ISO/TS 22939:2010

Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates

ISO/TS 22939:2010 specifies a method for the measurement of several enzyme activities simultaneously in soil samples. Enzyme activities of soil vary seasonally and depend on the chemical, physical and biological characteristics of soil. Its application for the detection of harmful effects of toxic chemicals or other anthropogenic impacts depends on the simultaneous comparison of enzyme activities in a control soil similar to the test soil, or on exposure tests with chemicals or treatments.

Qualité du sol — Mesure en microplaques de l'activité enzymatique dans des échantillons de sol en utilisant des substrats fluorogènes

L'ISO/TS 22939:2010 spécifie une méthode de mesure simultanée de plusieurs activités enzymatiques dans des échantillons de sol. Les activités enzymatiques du sol varient en fonction des saisons et dépendent des caractéristiques chimiques, physiques et biologiques du sol. Son application pour la détection des effets nocifs des produits chimiques toxiques ou d'autres impacts anthropogènes dépend de la comparaison simultanée des activités enzymatiques dans un sol de référence similaire au sol d'essai ou des essais d'exposition avec des produits chimiques ou des traitements.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 07-Mar-2010
• Withdrawal Date: 07-Mar-2010
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 4 - Effects on soil micro-organisms
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 08-Aug-2019

Relations

• Revised: ISO/TS 22939:2019 - Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates
• Effective Date: 21-Oct-2017

Standards Content (Sample)

TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 22939
First edition
2010-03-15

Soil quality — Measurement of enzyme
activity patterns in soil samples using
fluorogenic substrates in micro-well
plates
Qualité du sol — Mesure en microplaques de l'activité enzymatique
dans des échantillons de sol en utilisant des substrats fluorogènes




Reference number
ISO/TS 22939:2010(E)
©
ISO 2010

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.


COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT


©  ISO 2010
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Published in Switzerland

ii © ISO 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction.v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Abbreviated terms .1
4 Principle.1
5 Reagents.2
6 Apparatus and materials.5
7 Procedure.6
8 Calculation of results.7
9 Expression of results.8
10 Test report.8
Annex A (informative) Guidance on the use of freshly prepared substrates .9
Annex B (informative) Example of a graph for calculation.11
Bibliography.13

© ISO 2010 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical experts in
an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 % of the members
of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a technical
committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the committee casting
a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for a
further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or ISO/TS is
confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be transformed into an
International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 22939 was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological methods.
iv © ISO 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
Introduction
Micro-organisms are responsible for many key processes in the cycle of elements. Enzymes are responsible
for the degradation of organic molecules and their mineralization. The main postulate is the microbial origin of
soil enzymes, even if plant root exudates include enzymes. Extracellular enzymes in soil play key roles in the
biodegradation of organic macromolecules. The simultaneous monitoring of several enzyme activities
important in the biodegradation of organic compounds and mineralization of C, N, P and S in soil may reveal
harmful effects caused by chemicals and other anthropogenic impacts. However, the measurements carried
out under selected laboratory conditions using artificial substrates cannot be a substitute for the actual rate of
enzymatic processes in soil in situ.

© ISO 2010 – All rights reserved v

---------------------- Page: 5 ----------------------
TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 22939:2010(E)

Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil
samples using fluorogenic substrates in micro-well plates
1 Scope
This Technical Specification specifies a method for the measurement of several enzyme activities
simultaneously in soil samples. Enzyme activities of soil vary seasonally and depend on the chemical,
physical and biological characteristics of soil. Its application for the detection of harmful effects of toxic
chemicals or other anthropogenic impacts depends on the simultaneous comparison of enzyme activities in a
control soil similar to the test soil, or on exposure tests with chemicals or treatments.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 10381-6, Soil quality — Sampling — Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil
under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the
laboratory
ISO 10390, Soil quality — Determination of pH
ISO 10694, Soil quality — Determination of organic carbon and total carbon after dry combustion (elementary
analysis)
3 Abbreviated terms
E.C. Enzyme code number defined by the Nomenclature Committee of the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)
SOM Soil organic matter content
MUB Modified universal buffer
4 Principle
This Technical Specification describes a method for the simultaneous measurements of several enzymes in
soil samples. It is based on the use of soil samples diluted in buffer containing fluorogenic substrates, which
are incubated for 3 h at (30 ± 2) °C in multi-well plates. After the incubation the enzyme activities are
measured as fluorescence with a plate-reading fluorometer (References [1] and [2] in the Bibliography). The
method described is based on dried standard and substrate plates enabling storage and limiting bias due to
differences between reagent batches, and also enabling comparison between reagent batches. Annex A
describes a method utilizing freshly prepared reagents, which has a clearly defined and exact incubation
period. The advantage of the use of freshly prepared substrates is that an instrument for lyophilization is not
required.
© ISO 2010 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
5 Reagents
5.1 Buffers
5.1.1 General
The selection of the buffer depends on the soil sample because the pH strongly affects enzyme activities.
Sodium acetate buffer, 0,5 mol/l, at pH 5,5 has been used for acid soils with a high organic matter content.
The use of the modified universal buffer (MUB) at the pH of the soil sample gives the flexibility necessary for
coverage of a broad spectrum of different soils. Adequate stability of substrates at different buffers needs to
be ensured. Good stability has been observed in 0,5 mol/l sodium acetate buffer at pH 5,5 (Reference [3] in
the Bibliography).
5.1.2 Sodium acetate buffer, 0,5 mol/l, pH 5,5
⎯ sodium acetate trihydrate 68,04 g;
⎯ deionized water, ad 1 000 ml;
⎯ acetic acid > 99,8 %.
Dissolve sodium acetate trihydrate in water (e.g. 800 ml) and adjust the pH to 5,5 with concentrated acetic
acid (> 99,8 %; pro-analysis). Fill up to 1 000 ml. Sterilize in an autoclave at (121 ± 3) °C for 20 min. Store in a
refrigerator for a maximum of two weeks.
5.1.3 Modified universal buffer (MUB) (Reference [4])
5.1.3.1 Stock solution
⎯ tris(hydroxymethyl)aminomethane 12,1 g;
⎯ maleic acid 11,6 g;
⎯ citric acid 14,0 g;
⎯ boric acid 6,3 g;
⎯ sodium hydroxide (1 mol/l) 488 ml;
⎯ deionized water, ad 1 000 ml.
Dissolve the ingredients and store the solution in a refrigerator.
5.1.3.2 Final buffer
⎯ hydrochloric acid (0,1 mol/l);
⎯ sodium hydroxide (0,1 mol/l).
Place 200 ml of the stock solution (5.1.3.1) in a 500 ml beaker containing a magnetic stirring bar, and place
the beaker on a magnetic stirrer. Set the required pH with hydrochloric acid or with sodium hydroxide. Adjust
the volume to 1 000 ml with deionized water. Sterilize in an autoclave at (121 ± 3) °C for 20 min.
2 © ISO 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
5.2 Substrates and standards
5.2.1 Preparation of standard solutions
5.2.1.1 4-Methylumbelliferone (MUF) solution
⎯ 4-methylumbelliferone (MUF) 0,022 0 g;
⎯ dimethylsulfoxide (DMSO), ad 25 ml.
MUF in powder form can be stored at room temperature but protected from light. Weigh MUF carefully and
dissolve it in DMSO in a brown volumetric flask, avoiding exposure to daylight. The solution cannot be stored.
5.2.1.2 7-Amino-4-methylcoumarin (AMC) solution
⎯ 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) 0,021 9 g;
⎯ dimethylsulfoxide (DMSO), ad 25 ml.
AMC as powder can be stored in the refrigerator. Weigh AMC carefully and dissolve it in DMSO in a brown
volumetric flask, avoiding exposure to daylight. The solution cannot be stored.
5.2.2 Preparation of substrate solutions
Commercially available fluorogenic substrates are delivered as powders that can be stored deep-frozen at
(−20 ± 2) °C. On the day of use, weigh the amount required for a 1 000 µmol/l, 2 500 µmol/l or 2 750 µmol/l
concentration in a volume of, for example, 50 ml, avoiding exposure to light. Weigh the powder into a brown
volumetric flask and fill to the required volume with DMSO.
The volume should be big enough for reliable weighing and measurement of volumes. It also depends on the
number of plates needed.
The commonly used dispensers are able to distribute simultaneously just one volume (e.g. 40 µl) to eight rows.
To facilitate the use of these instruments enabling good volumetric precision, 2 500 µmol/l solutions of the
substrates should be prepared. However, for 4-MUF-β-D-glucopyranoside and for 4-MUF-phosphate
substrates, a solution with the concentration of 2 750 µmol/l is needed in order to produce the same final
concentration of 500 µmol/l. These two solutions are further diluted simultaneously with the addition of the
sample; 20 µl dimethylsulfoxide is added to the wells of these two substrates to facilitate dissolution. For
chitinase activity measurement, a lower concentration is needed in order to avoid substrate inhibition, and the
preparation of a solution with a concentration of 1 000 µmol/l 4-MUF-N-acetyl-β-D-glucosaminide can be used
to produce the final concentration of 200 µmol/l.
5.2.3 Preparation of multi-well plates
The substrate and standard solutions are added to multi-well plates as solutions and dried (e.g. freeze-dried)
on the multi-well plates directly after dispensing. Dry plates can be stored at (−20 ± 2) °C for a year. Exposure
to light shall be avoided during handling and storage of substrates and standards. A separate multi-well plate
for substrates and standards has proved to be convenient.
5.2.4 Preparation of standard plates
Adequate replicate measurements, e.g. three to four replicates, are necessary due to the small sample
volume. Standardization requires several concentrations of MUF or AMC, in replicate. Exposure to light shall
be avoided during the dilution of standards. Calculate the required volume that depends on the number of
samples and multi-well plates prepared. One example for the preparation of standards covering a wide range
of enzyme activities is given below, but modifications can be made depending on the range of enzyme
activities in the samples studied.
© ISO 2010 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
The stock solution of MUF with a concentration of 5 mmol/l is used to produce the dilutions containing
1 000 µmol/l, 500 µmol/l, 250 µmol/l, 125 µmol/l, 50 µmol/l, 25 µmol/l and 5 µmol/l MUF. Distribute the
volumes needed (e.g. 40 ml) into a multi-well plate for concentrations of 0 µmol/l, 1,0 µmol/l, 5,0 µmol/l,
10 µmol/l, 25 µmol/l, 50 µmol/l, 100 µmol/l and 200 µmol/l, in replicate. This step is critical for the
measurement uncertainty.
NOTE 1 This set of stock solutions enables the use of automatic dispensers, which yield a significantly better precision
than manual pipetting.
The stock solution of AMC with a concentration of 5 mmol/l is used to produce the dilutions containing
250 µmol/l, 125 µmol/l, 50 µmol/l, 25 µmol/l, 5 µmol/l, 2,5 µmol/l and 0,5 µmol/l AMC. Distribute the volumes
needed (e.g. 40 ml) into a multi-well plate for concentrations of 0 µmol/l, 0,1 µmol/l, 0,5 µmol/l, 1,0 µmol/l,
5,0 µmol/l, 10 µmol/l, 25 µmol/l and 50 µmol/l, in replicate. This step is critical for the measurement uncertainty.
NOTE 2 This set of stock solutions enables the use of automatic dispensers, which yield a significantly better precision
than manual pipetting.
5.2.5 Preparation of substrate plates
Exposure to light shall be avoided during dilution of substrates. When using multi-well plates with dry
substrates with the final substrate concentration of 500 µmol/l and the sample volume of 200 µl, a volume of
40 µl of the 2 500 µmol/l solution for the substrates is added, in replicate, to the wells. For
4-MUF-β-D-glucopyranoside and for 4-MUF-phosphate, a 2 750 µmol/l substrate solution is added, in replicate,
to the wells. For chitinase activity measurement, 40 µl of the substrate 4-MUF-N-acetyl-β-D-glucosaminide is
added as a 1 000 µmol/l solution to reach the final concentration of 200 µmol/l.
This is the concentration that has been used for several different soils with the assumption of an approximate
saturation level. In validation tests for a broad spectrum of soils, appropriate substrate concentrations should
be checked and/or an enzyme kinetic approach considered.
If a plate with 96 wells and an automatic dispenser are used for eight substrates, 12 replicates are
conveniently available. When using four replicates, it is possible to analyse three different samples or dilution
levels on one plate.
5.2.6 Drying of multi-well plates
Handling depends on the instrument e.g. lyophilizator used. Exposure to light shall be avoided during
processing of the multi-well plates.
5.2.7 Fluorogenic substrates
1)
Table 1 gives a list of fluorogenic substrates and standards that are available commercially .

1) Glycosynth and Sigma are examples of producers of fluorogenic molecules. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the producer named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4 © ISO 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(E)
Table 1 — Fluorogenic artificial substrates available commercially
for the en
...

SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 22939
Première édition
2010-03-15


Qualité du sol — Mesure en microplaques
de l'activité enzymatique dans des
échantillons de sol en utilisant des
substrats fluorogènes
Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil samples
using fluorogenic substrates in micro-well plates




Numéro de référence
ISO/TS 22939:2010(F)
©
ISO 2010

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
PDF – Exonération de responsabilité
Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées
acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute
responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.
Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info
du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir
l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,
veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.


DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT


©  ISO 2010
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous
quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail [e-mail]
Web www.iso.org
Publié en Suisse

ii © ISO 2010 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction.v
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives.1
3 Termes abrégés .1
4 Principe.1
5 Réactifs.2
6 Appareillage et matériaux.5
7 Mode opératoire.6
8 Calcul des résultats.8
9 Expression des résultats.8
10 Rapport d'essai.8
Annexe A (informative) Lignes directrices pour l'utilisation de substrats fraîchement préparés .9
Annexe B (informative) Exemple d'un graphique de calcul.11
Bibliographie.13

© ISO 2010 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
Dans d'autres circonstances, en particulier lorsqu'il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d'autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts dans
un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 % des
membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d'un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l'objet d'un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour trois
nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu'une ISO/PAS ou
ISO/TS a été confirmée, elle fait l'objet d'un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO/TS 22939 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Méthodes biologiques.
iv © ISO 2010 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
Introduction
Les micro-organismes sont responsables de nombreux processus clés dans le cycle des éléments. Les
enzymes sont responsables de la dégradation des molécules organiques et de leur minéralisation. Le
principal postulat énoncé est l'origine microbienne des enzymes du sol, même si les exsudats de racines de
plantes comprennent des enzymes. Les enzymes extracellulaires présentes dans le sol jouent un rôle majeur
dans la biodégradation des macromolécules organiques. La surveillance simultanée de plusieurs activités
enzymatiques importantes dans la biodégradation des composés organiques et dans la minéralisation de C, N,
P et S dans le sol, peut révéler les effets nocifs causés par les produits chimiques et d'autres impacts
anthropogènes. Cependant, les mesures effectuées dans des conditions de laboratoire sélectionnées utilisant
des substrats artificiels ne peuvent pas se substituer aux vitesses effectives des processus enzymatiques se
produisant in situ dans le sol.

© ISO 2010 – Tous droits réservés v

---------------------- Page: 5 ----------------------
SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 22939:2010(F)

Qualité du sol — Mesure en microplaques de l'activité
enzymatique dans des échantillons de sol en utilisant des
substrats fluorogènes
1 Domaine d'application
La présente Spécification technique spécifie une méthode de mesure simultanée de plusieurs activités
enzymatiques dans des échantillons de sol. Les activités enzymatiques du sol varient en fonction des saisons
et dépendent des caractéristiques chimiques, physiques et biologiques du sol. Son application pour la
détection des effets nocifs des produits chimiques toxiques ou d'autres impacts anthropogènes dépend de la
comparaison simultanée des activités enzymatiques dans un sol de référence similaire au sol d'essai ou des
essais d'exposition avec des produits chimiques ou des traitements.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 10381-6, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 6: Lignes directrices pour la collecte, la manipulation
et la conservation, dans des conditions aérobies, de sols destinés à l'évaluation en laboratoire des processus,
de la biomasse et de la diversité microbiens
ISO 10390, Qualité du sol — Détermination du pH
ISO 10694, Qualité du sol — Dosage du carbone organique et du carbone total après combustion sèche
(analyse élémentaire)
3 Termes abrégés
E.C. code d'enzyme défini par le Comité de nomenclature de l'Union internationale de biochimie et de
biologie moléculaire (NC-IUBMB)
MOS teneur en matière organique du sol
MUB tampon universel modifié
4 Principe
La présente Spécification technique décrit une méthode de mesure simultanée de plusieurs activités
enzymatiques dans des échantillons de sol. Cette méthode repose sur l'utilisation d'échantillons de sol dilués
dans un tampon contenant des substrats fluorogènes, qui sont incubés pendant 3 h à (30 ± 2) °C dans des
plaques multipuits. Après incubation, les activités enzymatiques sont mesurées par fluorescence à l'aide d'un
lecteur de microplaques (Références [1] et [2]). La méthode décrite utilise des plaques, étalons et substrats,
séchées permettant le stockage et limitant le biais dû aux différences entre les lots de réactifs, et permettant
également la comparaison des lots de réactifs. L'Annexe A décrit une méthode utilisant des réactifs
fraîchement préparés et dont la période d'incubation est exactement définie. L'avantage de l'utilisation de
substrats fraîchement préparés est qu'une lyophilisation est inutile.
© ISO 2010 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
5 Réactifs
5.1 Tampon
5.1.1 Généralités
Le choix du tampon dépend de l'échantillon de sol car le pH affecte fortement les activités enzymatiques. Le
tampon acétate de sodium, 0,5 mol/l, à pH 5,5, a été utilisé pour les sols acides à forte teneur en matière
organique. L'utilisation du tampon universel modifié (MUB), de pH équivalent à celui de l'échantillon de sol,
confère la souplesse nécessaire pour couvrir une vaste gamme de sols différents. La stabilité adéquate des
substrats à différents tampons doit être garantie. Une bonne stabilité a été observée dans un tampon acétate
de sodium, 0,5 mol/l, à pH 5,5 (Référence [3]).
5.1.2 Tampon acétate de sodium, 0,5 mol/l, pH 5,5
⎯ acétate de sodium, trihydrate 68,04 g;
⎯ eau déionisée, qsp 1 000 ml;
⎯ acide acétique > 99,8 %.
Dissoudre l'acétate de sodium trihydrate dans de l'eau (par exemple 800 ml) et ajuster le pH à 5,5 avec de
l'acide acétique concentré (> 99,8 %; pour analyse). Ajuster à 1 000 ml. Stériliser à l'autoclave à (121 ± 3) °C
pendant 20 min. Stocker au réfrigérateur pendant deux semaines maximum.
5.1.3 Tampon universel modifié (MUB) (Référence [4])
5.1.3.1 Solution mère
⎯ tris(hydroxyméthyl)aminométhane 12,1 g;
⎯ acide maléique 11,6 g;
⎯ acide citrique 14,0 g;
⎯ acide borique 6,3 g;
⎯ hydroxyde de sodium (1 mol/l) 488 ml;
⎯ eau déionisée, qsp 1 000 ml.
Dissoudre les ingrédients et stocker la solution au réfrigérateur.
5.1.3.2 Tampon final
⎯ acide chlorhydrique (0,1 mol/l);
⎯ hydroxyde de sodium (0,1 mol/l).
Verser 200 ml de solution mère (5.1.3.1) dans un bécher de 500 ml contenant un barreau magnétique et
placer le bécher sur un agitateur magnétique. Ajuster au pH requis avec de l'acide chlorhydrique ou de
l'hydroxyde de sodium. Compléter le volume à 1 000 ml avec de l'eau déionisée. Stériliser à l'autoclave à
(121 ± 3) °C pendant 20 min.
2 © ISO 2010 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
5.2 Substrats et étalons
5.2.1 Préparation des solutions étalons
5.2.1.1 Solution de 4-méthylumbelliférone (MUF)
⎯ 4-méthylumbelliférone (MUF) 0,022 0 g;
⎯ diméthylsulfoxyde (DMSO), qsp 25 ml.
La MUF en poudre peut être stockée à température ambiante, à l'abri de la lumière. Peser soigneusement la
MUF et la dissoudre dans du DMSO dans une fiole jaugée ambrée, en évitant toute exposition à la lumière du
jour. La solution ne peut pas être stockée.
5.2.1.2 Solution de 7-amino-4-méthylcoumarine (AMC)
⎯ 7-amino-4-méthylcoumarine (AMC) 0,021 9 g;
⎯ diméthylsulfoxyde (DMSO), qsp 25 ml.
L'AMC en poudre peut être stockée au réfrigérateur. Peser soigneusement l'AMC et la dissoudre dans du
DMSO dans une fiole jaugée ambrée, en évitant toute exposition à la lumière du jour. La solution ne peut pas
être stockée.
5.2.2 Préparation des solutions de substrats
Les substrats fluorogènes disponibles dans le commerce se présentent sous forme de poudres qui peuvent
être stockées congelées à (−20 ± 2) °C. Le jour de l'utilisation, peser la quantité requise pour une
concentration de 1 000 µmol/l, 2 500 µmol/l ou 2 750 µmol/l dans un volume de 50 ml par exemple, en évitant
toute exposition à la lumière. Peser la poudre dans une fiole jaugée ambrée et compléter le volume avec du
DMSO.
Il convient que le volume soit suffisamment important pour peser et mesurer les volumes de manière fiable. Il
dépend également du nombre de plaques nécessaires.
Les distributeurs couramment utilisés peuvent distribuer simultanément un seul volume (par exemple 40 µl)
dans huit lignes. Pour faciliter l'utilisation de ces instruments d'une bonne précision volumétrique, il convient
de préparer des solutions de substrats de 2 500 µmol/l. Cependant, pour les substrats
4-MUF-β-D-glucopyranoside et 4-MUF-phosphate, une solution d'une concentration de 2 750 µmol/l est
nécessaire pour produire la même concentration finale de 500 µmol/l. Ces deux solutions sont ensuite diluées
simultanément durant l'ajout de l'échantillon; 20 µl de diméthylsulfoxyde sont ajoutés dans les puits de ces
deux substrats pour en faciliter la dissolution. Pour mesurer l'activité de la chitinase, une concentration
inférieure est requise pour éviter toute inhibition du substrat et la préparation d'une solution d'une
concentration de 1 000 µmol/l de 4-MUF-N-acétyl-β-D-glucosaminide peut être utilisée pour produire la
concentration finale de 200 µmol/l.
5.2.3 Préparation des plaques multipuits
Les solutions de substrats et solutions étalons sont introduites dans les plaques multipuits et séchées (par
exemple lyophilisées) sur les plaques directement après distribution. Les plaques sèches peuvent être
stockées à (−20 ± 2) °C pendant une année. Toute exposition à la lumière doit être évitée pendant la
manipulation et le stockage des substrats et des étalons. Une plaque multipuits séparée pour les substrats et
les étalons s'est révélée appropriée.
© ISO 2010 – Tous droits réservés 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
5.2.4 Préparation des plaques étalons
Des mesures répliquées adéquates, par exemple trois à quatre réplicats, sont nécessaires en raison du faible
volume d'échantillon. La normalisation requiert plusieurs concentrations de MUF ou d'AMC en double. Toute
exposition à la lumière doit être évitée pendant la dilution des étalons. Calculer le volume nécessaire en
fonction du nombre d'échantillons et de plaques multipuits préparés. Un exemple de préparation des étalons
couvrant une vaste gamme d'activités enzymatiques est donné ci-après. Toutefois, des modifications peuvent
être apportées en fonction de la gamme d'activités enzymatiques des échantillons étudiés.
La solution mère de MUF d'une concentration de 5 mmol/l est utilisée pour produire les dilutions contenant
1 000 µmol/l, 500 µmol/l, 250 µmol/l, 125 µmol/l, 50 µmol/l, 25 µmol/l et 5 µmol/l de MUF. Dans les plaques
multipuits, distribuer les volumes nécessaires (par exemple 40 ml) aux concentrations de 0 µmol/l, 1,0 µmol/l,
5,0 µmol/l, 10 µmol/l, 25 µmol/l, 50 µmol/l, 100 µmol/l et 200 µmol/l en double. Cette étape est essentielle pour
l'incertitude de mesure.
NOTE 1 Cet ensemble de solutions mères permet d'utiliser des distributeurs automatiques qui permettent d'obtenir une
précision nettement supérieure au pipetage manuel.
La solution mère d'AMC d'une concentration de 5 mmol/l est utilisée pour produire les dilutions contenant
250 µmol/l, 125 µmol/l, 50 µmol/l, 25 µmol/l, 5 µmol/l, 2,5 µmol/l et 0,5 µmol/l d'AMC. Dans les plaques
multipuits, distribuer les volumes nécessaires (par exemple 40 ml) aux concentrations de 0 µmol/l, 0,1 µmol/l,
0,5 µmol/l, 1,0 µmol/l, 5,0 µmol/l, 10 µmol/l, 25 µmol/l et 50 µmol/l en double. Cette étape est essentielle pour
l'incertitude de mesure.
NOTE 2 Cet ensemble de solutions mères permet d'utiliser des distributeurs automatiques qui permettent d'obtenir une
précision nettement supérieure au pipetage manuel.
5.2.5 Préparation des plaques de substrats
Toute exposition à la lumière doit être évitée pendant la dilution des substrats. Lorsque les plaques multipuits
sont utilisées avec des substrats secs d'une concentration finale en substrat de 500 µmol/l et d'un volume
d'échantillon de 200 µl, un volume de 40 µl de la solution à 2 500 µmol/l pour les substrats est ajouté en
double dans les puits. Pour le 4-MUF-β-D-glucopyranoside et le 4-MUF-phosphate, une solution substrat de
2 750 µmol/l est ajoutée en double dans les puits. Pour mesurer l'activité de la chitinase, 40 µl du substrat
4-MUF-N-acétyl-β-D-glucosaminide sont ajoutés sous forme de solution à 1 000 µmol/l pour atteindre une
concentration finale de 200 µmol/l.
Cette concentration a été utilisée pour différents sols, en supposant que le taux de saturation est approximatif.
Lors des essais de validation pour une vaste gamme de sols, il convient de vérifier que les concentrations en
substrats sont appropriées et/ou d'envisager une approche de cinétique enzymatique.
Si une plaque à 96 puits et un distributeur automatique sont utilisés pour huit substrats, alors 12 réplicats sont
disponibles. En cas d'utilisation de quatre réplicats, il est possible d'analyser trois échantillons différents ou
différents taux de dilution sur une plaque.
5.2.6 Séchage des plaques multipuits
La manipulation dépend de l'instrument, par exemple lyophilisateur, utilisé. Toute exposition à la lumière doit
être évitée pendant le traitement des plaques multipuits.
5.2.7 Substrats fluorogènes
1)
Le Tableau 1 dresse une liste des substrats fluorogènes et des étalons disponibles dans le commerce .

1) Glycosynth et Sigma sont des exemples de producteurs de molécules fluorogènes. Cette information est donnée par
souci de commodité à l'intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l'ISO à
l'égard de ces producteurs. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils conduisent aux mêmes
résultats.
4 © ISO 2010 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO/TS 22939:2010(F)
Tableau 1 — Substrats fluorogènes artificiels disponibles dans le commerce
pour mesurer l'activité enzymatique
Enzyme NC-IUBMB Substrat Élément Macromolécule dégradée
(voir Article 3)
Arylsulfatase E.C. 3.1.6.1 4-MUF-sulfate Soufre Minéralisation du soufre
organique
α-Glucosidase E.C. 3.2.1.20 4-MUF-α-D- Carbone Amidon et glycogène
glucopy
...