ISO 20186-3:2019

Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-examination processes for venous whole blood — Part 3: Isolated circulating cell free DNA from plasma

This document provides recommendations and requirements on the handling, storage, processing and documentation of venous whole blood specimens intended for circulating cell free DNA (ccfDNA) examination during the pre-examination phase before an analytical test is performed. This document covers specimens collected in venous whole blood collection tubes. This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic examination performed by medical laboratories. It is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and manufacturers, biobanks, institutions and commercial organizations performing biomedical research, and regulatory authorities. Different dedicated measures are taken for stabilizing blood genomic DNA, which are not described in this document. Blood genomic DNA is covered in ISO 20186-2. Different dedicated measures are taken for preserving DNA in circulating exosomes, which are not described in this document. NOTE ccfDNA obtained from blood by the procedures cited in this document can contain DNA originally present in exosomes[8][9]. DNA in pathogens present in blood is not covered by this document.

Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour le sang total veineux — Partie 3: ADN libre circulant extrait du plasma

Le présent document fournit des recommandations et des exigences sur la manipulation, le stockage, le traitement et la documentation des prélèvements de sang total veineux destinés à l'analyse de l'ADN libre circulant (ADNlc) durant la phase préanalytique précédant la réalisation d'un essai analytique. Le présent document concerne les échantillons primaires prélevés dans des tubes de prélèvement de sang total veineux. Le présent document s'applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro réalisées par des laboratoires de biologie médicale. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires, des développeurs et fabricants de l'industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des autorités de réglementation. Des mesures spécifiques différentes, non décrites dans le présent document, sont prises pour stabiliser l'ADN génomique sanguin. L'ADN génomique sanguin est couvert par l'ISO 20186-2. Des mesures spécifiques différentes, non décrites dans le présent document, sont prises pour préserver l'ADN des exosomes circulants. NOTE L'ADNlc extrait du sang à l'aide des protocoles cités dans le présent document est susceptible de contenir de l'ADN présent à l'origine dans les exosomes[8][9]. L'ADN des pathogènes présents dans le sang n'est pas couvert par le présent document.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 24-Sep-2019
• ICS: 11.100.10 - In vitro diagnostic test systems
• Technical Committee: ISO/TC 212 - Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems
• Drafting Committee: ISO/TC 212/WG 4 - Microbiology and molecular diagnostics
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 25-Sep-2019
• Due Date: 17-Sep-2019
• Completion Date: 25-Sep-2019

Relations

• Consolidates: ISO 8559-1:2017 - Size designation of clothes — Part 1: Anthropometric definitions for body measurement
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20186-3
First edition
2019-09
Molecular in vitro diagnostic
examinations — Specifications for
pre-examination processes for venous
whole blood —
Part 3:
Isolated circulating cell free DNA
from plasma
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro — Spécifications relatives
aux processus préanalytiques pour le sang total veineux —
Partie 3: ADN libre circulant extrait du plasma
Reference number
ISO 20186-3:2019(E)
©
ISO 2019

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ISO 20186-3:2019(E)

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019
All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may
be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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CH-1214 Vernier, Geneva
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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved

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ISO 20186-3:2019(E)

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2  Normative references . 1
3  Terms and definitions . 1
4 General consideration . 5
5 Outside the laboratory . 5
5.1 Specimen collection . 5
5.1.1 Information about the specimen donor/patient . 5
5.1.2 Selection of the venous whole blood collection tube by the laboratory . 6
5.1.3 Venous whole blood collection from the donor/patient and stabilization
procedures . 6
5.1.4 Information about the specimen and storage requirements at the blood
collection facility . 7
5.2 Transport requirements . 7
6 Inside the laboratory . 8
6.1 Specimen reception . 8
6.2 Storage requirements for blood specimens . 8
6.3 Plasma preparation . 9
6.4 Storage requirements for plasma samples . 9
6.5 Isolation of the ccfDNA .10
6.5.1 General.10
6.5.2 Using blood collection tubes with stabilizers .10
6.5.3 Using blood collection tubes without stabilizers .11
6.6 Quantity and quality assessment of isolated ccfDNA .11
6.7 Storage of isolated ccfDNA .11
6.7.1 General.11
6.7.2 ccfDNA isolated with commercially available kits .12
6.7.3 ccfDNA isolated with the laboratory's own protocols .12
Annex A (informative) Impact of pre-examination process steps on circulating cell free DNA
profiles in venous whole blood plasma .13
Bibliography .16
© ISO 2019 – All rights reserved iii

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ISO 20186-3:2019(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso
.org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 212, Clinical laboratory testing and in
vitro diagnostic test systems.
A list of all parts in the ISO 20186 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
iv © ISO 2019 – All rights reserved

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ISO 20186-3:2019(E)

Introduction
Molecular in vitro diagnostics has enabled a significant progress in medicine. Further progress is
expected by new technologies analysing profiles of nucleic acids, proteins, and metabolites in human
tissues and body fluids. However, the profiles of these molecules can change drastically during the
pre-examination process, including the specimen collection, transport, storage and processing.
Consequently, this makes the outcome from diagnostics or research unreliable or even impossible
because the subsequent examination might not determine the real situation in the patient, but an
artificial profile generated during the pre-examination processes.
Circulating cell free DNA (ccfDNA) profiles can change significantly after blood collection (e.g. release
of genomic DNA from cells in blood, ccfDNA degradation and fragmentation and ccfDNA quantity
change). Therefore, special measures need to be taken to secure good quality specimens for ccfDNA
[23]
examination. Studies have been undertaken to determine the important influencing factors .
Standardization of the entire workflow from specimen collection to the ccfDNA examination is needed.
This document standardizes the steps of the pre-examination phase of circulating cell free DNA
prepared from plasma of venous whole blood.
In this document, the following verbal forms are used:
— “shall” indicates a requirement;
— “should” indicates a recommendation;
— “may” indicates a permission;
— “can” indicates a possibility or a capability.
© ISO 2019 – All rights reserved v

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20186-3:2019(E)
Molecular in vitro diagnostic examinations —
Specifications for pre-examination processes for venous
whole blood —
Part 3:
Isolated circulating cell free DNA from plasma
1 Scope
This document provides recommendations and requirements on the handling, storage, processing
and documentation of venous whole blood specimens intended for circulating cell free DNA (ccfDNA)
examination during the pre-examination phase before an analytical test is performed. This document
covers specimens collected in venous whole blood collection tubes.
This document is applicable to any molecular in vitro diagnostic examination performed by medical
laboratories. It is also intended to be used by laboratory customers, in vitro diagnostics developers and
manufacturers, biobanks, institutions and commercial organizations performing biomedical research,
and regulatory authorities.
Different dedicated measures are taken for stabilizing blood genomic DNA, which are not described in
this document. Blood genomic DNA is covered in ISO 20186-2.
Different dedicated measures are taken for preserving DNA in circulating exosomes, which are not
described in this document.
NOTE ccfDNA obtained from blood by the procedures cited in this document can contain DNA originally
[8][9]
present in exosomes .
DNA in pathogens present in blood is not covered by this document.
2  Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 15189:2012, Medical laboratories — Requirements for quality and competence
3  Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
analyte
component represented in the name of a measurable quantity
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2, modified — The example has been deleted.]
© ISO 2019 – All rights reserved 1

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ISO 20186-3:2019(E)

3.2
backflow
flow of a liquid opposite to the usual or desired direction
3.3
blood collection set
intravenous device specialized for venipuncture consisting of a stainless steel beveled needle and tube
(tubing) with attached plastic wings and fitting connector
Note 1 to entry: The connector attaches to an additional blood collection device, e.g. a blood collection tube.
3.4
blood collection tube
tube used for blood collection, usually with a vacuum which forces blood from the vein through the
needle into the tube
3.5
ccfDNA
circulating cell free DNA
extracellular human DNA present in blood and plasma
[8][9]
Note 1 to entry: ccfDNA can include DNA present in vesicles such as exosomes .
3.6
ccfDNA profile
circulating cell free DNA profile
amount of different ccfDNA molecules, present in blood and plasma that can be measured in the absence
of any losses, inhibition and interference
3.7
closed system
non-modifiable system provided by the vendor including all necessary components for the pre-
examination and/or examination (i.e. hardware, software, procedures and reagents)
3.8
DNA
deoxyribonucleic acid
polymer of deoxyribonucleotides occurring in a double-stranded (dsDNA) or single-stranded
(ssDNA) form
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.9
DNase
deoxyribonuclease
enzyme that catalyzes the degradation of DNA into smaller components
3.10
examination
analytical test
set of operations having the object of determining the value or characteristics of a property
Note 1 to entry: Processes that start with the isolated analyte and include all kinds of parameter testing or
chemical manipulation for quantitative or qualitative examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modified —"analytical test" has been added as additional preferred
term; Notes to entry have been deleted; new Note 1 to entry has been added.]
2 © ISO 2019 – All rights reserved

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ISO 20186-3:2019(E)

3.11
examination performance
analytical test performance
analytical performance
ability of an examination procedure to measure or detect a particular analyte
Note 1 to entry: Analytical performance is determined from analytical performance studies used to assess the
ability of an in vitro diagnostic examination procedure to measure or detect a particular analyte.
Note 2 to entry: Analytical performance includes such characteristics as analytical sensitivity, detection limit,
analytical specificity (interference and cross-reactivity), trueness, precision and linearity.
[SOURCE: ISO/TS 17822-1:2014, 3.2, modified — Two preferred terms have been added.]
3.12
examination provider
analytical test provider
entity that provides the specific analytical test
3.13
needle holder
barrel used in routine venipuncture procedures to hold the blood collection tube in place and to protect
the phlebotomist from direct contact with blood
3.14
pre-examination processes
preanalytical phase
preanalytical workflow
processes that start, in chronological order, from the clinician's request and include the examination
request, preparation and identification of the patient, collection of the primary sample(s),
transportation to and within the medical laboratory, isolation of analytes, and end when the analytical
examination begins
Note 1 to entry: The pre-examination phase includes preparative processes, e.g. ccfDNA isolation procedures,
which influence the outcome of the intended examination.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modified — An additional term has been added and more detail have
been included in the definition; Note 1 to entry has been added.]
3.15
primary sample
specimen
discrete portion of a body fluid, breath, hair or tissue taken for examination, study or analysis of one or
more quantities or properties assumed to apply for the whole
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modified — Notes to entry have been deleted.]
3.16
proficiency testing
evaluation of participant performance against pre-established criteria by means of inter-laboratory
comparisons
[SOURCE: ISO/IEC 17043:2010, 3.7, modified — Notes have been deleted.]
3.17
RNA
ribonucleic acid
polymer of ribonucleotides occurring in a double-stranded or single-stranded form
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.3]
© ISO 2019 – All rights reserved 3

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ISO 20186-3:2019(E)

3.18
RNase
ribonuclease
enzyme that catalyzes the degradation of RNA into smaller components
3.19
room temperature
temperature in the range of 18 °C to 25 °C for the purposes of this document
Note 1 to entry: Local or national regulations can have different definitions.
3.20
sample
one or more parts taken from a primary sample
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modified — The example has been deleted.]
3.21
stability
ability of a specimen or sample, when stored under specified conditions, to maintain a stated property
value within specified limits for a specified period of time
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.15, modified — The words “reference material” have been replaced by
“specimen or sample”.]
3.22
validation
confirmation, through the provision of objective evidence, that the requirements for a specific intended
use or application have been fulfilled
Note 1 to entry: The term “validated” is used to designate the corresponding status.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modified — Notes 1 and 3 to entry have been deleted, Note 2 to entry
has been renumbered as Note 1 to entry.]
3.23
venous whole blood
blood collected after directly puncturing a vein, usually with a needle and syringe, or other
collection device
3.24
verification
confirmation, through the provision of objective evidence, that specified requirements have been
fulfilled
Note 1 to entry: The term “verified” is used to designate the corresponding status.
Note 2 to entry: Confirmation can comprise activities such as
— performing alternative calculations;
— comparing a new design specification with a similar proven design specification;
— undertaking tests and demonstrations;
— reviewing documents prior to issue.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.12, modified — Notes 1 and Note 2 to entry have been deleted; Note 3 to
entry has been renumbered as Note 1 to entry; new Note 2 to entry has been added.]
3.25
workflow
series of activities necessary to complete a task
4 © ISO 2019 – All rights reserved

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ISO 20186-3:2019(E)

4 General consideration
For general statements on medical laboratory quality management systems and in particular on
specimen collection, reception and handling (including avoidance of cross contaminations) see
ISO 15189:2012, 4.2, 5.4.4, 5.4.6 or ISO/IEC 17020:2012, Clause 8 and 7.2. The requirements on
laboratory equipment, reagents, and consumables according to ISO 15189:2012, 5.3 shall be followed;
ISO 15189:2012, 5.5.1.2 and 5.5.1.3 and ISO/IEC 17020:2012, 6.2 can also apply.
All steps of a diagnostic workflow can influence the final examination result. Thus, the entire workflow,
including specimen/sample storage and transport conditions, and its impact on the stability of
biomolecules intended to be examined shall be verified and validated. Workflow steps which cannot
always be controlled shall be documented and their impact on the examination performance shall
be investigated and mitigation measures shall be established to allow the required examination
performance. In these cases, risk assessment is recommended.
CcfDNA profiles can change significantly after blood collection. The post-collection release of genomic
DNA from cells in blood can change the ccfDNA profile significantly (see A.1). Additional post-
[10][11][12][13]
collection effects can also occur, e.g. ccfDNA fragmentation . All these post-collection
changes can vary individually in specimens from different donors or patients, and they can also
[10][14][15][16]
depend on pathophysiological conditions . This can impact the validity and reliability of the
examination results (see A.2).
Before or during the design of an examination, it shall therefore be investigated and ensured that
the ccfDNA profile(s) intended to be analysed is/are not compromised in a manner impacting the
examination performance. This can be done, e.g. by applying the intended examination to specimens/
samples which underwent time course studies reflecting the individual pre-examination process steps
such as transport and storage and by implementing measures to prevent or reduce impacts by the
identified pre-analytical variables, e.g. by using blood collection tubes with stabilizers.
Safety procedures for handling and transport shall be in place. Safety requirements on transport and
handling shall be considered (see ISO 15189 and ISO 15190).
During the whole pre-examination process, precautions shall be taken to avoid cross contamination
between different samples/specimens, e.g. by using single-use material whenever feasible or
appropriate cleaning procedures between processing of different specimens/samples.
If a commercial product is not used in accordance with the manufacturer's instructions, responsibility
for its validation, verification, use and performance lies with the user.
5 Outside the laboratory
5.1 Specimen collection
5.1.1  Information about the specimen donor/patient
The documentation shall include the ID of the specimen donor/patient, which can be in the form of a code.
The documentation should include, but is not limited to:
a) the relevant health status of the specimen donor or patient [e.g. healthy, disease type, concomitant
disease, demographics (e.g. age and gender)];
NOTE In particular, e.g. cancer, inflammation, diabetes, hepatic disease, coronary disease, respiratory
[10]
syndrome, trauma, after exhaustive exercise , in elderly patients suffering from acute or chronic disease,
first trimester of pregnancy, placental disorders as pre-term labour, pre-eclampsia and malimplantation
[10][14][15][16]
have been reported to affect both ccfDNA quantity and fragmentation .
b) the information about medical treatment and special treatment prior to blood collection (e.g.
anaesthetics, medications, fasting status);
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ISO 20186-3:2019(E)

c) the type and purpose of the proposed examination requested;
d) the appropriate consent from the specimen donor/patient.
See also ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2  Selection of the venous whole blood collection tube by the laboratory
The ccfDNA profile can be influenced by inadequate venous whole blood collection procedures and
inappropriate storage/shipping conditions, plasma separation as well as by ccfDNA isolation procedures.
Specifically, the post-collection release of genomic DNA from white blood cells can change the ccfDNA
profile significantly (see A.1). This can impact the validity of the examination results (see A.2).
Venous whole blood should be collected in appropriate collection devices.
Blood should be collected in appropriate venous whole blood collection tubes containing ccfDNA
profile stabilizers as post-collection release of genomic DNA from blood cells or other ccfDNA profile
changes can cause impacts on the intended examination. The tubes' catalogue and lot number should be
documented.
Blood collection tubes not containing any ccfDNA profile stabilizers should be used only if allowed by
the examination provider's instructions. In these cases, EDTA blood collection tubes should be used
[12][17]
in preference to other collection tubes . EDTA prevents clotting but not the release of DNA from
[17]
blood cells . Consult the specifications by the examination provider for details. Where the ccfDNA
examination provider requires usage of a dedicated blood collection tube, this shall be used.
Induced clotting process in serum tubes can lead to a leucocytes lysis causing the release of DNA, thus
[18]
changing the native ccfDNA profile. Therefore the use of serum tubes should be avoided .
5.1.3  Venous whole blood collection from the donor/patient and stabilization procedures
a) The identity of the person collecting the specimen and the date and time of blood collection shall be
documented.
b) For the labelling (sample/specimen identification) of the blood collection tube a routine procedure
[ISO 15189:2012, 5.4.4.3, e)] or a procedure with additional information (e.g. 2D-barcode) shall
be used.
c) Standard venipuncture technique can be used. Steps for preventing possible backflow into the
donor's/patient’s body can be required. The manufacturer's instructions for using the blood
collection tubes shall be followed. A blood collection set and needle holder can be required when
using ccfDNA profile stabilizer containing tubes. In this case, the instructions of the collection set
and needle holder manufacturer shall be followed.
NOTE There is no known specific effect of venous whole blood draw procedure on the ccfDNA profile.
Routine procedures can therefore be used.
d) Blood collection tubes shall be filled in accordance with the manufacturer's instructions and
attention should be drawn to the correct positioning of the collection tube during the blood draw
as well as the required blood volume.
NOTE 1 Prolonged tourniquet during the venipuncture process or any hard-draw collection, such as
retracting and/or pulling the syringe plunger too hard, can lead to increased hemolysis.
NOTE 2 Underfilled/overfilled blood collection tubes alter the dilution factor with the stabilizer and/or
anticoagulant, which can lead to changed ccfDNA profiles.
e) Blood collection tube manufacturer’s instructions, for mixing or inverting the tube immediately
after blood collection, shall be followed. Mixing or inverting the blood collection tube shall be done
gently to avoid the destruction of cells in blood with subsequent release of DNA. If no information
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ISO 20186-3:2019(E)

about mixing or inverting is given by the manufacturer’s instructions, each tube should be inverted
8 times to 10 times.
NOTE 3 Wrong and/or insufficient mixing can be one of the most important pre-examination variables.
Unless additives in the blood collection tubes are homogenously mixed with the specimen, the ccfDNA
profile and the ccfDNA quality can be compromised, which can impact the validity and reliability of the
examination results.
f) Any tampering with and/or additions to the specimen shall be documented.
Until clean plasma is obtained, special care need to be taken to avoid lysis of blood cells thus leading
to the release of cellular DNA changing the native ccfDNA profile of the donor/patient. Therefore, the
[11]
specimen shall not be frozen or shaken vigorously .
5.1.4  Information about the specimen and storage requirements at the blood collection facility
5.1.4.1 General
The cellular DNA released by the ongoing blood cell lysis after blood collection contaminates the
[11]
sample and can affect the validity and reliability of the examination result (see A.1 and A.2). The
[11][18]
documentation regarding the specimen shall include the date and time of blood collection .
It shall be documented that the required storage conditions have been followed. The temporary storage
duration in the blood collection facility contributes to the total duration for storage.
5.1.4.2  Using blood collection tubes with stabilizers
Blood tubes with ccfDNA profile stabilizers should be used. For storing the specimens collected in blood
tubes with ccfDNA profile stabilizers, the dedicated blood collection tube manufacturer’s instructions
on storage conditions shall be followed (e.g. temperature and storage duration). Where the examination
provider’s instructions are more stringent, these shall be followed. The storage conditions (temperature
and duration etc.) shall be documented.
5.1.4.3  Using blood collection tubes without stabilizers
5.1.4.3.1 Blood collection tubes without ccfDNA profile stabilizers should only be used, if the ordered
examination specifications allow the usage of such tubes. In these cases, the examination provider's
instructions on storage conditions shall be followed. This can require documentation of storage
conditions (temperature and duration etc.).
5.1.4.3.2 When using blood collection tubes without ccfDNA profile stabilizers and no requirements on
the storage conditions are available, the specimen should be transf
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20186-3
Première édition
2019-09
Analyses de diagnostic moléculaire in
vitro — Spécifications relatives aux
processus préanalytiques pour le sang
total veineux —
Partie 3:
ADN libre circulant extrait du plasma
Molecular in vitro diagnostic examinations — Specifications for pre-
examination processes for venous whole blood —
Part 3: Isolated circulating cell free DNA from plasma
Numéro de référence
ISO 20186-3:2019(F)
©
ISO 2019

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ISO 20186-3:2019(F)

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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
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CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
Fax: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés

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ISO 20186-3:2019(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3  Termes et définitions . 1
4 Considérations générales . 5
5 Hors du laboratoire . 6
5.1 Recueil des prélèvements . 6
5.1.1 Informations relatives au donneur/patient . 6
5.1.2 Choix du tube de prélèvement de sang total veineux par le laboratoire . 6
5.1.3 Protocoles de prélèvement de sang total veineux du donneur/patient et
protocoles de stabilisation . 7
5.1.4 Informations sur les échantillons primaires et exigences de stockage dans
le centre de prélèvement . 7
5.2 Exigences de transport . 8
6 Dans le laboratoire . 9
6.1 Réception des prélèvements . 9
6.2 Exigences de stockage pour les prélèvements de sang . 9
6.3 Préparation du plasma . 9
6.4 Exigences de stockage pour les échantillons de plasma .10
6.5 Extraction de l’ADNlc .11
6.5.1 Généralités .11
6.5.2 Utilisation de tubes de prélèvement sanguin contenant des stabilisateurs .11
6.5.3 Utilisation de tubes de prélèvement sanguin sans stabilisateur .12
6.6 Évaluation quantitative et qualitative de l’ADNlc extrait .12
6.7 Stockage de l’ADNlc extrait .12
6.7.1 Généralités .12
6.7.2 ADNlc extrait avec des kits disponibles dans le commerce .13
6.7.3 ADNlc extrait suivant des protocoles propres au laboratoire .13
Annexe A (informative) Impact des étapes du processus préanalytique sur les profils d’ADN
libre circulant dans le plasma du sang total veineux .14
Bibliographie .18
© ISO 2019 – Tous droits réservés iii

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ISO 20186-3:2019(F)

Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 212, Laboratoires d'analyses de
biologie médicale et systèmes de diagnostic in vitro.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 20186 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 20186-3:2019(F)

Introduction
Le diagnostic moléculaire in vitro a permis de faire considérablement progresser la médecine. D’autres
avancées sont attendues avec les nouvelles technologies d’analyse des profils des acides nucléiques,
des protéines et des métabolites dans les tissus humains et les fluides corporels. Toutefois, les profils
de ces molécules peuvent varier considérablement au cours du processus préanalytique, incluant le
prélèvement des échantillons, le transport, le stockage et le traitement. Il en découle un résultat de
diagnostic ou de recherche peu fiable, voire impossible, car l’analyse subséquente pourrait ne pas
déterminer l’état réel du patient, mais un profil artificiel généré pendant les processus préanalytiques.
Les profils d’ADN libre circulant (ADNlc) peuvent varier considérablement suite à un prélèvement
sanguin (par exemple, libération d’ADN génomique par les cellules sanguines, dégradation et
fragmentation de l’ADNlc et changement de la quantité d’ADNlc). Par conséquent, il est nécessaire que
des mesures spécifiques soient prises pour assurer la bonne qualité des échantillons primaires en vue
[23]
de l’analyse de l’ADNlc. Des études ont été réalisées afin de définir les facteurs les plus influents .
Une normalisation de l’ensemble du flux de travail, à partir du prélèvement de l’échantillon primaire
jusqu’à l’analyse de l’ADNlc, est nécessaire.
Le présent document normalise les étapes de la phase préanalytique de l’ADN libre circulant préparé à
partir du plasma du sang total veineux.
Dans le présent document, les formes verbales suivantes sont utilisées:
— «doit» indique une exigence;
— «il convient de/que» indique une recommandation;
— «peut/il est admis/permis» indique une autorisation;
— «peut/il est possible» indique une possibilité ou une capacité.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20186-3:2019(F)
Analyses de diagnostic moléculaire in vitro —
Spécifications relatives aux processus préanalytiques pour
le sang total veineux —
Partie 3:
ADN libre circulant extrait du plasma
1 Domaine d’application
Le présent document fournit des recommandations et des exigences sur la manipulation, le stockage,
le traitement et la documentation des prélèvements de sang total veineux destinés à l’analyse de l’ADN
libre circulant (ADNlc) durant la phase préanalytique précédant la réalisation d’un essai analytique. Le
présent document concerne les échantillons primaires prélevés dans des tubes de prélèvement de sang
total veineux.
Le présent document s’applique aux analyses de diagnostic moléculaire in vitro réalisées par des
laboratoires de biologie médicale. Il est également destiné à être utilisé par des clients de laboratoires,
des développeurs et fabricants de l’industrie du diagnostic in vitro, ainsi que par des biobanques, des
institutions et des organismes commerciaux spécialisés en recherche biomédicale, de même que des
autorités de réglementation.
Des mesures spécifiques différentes, non décrites dans le présent document, sont prises pour stabiliser
l’ADN génomique sanguin. L’ADN génomique sanguin est couvert par l’ISO 20186-2.
Des mesures spécifiques différentes, non décrites dans le présent document, sont prises pour préserver
l’ADN des exosomes circulants.
NOTE L’ADNlc extrait du sang à l’aide des protocoles cités dans le présent document est susceptible de
[8][9]
contenir de l’ADN présent à l’origine dans les exosomes .
L’ADN des pathogènes présents dans le sang n’est pas couvert par le présent document.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 15189:2012, Laboratoires de biologie médicale — Exigences concernant la qualité et la compétence
3  Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
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ISO 20186-3:2019(F)

3.1
analyte
composant représenté sous la forme d’une grandeur mesurable
[SOURCE: ISO 17511:2003, 3.2, modifiée — L'exemple a été supprimé.]
3.2
reflux
écoulement d’un liquide dans la direction opposée à la direction d’écoulement habituelle ou souhaitée
3.3
kit de prélèvement sanguin
dispositif intraveineux conçu spécifiquement pour la ponction veineuse, constitué d’une aiguille
biseautée en acier inoxydable et d’un tube doté d’ailettes en plastique et d’un raccord
Note 1 à l'article: Le raccord se fixe sur un dispositif de prélèvement sanguin supplémentaire, par exemple un
tube de prélèvement sanguin.
3.4
tube de prélèvement sanguin
tube utilisé pour prélever du sang, généralement avec un vide entraînant le sang de la veine à pénétrer
dans l’aiguille pour venir remplir le tube
3.5
ADNlc
ADN libre circulant
ADN humain extracellulaire présent dans le sang et le plasma
[8][9]
Note 1 à l'article: l’ADNlc peut inclure de l’ADN présent dans des vésicules telles que les exosomes .
3.6
profil d’ADNlc
profil d’ADN libre circulant
quantité de molécules d’ADNlc individuelles présentes dans le sang et le plasma qui peut être mesurée
en l’absence de toute perte, inhibition et interférence
3.7
système fermé
système non modifiable, fourni par le fournisseur, incluant tous les composants nécessaires à la
préanalyse et/ou à l’analyse (c’est-à-dire le matériel, les logiciels, les protocoles et les réactifs)
3.8
ADN
acide désoxyribonucléique
polymère de désoxyribonucléotides se présentant sous la forme de double brin (ADNdb) ou de simple
brin (ADNsb)
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.2]
3.9
DNase
désoxyribonucléase
enzyme catalysant la dégradation de l’ADN en composants plus petits
3.10
analyse
essai analytique
phase analytique
ensemble des opérations destinées à déterminer la valeur ou les caractéristiques d’une propriété
Note 1 à l'article: Les processus débutent avec l’analyte extrait et comprennent toutes sortes d’essais
paramétriques ou une manipulation chimique en vue de réaliser l’analyse quantitative ou qualitative.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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ISO 20186-3:2019(F)

[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.7, modifiée — Les termes « essai analytique » et « phase analytique » ont
été ajoutés et sont considérés comme des termes complémentaires recommandés; les Notes à l’article
ont été supprimées; une nouvelle Note 1 à l’article a été ajoutée.]
3.11
performance d’analyse
performance d’un essai analytique
performance analytique
aptitude d’un protocole d’analyse à mesurer ou détecter un analyte particulier
Note 1 à l'article: La performance analytique est déterminée à partir des études de performance analytique
servant à évaluer l’aptitude d’un protocole d’analyse de diagnostic in vitro à mesurer ou détecter un analyte
particulier.
Note 2 à l'article: La performance analytique englobe des caractéristiques telles que la sensibilité analytique,
la limite de détection, la spécificité analytique (interférences et réactivité croisée), la justesse, la fidélité et la
linéarité.
[SOURCE: ISO/TS 17822-1:2014, 3.2, modifiée — Deux termes recommandés ont été ajoutés.]
3.12
prestataire d’analyse
prestataire d’essai analytique
entité fournissant un essai analytique spécifique
3.13
porte-aiguille
corps de seringue utilisé dans les protocoles de ponction veineuse de routine pour maintenir en place le
tube de prélèvement sanguin et protéger le phlébotomiste d’un contact direct avec le sang
3.14
processus préanalytiques
phase préanalytique
flux de travail préanalytique
processus commençant chronologiquement par la prescription des analyses par le clinicien, comprenant
la demande d’analyse, la préparation et l’identification du patient, le prélèvement de l’échantillon
primaire, son acheminement jusqu’au laboratoire et au sein du laboratoire médical, l’extraction des
analytes, et finissant au début de l’analyse
Note 1 à l'article: La phase préanalytique comprend des processus de préparation, par exemple des protocoles
d’extraction de l’ADNlc, qui influencent le résultat prévu de l’analyse.
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.15, modifiée — Un terme supplémentaire a été ajouté et davantage de
précisions ont été apportées à la définition; la Note 1 à l’article a été ajoutée.]
3.15
échantillon primaire
prélèvement
partie discrète d’un fluide corporel, d’une haleine, d’un cheveu ou d’un tissu prélevé à des fins d’examens,
d’étude ou d’analyse d’une ou plusieurs grandeurs ou propriétés pour déterminer le caractère de
l’ensemble
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.16, modifiée — Les Notes à l’article ont été supprimées.]
3.16
essai d’aptitude
évaluation de la performance d’un participant par rapport à des critères préétablis au moyen de
comparaisons interlaboratoires
[SOURCE: ISO/IEC 17043:2010, 3.7, modifiée — Les notes ont été supprimées.]
© ISO 2019 – Tous droits réservés 3

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ISO 20186-3:2019(F)

3.17
ARN
acide ribonucléique
polymère de ribonucléotide se présentant sous la forme de double brin ou de brin simple
[SOURCE: ISO 22174:2005, 3.1.3]
3.18
RNase
ribonucléase
enzyme catalysant la dégradation de l’ARN en composants plus petits
3.19
température de laboratoire
température dans la plage de 18 °C à 25 °C pour les besoins du présent document
Note 1 à l'article: Des réglementations locales ou nationales peuvent stipuler des définitions différentes.
3.20
échantillon
une ou plusieurs parties prélevées à partir d’un échantillon primaire
[SOURCE: ISO 15189:2012, 3.24, modifiée — L’exemple a été supprimé.]
3.21
stabilité
caractéristique d’un échantillon primaire ou d’un échantillon, lorsqu’il est entreposé dans des
conditions spécifiées, à conserver une valeur de propriété spécifiée dans des limites spécifiées pendant
une période de temps spécifiée
[SOURCE: ISO Guide 30:2015, 2.1.15, modifiée — L’expression « matériau de référence » a été remplacée
par « échantillon primaire ou échantillon ».]
3.22
validation
confirmation, par des preuves objectives, que les exigences pour une utilisation spécifique ou une
application prévue ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme « validé » est utilisé pour désigner l’état correspondant.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.13, modifiée — Les Notes 1 et 3 à l’article ont été supprimées, la Note 2 à
l’article a été renumérotée en Note 1 à l’article.]
3.23
sang total veineux
sang prélevé après perforation directe d’une veine, généralement avec une aiguille et une seringue ou
tout autre dispositif de prélèvement
3.24
vérification
confirmation par des preuves tangibles que les exigences spécifiées ont été satisfaites
Note 1 à l'article: Le terme « vérifié » est utilisé pour désigner l’état correspondant.
Note 2 à l'article: La confirmation peut couvrir des activités telles que:
— réalisation d’autres calculs;
— comparaison d’une spécification de conception nouvelle avec une spécification de conception similaire
éprouvée;
— réalisation d’essais et de démonstrations;
4 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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ISO 20186-3:2019(F)

— revue des documents avant diffusion.
[SOURCE: ISO 9000:2015, 3.8.12, modifiée — Les Notes 1 et 2 à l’article ont été supprimées, la Note 3 à
l’article a été renumérotée en Note 1 à l’article; une nouvelle Note 2 à l’article a été ajoutée.]
3.25
flux de travail
série d’activités nécessaires à la réalisation d’une tâche
4 Considérations générales
Pour les instructions générales relatives aux systèmes de management de la qualité de laboratoire
de biologie médicale et portant en particulier sur le prélèvement, la réception et la manipulation
d’échantillons primaires (y compris la prévention des contaminations croisées), voir l’ISO 15189:2012,
4.2, 5.4.4, 5.4.6 ou l’ISO/IEC 17020:2012, Articles 8 et 7.2. Les exigences relatives aux équipements
de laboratoire, aux réactifs et aux consommables conformément à l’ISO 15189:2012, 5.3 doivent
être respectées; l’ISO 15189:2012, 5.5.1.2 et 5.5.1.3 et l’ISO/IEC 17020:2012, 6.2 peuvent également
s’appliquer.
Toutes les étapes d’un flux de travail de diagnostic peuvent influencer le résultat final de l’analyse.
Par conséquent, le flux de travail complet, y compris les conditions de stockage et de transport des
prélèvements/échantillons, et son impact sur la stabilité des biomolécules à analyser doivent être
vérifiés et validés. Les étapes du flux de travail qui ne peuvent pas toujours être contrôlées doivent être
documentées, leur impact sur la performance analytique doit être étudié et des mesures d’atténuation
doivent être mises en place pour permettre la performance analytique requise. Dans pareils cas, une
évaluation des risques est recommandée.
Les profils d’ADNlc peuvent varier de manière significative après le prélèvement sanguin. La libération
d’ADN génomique par les cellules sanguines après le prélèvement peut modifier considérablement
le profil de l’ADNlc (voir A.1). Des effets supplémentaires peuvent également se produire après le
[10][11][12][13]
prélèvement, par exemple une fragmentation de l’ADNlc . Toutes ces modifications après
prélèvement peuvent varier individuellement parmi les prélèvements provenant de différents donneurs
[10][14][15][16]
ou patients et peuvent dépendre également de l’état physiopathologique . Cela peut avoir un
impact sur la validité et la fiabilité des résultats de l’analyse (voir A.2).
Avant ou pendant la conception d’une analyse, il doit donc être examiné et garanti que le ou les profils
d’ADNlc destinés à être analysés ne sont pas compromis d’une manière susceptible d’influer sur la
performance de l’analyse. Cela peut être effectué, par exemple, en appliquant l’analyse prévue aux
prélèvements/échantillons ayant été soumis à des études en temps contrôlé représentant les étapes
unitaires du processus préanalytique telles que le transport et le stockage et en mettant en place
des mesures destinées à prévenir ou à réduire les impacts induits par les variables préanalytiques
identifiées, par exemple, en utilisant des tubes de prélèvement sanguin contenant des stabilisateurs.
Des protocoles de sécurité doivent être en mis en œuvre pour la manipulation et le transport.
Les exigences en matière de sécurité pour le transport et la manipulation doivent être prises en
considération (voir l’ISO 15189 et l’ISO 15190).
Des précautions doivent être prises au cours de l’ensemble du processus préanalytique afin d’éviter
toute contamination croisée entre les différents prélèvements/échantillons, par exemple en utilisant,
dans la mesure du possible, du matériel à usage unique ou en mettant en place des méthodes de
nettoyage appropriées entre les traitements des différents prélèvements/échantillons.
Si un produit commercial n’est pas utilisé selon les instructions du fabricant, la responsabilité de sa
validation, de sa vérification, de son utilisation et de sa performance incombe à l’utilisateur.
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ISO 20186-3:2019(F)

5 Hors du laboratoire
5.1 Recueil des prélèvements
5.1.1 Informations relatives au donneur/patient
La documentation doit inclure l’identifiant du donneur/patient, lequel peut se présenter sous la forme
d’un code.
Il convient que la documentation comprenne, sans toutefois s’y limiter:
a) l’état de santé correspondant du donneur/patient [par exemple, sain, type de maladie, maladie
concomitante, données démographiques (âge et sexe, par exemple)];
NOTE Par exemple, il a été rapporté que les cancers, inflammations, diabètes, maladies hépatiques,
[10]
maladies coronariennes, syndromes respiratoires, traumatismes, les suites d’un entraînement intensif ,
les maladies graves et chroniques affectant les patients âgés, le premier trimestre de la grossesse, les
problèmes placentaires comme le travail prématuré, la pré-éclampsie et la mauvaise implantation
[10][14][15][16]
embryonnaire avaient une influence à la fois sur la quantité et la fragmentation de l’ADNlc .
b) les informations concernant le traitement médical de routine et le traitement particulier avant le
prélèvement de sang (par exemple, anesthésiques, médicaments, état de jeûne);
c) le type et la finalité de l’analyse spécifiée;
d) le consentement approprié du donneur/patient.
Voir également l’ISO 15189:2012, 5.4.4.
5.1.2  Choix du tube de prélèvement de sang total veineux par le laboratoire
Le profil d’ADNlc peut être influencé par des protocoles de prélèvement du sang total veineux
inappropriés, ainsi que par des conditions de stockage/transport, une séparation plasmatique et des
protocoles d’extraction de l’ADNlc inappropriés. Plus spécifiquement, la libération d’ADN génomique
par les leucocytes après le prélèvement peut modifier considérablement le profil de l’ADNlc (voir A.1).
Cela peut avoir un impact sur la validité des résultats de l’analyse (voir A.2).
Il convient de prélever le sang total veineux dans des dispositifs de prélèvement appropriés.
Il convient de prélever le sang total veineux dans des tubes de prélèvement sanguin appropriés
contenant des stabilisateurs de profil d’ADNlc, car la libération d’ADN génomique par les cellules
sanguines ou d’autres modifications du profile de l’ADNlc après le prélèvement peuvent avoir un impact
sur l’analyse prévue. Il convient de documenter la référence et le numéro de lot des tubes.
Il convient de n’utiliser des tubes de prélèvement sanguin ne contenant pas de stabilisateur de profil
d’ADNlc que s’ils sont autorisés par les instructions du prestataire d’analyse. Dans pareils cas, il
convient d’utiliser de préférence des tubes de prélèvement de sang EDTA plutôt que d’autres tubes
[12][17]
de prélèvement . l’EDTA empêche la coagulation, mais pas la libération d’ADN par les cellules
[17]
sanguines . Consulter les spécifications données par le prestataire d’analyse pour de plus amples
détails. Lorsque le prestataire de l’analyse de l’ADNlc exige l’utilisation d’un certain type de tube de
prélèvement sanguin, ce type de tube doit être utilisé.
Le processus de coagulation induit dans les tubes sérologiques peut causer la lyse des leucocytes,
entraînant la libération de l’ADN et modifiant ainsi le profil natif de l’ADNlc. Par conséquent, il convient
[18]
d’éviter l’utilisation de tubes sérologiques .
6 © ISO 2019 – Tous droits réservés

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ISO 20186-3:2019(F)

5.1.3  Protocoles de prélèvement de sang total veineux du donneur/patient et protocoles de
stabilisation
a) L’identité de la personne qui prélève l’échantillon primaire et l’heure et la date du prélèvement
doivent être documentées.
b) Pour l’étiquetage (identification de l’échantillon/du prélèvement) du tube de prélèvement sanguin,
un protocole de routine [ISO 15189:2012, 5.4.4.3, e)] ou un protocole comportant des informations
supplémentaires (par exemple, codes à barres en 2D) doit être utilisé.
c) La technique de ponction veineuse standard peut être utilisée. Des mesures peuvent être
nécessaires pour empêcher un reflux éventuel dans l’organisme du donneur/patient. Les
instructions du fabricant sur l’utilisation des tubes de prélèvement sanguin doivent être suivies.
Un kit de prélèvement sanguin et un porte-aiguille peuvent être requis en cas d’utilisation de tubes
contenant un stabilisateur de profil d’ADNlc. Dans ce cas, les instructions du fabricant du kit de
prélèvement et du porte-aiguille doivent être suivies.
NOTE Il n’existe aucun effet spécifique connu du protocole de prise de sang total veineux sur le profil
d’ADNlc. Les protocoles de routine peuven
...