ISO 5354-1:2025
(Main)Molecular biomarkers — Detection of DNA in cotton used for textile production — Part 1: Extraction of DNA from cotton, cottonseed and raw materials derived therefrom
Molecular biomarkers — Detection of DNA in cotton used for textile production — Part 1: Extraction of DNA from cotton, cottonseed and raw materials derived therefrom
This document specifies requirements and recommendations to laboratories that perform extraction of polymerase chain reaction (PCR) quality deoxyribonucleic acid (DNA) from cottonseed, cotton leaf and raw material derived therefrom, that is sufficient for the purpose of PCR analysis. This document is applicable to: a) identifying cotton raw material from which PCR quality DNA can be extracted; b) specifying a method for effective DNA extraction from cotton and cotton-derived raw materials; c) specifying the cotton-specific marker(s) to be used as controls for PCR amplification of DNA. A PCR result obtained from analysis of cottonseed, cotton leaf and to some extant raw materials derived therefrom can only indicate that it is not derived from pure genetically modified organism (GMO)-derived cotton. Admixtures of GMO-derived cotton cannot be detected for cotton fibre and cotton fibre-derived materials. This document does not apply to bulk sampling of the seed, bale or processed fabric and yarn. A recommended sampling method is given in ISO 6497. General guidance for the sampling of bulk materials or for cotton-based products is available in standards such as ASTM D1441-12 and CEN/TS 15568.
Biomarqueurs moléculaires — Détection d’ADN dans le coton utilisé pour la production textile — Partie 1: Extraction d’ADN à partir de coton, de graines de coton et de matières premières issues de celles-ci
Le présent document spécifie des exigences et des recommandations destinées aux laboratoires qui réalisent l’extraction d’acide désoxyribonucléique (ADN) de qualité PCR à partir de graines de coton, de feuilles de coton ainsi que de matières premières issues de celles-ci, de manière suffisante pour une analyse par réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Le présent document est applicable à: a) l’identification de matières premières de coton à partir desquelles de l’ADN de qualité PCR peut être extrait; b) la spécification d’une méthode d’extraction effective d’extraction d’ADN à partir de coton et de matières premières issues du coton; c) la spécification du ou des marqueurs spécifiques du coton à utiliser en tant que témoins pour l’amplification par PCR de l’ADN. La seule conclusion qu’il est possible de tirer d’un résultat d’analyse PCR de graines de coton, de feuilles de coton et, dans une certaine mesure, de matières premières issues de celles-ci est qu’il ne s’agit pas de coton GM pur. Les adjuvants de coton GM ne peuvent pas être détectés pour les fibres de coton et les matières issues des fibres de coton. Le présent document ne s’applique pas à l’échantillonnage de lots constitués de graines, de balles, d’étoffes traitées ou de fils traités. Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 6497. Des recommandations générales pour l’échantillonnage des matériaux en vrac ou des produits à base de coton sont disponibles dans les normes telles que l’ASTM D1441-12 et la CEN/TS 15568.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 5354-1
First edition
Molecular biomarkers — Detection
2025-06
of DNA in cotton used for textile
production —
Part 1:
Extraction of DNA from cotton,
cottonseed and raw materials
derived therefrom
Biomarqueurs moléculaires — Détection d’ADN dans le coton
utilisé pour la production textile —
Partie 1: Extraction d’ADN à partir de coton, de graines de coton
et de matières premières issues de celles-ci
Reference number
© ISO 2025
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CH-1214 Vernier, Geneva
Phone: +41 22 749 01 11
Email: copyright@iso.org
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 3
5 Identification of a suitable cotton endogenous DNA marker . 3
6 Test sample preparation . 3
7 Assessment of DNA extraction methods for different cotton production stages . 4
7.1 General .4
7.2 Results from the single laboratory analysis of DNA extraction methods .4
7.3 Conclusion .5
8 Storage . 5
9 DNA quantitation . 5
10 DNA quality control. 5
10.1 General .5
10.2 Use of SAH7 marker as a cotton DNA quality control assay .5
10.3 Analysis for PCR inhibitors.6
10.4 Cotton matrix control method . .6
10.4.1 Results .6
11 Test report . 6
Annex A (informative) Cotton endogenous control analysis . 8
Annex B (informative) Assessment of DNA extraction methods for different cotton production
stages . 10
Annex C (informative) PCR method to detect SAH7 gene target DNA in cotton . 14
Annex D (informative) Evaluation of DNA isolated with a commercial spin column-based DNA
extraction system designed for the extraction of DNA from stool samples with the SAH7
method . 16
Bibliography .20
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 16,
Horizontal methods for molecular biomarker analysis.
This first edition, along with ISO/TS 5354-2:2024, cancels and replaces IWA 32:2019, which has been
technically revised throughout.
A list of all parts in the ISO 5354 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
Introduction
The purpose of this document is to provide guidance to assess whether cotton, cotton fibre or cotton-derived
materials, or all of these, contain a specific DNA sequence or sequences. This guidance can be applied to
detection of pure genetically modified (GM) cotton in textile production, detection of a specific GM cotton
target sequence in other cotton and for confirming or tracing a particular species, variety or genetic marker.
[1]
While GM-cotton cultivation covers a large percentage of global cotton production today, there are
countries where the cultivation of GM cotton is not permitted by law, as well as voluntary, private and public
standards that do not permit the intentional use of genetically modified organisms (GMOs) in the cotton
and textile production process or require labelling. Due to asynchronous regulatory approvals, a GM cotton
variety that is approved for growth and import and in one country can be disapproved or require labelling
in another country. There has been a need for detection of a specific GM cotton event in GM (or non-GM)
cotton. The detection methods submitted and approved by global regulatory agencies are available for that
purpose and this method does not supplant those nor the results of those analyses.
Growers of non-GM cotton can provide traceability and certification of cottonseed to ensure that the seeds
entering a certified cultivation scheme are not GM. If the starter seed is conventional (non-GM), which can
be accurately determined depending on the availability of methods, and growers follow their certification
process then the ginned fibre can be received as is without misleading consumers. This document provides
evidence that DNA extraction methods are only effective and accurate for seeds and leaves. Although pure
GM cotton can be detected at the ginned cotton stage, and potentially at the griege yarn stage, non-GM
cotton cannot be claimed if a negative result is obtained because there is a significant potential for a false
negative result due to the lack of polymerase chain reaction (PCR) quality DNA.
The DNA sequence screening approach described in this document is based on PCR-methods. The methods
described in this document are designed to work on all four of the major commercial cotton species:
Gossypium hirsutum, G. barbadense, G. arboreum and G. herbaceum.
Cotton (Gossypium spp.) has been cultivated for lint for over 8 000 years. There are over 50 species in the
[2] [3]
Gossypium genus. The Gossypium genome is complex, containing 2,25 to 2,43 gigabasepairs.
This document describes the key factors necessary to screen cottonseed, cotton leaf and fibre samples at
different stages of textile development in the cotton production chain for the potential presence of specific
DNA elements. The protocol describes two major steps:
a) an effective way to isolate DNA from cotton materials;
b) a method to confirm that the isolated DNA is PCR quality DNA, i.e. suitable for PCR (preferred markers
chosen for this purpose will be nuclear, and low copy number).
[4]
GM element screening is described in ISO/TS 5354-2 .
The single laboratory validation studies described in this document including method development was
carried out by the Wageningen University and Research Institute (WFSR), the Netherlands.
v
International Standard ISO 5354-1:2025(en)
Molecular biomarkers — Detection of DNA in cotton used for
textile production —
Part 1:
Extraction of DNA from cotton, cottonseed and raw materials
derived therefrom
1 Scope
This document specifies requirements and recommendations to laboratories that perform extraction of
polymerase chain reaction (PCR) quality deoxyribonucleic acid (DNA) from cottonseed, cotton leaf and raw
material derived therefrom, that is sufficient for the purpose of PCR analysis.
This document is applicable to:
a) identifying cotton raw material from which PCR quality DNA can be extracted;
b) specifying a method for effective DNA extraction from cotton and cotton-derived raw materials;
c) specifying the cotton-specific marker(s) to be used as controls for PCR amplification of DNA.
A PCR result obtained from analysis of cottonseed, cotton leaf and to some extant raw materials derived
therefrom can only indicate that it is not derived from pure genetically modified organism (GMO)-derived
cotton. Admixtures of GMO-derived cotton cannot be detected for cotton fibre and cotton fibre-derived
materials.
This document does not apply to bulk sampling of the seed, bale or processed fabric and yarn. A recommended
[5]
sampling method is given in ISO 6497 . General guidance for the sampling of bulk materials or for cotton-
[6] [7]
based products is available in standards such as ASTM D1441-12 and CEN/TS 15568 .
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16577, Molecular biomarker analysis — Vocabulary for molecular biomarker analytical methods in
agriculture and food production
ISO 21570:2005, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — Quantitative nucleic acid based methods
ISO 21571, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived
products — Nucleic acid extraction
ISO 24276:2006, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and
derived products — General requirements and definitions
ISO 24276:2006/Amd 1:2013, Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified
organisms and derived products — General requirements and definitions — Amendment 1
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16577 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
textile
woven fabric, knitted fabric, etc., formed by the interlocking of fibres and yarns having a certain cohesion
and which is generally intended for clothing or furniture applications
Note 1 to entry: Textiles often include certain types of non-woven fabrics.
[8]
[SOURCE: ISO 16373‑3:2014 , 2.1]
3.2
cottonseed
seed from cotton plants
3.3
cotton leaf
leaf from cotton plants
3.4
seed cotton
fuzzy seed
raw cotton that contains both the seed and the fibre before it has been ginned
3.5
cotton lint
raw fibre that has gone through the ginning process
3.6
greige yarn
unprocessed long continuous length of interlocked cotton lint (3.5) that results from the cleaning and
subsequent spinning of the cotton lint
3.7
greige fabric
unprocessed textiles (3.1) formed by weaving, knitting or crocheting yarn and non-woven fabric
3.8
processed yarn
yarn that has undergone processing to develop its full textile potential
3.9
processed fabric
fabric that has undergone processing to develop its full textile potential
3.10
polymerase chain reaction quality deoxyribonucleic acid
PCR quality DNA
DNA template of sufficient length, chemical purity and structural integrity to be amplified by PCR
[SOURCE: ISO 24276:2006, 3.2.3]
3.11
cotton matrix control
sample that can be identified as cotton derived based upon polymerase chain reaction amplification and
detection of the SAH7 gene in its extracted DNA
3.12
cycle quantification
Cq
cycle in real-time polymerase chain reaction at which the fluorescence signal from the reaction crosses a
threshold level at which the signal can be distinguished from background levels
[SOURCE: ISO 16577:2022, modified — Other terms and note to entry deleted.]
4 Principle
This document describes the requirements for preparation and screening of specific DNA in cotton and
textiles. It describes conditions for obtaining DNA for detecting a specific DNA element and a scheme for
detecting an endogenous cotton gene (positive control). The amplification and detection of endogenous
cotton DNA sequences is achieved through extraction methods that result in PCR quality DNA. In application
to cotton samples PCR quality DNA allows for the detection of specific cotton DNA sequences. Admixtures of
GM cotton were not analysed.
PCR quality DNA may be isolated from the production stages of cottonseed up to and including greige yarn
and greige fabric. A PCR result obtained from analysis of cotton fibre and cotton fibre-derived materials
can only indicate that it is not derived from pure GMO-derived cotton. Admixtures of GMO-derived cotton
cannot be detected for cotton fibre and cotton fibre-derived materials.
Processed yarn and processed fabric were examined as part of the development of this document, but it was
found that PCR quality DNA could not be isolated from this material.
[4]
Further screening for GM-content-based real-time PCR methods is described in ISO/TS 5354-2 .
5 Identification of a suitable cotton endogenous DNA marker
The identification of a suitable endogenous DNA marker for the detection of the four commercial cotton
species (Gossypium hirsutum, G. barbadense, G. arboreum and G. herbaceum) was undertaken in a study by
WFSR (The Netherlands). Three different potential DNA markers were compared:
a) cotton fibre-specific acyl carrier protein (ACP1) gene;
b) alcohol dehydrogenase C (AdhC);
[9]
c) Sinapsis arabidopsis homolog 7 (SAH7).
SAH7 outperformed AdhC and ACP1 markers, showing earlier amplification and consistent amplification
of the four commercial cotton species (G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum and G. herbaceum). Data
[10][11]
supporting this conclusion is presented in Annex A. In cases where there was a lack of a signal for the
larger quantity of DNA, no further analysis was done to elucidate the cause for PCR inhibition.
6 Test sample preparation
The test sample should be homogenized using suitable methods and avoiding excessive heating. Sample
preparation is dependent on sample type. Prepare samples by using one of the following techniques: teasing,
cutting, crushing or shredding.
Prepare at least two replicates per sample. Include appropriate negative and positive controls, as specified
in ISO 21571 on DNA extraction.
Suitable test sample preparation methods for different types of material are as follows:
— Cottonseed: Crush the seeds thoroughly with a suitable method. Use 100 mg in the DNA extraction
procedure. Ensure that seeds are free of small fibres/lint, i.e. delinted.
— Cotton leaf: Crush the leaves thoroughly with a suitable method. Use 100 mg in the DNA extraction
procedure.
— Seed cotton: Separate the seeds from the long fibres and crush the seeds thoroughly with a suitable
method. Use 100 mg in the DNA extraction procedure.
— Cotton lint: The fibre material can be separated from the seed and teased thoroughly by applying a
suitable method. Use 100 mg in the DNA extraction procedure.
— Greige yarn: Cut the yarn with a suitable method into small parts of a maximum of approximately 0,5 cm
length. Use 100 mg in the DNA extraction procedure.
— Greige fabric: Cut the fabric with a suitable method in small parts of a maximum of approximately
0,5 × 0,5 cm in size. Use 100 mg in the DNA extraction procedure.
7 Assessment of DNA extraction methods for different cotton production stages
7.1 General
Different extraction methods for obtaining PCR quality DNA from different cotton materials in the
production process from cottonseed to textiles were tested to determine if any gave better results across
specified matrices. Cottonseed matrix tested most consistently and gave best yields on multiple extract
methods. In the WFSR study, cotton samples from the cotton production process were used to compare five
DNA extraction methods. The samples were obtained from sources in the United States of America (USA),
Türkiye and India. To confirm the presence and PCR quality of the extracted DNA, each isolated DNA was
[11]
used in a quantitative PCR for the endogenous control SAH7. Quantitative PCR assays were performed in
duplicate with undiluted DNA. The five DNA extraction methods that were examined included:
a) a cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method;
b) a commercial kit based on magnetic beads;
[12]
c) a CTAB method in combination with a plant DNA-extraction kit;
d) a CTAB-cotton Community Reference Laboratory (CRL) VL-14/05XP method;
e) a commercial spin column based DNA extraction system designed for the extraction of DNA from stool
®1) [13]
samples (QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit ).
The results of the study are provided in Annex B.
7.2 Results from the single laboratory analysis of DNA extraction methods
Cottonseed extracts consistently produced the best amplifications, while much lower or no amplification
was observed on other matrices depending on the method. The commercial spin column-based DNA
extraction system designed for the extraction of DNA from stool samples permitted the extraction of PCR
quality DNA (amplifiable DNA using the method for endogenous SAH7) from samples of cottonseed, cotton
leaf, cotton lint, greige yarn and greige fabric. Data for evaluation of DNA isolated with this commercial spin
column-based DNA extraction system designed for the extraction of DNA from stool samples with the SAH7
method is provided in Annex D. From greige yarn and greige fabric only a very small DNA quantity at the
limit of detection (LOD) of the PCR test could be extracted. Processed yarn and processed fabric did not yield
PCR quality DNA. This DNA was not successfully amplified with the endogenous target SAH7 PCR method. ®
1) QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit is the trademark of a product supplied by Qiagen GmbH. This information is given
for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
DNA extraction from processed yarn and processed fabric does not produce DNA that can be used in GMO
screening. The other DNA extraction methods used in the study yielded little or no PCR quality DNA with
processed yarn and processed fabric, and subsequent quantitative PCR with the endogenous control was not
successful. The results are provided in Annex B.
7.3 Conclusion
For the evaluated DNA extraction methods and cotton production stages, results showed that the commercial
spin column-based DNA extraction system designed for the extraction of DNA from stool samples was the
only DNA extraction method that produced PCR quality DNA from cottonseed, cotton lint, greige yarn and
[12]
greige fabric. However, the stool method (see Annex D), the CTAB with plant extraction kit (see B.1.1)
and the CTAB-spin column (see B.1.4) gave similar results on cottonseed. Because of the very low amount of
quality DNA extractable from cotton lint and greige yarn and greige fabric (Cq > 34), the practical LOD for
GMO content in cotton admixtures would be very high. A PCR result obtained from analysis of cotton fibre
[4]
and cotton fibre-derived materials using the GMO screening methods described in ISO/TS 5354-2:2024
therefore only informs that the material is not derived from pure GMO-derived cotton. Admixtures of GMO-
derived cotton cannot be detected for cotton lint, greige yarn and greige fabric.
The SAH7 target was not detectable in DNA isolated from the final production stages: processed yarn and
processed fabric. Other DNA extraction methods yielded little or no DNA for these products, and subsequent
quantitative PCR with the endogenous control was not successful.
8 Storage
Isolated DNA can be stored at 4 °C for a maximum of one week or at −20 °C indefinitely.
9 DNA quantitation
Quantification of extracted DNA can be performed by physical (e.g. measurement of absorbance at
230 nm/260 nm/280 nm), chemicophysical (e.g. use of fluorescent intercalating or binding dyes or
enzymatic (e.g. bioluminescence detection method) or by quantitative PCR. These methods are described in
ISO 21571:2005, Annex B.
Alternative protocols may be applied, provided that the method has been validated on the respective matrix
under investigation. The user can choose the most appropriate method to be applied, depending on the
amount and quality of DNA to be quantified.
Quantit
...
Norme
internationale
ISO 5354-1
Première édition
Biomarqueurs moléculaires —
2025-06
Détection d’ADN dans le coton
utilisé pour la production textile —
Partie 1:
Extraction d’ADN à partir de coton,
de graines de coton et de matières
premières issues de celles-ci
Molecular biomarkers — Detection of DNA in cotton used for
textile production —
Part 1: Extraction of DNA from cotton, cottonseed and raw
materials derived therefrom
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe. 3
5 Identification d’un marqueur d’ADN endogène approprié du coton . 3
6 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
7 Évaluation des méthodes d’extraction d’ADN pour différentes phases de production du
coton . 4
7.1 Généralités .4
7.2 Résultats de l’analyse intralaboratoire des méthodes d’extraction d’ADN .5
7.3 Conclusion .5
8 Stockage . 5
9 Quantification de l’ADN . 5
10 Contrôle de la qualité de l’ADN . 6
10.1 Généralités .6
10.2 Utilisation du marqueur SAH7 comme essai de contrôle de la qualité de l’ADN du coton .6
10.3 Analyse des inhibiteurs de PCR .6
10.4 Méthode de contrôle de matrice de coton .6
10.4.1 Résultats .6
11 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Analyse des témoins endogènes du coton . 8
Annexe B (informative) Évaluation des méthodes d’extraction d’ADN pour différentes phases
de production du coton . 10
Annexe C (informative) Méthode de PCR pour détecter l’ADN cible du gène SAH7 dans le coton . 14
Annexe D (informative) Évaluation de l’ADN extrait à l’aide d’un système commercial
d’extraction d’ADN sur colonne à centrifuger conçu pour l’extraction d’ADN à partir
d’échantillons de selles avec la méthode SAH7 . 17
Bibliographie .22
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 16, Méthodes horizontales pour l’analyse de biomarqueurs moléculaires.
Cette première édition, conjointement avec l’ISO/TS 5354-2:2024, annule et remplace l’IWA 32:2019, qui a
fait l’objet d’une révision technique complète.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 5354 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Introduction
Le présent document vise à fournir des recommandations pour évaluer si du coton, des fibres de coton et/
ou des matériaux dérivés du coton contiennent une ou plusieurs séquences d’ADN spécifiques. Ce document
d’orientation peut être appliqué à la détection de coton génétiquement modifié (GM) pur dans la production
textile, à la détection d’une séquence cible particulière de coton dans un autre type de coton GM et pour
confirmer ou tracer une espèce ou une variété donnée ou un marqueur génétique particulier.
À l’heure actuelle, la culture du coton GM représente un pourcentage important de la production mondiale
[1]
de coton. Toutefois, dans certains pays, la culture du coton GM est interdite par la loi ainsi que par des
normes publiques et privées de nature volontaire qui interdisent l’usage intentionnel d’organismes
génétiquement modifiés (OGM) dans le cadre du processus de production de coton et de textile ou exigent
un étiquetage en conséquence. Du fait de la nature asynchrone des autorisations réglementaires, une variété
de coton GM dont la culture et l’importation sont autorisées dans un pays peut ne pas être autorisée ou
devoir être étiquetée en conséquence dans un autre pays. Il a été nécessaire de détecter un événement de
coton GM spécifique dans le coton GM (ou non GM). Les méthodes de détection soumises et approuvées par
les organismes de réglementation internationaux sont disponibles à cette fin. Cette méthode ne remplace
ni ces méthodes, ni les résultats de ces analyses.
Les producteurs de coton non GM peuvent fournir une traçabilité et une certification des graines de coton
pour garantir que les graines entrant dans un principe de culture certifiée ne sont pas GM. Si la graine
de départ est conventionnelle (non GM), ce qui peut être déterminé avec exactitude selon la disponibilité
de méthodes, et si les producteurs suivent leur processus de certification, la fibre égrenée peut alors être
certifiée non GM sans induire les consommateurs en erreur. Le présent document démontre que les méthodes
d’extraction d’ADN ne sont efficaces et exactes que pour les graines et les feuilles. Même s’il est possible
de détecter le coton GM pur au stade de coton égrené et potentiellement au stade de fil grège, un coton
pour lequel un résultat négatif est obtenu ne peut pas être déclaré non GM en raison du risque significatif
de résultat faussement négatif dû à une insuffisance d’ADN de qualité PCR (réaction de polymérisation en
chaîne).
L’approche de criblage de séquence d’ADN décrite dans le présent document repose sur des méthodes PCR.
Les méthodes décrites dans le présent document sont conçues pour être applicables aux quatre principales
espèces de coton du commerce: Gossypium hirsutum, G. barbadense, G. arboreum et G. herbaceum.
Le coton (Gossypium spp.) est cultivé pour ses fibres depuis plus de 8 000 ans. Il existe plus de 50 espèces
[2] [3]
du genre Gossypium. Le génome Gossypium est complexe et contient de 2,25 à 2,43 giga paires de bases.
Le présent document décrit les facteurs clés nécessaires pour cribler les échantillons de graines, de feuilles
de coton et de fibres de coton à différentes phases de fabrication de textile au sein de la chaîne de production
du coton permettant de déceler l’éventuelle présence d’éléments d’ADN spécifiques. Le protocole décrit
deux étapes majeures:
a) une méthode effective d’extraction d’ADN à partir de matériaux de coton;
b) une méthode de confirmation que l’ADN extrait est de l’ADN de qualité PCR, c’est-à-dire adapté à la
PCR (les marqueurs conseillés choisis à cette fin seront nucléaires et présenteront un faible nombre de
copies).
[4]
Le criblage d’éléments GM est décrit dans l’ISO/TS 5354-2 .
L’étude de validation intralaboratoire décrite dans le présent document couvrant la mise au point de la
méthode a été réalisée par le Wageningen University and Research Institute (WFSR), aux Pays-Bas.
v
Norme internationale ISO 5354-1:2025(fr)
Biomarqueurs moléculaires — Détection d’ADN dans le coton
utilisé pour la production textile —
Partie 1:
Extraction d’ADN à partir de coton, de graines de coton et de
matières premières issues de celles-ci
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des exigences et des recommandations destinées aux laboratoires qui réalisent
l’extraction d’acide désoxyribonucléique (ADN) de qualité PCR à partir de graines de coton, de feuilles
de coton ainsi que de matières premières issues de celles-ci, de manière suffisante pour une analyse par
réaction de polymérisation en chaîne (PCR).
Le présent document est applicable à:
a) l’identification de matières premières de coton à partir desquelles de l’ADN de qualité PCR peut être
extrait;
b) la spécification d’une méthode d’extraction effective d’extraction d’ADN à partir de coton et de matières
premières issues du coton;
c) la spécification du ou des marqueurs spécifiques du coton à utiliser en tant que témoins pour
l’amplification par PCR de l’ADN.
La seule conclusion qu’il est possible de tirer d’un résultat d’analyse PCR de graines de coton, de feuilles
de coton et, dans une certaine mesure, de matières premières issues de celles-ci est qu’il ne s’agit pas de
coton GM pur. Les adjuvants de coton GM ne peuvent pas être détectés pour les fibres de coton et les matières
issues des fibres de coton.
Le présent document ne s’applique pas à l’échantillonnage de lots constitués de graines, de balles, d’étoffes
[5]
traitées ou de fils traités. Une méthode d’échantillonnage recommandée est donnée dans l’ISO 6497 .
Des recommandations générales pour l’échantillonnage des matériaux en vrac ou des produits à base de
[6] [7]
coton sont disponibles dans les normes telles que l’ASTM D1441-12 et la CEN/TS 15568 .
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 16577, Analyse de biomarqueurs moléculaires — Vocabulaire pour les méthodes d’analyse de biomarqueurs
moléculaires dans l’agriculture et la production agroalimentaire
ISO 21570:2005, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Méthodes quantitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques
ISO 21571, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Extraction des acides nucléiques
ISO 24276:2006, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement
modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions
ISO 24276:2006/Amd 1:2013, Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes
génétiquement modifiés et des produits dérivés — Exigences générales et définitions — Amendement 1
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16577 ainsi que les suivants
s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
textile
étoffe tissée, tricotée, etc., formée par l’entrelacement de fibres et de fils ayant une certaine cohésion et qui
est généralement destinée à l’habillement ou à l’ameublement
Note 1 à l'article: Les textiles incluent souvent certains types d’étoffes en non-tissés.
[8]
[SOURCE: ISO 16373-3:2014 , 2.1]
3.2
graine de coton
graine du cotonnier
3.3
feuille de coton
feuille du cotonnier
3.4
coton-graine
graine pelucheuse
coton brut qui contient à la fois des graines et des fibres avant d’être égrené
3.5
bourre de coton
fibre brute obtenue après égrenage
3.6
fil grège
grande longueur continue non traitée de bourre de coton (3.5) entrelacée, obtenue après nettoyage puis
filage de la bourre de coton
3.7
étoffe grège
textiles (3.1) non traités formés pas tissage, tricotage ou crochetage de fil et d’étoffe non tissée
3.8
fil traité
fil obtenu après avoir subi un traitement lui permettant d’atteindre son plein potentiel textile
3.9
étoffe traitée
étoffe obtenue après avoir subi un traitement lui permettant d’atteindre son plein potentiel textile
3.10
acide désoxyribonucléique de qualité pour réaction de polymérisation en chaîne
ADN de qualité PCR
matrice d’ADN de longueur, de pureté chimique et d’intégrité structurelle suffisantes pour être amplifiée
par la PCR
[SOURCE: ISO 24276:2006, 3.2.3]
3.11
témoin de matrice de coton
échantillon pouvant être identifié comme issu du coton par amplification par PCR et détection du gène SAH7
dans son ADN extrait
3.12
cycle de quantification
Cq
dans une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel, cycle auquel le signal de fluorescence dû à la
réaction atteint un niveau de seuil auquel le signal peut être distingué des niveaux de bruit de fond
[SOURCE: ISO 16577:2022, modifiée — D’autres termes et la note à l’article ont été supprimés.]
4 Principe
Le présent document décrit les exigences relatives à la préparation et au criblage d’ADN spécifique présent
dans le coton et les textiles. Il décrit les conditions d’obtention d’ADN pour la détection d’un élément
d’ADN spécifique et un schéma de détection d’un gène endogène du coton (témoin positif). L’amplification
et la détection de séquences d’ADN endogènes du coton sont précédées par des méthodes d’extraction qui
donnent de l’ADN de qualité PCR. Dans le cas des échantillons de coton, l’ADN de qualité PCR permet la
détection de séquences spécifiques d’ADN de coton. Aucun adjuvant de coton GM n’a été analysé.
De l’ADN de qualité PCR peut être extrait pour les phases de production allant des graines de coton jusqu’aux
fils et étoffes grèges inclus. La seule conclusion qu’il est possible de tirer d’un résultat d’analyse PCR de
fibres de coton et de matières issues de fibres de coton est qu’il ne s’agit pas de coton GM pur. Les adjuvants
de coton GM ne peuvent pas être détectés pour les fibres de coton et les matières issues des fibres de coton.
Un fil traité et une étoffe traitée ont été examinés dans le cadre de l’élaboration du présent document,
mais il a été constaté qu’il n’est pas possible d’extraire de l’ADN de qualité PCR à partir de ces matériaux.
Un autre criblage de contenu GM reposant sur des méthodes de PCR en temps réel est décrit dans
[4]
l’ISO/TS 5354-2 .
5 Identification d’un marqueur d’ADN endogène approprié du coton
L’identification d’un marqueur d’ADN endogène approprié pour la détection des quatre espèces de coton
du commerce (Gossypium hirsutum, G. barbadense, G. arboreum et G. herbaceum) a été entreprise dans le
cadre d’une étude du WFSR (Pays-Bas). Trois marqueurs d’ADN possibles ont été comparés:
a) gène de la protéine porteuse d’acyle spécifique de la fibre de coton (ACP1);
b) alcool déshydrogénase C (AdhC);
[9]
c) homologue 7 de Sinapsis arabidopsis (SAH7).
Le SAH7 a obtenu de meilleurs résultats que l’AdhC et l’ACP1, montrant une amplification plus précoce
et cohérente des quatre espèces de coton du commerce (G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum et G.
[10][11]
herbaceum). Les données étayant cette conclusion figurent dans l’Annexe A. Dans certains cas, aucun
signal n’a été obtenu en partant de la plus grande quantité d’ADN et aucune analyse supplémentaire n’a été
réalisée pour élucider la cause de l’inhibition de la PCR.
6 Préparation de l’échantillon pour essai
Il convient d’homogénéiser l’échantillon pour essai au moyen de méthodes adaptées et en évitant tout
chauffage excessif. La préparation de l’échantillon dépend du type d’échantillon. Préparer les échantillons en
utilisant l’une des techniques suivantes: arrachage, découpe, broyage ou déchiquetage.
Préparer au moins deux réplicats par échantillon. Inclure des témoins négatifs et positifs appropriés,
comme spécifié dans l’ISO 21571 relative à l’extraction de l’ADN.
Les méthodes appropriées de préparation des échantillons pour essai pour différents types de matériau
sont les suivantes:
— graines de coton: broyer soigneusement les graines en utilisant une méthode adaptée. En utiliser 100 mg
pour le mode opératoire d’extraction de l’ADN. S’assurer que les graines sont exemptes de petites fibres/
bourre, c’est-à-dire qu’elles sont délintées;
— feuille de coton: broyer soigneusement les feuilles en utilisant une méthode adaptée. En utiliser 100 mg
pour le mode opératoire d’extraction de l’ADN;
— coton-graine: séparer les graines des longues fibres et broyer soigneusement les graines en utilisant
une méthode adaptée. En utiliser 100 mg pour le mode opératoire d’extraction de l’ADN;
— bourre de coton: le matériau fibreux peut être séparé de la graine et arraché soigneusement en utilisant
une méthode adaptée. En utiliser 100 mg pour le mode opératoire d’extraction de l’ADN;
— fil grège: découper le fil en petits morceaux d’environ 0,5 cm de longueur au maximum en utilisant
une méthode adaptée. En utiliser 100 mg pour le mode opératoire d’extraction de l’ADN;
— étoffe grège: découper l’étoffe en petits morceaux d’environ 0,5 cm × 0,5 cm au maximum en utilisant
une méthode adaptée. En utiliser 100 mg pour le mode opératoire d’extraction de l’ADN.
7 Évaluation des méthodes d’extraction d’ADN pour différentes phases
de production du coton
7.1 Généralités
Plusieurs méthodes d’extraction permettant d’obtenir de l’ADN de qualité PCR à partir de différents
matériaux de coton utilisés dans le processus de production, de la graine de coton aux textiles, ont été
soumises à essai afin de déterminer si l’une d’elles donnait de meilleurs résultats dans des matrices
spécifiées. La matrice de graines de coton, dont les essais ont été les plus constants, a donné les meilleurs
rendements avec des méthodes à extraits multiples. Dans le cadre de l’étude du WFSR, des échantillons
de coton provenant du processus de production du coton ont été utilisés pour comparer cinq méthodes
d’extraction d’ADN. Les échantillons ont été obtenus auprès de sources aux États-Unis, en Türkiye et en Inde.
Pour confirmer la présence et la qualité PCR de l’ADN extrait, chaque ADN extrait a été soumis à une PCR
[11]
quantitative pour le témoin endogène SAH7. Les essais de PCR quantitative ont été réalisés deux fois sur
l’ADN non dilué. Les cinq méthodes d’extraction d’ADN examinées étaient:
a) une méthode au bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB);
b) un kit commercial d’extraction par billes magnétiques;
[12]
c) une méthode au CTAB combinée à un kit d’extraction d’ADN végétal;
d) une méthode au CTAB utilisée par le laboratoire communautaire de référence VL-14/05XP;
e) un système commercial d’extraction d’ADN sur colonne à centrifuger conçu pour l’extraction d’ADN
®1) [13]
à partir d’échantillons de selles (QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit ).
Les résultats de cette étude sont fournis à l’Annexe B.
7.2 Résultats de l’analyse intralaboratoire des méthodes d’extraction d’ADN
Les extraits de graines de coton ont produit de manière constante les meilleures amplifications, tandis
qu’une amplification beaucoup plus faible ou nulle a été observée sur d’autres matrices selon la méthode.
Le système commercial d’extraction d’ADN sur colonne à centrifuger conçu pour l’extraction d’ADN à partir
d’échantillons de selles a permis l’extraction d’ADN de qualité PCR (ADN amplifiable en utilisant la méthode
pour le SAH7 endogène) à partir d’échantillons de graines de coton, de feuilles de coton, de bourre de coton,
de fil grège et d’étoffe grège. Les données pour l’évaluation de l’ADN extrait à l’aide de ce système commercial
d’extraction d’ADN sur colonne à centrifuger conçu pour l’extraction d’ADN à partir d’échantillons de selles
avec la méthode SAH7 sont fournies à l’Annexe D. Pour le fil grège et l’étoffe grège, seule une très petite
quantité d’ADN a pu être extraite à la limite de détection de l’essai de PCR. Le fil traité et l’étoffe traitée n’ont
pas donné d’ADN de qualité PCR. Cet ADN n’a pas été amplifié avec succès avec la méthode PCR pour la cible
endogène SAH7. L’extraction d’ADN à partir de fil traité et d’étoffe traitée ne produit pas d’ADN pouvant être
utilisé dans le criblage d’OGM. Les autres méthodes d’extraction d’ADN utilisées dans l’étude n’ont donné que
peu voire pas d’ADN de qualité PCR avec le fil traité et l’étoffe traitée, et la PCR quantitative ultérieure avec
le témoin endogène n’a pas abouti. Les résultats sont fournis à l’Annexe B.
7.3 Conclusion
Pour les méthodes d’extraction d’ADN et les phases de production de coton évaluées, les résultats ont
montré que le système commercial d’extraction d’ADN sur colonne à centrifuger conçu pour l’extraction
d’ADN à partir d’échantillons de selles était la seule méthode d’extraction d’ADN qui produisait de l’ADN
de qualité PCR à partir de graines de coton, de bourre de coton, de fil grège et d’étoffe grège. Cependant, la
[12]
méthode des selles (voir Annexe D), la méthode au CTAB avec kit d’extraction d’ADN végétal (voir B.1.1) et
la méthode au CTAB sur colonne à centrifuger (voir B.1.4) ont donné des résultats similaires sur les graines
de coton. En raison de la très faible quantité d’ADN de qualité extractible à partir de bourre de coton, de
fil grège et d’étoffe grège (Cq > 34), la limite de détection pratique du contenu GM dans les adjuvants de
coton est très élevée. La seule conclusion qu’il est possible de tirer d’un résultat d’analyse PCR de fibres de
coton et de matières issues de fibres de coton en utilisant les méthodes de criblage d’OGM décrites dans
[4]
l’ISO/TS 5354-2:2024 est qu’il ne s’agit pas de coton GM pur. Les adjuvants de coton GM ne peuvent pas
être détectés pour la bourre de coton, le fil grège et l’étoffe grège.
La cible SAH7 n’était pas détectable dans l’ADN extrait des matériaux des phases finales de production:
fil traité et étoffe traitée. D’autres méthodes d’extraction d’ADN n’ont donné que peu voire pas d’ADN pour
ces produits, et la PCR quantitative ultérieure avec le témoin endogène n’a pas abouti.
8 Stockage
L’ADN extrait peut être conservé à 4 °C pendant une semaine au maximum ou à −20 °C indéfiniment.
9 Quantification de l’ADN
Une quantification de l’ADN extrait peut se faire soit à l’aide de méthodes physiques (par exemple, par
mesurage de l’absorbance à 230/260/280 nm), chimico-physiques (par exemple, par emploi de marqueurs
fluorescents intercalants ou de liaison) ou enzymatiques (par exemple, par détection de bioluminescence),
soit en procédant à une PCR quantitative. Ces méthodes sont décrites dans l’ISO 21571:2005, Annexe B. ®
1) QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Qiagen GmbH. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve l’emploi du
produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes
résultats.
D’autres protocoles peuvent être appliqués, à condition que la méthode ait été validée sur la matrice
concernée étudiée. L’utilisateur peut choisir la méthode la plus appropriée en fonction de la quantité et de la
qualité de l’ADN à quantifier.
La PCR quantitative est particulièrement adaptée aux matrices pour lesquelles l’extrait d’ADN peut avoir
une faible concentration d’ADN ou celles pour l
...
Questions, Comments and Discussion
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