ISO 17372:2008
(Main)Animal feeding stuffs — Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance liquid chromatography
Animal feeding stuffs — Determination of zearalenone by immunoaffinity column chromatography and high performance liquid chromatography
ISO 17372:2007 is applicable to the analysis of zearalenone in animal feed and feed ingredients, including barley, corn, oats, rye, wheat, soybean meal, canola (rapeseed) meal, corn gluten, dried distillers' grains, lentils, and sugar beet pulp. The limit of quantification is 0,05 mg/kg (50 µg/kg). A lower limit of quantification may be achievable subject to appropriate validation being conducted by the user laboratory.
Aliments des animaux — Dosage de la zéaralénone par chromatographie à colonne à immunoaffinité et par chromatographie liquide haute performance
L'ISO 17372:2008 s'applique à l'analyse de la zéaralénone dans les aliments pour animaux et leurs ingrédients, comprenant l'orge, le maïs, l'avoine, le seigle, le blé, la farine de soja, la farine de canola (colza), le gluten de maïs, la drêche, les lentilles et la pulpe de betterave à sucre. La limite de quantification est de 0,05 mg/kg (50 µg/kg). Une limite de quantification inférieure à cette valeur peut être atteinte, à condition que le laboratoire utilisateur la valide.
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 17372
First edition
2008-02-01
Animal feeding stuffs — Determination of
zearalenone by immunoaffinity column
chromatography and high performance
liquid chromatography
Aliments des animaux — Dosage de la zéaralénone par
chromatographie à colonne à immunoaffinité et par chromatographie
liquide haute performance
Reference number
ISO 17372:2008(E)
©
ISO 2008
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ISO 17372:2008(E)
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ISO 17372:2008(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Principle.1
4 Reagents.2
5 Apparatus .4
6 Sampling.5
7 Preparation of test sample.5
8 Procedure .5
9 Calculation of results .9
10 Precision.10
11 Test report .11
Annex A (normative) Confirmation using normal phase chromatography.12
Annex B (informative) Results of an interlaboratory test.14
Bibliography .16
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ISO 17372:2008(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 17372 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal
feeding stuffs.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 17372:2008(E)
Animal feeding stuffs — Determination of zearalenone by
immunoaffinity column chromatography and high performance
liquid chromatography
1 Scope
This International Standard is applicable to the analysis of zearalenone in animal feed and feed ingredients,
including barley, corn, oats, rye, wheat, soybean meal, canola (rapeseed) meal, corn gluten, dried distillers'
grains, lentils, and sugar beet pulp. The limit of quantification is 0,05 mg/kg (50 µg/kg). A lower limit of
quantification may be achievable subject to appropriate validation being conducted by the user laboratory.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 565, Test sieves — Metal wire cloth, perforated metal plate and electroformed sheet — Nominal sizes of
openings
ISO 648, Laboratory glassware — Single volume pipettes
ISO 1042, Laboratory glassware — One-mark volumetric flasks
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 4788, Laboratory glassware — Graduated measuring cylinders
ISO 6498, Animal feeding stuffs — Preparation of test samples
3 Principle
Samples are extracted with diluted acetonitrile and clarified by filtration. Then an aliquot of the filtrate is diluted
with water or phosphate-buffered saline (PBS) and purified using immunoaffinity column (IAC)
chromatography. The purified extracts are analysed by reverse-phase high performance liquid
chromatography (HPLC) with fluorescence detection. Suspect positive samples can be confirmed by
wavelength ratioing, by using normal phase HPLC analysis, or by using diode-array detection.
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ISO 17372:2008(E)
4 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
WARNING — Handle all solvents and solutions under a fume hood. Wear safety glasses, protective
clothing, and avoid skin contact.
4.1 Water, complying with ISO 3696, grade 1.
4.2 Acetonitrile (CH CN), HPLC grade.
3
4.3 Methanol (CH OH), HPLC grade.
3
4.4 Sodium chloride (NaCl), of purity not less than 99 % by mass.
4.5 Extraction solvent, volume fraction, φ(CH CN) = 90 %.
3
Mix 900 ml of acetonitrile (4.2) with 100 ml water (4.1). Mix well.
4.6 Dilute acetonitrile, volume fraction, φ(CH CN) = 50 %.
3
Combine 1 volume of acetonitrile (4.2) with 1 volume of water (4.1). Mix well. This solution is used for the
autosampler syringe, if applicable.
4.7 Dilute methanol, volume fraction, φ(CH OH) = 30 %.
3
Combine 75 ml methanol (4.3) with 175 ml water (4.1). Mix well.
4.8 Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ), purity not less than 99 % mass fraction.
2 4
4.9 Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ), purity not less than 99 % mass fraction.
2 4
4.10 Potassium chloride (KCl), purity not less than 99 % mass fraction.
4.11 Sodium hydroxide (NaOH), purity not less than 99 % mass fraction.
4.12 Phosphate-buffered saline (PBS).
Dissolve 8 g sodium chloride (4.4), 1,16 g disodium hydrogenphosphate (4.8), 0,2 g potassium
dihydrogenphosphate (4.9), and 0,2 g potassium chloride (4.10) in 1 l water (4.1). Adjust pH to 7,4 with
sodium hydroxide solution (4.13). Alternatively, prepared concentrated PBS can be purchased, then diluted for
use.
4.13 Sodium hydroxide solution, c(NaOH) = 0,2 mol/l.
Dissolve 8 g sodium hydroxide (4.11) in 1 l water (4.1).
4.14 HPLC mobile phase.
Add 460 ml acetonitrile (4.2) to 1 l reagent flask, add 460 ml water (4.1) and 80 ml methanol (4.3). Mix well
and filter through a filter with a pore size of 0,45 µm (5.14).
4.15 Zearalenone stock standard solution, ρ(C H O ) ≈ 50 µg/ml.
18 22 5
WARNING — Zearalenone is an oestrogen. Handle with due regard to its biological activity.
Weigh 5,0 mg zearalenone to the nearest 0,1 mg. Transfer into a 100 ml one-mark volumetric flask (5.1.2).
Dissolve in acetonitrile (4.2) and make up to the mark with the same solvent.
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ISO 17372:2008(E)
Calibrate the standard solution as follows. Pipette (5.1.3) 4,0 ml of stock standard into a 25 ml one-mark
volumetric flask (5.1.2) and make up to the mark with acetonitrile (approximately 8 µg of zearalenone per
millilitre).
Measure the ultraviolet (UV) absorbance using a quartz cuvette of pathlength 10 mm.
Determine the concentration, ρ(C H O ), in milligrams per millilitre, by Equation (1):
18 22 5
MA××1000× 25
r
ρ(C H O )= (1)
18 22 5
ε× 4
where
M is the relative molecular mass, 318,4, of zearalenone;
r
A is the UV absorbance;
ε is the emissivity, 12 623 ± 111, at 274 nm.
Record the result to three significant figures.
The stock standard solution is stable for at least 1 year if stored under refrigeration and tightly sealed.
Recalibrate whenever fresh diluted standard solutions (4.16 and 4.17) are prepared.
4.16 Spiking standard solution, ρ(C H O ) = 5,0 µg/ml.
18 22 5
Dilute 10,0 ml stock standard solution (4.15) to 100 ml with extraction solvent (4.5). Store in a refrigerator.
Prepare fresh every 6 months.
4.17 HPLC standard solutions.
Prepare five standard solutions of zearalenone concentrations shown in Table 1 by diluting the spiking
standard solution (4.16) or HPLC standard solution (4.17.1) with HPLC mobile phase (4.14).
Table 1 — Preparation of HPLC standard solutions
HPLC standard Standard solution to Zearalenone
Volume to dilute Final volume
solution dilute concentration
ml ml µg/ml
4.17.1 4.16 2,0 50 0,20
4.17.2 4.16 1,5 50 0,15
4.17.3
4.16 1,0 50 0,10
4.17.4 4.16 1,0 100 0,050
4.17.5 4.17.1 5,0 50 0,020
Store all HPLC standard solutions in a refrigerator. Prepare fresh every 6 months.
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ISO 17372:2008(E)
5 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
5.1 Common laboratory glassware.
5.1.1 Measuring cylinders, complying with ISO 4788, class A.
5.1.2 One-mark volumetric flasks, complying with ISO 1042, class A.
5.1.3 Pipettes, complying with ISO 648, class A.
5.2 UV spectrophotometer.
5.3 Vacuum manifold, to accommodate IACs.
5.4 Conical flasks, of capacities 125 ml and 500 ml.
1)
5.5 Filter paper, of diameter 185 mm, e.g. Whatman No. 41 .
5.6 Glass tube, 5 ml (13 mm × 100 mm) round bottom, or equivalent.
5.7 Centrifuge tubes, of polypropylene or equivalent, of capacity 50 ml.
5.8 Glass funnels, of maximum internal diameter 60 mm and 90 mm.
1)
5.9 Glass microfibre filter paper, of diameter 125 mm, Whatman 934AH .
1)
5.10 Immunoaffinity columns, loading capacity W 2 µg zearalenone and recovery W 85 %, ZearalaTest
1)
[standard or WB (wide bore; preferred, as less prone to blockage)] and EASI-EXTRACT .
5.11 Shaker, orbital or wrist action, or equivalent.
5.12 Plastic syringes, of capacity 5 ml.
5.13 Disposable syringe filters, of polyvinyldifluoride (PVDF), of pore size 0,45 µm and diameter 13 mm.
5.14 Solvent filtration system: all glass filter apparatus suitable for a filter of diameter 47 mm (5.15), and a
nylon (polyamide) or PTFE filter of diameter 47 mm and of pore size 0,45 µm.
5.15 HPLC system consisting of:
5.15.1 Pump, pulse free, of output capacity 0,5 ml/min to 1,5 ml/min.
5.15.2 Injector system, manual or autosampler, with loop suitable for 100 µl injections.
1)
5.15.3 Analytical column, 4 µm or 5 µm C , 150 mm × 4 mm, e.g. Waters Nova-Pak C , Inertsil
18 18
1) 1) 1) 1)
ODS-3 , Lichrospher 100-RP-18 , ACE 3 C , Waters Symmetry Shield RP18 , and Hypersil
18
1)
ODS/BDS .
5.15.4 Fluorescence detector, suitable for measurements with excitation wavelengths 236 nm and 274 nm,
and emission at 440 nm (variable wavelength detector) or 418 nm (detector with emission filter).
1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product. Equivalent products may be used if
they can be shown to lead to the same results.
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ISO 17372:2008(E)
5.15.5 Integrator or PC workstation.
5.15.6 Diode-array detector, optional.
1)
5.16 Glass microfibre filters, of diameter 21 mm, e.g. Whatman GF/D .
5.17 Reservoirs, polypropylene, suitable for attachment to the top of the IAC, of capacity 20 ml and internal
diameter 20 mm. An adapter may be required.
5.18 Frits, for reservoirs (5.17), of diameter 20 mm and of pore size 20 µm.
5.19 Sieves, complying with the requirements of ISO 565.
5.20 Nitrogen evaporator, with a bath capable of being maintained at 50 °C ± 5 °C.
5.21 Vortex mixer.
6 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport and storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 6497 .
Samples should be stored frozen to prevent changes in mycotoxin levels due to growth of the causitive
moulds.
7 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with ISO 6498.
Grind the entire laboratory sample so it passes completely through a sieve of nominal opening size 1 mm
(5.19). Mix thoroughly.
Studies with other mycotoxins have shown that grinding samples through a 0,5 mm ring sieve vs. a 1,0 mm
sieve reduced the variability of replicate analyses and increased the extraction efficiency. Grinding equipment
producing a particle size less than 1 mm is recommended; however, care is required to avoid overheating the
sample due to the openings of the ring sieve being too small. A 0,75 mm ring sieve is suggested; most of the
ground material will pass through a sieve of nominal opening size 0,5 mm.
8 Procedure
8.1 Preparation of quality control sample
The use of a quality control sample is recommended; analysis results should meet the recovery specification,
i.e. W 85 %. Analyse a spiked control sample (0,10 mg/kg) with each sample set. Prepare by pipetting 1,0 ml
spiking standard (4.16) into 50 g test portion of blank wheat or corn, and mix. Analyse the blank sample also.
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ISO 17372:2008(E)
8.2 Extraction
Process each test portion as follows.
Weigh, to the nearest 0,01 g, 50,00 g into a 500 ml conical flask (5.4).
Weigh and add 5 g of sodium chloride (4.4).
Add 150 ml extraction solvent (4.5). Shake for 1 h. Proceed to the IAC cleanup procedure (8.3).
Matrices such as dried silage can absorb most of the 150 ml extraction solvent. In that case, increase the
volume of extracting solvent to 200 ml or 250 ml.
If desired, the shaking step can be started at the end of the day using a shaker (5.11) with a timer, shake
briefly the next morning, then proceed to step 8.3.
8.3 Immunoaffinity column cleanup
Follow the instructions provided by the manufacturer with IACs, but use a reservoir (5.17) equipped with a frit
1) 1)
(5.18) and GF/D filter(s) (5.16) for the ZearalaTest (8.3.1) and for the EASI-EXTRACT (8.3.2), columns, and
elute with 2,0 ml eluent. For other brands, follow either 8.3.1 or 8.3.2, whichever is more appropriate.
An option is provided for analysing highly pigmented matrices and matrices that present interferences in the
chromatogram. Methanol, volume fraction 30 % (4.7), is used to elute interferences without causing antibody
denaturation; do not exceed a methanol volume fraction of 35 %. For all types of IAC, to achieve the limit of
quantification of 0,05 mg/kg, to reduce variability and to enhance HPLC chromatography, column eluates are
evaporated and then dissolved in a minimum volume (2,0 ml) of mobile phase (4.14).
NOTE 1 More than 10 ml of diluted filtrate can be added to the columns in steps 8.3.1.4 and 8.3.2.5 as long as the
loading capacity is not exceeded. Blockage of the frit and column may occur with larger volumes; barley is known to be a
problem, although the use of two filters on the frit helps to prevent frit blockage. Wide bore columns are less susceptible to
blockage.
NOTE 2 The clarity of the filtrate being applied to the IAC affects the column’s performance. In addition to causing
column blockage, particulates can prevent adsorption of zearalenone on to the antibodies, resulting in variable and low
recoveries.
1)
8.3.1 ZearalaTest immunoaffinity column [standard format and wide bore (WB)]
8.3.1.1 Filter more than 10 ml extract through a fluted filter paper (5.5) into a 125 ml conical flask (5.4).
8.3.1.2 Pipette (5.1.3) 10 ml filtered extract into a 50 ml one-mark volumetric flask (5.1.2) and make up to
the mark with water. Mix well. Filter the diluted extract (approximately 25 ml) through glass microfibre filter
paper (5.9) into a 50 ml centrifuge tube (5.7).
8.3.1.3 Attach the IAC to the port of the vacuum manifold (5.3). Attach a reservoir (5.17) with frit (5.18) to
the top of the column. An adapter is required for WB columns. Insert a glass microfibre filter (5.16).
For standard format columns, two glass microfibre filters are required for some matrices, such as barley. If the
filtered solution (8.3.1.2) is clear, no frit or filter is required.
8.3.1.4 Pipette (5.1.3) 10 ml filtrate (8.3.1.2) into the reservoir. Draw extract through the column at a
steady flow rate until air comes through the column; the flow rate shall be such that droplets are formed
(1 drop per second to 2 drops per second).
8.3.1.5 For pigmented products and samples with interfering peaks, wash column with 15 ml methanol,
volume fraction 30 %, (4.7) at a rate of 1 drop per second to 2 drops per second until air comes through the
column. For all other types of samples, wash the column with 10 ml water (4.1) at a rate of 1 drop per second
to 2 drops per second until air comes through the column.
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ISO 17372:2008(E)
8.3.1.6 Remove the reservoir, attach a reservoir with no frit (not required for WB columns) and elute
zearalenone by passing 2,0 ml methanol (4.3) through the column at a rate of about 1 drop per second,
collecting the eluate in a 5 ml tube (5.6).
NOTE The frit can be removed from used reservoirs by use of a wire or narrow rod through the bottom of the
reservoir, and the reservoirs can be cleaned and reused.
8.3.1.7 Evaporate to dryness using a nitrogen evaporator
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 17372
Première édition
2008-02-01
Aliments des animaux — Dosage de la
zéaralénone par chromatographie à
colonne à immunoaffinité et par
chromatographie liquide haute
performance
Animal feeding stuffs — Determination of zearalenone by
immunoaffinity column chromatography and high performance liquid
chromatography
Numéro de référence
ISO 17372:2008(F)
©
ISO 2008
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ISO 17372:2008(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2008 – Tous droits réservés
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ISO 17372:2008(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Principe. 1
4 Réactifs . 2
5 Appareillage . 4
6 Échantillonnage . 5
7 Préparation de l'échantillon pour essai. 5
8 Mode opératoire . 5
9 Calcul des résultats. 9
10 Fidélité . 10
11 Rapport d'essai . 11
Annexe A (normative) Confirmation par chromatographie en phase normale. 12
Annexe B (informative) Résultats d'un essai interlaboratoires. 14
Bibliographie . 16
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ISO 17372:2008(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 17372 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10,
Aliments des animaux.
iv © ISO 2008 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 17372:2008(F)
Aliments des animaux — Dosage de la zéaralénone par
chromatographie à colonne à immunoaffinité et par
chromatographie liquide haute performance
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale s'applique à l'analyse de la zéaralénone dans les aliments pour animaux et
leurs ingrédients, comprenant l'orge, le maïs, l'avoine, le seigle, le blé, la farine de soja, la farine de canola
(colza), le gluten de maïs, la drêche, les lentilles et la pulpe de betterave à sucre. La limite de quantification
est de 0,05 mg/kg (50 µg/kg). Une limite de quantification inférieure à cette valeur peut être atteinte, à
condition que le laboratoire utilisateur la valide.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 565, Tamis de contrôle — Tissus métalliques, tôles métalliques perforées et feuilles électroformées —
Dimensions nominales des ouvertures
ISO 648, Verrerie de laboratoire — Pipettes à un volume
ISO 1042, Verrerie de laboratoire — Fioles jaugées à un trait
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 4788, Verrerie de laboratoire — Éprouvettes graduées cylindriques
ISO 6498, Aliments des animaux — Préparation des échantillons pour essai
3 Principe
Les échantillons sont extraits avec de l'acétonitrile dilué, puis clarifiés par filtration. Une aliquote du filtrat est
ensuite diluée avec de l'eau ou avec un tampon phosphate (PBS), avant d'être purifiée par chromatographie à
colonne d'immunoaffinité. Les extraits ainsi purifiés sont analysés par chromatographie liquide haute
performance (CLHP) en phase inverse avec détection par fluorescence. La présence de zéaralénone dans les
échantillons potentiellement positifs peut être confirmée en calculant les rapports de la réponse obtenue à
plusieurs longueurs d'ondes, en procédant à une analyse par CLHP en phase normale ou en utilisant un
détecteur à barrette de diodes.
© ISO 2008 – Tous droits réservés 1
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ISO 17372:2008(F)
4 Réactifs
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
AVERTISSEMENT — Utiliser tous les solvants et les solutions sous une hotte aspirante. Porter des
lunettes et des vêtements de protection et éviter tout contact avec la peau.
4.1 Eau, de qualité 1 telle que définie dans l'ISO 3696.
4.2 Acétonitrile (CH CN), de qualité CLHP.
3
4.3 Méthanol (CH OH), de qualité CLHP.
3
4.4 Chlorure de sodium (NaCl), d'une pureté d'au moins 99 % (fraction massique).
4.5 Solvant d'extraction, de fraction volumique, φ(CH CN) = 90 %.
3
Mélanger 900 ml d'acétonitrile (4.2) avec 100 ml d'eau (4.1). Bien mélanger.
4.6 Acétonitrile dilué, de fraction volumique φ(CH CN) = 50 %.
3
Mélanger 1 volume d'acétonitrile (4.2) avec 1 volume d'eau (4.1). Bien mélanger. Le cas échéant, cette
solution est utilisée pour la seringue de l'échantillonneur automatique.
4.7 Méthanol dilué, de fraction volumique φ(CH OH) = 30 %.
3
Mélanger 75 ml de méthanol (4.3) avec 175 ml d'eau (4.1). Bien mélanger.
4.8 Hydrogénophosphate de disodium (Na HPO ), d'une pureté d'au moins 99 % (fraction massique).
2 4
4.9 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ), d'une pureté d'au moins 99 % (fraction massique).
2 4
4.10 Chlorure de potassium (KCl), d'une pureté d'au moins 99 % (fraction massique).
4.11 Hydroxyde de sodium (NaOH), d'une pureté d'au moins 99 % (fraction massique).
4.12 Solution tampon phosphate (PBS).
Dissoudre 8 g de chlorure de sodium (4.4), 1,16 g d'hydrogénophosphate de disodium (4.8), 0,2 g de
dihydrogénophosphate de potassium (4.9) et 0,2 g de chlorure de potassium (4.10) dans 1 l d'eau (4.1).
Ajuster le pH à 7,4 à l'aide de la solution d'hydroxyde de sodium (4.13). Il est également possible de se
procurer dans le commerce une solution PBS concentrée prête à l'emploi et de la diluer comme nécessaire.
4.13 Solution d'hydroxyde de sodium, c(NaOH) = 0,2 mol/l.
Dissoudre 8 g d'hydroxyde de sodium (4.11) dans 1 l d'eau (4.1).
4.14 Phase mobile CLHP.
Ajouter 460 ml d'acétonitrile (4.2) dans une fiole de 1 l, ajouter 460 ml d'eau (4.1) et 80 ml de méthanol (4.3).
Bien mélanger et filtrer sur un filtre d'une porosité de 0,45 µm (5.14).
4.15 Solution étalon mère de zéaralénone, ρ(C H O ) ≈ 50 µg/ml.
18 22 5
AVERTISSEMENT — La zéaralénone est un œstrogène. À manipuler avec précaution en raison de son
activité biologique.
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Peser 5,0 mg de zéaralénone à 0,1 mg près. Les transvaser dans une fiole jaugée à un trait de 100 ml (5.1.2).
Dissoudre dans de l'acétonitrile (4.2) et compléter au trait avec le même solvant.
Déterminer la concentration de la solution étalon comme suit. Verser à la pipette (5.1.3) 4,0 ml de solution
étalon mère dans une fiole jaugée à un trait de 25 ml (5.1.2) et compléter au trait avec de l'acétonitrile
(environ 8 µg de zéaralénone par millilitre).
Mesurer l'absorption ultraviolette (UV) à l'aide d'une cuve en quartz de 10 mm.
Déterminer la concentration, ρ(C H O ), en milligrammes par millilitre, par l'Équation (1):
18 22 5
MA××1000× 25
r
ρ(C H O )= (1)
18 22 5
ε× 4
où
M est la masse moléculaire relative, 318,4, de la zéaralénone;
r
A est l'absorption UV;
ε est l'émissivité, 12 623 ± 111, à 274 nm.
Consigner le résultat à trois chiffres significatifs.
La solution étalon, fermée hermétiquement et conservée au réfrigérateur, est stable pendant au moins un an.
Réétalonner à chaque préparation de nouvelles solutions étalons diluées (4.16 et 4.17).
4.16 Solution étalon de dopage, ρ(C H O ) = 5,0 µg/ml.
18 22 5
Diluer 10,0 ml de solution étalon mère (4.15) dans 100 ml avec le solvant d'extraction (4.5). Stocker au
réfrigérateur. Renouveler la solution tous les 6 mois.
4.17 Solutions étalons pour CLHP.
Préparer cinq solutions étalons de zéaralénone à des concentrations indiquées dans le Tableau 1 en diluant
la solution étalon de dopage (4.16) ou la solution étalon pour CLHP (4.17.1) avec la phase mobile CLHP
(4.14).
Tableau 1 — Préparation des solutions étalons pour CLHP
Solution étalon Concentration
Solution étalon à diluer Volume à diluer Volume final
pour CLHP de zéaralénone
ml ml µg/ml
4.17.1
4.16 2,0 50 0,20
4.17.2
4.16 1,5 50 0,15
4.17.3 4.16 1,0 50 0,10
4.17.4 4.16 1,0 100 0,050
4.17.5 4.17.1 5,0 50 0,020
Stocker au réfrigérateur toutes les solutions étalons pour CLHP. Les renouveler tous les 6 mois.
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5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Verrerie de laboratoire usuelle.
5.1.1 Éprouvettes graduées, conformes à l'ISO 4788, classe A.
5.1.2 Fioles jaugées à un trait, conformes à l'ISO 1042, classe A.
5.1.3 Pipettes, conformes à l'ISO 648, classe A.
5.2 Spectrophotomètre UV.
5.3 Support de filtration sous vide, compatible avec les colonnes d'immunoaffinité.
5.4 Erlenmeyer, de 125 ml et 500 ml de capacités.
1)
5.5 Papier-filtre, d'un diamètre de 185 mm, par exemple Whatman no. 41 .
5.6 Tube en verre, à fond rond de 5 ml (13 mm × 100 mm), ou équivalent.
5.7 Tubes à centrifuger, d'une capacité de 50 ml, en polypropylène ou équivalent.
5.8 Entonnoirs en verre, d'un diamètre intérieur de 60 mm et de 90 mm.
1)
5.9 Papier-filtre en microfibres de verre, d'un diamètre de 125 mm, par exemple Whatman 934AH .
5.10 Colonnes d'immunoaffinité, d'une capacité de chargement W 2 µg de zéaralénone et présentant une
1)
récupération W 85 %. ZearalaTest [format standard ou WB («wide bore»; recommandé pour limiter les
1)
risques de colmatage)] et EASI-EXTRACT .
5.11 Agitateur, orbital ou manuel, ou équivalent.
5.12 Seringues en plastique, d'une capacité de 5 ml.
5.13 Filtres pour seringue jetables, en difluorure de polyvinyle (PVDF), de porosité 0,45 µm et de diamètre
13 mm.
5.14 Système de filtration des solvants: tout matériel de filtration en verre compatible avec un filtre de
47 mm de diamètre ainsi qu'un filtre en nylon (polyamide) ou en polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 47 mm de
diamètre et d'une porosité de 0,45 µm.
5.15 Système CLHP, se composant des éléments suivants:
5.15.1 Pompe, exempte d'impulsions, d'une capacité de débit allant de 0,5 ml/min à 1,5 ml/min.
5.15.2 Système d'injection, manuel ou via un échantillonneur automatique, muni d'une boucle permettant
de réaliser des injections de 100 µl.
1)
5.15.3 Colonne analytique, C 4 µm ou 5 µm, 150 mm × 4 mm; par exemple: Waters Nova-Pak C ,
18 18
1) 1) 1) 1)
Inertsil ODS-3 , Lichrospher 100-RP-18 , ACE 3 C , Waters Symmetry Shield RP18 et
18
1)
Hypersil ODS/BDS .
1) C'est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée pour la commodité
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux
mêmes résultats.
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5.15.4 Détecteur fluorimétrique, permettant d'effectuer des mesures avec des longueurs d'onde
d'excitation de 236 nm et de 274 nm, et une émission à 440 nm (détecteur à longueur d'onde variable) ou à
418 nm (détecteur équipé d'un filtre d'émission).
5.15.5 Intégrateur ou logiciel PC.
5.15.6 Détecteur à barrette de diodes, facultatif.
1)
5.16 Filtres en microfibres de verre, d'un diamètre de 21 mm, par exemple Whatman GF/D .
5.17 Réservoirs, en polypropylène, pouvant être fixés sur la partie supérieure des colonnes
d'immunoaffinité, d'une capacité de 20 ml et de diamètre intérieur 20 mm. Un adaptateur peut s'avérer
nécessaire.
5.18 Frittés, pour les réservoirs (5.17), d'un diamètre de 20 mm et d'une porosité de 20 µm.
5.19 Tamis, conforme aux prescriptions de l'ISO 565.
5.20 Évaporateur à azote, avec bain pouvant être maintenu à une température de 50 °C ± 5 °C.
5.21 Mélangeur vortex.
6 Échantillonnage
Il convient que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, qui n'ait été ni endommagé ni
modifié lors du transport ou du stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d'échantillonnage recommandée est indiquée dans l'ISO 6497 .
Il est recommandé de conserver les échantillons à l'état congelé, de manière à éviter que les concentrations
en mycotoxines ne varient avec la croissance des champignons producteurs.
7 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à l'ISO 6498.
Broyer l'intégralité de l'échantillon de laboratoire, de sorte qu'il passe en totalité à travers un tamis (5.19)
d'ouverture nominale de mailles égale à 1 mm. Bien mélanger.
Des études avec d'autres mycotoxines ont montré que broyer un échantillon à l'aide d'une grille de 0,5 mm
plutôt qu'une grille de 1,0 mm réduit la variabilité de la répétabilité des analyses et augmente l'efficacité
d'extraction. Il est recommandé d'utiliser un équipement de broyage produisant une granulométrie inférieure à
1 mm; veiller néanmoins à ce que la grille présente des ouvertures de mailles suffisantes pour ne pas
provoquer de surchauffe de l'échantillon. Il est suggéré d'utiliser une grille de 0,75 mm; la majeure partie de la
matière broyée passe à travers un tamis de 0,5 mm d'ouverture nominale de maille.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation de l'échantillon de contrôle
Il est recommandé d'utiliser un échantillon de contrôle; les résultats d'analyse doivent être conformes à la
spécification relative à la récupération (à savoir une récupération W 85 %). Analyser un échantillon de contrôle
dopé (0,10 mg/kg) par série d'échantillons. Préparer en pipettant 1,0 ml de la solution étalon de dopage (4.16)
et en les versant dans une prise d'essai de 50 g de blé ou de maïs exempt de zéaralénone et mélanger.
Analyser également l'échantillon exempt de zéaralénone (appelé «blanc»).
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8.2 Extraction
Pour chaque prise d'essai, suivre le mode opératoire suivant.
Peser, à 0,01 g près, 50,00 g dans un erlenmeyer de 500 ml (5.4).
Peser et ajouter 5 g de chlorure de sodium (4.4).
Ajouter 150 ml de solvant d'extraction (4.5). Agiter pendant 1 h. Poursuivre avec le protocole de purification
par colonne d'immunoaffinité (8.3).
Certaines matrices, comme l'ensilage séché, par exemple, peuvent absorber plus de 150 ml de solvant
d'extraction. Dans ce cas, porter le volume de solvant d'extraction à 200 ml ou 250 ml.
Si besoin, il est possible de démarrer l'étape d'agitation à la fin de la journée, en utilisant un agitateur (5.11)
muni d'un chronomètre d'arrêt; dans ce cas, agiter brièvement le lendemain matin avant de passer à l'étape
décrite en 8.3.
8.3 Purification par colonne d'immunoaffinité
Se conformer aux instructions fournies avec les colonnes d'immunoaffinité, mais utiliser un réservoir (5.17)
1)
équipé d'un verre fritté (5.18) et d'un ou plusieurs filtres GF/D (5.16), pour les colonnes ZearalaTest (8.3.1)
1)
et les colonnes EASI-EXTRACT (8.3.2), et éluer avec 2,0 ml d'éluant. Pour les autres modèles, se conformer
soit à 8.3.1, soit à 8.3.2, selon le plus approprié.
Il est possible d'analyser des matrices hautement pigmentées et des matrices pour lesquelles des signaux
parasites apparaissent dans le chromatogramme. Du méthanol, de fraction volumique 30 % (4.7), est utilisé
pour éluer les substances parasites sans dénaturer les anticorps; ne pas dépasser une fraction volumique de
35 %. Avec tous les types de colonnes d'immunoaffinité, pour atteindre la limite de quantification de
0,05 mg/kg, pour limiter la variabilité et pour améliorer la chromatographie CLHP, les éluats de la colonne
sont évaporés puis dissous dans un volume minimal (2,0 ml) de phase mobile (4.14).
NOTE 1 Plus de 10 ml de filtrat dilué peut être ajouté aux colonnes dans les étapes 8.3.1.4 et 8.3.2.5, à condition de
ne pas dépasser la capacité de chargement. Les gros volumes peuvent engendrer des problèmes de colmatage du verre
fritté et de la colonne; l'orge est connu pour poser ce type de problèmes; l'utilisation de deux filtres sur le verre fritté
permet de limiter les risques de colmatage. Les colonnes «wide bore» sont moins sujettes aux risques de colmatage.
NOTE 2 La clarté du filtrat appliqué à la colonne d'immunoaffinité a une incidence sur les performances de cette
dernière. Outre les risques d'obstruction de la colonne, les particules peuvent empêcher la zéaralénone de se fixer aux
anticorps, ce qui provoque une altération et une plus grande variabilité des performances de récupération.
1)
8.3.1 Colonne d'immunoaffinité ZearalaTest [format standard et «wide bore» (WB)].
8.3.1.1 Filtrer au moins 10 ml d'extrait sur du papier-filtre plissé (5.5) dans un erlenmeyer de 125 ml (5.4).
8.3.1.2 Prélever à la pipette (5.1.3) 10 ml d'extrait filtré et les introduire dans une fiole jaugée à un trait de
50 ml (5.1.2), compléter au trait avec de l'eau. Bien mélanger. Filtrer l'extrait dilué (environ 25 ml) sur du
papier-filtre en microfibres de verre (5.9) dans un tube à centrifuger de 50 ml (5.7).
8.3.1.3 Raccorder la colonne d'immunoaffinité au port du système de filtration sous vide (5.3). Fixer un
réservoir (5.17) muni d'un fritté (5.18) à la partie supérieure de la colonne. Un adaptateur est requis pour les
colonnes WB. Insérer un filtre en microfibres de verre (5.16).
Pour les colonnes de format standard, deux filtres en microfibres de verre sont nécessaires pour certaines
matrices telles que l'orge. Si la solution filtrée (8.3.1.2) est claire, aucun fritté ni filtre n'est nécessaire.
8.3.1.4 Prélever à la pipette (5.1.3) 10 ml du filtrat (8.3.1.2) et les introduire dans le réservoir. Faire
passer l'extrait à travers la colonne à un débit constant, jusqu'à ce que de l'air pénètre dans la colonne; le
débit doit être suffisant pour que des gouttelettes se forment (de 1 goutte par seconde à 2 gouttes par
seconde).
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ISO 17372:2008(F)
8.3.1.5 Pour les produits pigmentés et les échantillons présentant des pics parasites, laver la colonne
avec 15 ml de méthanol, fraction volumique 30 % (4.7) avec un débit de 1 goutte par seconde à 2 gouttes par
seconde jusqu'à ce que de l'air pénètre dans la colonne. Pour tous les autres types d'échantillons, laver la
colonne avec 10 ml d'eau (4.1) avec un débit de 1 goutte par seconde à 2 gouttes par seconde, jusqu'à ce
que de l'air pénètre dans la colonne.
8.3.1.6 Retirer le réservoir, fixer un réservoir sans fritté (pour les colonnes WB, aucun réservoir n'est
requis) et éluer la zéaralénone en faisant passer 2,0 ml de méthanol (4.3) à travers la colonne à une vitesse
d'environ 1 goutte par seconde, en collectant l'éluant dans un tube de 5 ml (5.6).
NOTE Le fritté peut être retiré des réservoirs usagés en faisant passer un câble ou une tige de petit diamètre par le
fond du réservoir; les réservoirs peuvent ensuite être nettoyés et réutilisés.
8.3.1.7 Évaporer à sec à l'aide d'un évaporateur à azote, sous une température de bain de 50 °C ± 5 °C
(5.20). Ajouter 2,0 ml de phase mobile CLHP (4.14). Agiter au mélangeur vortex (5.21). Poursuivre
conformément à 8.4.
8.3.1.8 La solution d'essai peut aussi être filtrée sur un filtre en PVDF (5.13) en utilisant une seringue en
plastique (étape facultative). Vérifier que le lot de filtres ne présente pas de pic(s) parasite(s). Si les réservoirs
(5.17) sont équipés de filtres et de frittés (5.18), il convient que les solutions d'essai soient claires et n'aient
pas besoin d'être filtrées.
®
8.3.2 Colonne d'immunoaffinité EASI-EXTRACT .
8.3.2.1 Filtrer plus de 10 ml d'extrait sur du papier-filtre cannelé (5.5) dans un erlenmeyer de 125 ml (5.4).
8.3.2.2 Prélever à la pipette (5.1.3) 10 ml d'extrait filtré et les introduire dans une fiole jaugée à un trait de
50 ml (5.1.2), compléter au trait avec de la solution tampon phosphate (4.12). Bien mélanger.
8.3.2.3 Filtrer l'extrait dilué (environ 25 ml) sur du papier-filtre en microfibres de verre (5.9) dans un tube
à centrifuger de 50 ml (5.7).
8.3.2.4 Raccorder la colonne d'immunoaffinité au port du système de filtration sous vide sous vide (5.3).
Fixer un réservoir (5.17) muni d'un fritté (5.18) à la partie supérieure de la colonne à l'aide d'un adaptateur.
Insérer un filtre en microfibres de verre (5.16). Laver la colonne avec 10 ml à 20 ml de solution tampon
phosphate (4.12).
Si la solution filtrée (8.3.2.3) est claire, aucun fritté ni filtre n'est nécessaire.
8.3.2.5 Prélever à la pipette (5.1.3) 10 ml de filtrat (8.3.2.3) et les introduire dans le réservoir. Faire
passer l'extrait dans la colonne à un débit constant, jusqu'à ce que de l'air pénètre dans la colonne; le débit
doit être suffisant pour que des gouttelettes se forment (à une vitesse de 1 goutte par seconde à 2 gouttes par
seconde).
8.3.2.6 Pour les produits pigmentés et les échantillons présentant des pics parasites, laver la colonne
avec 15 ml de méthanol, fraction volumique 30 % (4.7) à une vitesse de 1 goutte par seconde à 2 gouttes par
seconde, jusqu'à ce que de l'air pénètre dans la colonne. Pour tous les autres échantillons, laver la colonne
avec 20 ml d'eau (4.1) à une vitesse de 1 goutte par seconde à 2 gouttes par seconde, jusqu'à ce que de l'air
pénètre dans la colonne.
8.3.2.7 Retirer le réservoir, éluer la zéaralénone en passant 2,0 ml d'acétonitrile (4.2) à travers la colonne
à une vitesse d'environ 1 goutte par seconde, en collectant l'éluant dans un tube de 5 ml (5.6).
8.3.2.8 Évaporer à sec à l'aide d'un évaporateur à azote, sous une température de bain de 50 °C ± 5 °C
(5.20). Ajouter 2,0 ml de phase mobile CLHP (4.14). Agiter au mélangeur vortex (5.21).
8.3.2.9 La solution d'essai peut aussi être filtrée sur un filtre en PVDF (5.13) en utilisant une seringue en
plastique (étape facultative). Vérifier que le lot de filtres ne présente pas de pic(s) parasite(s). Si les réservoirs
sont équipés de filtres et de frittés, il convient que les solutions d'essai soient claires et n'aient pas besoin
d'être filtrées.
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8.4 Analyse par CLHP
8.4.1 Conditions CLHP
Phase mobile voir 4.14
Débit 1,0 ml/min
Volume pour injection 100 µl
Colonne voir en 5.15.3, avec colonne de garde C
18
Longueur d'onde du détecteur excitation 274 nm
émission 440 nm (pour un détecteur à longueur d'onde variable)
418 nm (pour un détecteur équipé d'un filtre d'émission)
8.4.2 Vérification de la performance du système
8.4.2.1 Résolution
Injecter un volume de 0,050 µg/ml de solution étalon pour CLHP (4.17.4). Un seul pic devrait être observé;
néanmoins, en présence d'un pic adjacent, le pic de la zéaralénone doit être résolu au niveau de la ligne de
base.
8.4.2.2 Facteur de traînée
Le facteur de traînée USP (United States Pharmacopeia), numériquement égal au facteur de symétrie EP
(European Pharmacopoeia), F, doit être inférieur à 1,6.
8.4.3 Détermination
8.4.3.1 Injecter 100 µl (boucle complète) de solution étalon pour CLHP à 0,020 µg/ml (4.17.5). Procéder
à au moins deux injections d'étalons, pour s'assurer que la répétabilité de l'aire du pic est ~2 %. Déterminer la
linéarité en injectant 100 µl (boucle complète) de chaque solution étalon pour CLHP (4.17). Reporter sous
forme d'un graphique l'aire du pic en fonction de la concentration de la zéaralénone, en microgrammes par
millilitre. Le coefficient de corrélation doit être W 0,999 et l'intervalle de confiance de 95 % de l'ordonnée à
l'origine y doit inclure le zéro (par analyse des résidus).
8.4.3.2 Injecter 100 µl des solutions d'essai. Injecter les cinq solutions étalons pour CLHP (4.17) après la
série des solutions d'essais, et calculer la moyenne de la réponse de l'aire du pic avec celles obtenues de
8.4.3.1 pour la préparation de la courbe d'étalonnage. Encadrer toutes les cinq à huit injections de solutions
d'essai par 100 µl d'une solution étalon CLHP, pour déterminer la dérive. Diluer la solution d'essai si l'aire du
pic dépasse le domaine de la courbe d'étalonnage.
8.4.3.3 Si la concentration massique de la zéaralénone dans l'échantillon pour essai est supérieure à
3 mg/kg, pour s'assurer que la colonne d'immunoaffinité n'était pas trop chargée, diluer 10 fois l'extrait (8.2)
avec le solvant d'extraction (4.5), puis répéter le mode d'emploi spécifié en 8.3.
8.4.3.4 La présence de zéaralénone dans les échantillons potentiellement positifs peut être confirmée en
utilisant une longueur d'onde d'excitation de 236 nm (on constate une sensibilité accrue) ou en utilisant un
détecteur à barrette de diodes. Utiliser l'une des techniques spécifiées en 8.4.3.4.1, 8.4.3.4.2 ou 8.4.3.4.3.
8.4.3.4.1 Dans le cas d'un détecteur fluorimétrique muni d'une lampe au deu
...
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