ISO 29200:2013
(Main)Soil quality — Assessment of genotoxic effects on higher plants — Vicia faba micronucleus test
Soil quality — Assessment of genotoxic effects on higher plants — Vicia faba micronucleus test
The purpose of ISO 29200:2013 is to describe a method for assessing genotoxic effects (chromosome breakage or dysfunction of the mitotic spindle) of soils or soil materials on the secondary roots of a higher plant: Vicia faba (broad bean). This method allows the assessment of genotoxicity (toxicity for genetic material) of soils and soil materials like compost, sludge, waste, fertilizing matters, etc. Two ways of exposure can be considered: a direct exposure of plants to the soil (or soil material) which is relevant for the real genotoxic potential and an exposure of plants to the water extract of the soil (or soil material). This last way of exposure to a leachate or an eluate allows the detection of the mutagens which are not adsorbed to soils and which may be transferred to aquatic compartments. Moreover, this test may be used to evaluate genotoxic effects of chemical substances and to waters, effluents, etc.
Qualité du sol — Évaluation des effets génotoxiques sur les végétaux supérieurs — Essai des micronoyaux sur Vicia faba
L'ISO 29200:2013 décrit une méthode pour évaluer les effets génotoxiques (cassure des chromosomes ou dysfonctionnement du fuseau mitotique) des sols ou des matrices solides sur une plante supérieure: Vicia faba (fève). Cette méthode permet d'évaluer la génotoxicité (toxicité vis-à-vis du matériel génétique) des sols ou des matrices solides telles que des composts, boues, déchets, matières fertilisantes, etc. Deux modes d'exposition peuvent être considérés: une exposition directe des plantes au sol (ou aux matrices solides) ce qui est représentatif du potentiel génotoxique réel et une exposition des plantes à l'extrait aqueux du sol (ou des matrices solides). Ce dernier mode d'exposition à un lixiviat ou un éluat permet de détecter les mutagènes qui ne sont pas adsorbés dans les sols et qui peuvent être transférés aux compartiments aquatiques. D'autre part, cet essai peut être utilisé pour évaluer les effets génotoxiques des substances chimiques, ainsi que des eaux, effluents, etc.
General Information
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 29200
First edition
2013-09-01
Soil quality — Assessment of
genotoxic effects on higher plants —
Vicia faba micronucleus test
Qualité du sol — Évaluation des effets génotoxiques sur les végétaux
supérieurs — Essai des micronoyaux sur Vicia faba
Reference number
©
ISO 2013
© ISO 2013
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Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative reference . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Plants, test equipment and reagents . 2
5.1 Equipment . 2
5.2 Test organism . 2
5.3 Reference substance . 2
5.4 Reagents. 3
6 Protocols . 3
6.1 Preparation of the soil to be tested . 3
6.2 Preparation of the seeds . 4
6.3 Conducting of the test . 5
6.4 Test environment . 6
6.5 Cell preparation . 6
7 Assessment of the results . 8
7.1 Presentation of the data . 8
7.2 Statistical analysis . 8
7.3 Interpretation of the results . 8
8 Validity criteria . 8
9 Test report . 8
Annex A (informative) Composition of Hoagland’s medium .10
Annex B (informative) Testing chemicals added to soils .11
Annex C (informative) Results of the interlaboratory test conducted within the framework of
NF T 90-327
.............................................................................................................................................................................................................12
Annex D (informative) Results of the interlaboratory test conducted on the reference substance
and an industrial contaminated soil .14
Bibliography .18
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2. www.iso.org/directives
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of any
patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or on
the ISO list of patent declarations received. www.iso.org/patents
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
The committee responsible for this document is ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
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Introduction
In the field of assessment of the quality of soils and soil materials, it appears necessary to determine
in vivo their genotoxic potential which may be induced by pollution or by a decontamination process.
Indeed, genotoxic agents have the ability to damage the genome of living organisms or to interfere with
its functioning, but they are not always detected by chemical analysis or classical ecotoxicological tests.
Actually, genotoxic effects are often observed at sublethal concentrations, where no toxic effect (e.g.
survival or growth) can be observed in the short term but some long term effects may be feared in living
organisms. Moreover, higher plants, like Vicia faba (broad bean) are ecologically relevant to assess soils
and soil materials quality.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 29200:2013(E)
Soil quality — Assessment of genotoxic effects on higher
plants — Vicia faba micronucleus test
1 Scope
The purpose of this International Standard is to describe a method for assessing genotoxic effects
(chromosome breakage or dysfunction of the mitotic spindle) of soils or soil materials on the secondary
roots of a higher plant: Vicia faba (broad bean). This method allows the assessment of genotoxicity
(toxicity for genetic material) of soils and soil materials like compost, sludge, waste, fertilizing matters,
etc. Two ways of exposure can be considered: a direct exposure of plants to the soil (or soil material)
which is relevant for the real genotoxic potential and an exposure of plants to the water extract of the
soil (or soil material). This last way of exposure to a leachate or an eluate allows the detection of the
mutagens which are not adsorbed to soils and which may be transferred to aquatic compartments.
Moreover, this test may be used to evaluate genotoxic effects of chemical substances and to waters,
effluents, etc.
2 Normative reference
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under
aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)
ISO 11260, Soil quality — Determination of effective cation exchange capacity and base saturation level
using barium chloride solution
ISO 11269-2:2012, Soil quality — Determination of the effects of pollutants on soil flora — Part 2: Effects of
contaminated soil on the emergence and early growth of higher plants
ISO 11465, Soil quality — Determination of dry matter and water content on a mass basis — Gravimetric method
ISO/TS 21268-1, Soil quality — Leaching procedures for subsequent chemical and ecotoxicological testing
of soil and soil materials — Part 1: Batch test using a liquid to solid ratio of 2 l/kg dry matter
ISO/TS 21268-2, Soil quality — Leaching procedures for subsequent chemical and ecotoxicological testing
of soil and soil materials — Part 2: Batch test using a liquid to solid ratio of 10 l/kg dry matter
EN 14735, Characterization of waste — Preparation of waste samples for ecotoxicity tests
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
control soil
uncontaminated substrate used as control and dilution medium for preparing dilution series with test
soils or test materials
EXAMPLE compost, sludge, waste, chemicals
3.2
mitotic index
number of cells in division per 1 000 cells observed when all of the stages of the mitosis are taken into
account, from the prophase (when the chromosomes begin to condense) up to the telophase (when the
chromatin of the two nuclei formed at each pole of the cell finishes decondensing).
3.3
test mixture
mixture of test material (soil, compost, sludge, waste or chemical) with control soil
4 Principle
This genotoxicity test is based on the detection of micronuclei in the cells of the secondary root tips of
Vicia faba (broad bean). The micronuclei, visible in the cytoplasm of the cells, result from a chromosome
break (effect of clastogenic substances) or from a dysfunction of the mitotic spindle (effect of aneugens).
In both cases, the fragments of chromosomes or the entire chromosomes cannot migrate to one of the
poles of the spindle at the time of the anaphase of the mitotic division and therefore form one (or more)
micronucleus.
The micronucleus frequency is determined in the control root cells and in those which have been exposed
to the soil (or soil material) or the water extract of the soil being tested. A statistical test then enables to
determine the significativeness of data.
5 Plants, test equipment and reagents
5.1 Equipment
The exposure of the plants to the soils and soil materials under test is performed in plastic pots (diameter:
9 cm, height: 10 cm).
Exposure to water extract of soils is carried out in glass containers (e.g. glass beaker of capacity 200 ml).
A microscope equipped with an objective with x 400 magnification is required for studying the
microscopic effects of the cells.
5.2 Test organism
The plant selected for its high sensitivity to micropollutants and for its ease of obtention is Vicia faba
(broad bean), Aguadulce, with a very long pod. This higher plant forms part of the family of pulses and
of the dicotyledoneae class.
Seeds coated with insecticides and/or fungicides should not be used.
5.3 Reference substance
Maleic hydrazide is recommended as a reference substance. The positive control is carried out at
-5
the concentration of 10 M, 1,12 mg/kg and 1,12 mg/l for solid-phase and liquid-phase exposures
respectively.
The preparation of this photodegradable substance as well as the exposure of the plant organisms to the
solution shall be carried out in the dark.
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5.4 Reagents
5.4.1 Carnoy’s solution
Carnoy’s solution is composed of glacial acetic acid and of ethanol in respective volume proportions of
25 % and 75 % and shall be prepared extemporaneously.
5.4.2 Hydrolysis solution
A solution of HCl with concentration 1 mol/l enables to conduct the hydrolysis of the roots.
5.4.3 Staining solution
The staining solution used for specifically highlighting the DNA is 1 % orcein diluted in 45 % acetic acid.
This mixture is brought to the boil during 10 min, then filtered after cooling down. When it is used, it is
important to filter the staining solution after each use in order to prevent the forming of orcein crystals
which could be confused with micronuclei during the microscopic examination of the cells.
NOTE Other specific DNA staining solution can be used.
5.4.4 Hoagland’s medium
Nutritive medium of which the composition is given in Annex A.
5.4.5 Intermediate solvent
Dimethyl sulfoxide (DMSO), at a maximal concentration of 1 %.
NOTE Any other appropriate water-miscible solvent whose genotoxic innocuousness has been previously
established may be used.
6 Protocols
6.1 Preparation of the soil to be tested
6.1.1 Chemical substances
Chemical substances may be tested: their preparation is explained in Annex B.
6.1.2 Soils and soil materials
Whatever the soil to be tested (sampled from a contaminated site or from a remediated soil, or other
soil materials like compost, sludge, waste, fertilizing matters, etc.), it should have pH values after
sieving within a range that is not toxic to Vicia faba. Soils under test should be sieved by 4 mm mesh and
thoroughly mixed and should be stored as shortly as possible, in the dark at 4 °C ± 2 °C in accordance with
ISO 10381-6 using containers that minimise losses of soil contaminants by volatilisation and sorption to
the container walls. Soil pH should not be corrected.
For each soil to be tested, the following characteristics should be determined:
— Soil texture classification,
— pH in accordance with ISO 10390,
— Water content in accordance with ISO 11465,
— Water holding capacity according to Annex B of ISO 11269-2:2012,
— Cationic exchange capacity in accordance with ISO 11260,
— Organic matter content in accordance with ISO 10694.
The soil mixtures are placed in plastic pots with a moisture content of 70 % of water-holding capacity.
6.1.3 Control soil
1)
Either reference or standard natural soils can be used as control soil, e.g. LUFA soils previously air
dried at room temperature, sieved between 2 mm and 5 mm, with clay (< 2µm) content < 25 % , silt (2 µm
-50 µm) content < 45 % , soil organic matter content between 1,5 % and 5 % , pH between 5 and 8 .
water
When comparing soils of known and unknown quality, the control soil and soil under test should be of
the same textural class, and be as similar as practicable in all respects other than the presence of the
chemical or contaminant being investigated. Indeed, significant differences in soil characteristics other
than the presence of contaminants may lead to differences in plant cell division, so in micronucleus
frequency and may induce false positive test results.
NOTE Although mitotic index is not modified by pH between 4 and 9, it is recommended to use a control soil
with a pH between 5 and 8 for a better genotoxicity assessment of chemicals.
water
6.1.4 Water extracts of soil
Water extracts of soils or soil materials are prepared, as rapidly as possible after receipt of the sample
at the laboratory, with a leaching test according to one of the protocols described in ISO/TS 21268-1 or
ISO/TS 21268-2 or EN 14735. However, the eluates obtained shall not be filtered but can be decanted
during 2 h. In this case, the supernatant phase is sampled and stored in the dark at a temperature of 4 °C
± 3 °C up until the test is carried out which shall take place at the maximum 24 h after the leaching stage.
The Hoagland’s medium is used for the negative control and to prepare the dilutions of the water extract.
6.2 Preparation of the seeds
Seeds (approximately three times higher than the required number) are selected from the stock of seeds
stored at 4 °C in the dark. Then a germination step is necessary to obtain secondary roots: the seeds
are cleaned with demineralised water and immersed during a period between 6 h and 24 h at ambient
temperature in demineralised water in order to hydrate them. The seed coats are then removed and
the seeds are left to germinate vertically at 24 °C ± 1 °C in continually humidified cotton (not having
undergone any chlorinated treatment) in the dark.
NOTE Other germination material may be used: vermiculite, peat, etc.
After about three days, only those seeds whose primary root length is between 3 cm and 5 cm are
selected. Their tip (around 5 mm) is then cut off in order to interrupt the growth of this main root and
to stimulate that of the secondary roots.
For solid phase exposure, the primary rooted seeds are directly placed in soils for beginning the
exposure of secondary roots.
For liquid phase exposure, the seeds are then placed, so as to immerse only the root, over a container
containing some nutritive medium (Hoagland’s medium (5.4.4)) at a temperature of 24 °C ± 1 °C in order
to induce the secondary roots sprouting. This previously oxygenated medium is renewed every 24h. The
secondary roots of the seeds reach a length of 1 cm to 2 cm after a period of four days; the seeds bearing
these secondary roots are then used for the purpose of the test.
This germination step of the Vicia faba seeds, necessary in both ways of exposure, can be started four
days and eight days respectively for solid-phase and liquid-phase exposure before beginning the test.
1) LUFA soils are an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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6.3 Conducting of the test
6.3.1 Soils and soil materials
The dilutions of the test mixture are chosen within a geometric series with a factor not exceeding two
and shall cover a large range of concentrations (e.g. from 0,01 % to 100 % ). These mixtures are prepared
by diluting the soil with a reference soil.
Each test shall include a negative control without any test sample and a positive control (see 5.3).
The direct exposure of the plant organisms to the different concentrations of the soil is performed by
placing the germinated seeds (at least three per dilution) in a plastic pot containing 200 g of the tested
soil and/or mixtures (see Figur
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 29200
Première édition
2013-09-01
Qualité du sol — Évaluation des
effets génotoxiques sur les végétaux
supérieurs — Essai des micronoyaux
sur Vicia faba
Soil quality — Assessment of genotoxic effects on higher plants —
Vicia faba micronucleus test
Numéro de référence
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ISO 2013
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
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Tel. + 41 22 749 01 11
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Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
5 Plantes, matériel d’essai et réactifs . 2
5.1 Matériel . 2
5.2 Organisme d’essai . 2
5.3 Substance de référence . 3
5.4 Réactifs . 3
6 Protocoles . 3
6.1 Préparation du sol à soumettre à essai . 3
6.2 Préparation des graines . 4
6.3 Réalisation de l’essai . 5
6.4 Conditions d’essai . 7
6.5 Préparation des cellules . 7
7 Évaluation des résultats . 9
7.1 Présentation des données . 9
7.2 Analyse statistique . 9
7.3 Interprétation des résultats . 9
8 Critères de validité . 9
9 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Composition du milieu de Hoagland .11
Annexe B (informative) Produits chimiques soumis à essai ajoutés aux sols .12
Annexe C (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires mené dans le cadre de la norme
NF T 90-327
.............................................................................................................................................................................................................13
Annexe D (informative) Résultats de l’essai interlaboratoires effectué sur la substance de
référence et sur un sol industriel contaminé .15
Bibliographie .19
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/CEI, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/CEI, Partie 2, www.iso.
org/directives.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant les
références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de l’élaboration
du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou sur la liste ISO des déclarations de brevets reçues,
www.iso.org/brevets.
Les éventuelles appellations commerciales utilisées dans le présent document sont données pour
information à l’intention des utilisateurs et ne constituent pas une approbation ou une recommandation.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2013 – Tous droits réservés
Introduction
Dans le domaine de l’évaluation de la qualité du sol, il apparaît nécessaire de déterminer in vivo le
potentiel génotoxique des sols et des matrices solides, qui peut être induit par la pollution ou par un
processus de remédiation. En effet, les agents génotoxiques ont la capacité d’endommager le génome des
organismes vivants ou d’interférer avec son fonctionnement, mais ils ne sont pas toujours détectés par
une analyse chimique ou des essais d’écotoxicité classiques. En fait, les effets génotoxiques sont souvent
observés chez les organismes vivants à une concentration sublétale, à laquelle aucun effet toxique
(par exemple survie ou croissance) ne peut être observé à court terme mais des effets à long terme
peuvent être craints. De plus, les plantes supérieures, telles que Vicia faba (fève) sont écologiquement
représentatives pour évaluer la qualité des sols ou des matrices solides.
NORME INTERNATIONALE ISO 29200:2013(F)
Qualité du sol — Évaluation des effets génotoxiques sur les
végétaux supérieurs — Essai des micronoyaux sur Vicia faba
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale décrit une méthode pour évaluer les effets génotoxiques (cassure
des chromosomes ou dysfonctionnement du fuseau mitotique) des sols ou des matrices solides sur une
plante supérieure: Vicia faba (fève). Cette méthode permet d’évaluer la génotoxicité (toxicité vis-à-vis du
matériel génétique) des sols ou des matrices solides telles que des composts, boues, déchets, matières
fertilisantes, etc. Deux modes d’exposition peuvent être considérés: une exposition directe des plantes
au sol (ou aux matrices solides) ce qui est représentatif du potentiel génotoxique réel et une exposition
des plantes à l’extrait aqueux du sol (ou des matrices solides). Ce dernier mode d’exposition à un lixiviat
ou un éluat permet de détecter les mutagènes qui ne sont pas adsorbés dans les sols et qui peuvent être
transférés aux compartiments aquatiques. D’autre part, cet essai peut être utilisé pour évaluer les effets
génotoxiques des substances chimiques, ainsi que des eaux, effluents, etc.
2 Références normatives
Les documents suivants, en tout ou partie, sont référencés de manière normative dans le présent
document et sont indispensables pour son application. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l’évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
ISO 11260, Qualité du sol — Détermination de la capacité d’échange cationique effective et du taux de
saturation en bases échangeables à l’aide d’une solution de chlorure de baryum
ISO 11269-2:2012, Qualité du sol — Détermination des effets des polluants sur la flore du sol — Partie 2:
Effets des sols contaminés sur l’émergence et la croissance des végétaux supérieurs
ISO 11465, Qualité du sol — Détermination de la teneur pondérale en matière sèche et en eau — Méthode
gravimétrique
ISO/TS 21268-1, Qualité du sol — Modes opératoires de lixiviation en vue d’essais chimiques et
écotoxicologiques ultérieurs des sols et matériaux du sol — Partie 1: Essai en bâchée avec un rapport
liquide/solide de 2 l/kg de matière sèche
ISO/TS 21268-2, Qualité du sol — Modes opératoires de lixiviation en vue d’essais chimiques et
écotoxicologiques ultérieurs des sols et matériaux du sol — Partie 2: Essai en bâchée avec un rapport
liquide/solide de 10 l/kg de matière sèche
EN 14735, Caractérisation des déchets — Préparation des échantillons de déchets en vue d’essais
écotoxicologiques
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
sol témoin
substrat non contaminé utilisé comme milieu de contrôle et pour la préparation des différentes
concentrations des sols ou des matrices solides à soumettre à essai
EXEMPLE Composts, boues, déchets, substances chimiques.
3.2
indice mitotique
nombre de cellules en division pour 1 000 cellules observées lorsque toutes les phases de la mitose sont prises
en compte, depuis la prophase (quand les chromosomes commencent à se condenser) jusqu’à la télophase
(quand la chromatine des deux noyaux formés à chaque pôle de la cellule termine de se décondenser)
3.3
mélange d’essai
mélange du milieu soumis à essai (sols, composts, boues, déchets, substances chimiques) avec le sol témoin
4 Principe
Cet essai de génotoxicité est basé sur la détection des micronoyaux dans les cellules des extrémités
des racines secondaires de Vicia faba (fève). Les micronoyaux, visibles dans le cytoplasme des cellules,
résultent d’une cassure chromosomique (effet des substances clastogènes) ou d’un dysfonctionnement
du fuseau mitotique (effet aneugène).
Dans les deux cas, les fragments des chromosomes ou les chromosomes entiers ne peuvent pas migrer
vers l’un des deux pôles du fuseau au moment de l’anaphase de la division mitotique et donc, forment un
(ou plusieurs) micronoyau(x).
La fréquence de micronoyaux est déterminée dans les cellules des racines témoins et dans celles qui
ont été exposées au sol (ou aux matrices solides) ou à l’extrait aqueux du sol soumis à essai. Un test
statistique permet donc de déterminer la significativité des données.
5 Plantes, matériel d’essai et réactifs
5.1 Matériel
L’exposition des plantes aux sols et aux matrices solides à soumettre à essai a lieu dans des pots en
plastique (diamètre: 9 cm, hauteur: 10 cm).
L’exposition à l’extrait aqueux des sols est effectuée dans des contenants en verre (par exemple bécher
en verre d’une contenance de 200 ml).
Un microscope équipé d’un objectif grossissant ×400 est requis pour étudier les effets microscopiques
sur les cellules.
5.2 Organisme d’essai
La plante choisie pour sa sensibilité aux micropolluants et pour sa facilité d’obtention est Vicia faba
(fève), Aguadulce à très longue cosse. Cette plante supérieure fait partie de la famille des légumineuses
et appartient à la classe des dicotylédones.
Il est recommandé de ne pas utiliser de graines enrobées d’insecticides et/ou de fongicides.
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
5.3 Substance de référence
L’hydrazide maléique est recommandé comme substance de référence. Le contrôle positif est effectué
−5
à une concentration de 10 M, respectivement 1,12 mg/kg et 1,12 mg/l pour des expositions en phase
solide et en phase liquide.
La préparation de cette substance photodégradable et l’exposition des organismes végétaux à la solution
doivent être exécutées à l’abri de la lumière.
5.4 Réactifs
5.4.1 Solution de Carnoy
La solution de Carnoy est composée d’acide acétique glacial et d’éthanol dans des proportions respectives
de 25 % et 75 % et doit être préparée extemporanément.
5.4.2 Solution d’hydrolyse
Une solution de HCI d’une concentration de 1 mol/l permet d’effectuer l’hydrolyse des racines.
5.4.3 Solution de coloration
La solution de coloration utilisée pour mettre spécifiquement en évidence l’ADN est de l’orcéine à 1 %
diluée dans de l’acide acétique à 45 %. Le mélange est amené à ébullition pendant 10 min, ensuite filtré
après refroidissement. Lors de l’emploi, il est important de filtrer la solution de coloration après chaque
utilisation afin d’empêcher la formation de cristaux d’orcéine qui pourraient être confondus avec les
micronoyaux durant l’examen microscopique des cellules.
NOTE Une autre solution de coloration spécifique de l’ADN peut être utilisée.
5.4.4 Milieu de Hoagland
Milieu nutritif dont la composition est donnée dans l’Annexe A.
5.4.5 Solvant intermédiaire
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO), à une concentration maximale de 1 %.
NOTE Tout autre solvant approprié miscible à l’eau dont l’innocuité génotoxique a été préalablement établie
peut être utilisé.
6 Protocoles
6.1 Préparation du sol à soumettre à essai
6.1.1 Substances chimiques
Les substances chimiques peuvent être soumises à essai: leur préparation est expliquée dans l’Annexe B.
6.1.2 Sols et matrices solides
Quel que soit le sol à soumettre à essai (échantillons provenant d’un site contaminé ou d’un sol dépollué
ou d’autres matrices solides telles que des composts, boues, déchets ou matières fertilisantes, etc.), il est
recommandé qu’il possède, après tamisage, des valeurs de pH qui ne soient pas toxiques pour Vicia faba.
Il est recommandé que les sols à soumettre à essai soient tamisés à 4 mm, mélangés minutieusement et
stockés aussi brièvement que possible à l’abri de la lumière à une température de 4 °C ± 2 °C conformément
à l’ISO 10381-6 en utilisant des contenants qui réduisent le plus possible les pertes des contaminants du
sol par volatilisation et par sorption sur les parois des contenants. Il est recommandé de ne pas corriger
le pH du sol.
Pour chaque sol à soumettre à essai, il est recommandé de déterminer les caractéristiques suivantes:
— classification de la texture du sol,
— pH conformément à l’ISO 10390,
— teneur en eau conformément à l’ISO 11465,
— capacité de rétention d’eau conformément à l’Annexe B de l’ISO 11269-2:2012,
— capacité d’échange cationique conformément à l’ISO 11260,
— teneur en matière organique conformément à l’ISO 10694.
Les mélanges de sol sont placés dans des pots en plastique avec une teneur en humidité de 70 % de la
capacité de rétention en eau.
6.1.3 Sol témoin
Tout sol naturel de référence ou standard peut être utilisé comme sol témoin, par exemple les sols
1)
LUFA préférablement séchés à température ambiante, tamisés entre 2 mm et 5 mm, avec une teneur en
argiles < 25 % (<2 µm), une teneur en limons < 45 % (2 µm – 50 µm), une teneur en matière organique
du sol entre 1,5 % et 5 %, pH entre 5 et 8.
eau
Lorsque des sols de qualité connue et inconnue sont comparés, il est recommandé que le sol témoin
et le sol à soumettre à essai soient du même type de texture et soient, dans la mesure du possible,
similaires à tous égards autres que la présence des substances chimiques ou contaminants à soumettre
à essai. En effet, des différences significatives dans les caractéristiques de sol autres que la présence de
contaminants peuvent conduire à des différences dans la division cellulaire de la plante, donc dans la
fréquence des micronoyaux et peuvent induire de faux résultats positifs.
NOTE Bien que l’indice mitotique ne soit pas modifié par un pH entre 4 et 9, il est recommandé d’utiliser le sol
témoin avec un pH entre 5 et 8 pour une meilleure évaluation de la génotoxicité des substances chimiques.
eau
6.1.4 Extraits aqueux du sol
Les extraits aqueux des sols et des matrices solides sont préparés aussi rapidement que possible après
réception de l’échantillon au laboratoire, à l’aide d’un essai de lixiviation conformément à l’un des
protocoles décrits dans l’ISO/TS 21268-1, l’ISO/TS 21268-2 ou l’EN 14735. Cependant, les lixiviats obtenus
ne doivent pas être filtrés mais peuvent être décantés durant 2 h. Dans ce cas, la phase surnageante est
échantillonnée et stockée à l’abri de la lumière à une température maximale de 4 °C ± 3 °C jusqu’à ce
que l’essai soit réalisé, ce qui doit avoir lieu au maximum 24 h après l’étape de lixiviation. Le milieu de
Hoagland est utilisé pour le témoin négatif et pour préparer les dilutions de l’extrait aqueux.
6.2 Préparation des graines
Les graines (approximativement en quantité trois fois supérieure à la quantité nécessaire) sont prélevées
dans le stock de graines entreposé à une température de 4 °C à l’abri de la lumière. Ensuite, une étape de
germination est nécessaire pour obtenir les racines secondaires: les graines sont nettoyées avec de l’eau
déminéralisée et immergées dans l’eau déminéralisée à température ambiante pendant une période de
6 h à 24 h afin de les hydrater. Les téguments des graines sont ensuite enlevés et les graines sont mises
1) Les sols LUFA sont un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée
à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande
l’emploi exclusif du produit ainsi désigné.
4 © ISO 2013 – Tous droits réservés
à germer verticalement à 24 °C ± 1 °C dans du coton (n’ayant pas été traité au chlore) humidifié de façon
continue à l’abri de la lumière.
NOTE D’autres matériaux de germination peuvent être utilisés: vermiculite, tourbe, etc.
Après environ trois jours, seules les graines ayant une racine principale d’une longueur comprise entre
3 cm et 5 cm sont choisies. Leur extrémité (environ 5 mm) est ensuite coupée afin d’interrompre la
croissance de cette racine principale et de stimuler celle des racines secondaires.
Pour l’exposition en phase solide, les graines avec la racine primaire sont directement placées dans les
sols pour le début de l’exposition des racines secondaires.
Pour l’exposition en phase liquide, les graines sont ensuite placées, de façon à immerger uniquement
la racine, au-dessus d’un récipient contenant du milieu nutritif [milieu de Hoagland (5.4.4)] à une
température de 24 °C ± 1 °C afin d’induire la germination des racines secondaires. Ce milieu préalablement
oxygéné est renouvelé chaque 24 h. Les racines secondaires des graines atteignent une longueur de 1 cm
à 2 cm après une période de quatre jours; les graines pourvues de ces racines secondaires sont ensuite
utilisées pour l’essai.
Cette étape de germination des graines de Vicia faba, nécessaire dans les deux modes d’exposition, peut
débuter avant le début de l’essai quatre jours et huit jours respectivement pour l’exposition en phase
solide et pour l’exposition en phase liquide.
6.3 Réalisation de l’essai
6.3.1 Sols et matrices solides
Les concentrations sont choisies dans une série géométrique avec un facteur ne dépassant pas deux et
doivent couvrir une large gamme de concentrations (par exemple de 0,01 % à 100 %). Ces mélanges sont
préparés par mélange du sol avec un sol de référence.
Chaque essai doit inclure un témoin négatif sans aucun échantillon et un témoin positif (voir 5.3).
L’exposition directe des organismes végétaux aux différentes concent
...
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