaire.
5.1.4 Traitement du prélèvement
Les tissus qui nécessitent d’être congelés à des fins de diagnostic peuvent provenir d’un prélèvement
tissulaire de grande taille ou être des prélèvements tissulaires de petite taille tels que des biopsies,
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par exemple prélevées par endoscopie, ou prélevées sur des patients au cours d’une intervention
chirurgicale où un diagnostic sur une coupe rapidement congelée est requis.
NOTE Les tissus post‑mortem peuvent être congelés à des fins de diagnostic. Toutefois, la préservation des
protéines dépend de l’intervalle de temps entre le décès et l’autopsie, ainsi que de la température de stockage du
corps après le décès.
Tout ajout ou changement apporté à l’échantillon primaire après le prélèvement sur l’organisme (par
exemple étiquetage pour l’orientation du prélèvement [tel que marquage à l’encre, points de suture,
incision(s)]) doit être documenté.
Lorsqu’un diagnostic pathologique est requis sur le prélèvement, l’échantillonnage doit être effectué
par un professionnel de santé (par exemple docteur en médecine détenteur d’un certificat de spécialiste
en anatomopathologie), sous sa supervision ou conformément à ses recommandations (voir 6.2).
Lorsque l’échantillon primaire a été prélevé en l’absence d’une exigence de diagnostic pathologique,
l’évaluation, la sélection et la documentation des prélèvements peuvent être effectuées par d’autres
personnes qualifiées que des pathologistes.
La congélation de l’échantillon primaire ou des échantillons prélevés sur l’échantillon primaire peut
être réalisée hors du laboratoire ou dans le laboratoire.
L’ischémie froide peut avoir une influence sur le profil protéique; de ce fait, il convient de privilégier la
congélation directe.
a) Dans le cas où le prélèvement ou l’échantillon est congelé hors du laboratoire, continuer sans délai
avec 6.2.
b) Dans le cas où le prélèvement ou l’échantillon est congelé dans le laboratoire, il est nécessaire de
transporter les prélèvements de tissus frais vers le laboratoire. Les étapes décrites en 5.2 pour le
transport de tissus frais doivent être réalisées sans délai.
5.2  Exigences relatives au transport de tissus frais
5.2.1 Généralités
Lorsque le transport du prélèvement ou de l’échantillon vers le laboratoire est requis pour la congélation,
le laboratoire en collaboration avec le service clinique ou de chirurgie doit établir un protocole pour la
méthode de transport des tissus.
5.2.2 Préparation pour le transport
Les étapes suivantes doivent être suivies:
a) la sélection et l’utilisation de récipients et d’emballages (par exemple boîte réfrigérante, boîte pour
stockage et transport, emballage sous vide), conformément aux réglementations de transport en
vigueur;
b) la sélection et l’utilisation de méthodes de stabilisation (par exemple techniques de réfrigération)
en vue du transport;
NOTE Une congélation accidentelle du tissu (due par exemple à l’utilisation à mauvais escient de blocs
réfrigérants) peut mener à une dégradation des protéines au moment où le tissu se décongèlera. Elle peut
également avoir un impact sur la caractérisation morphologique.
c) l’étiquetage du récipient (par exemple numéro d’enregistrement, code-barres, type de prélèvement,
quantité, et organe d’origine du tissu) et une documentation supplémentaire [informations
spécifiées en 5.1.2, 5.1.3, 5.1.4 et 5.2.2 a) et b)].
Plusieurs prélèvements issus du même patient/donneur et partageant des caractéristiques communes
(aspect macroscopique, type de tissu, état pathologique, emplacement anatomique) peuvent être placés
dans un même récipient/compartiment de récipient.
Il convient de transférer sans délai les prélèvements dans le récipient après l’ablation sur l’organisme.
Il convient ensuite de conserver le récipient sur un bain de glace ou entre 2 °C et 8 °C afin de réduire le
plus possible les modifications de profils protéiques.
Il convient de consigner les températures de l’environnement du récipient durant l’ischémie froide (par
exemple les températures dans les différents locaux, pendant le transport). Si la température n’est pas
mesurée, il convient d’évaluer les plages de températures par une classification comme température
ambiante, température de laboratoire ou entre 2 °C et 8 °C.
5.2.3 Au cours du transport
Il convient de mettre en œuvre une surveillance de la température de manière appropriée.
Si le prélèvement n’est pas déjà congelé, il convient de l’acheminer sans délai sur un bain de glace ou
entre 2 °C et 8 °C afin de réduire le plus possible les modifications du profil protéique.
NOTE Il a été montré que les protéines dans les tissus peuvent être stabilisées dans des sacs en plastique
sous vide maintenus entre 0 °C et 4 °C au cours du transport avant que les échantillons soient congelés pour les
[11]
biobanques ou utilisés pour une évaluation histopathologique .
Le respect du protocole de la méthode de transport doit être consigné. Tout écart au protocole doit être
décrit et documenté.
6 Dans le laboratoire
6.1 Informations relatives à la réception du prélèvement
Le nom de la personne réceptionnant le prélèvement doit être consigné. La date et l’heure d’arrivée
du prélèvement, ainsi que les conditions (par exemple étiquetage, conditions de transport incluant la
température, le type et la quantité de tissu du prélèvement, fuite/bris du récipient, intégrité du vide)
des prélèvements reçus doivent être consignées. Tout écart au protocole établi pour la méthode de
transport (voir 5.2) doit être consigné.
L’identification correcte du prélèvement doit être vérifiée. Il convient que cela comprenne les
informations cliniques (voir 5.1.2 et 5.1.3) du prélèvement, du numéro d’admission à l’hôpital et/ou de
l’identifiant du donneur/patient, le nom du patient et la date de naissance du patient.
6.2 Évaluation de la pathologie du prélèvement et sélection du ou des échantillons
L’évaluation et la documentation de la pathologie du prélèvement, de même que la sélection du ou des
échantillons issus du prélèvement pour traitement supplémentaire, doivent être effectuées par ou
sous la supervision ou la responsabilité d’un professionnel de santé (par exemple docteur en médecine
détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie).
Des réglementations nationales, régionales ou locales peuvent s’appliquer.
Options de sélection du ou des échantillons pour l’analyse des protéines:
a) La sélection sur le prélèvement des pièces appropriées pour des analyses moléculaires et
histopathologiques, ainsi qu’à des fins de recherches complémentaires facultatives, doit être
effectuée par ou sous la supervision d’un professionnel de santé (par exemple un docteur en
médecine détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie), afin de garantir que le
prélèvement de l’échantillon destiné à l’analyse des protéines ne compromet pas les analyses
histopathologiques. Il convient de sélectionner des pièces de tissu appropriées pour l’analyse
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moléculaire et d’éviter les pièces susceptibles de la compromettre le cas échéant, telles que les
parties hémorragiques ou nécrotiques.
NOTE 1 En fonction des procédures locales, la sélection des pièces appropriées du prélèvement peut
également être réalisée hors du laboratoire, par exemple dans le bloc opératoire (voir 5.1.4).
Dans le cadre de l’examen macroscopique du prélèvement chirurgical avant et/ou après la
congélation, il convient de vérifier les informations cliniques (voir 5.1.2 et 5.1.3) du prélèvement
(par exemple le type, la taille, le nombre), le numéro d’admission à l’hôpital et/ou le numéro de
dossier de pathologie et/ou l’identifiant du donneur/patient, le nom du patient, la date de naissance
du patient et le type de tissu. Le prélèvement chirurgical et tous les résultats doivent être décrits
de manière appropriée conformément aux lignes directrices des sociétés médicales respectives
et en corrélation avec les informations et questions cliniques. Le site anatomique représenté par
le prélèvement doit être décrit, les limites marginales de résection et autres zones importantes
peuvent être marquées si nécessaire et s’avérer utiles pour une évaluation microscopique
ultérieure; des photographies peuvent être prises. Des échantillons représentatifs doivent être pris
(c’est‑à‑dire découpés en petites pièces) aux fins d’une évaluation microscopique conformément
aux lignes directrices spécifiques aux organes/pathologies, adoptées par les sociétés médicales
respectives.
NOTE 2 L’évaluation ou la documentation décrites ci-dessus peuvent également être réalisées hors du
laboratoire, par exemple dans le bloc opératoire.
b) Lorsque l’échantillon primaire a été prélevé en l’absence d’une exigence de diagnostic
histopathologique, l’évaluation, la sélection et la documentation des prélèvements peuvent être
effectuées par d’autres personnes qualifiées que des pathologistes.
c) Lorsqu’un diagnostic sur une coupe congelée est nécessaire, la partie du prélèvement sélectionnée
doit être congelée (voir 6.3) dans un milieu de congélation approprié. Le milieu de congélation utilisé
doit être documenté. Les coupes congelées doivent être évaluées par un professionnel de santé
(par exemple docteur en médecine détenteur d’un certificat de spécialiste en anatomopathologie).
Il convient d’envisager la microdissection de tissu pour sélectionner ou compléter certaines
caractéristiques cellulaires d’une maladie.
6.3 Congélation du prélèvement, du ou des échantillons
6.3.1 La congélation du prélèvement ou des échantillons doit être réalisée sans délai. Il convient de
sélectionner et d’utiliser la méthode de congélation la mieux adaptée (voir 6.3.2) pour le prélèvement ou
l’échantillon au regard de l’usage prévu et des conditions de travail.
Le tube doit être étiqueté avant d’être pré-refroidi.
6.3.2 Les trois procédures de congélation possibles sont comme suit:
[12]
a) Procédure de congélation instantanée : cette méthode est utilisée pour des échantillons de
tissus congelés. L’isopentane (C H , également appelé méthylbutane ou 2-méthylbutane) doit être
5 12
pré‑refroidi dans une plage de températures de ≤ −80 °C à > −160 °C, à laquelle il peut être utilisé
pour la congélation instantanée. Il est possible d’effectuer la pré-réfrigération avec de l’azote liquide
(−196 °C), de la glace carbonique (−80 °C), des congélateurs à −80 °C ou des appareils de congélation
dédiés qui maintiennent l’isopentane à ≤ −80 °C avec ou sans vitesse de refroidissement contrôlée.
L’isopentane doit être refroidi dans un tube ou un autre récipient (par exemple un bécher en
verre) résistant aux fluctuations importantes et brutales de température. Le volume d’isopentane
pré-refroidi doit être égal à au moins 10 fois le volume du prélèvement ou de l’échantillon. Pour
la congélation instantanée, l’échantillon de tissu doit être totalement immergé dans l’isopentane
pré-refroidi.
Une fois le tissu congelé, il doit être transféré dans son tube cryogénique attitré étiqueté et
pré-refroidi. Le tube doit être fermé conformément aux instructions du fabricant. Il convient de
renouveler l’isopentane lorsque des sédiments de tissu sont visibles au fond du tube.
L’isopentane est un liquide extrêmement volatil et inflammable à température et à pression de
laboratoire. Par conséquent, il convient que le laboratoire soit convenablement ventilé. L’isopentane
du tube doit être froid.
b) Procédure de congélation rapide: les tissus doivent être rapidement congelés sur une plaque
métallique pré-refroidie ou un panier métallique placé à la surface d’un bain d’azote liquide ou de
glace carbonique. La surface métallique doit être pré-refroidie dans une plage de températures de
≤ −80 °C à > −196 °C. La plaque métallique ou le panier métallique peuvent être fixés en position à
l’aide d’un support et d’un étau appropriés. En variante, l’échantillon peut être congelé directement
dans de l’azote liquide, ou encore dans le tube de stockage étiqueté et fermé placé dans de l’azote
liquide ou de la glace carbonique. Cependant, un processus de congélation lente peut provoquer une
rupture des membranes due à l’augmentation des concentrations en sel dans les compartiments
et à la formation de cristaux qui peuvent affecter sérieusement la morphologie. Afin d’éviter toute
contamination croisée, il convient de nettoyer le panier ou la plaque entre la congélation des
échantillons.
[13]
NOTE La congélation dans de l’azote liquide est caractérisée par l’effet Leidenfrost , produit par
l’ébullition de l’azote liquide autour du tissu induite par sa température relativement élevée. Cela réduit la
transmission de la chaleur de l’échantillon à l’azote liquide; cet effet est renforcé lorsque l’échantillon est
placé dans le tube étiqueté.
c) Procédure de coupe congelée: pour congeler un tissu en vue d’un diagnostic sur coupe rapidement
congelée, il convient de transporter sans délai vers le laboratoire le tissu fraîchement prélevé.
La partie du prélèvement sélectionnée doit être congelée sur des grilles métalliques spéciales
ajustables sur le cryostat, dans un milieu de congélation approprié. Il convient de documenter le
milieu de congélation utilisé. La grille métallique contenant le tissu et le milieu de congélation est
congelée en maintenant le métal dans de l’azote liquide ou de la glace carbonique jusqu’à ce que le
tissu soit congelé. Après avoir découpé les coupes congelées, il convient de retirer le tissu restant
de la grille métallique sans décongélation et de le placer dans un tube pré-refroidi pour stockage à
long terme.
NOTE Il est reconnu que l’utilisation d’un milieu de congélation est préjudiciable à la spectrométrie de
masse des protéines, la colonne de séparation pouvant être détériorée.
6.3.3 Les étapes suivantes doivent être effectuées avant, pendant et après la procédure de congélation:
a) la documentation de la procédure de congélation (par exemple congélation dans de l’azote
liquide, congélation instantanée dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide ou de la glace
carbonique, congélation dans un milieu de congélation approprié, congélation avec une vitesse de
refroidissement contrôlée);
b) la documentation de l’heure et de la date de congélation (pour déterminer le temps de latence: temps
écoulé entre le prélèvement sur l’organisme et la congélation du prélèvement ou de l’échantillon);
c) déterminer si la taille de l’échantillon de tissu requise convient au tube cryogénique choisi avant
la congélation, car la taille du tissu détermine la taille du récipient; il est donc recommandé que le
prélèvement/l’échantillon ne soit pas supérieur à 1 cm dans une dimension;
d) le choix du récipient du prélèvement/de l’échantillon pour la cryopréservation:
1) le récipient doit avoir un volume suffisant pour la taille du prélèvement ou de l’échantillon à
conserver;
2) le récipient doit être homologué pour la température de stockage;
3) pour des raisons de sécurité, le récipient doit pouvoir être fermé hermétiquement, de préférence
avec un couvercle à vis; les récipients avec un couvercle rabattable ne doivent pas être utilisés;
NOTE Les récipients peuvent exploser lors de la récupération des prélèvements ou échantillons qui
ont été conservés dans de l’azote liquide.
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4) le récipient doit être adapté pour un étiquetage permanent dans des conditions de stockage
par congélation;
e) l’étiquette doit être adaptée aux conditions respectives de stockage par congélation;
NOTE Les étiquettes appropriées sont, par exemple, les étiquettes autoadhésives, l’écriture manuscrite,
l’identification par radiofréquence (RFID), les récipients pré‑étiquetés, qui ont été vérifiés pour l’usage prévu.
f) l’étiquetage du récipient doit garantir une traçabilité appropriée des prélèvements et des
échantillons. Par conséquent, l’étiquetage du récipient doit fournir au minimum les informations
suivantes:
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