Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products — Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and maximum growth rate

This document specifies protocols for conducting microbiological challenge tests for growth studies on vegetative and spore-forming bacteria in raw materials and intermediate or end products. The use of this document can be extended to yeasts that do not form mycelium.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologique — Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le temps de latence et le taux de croissance maximal

Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests de croissance sur les bactéries végétatives et sporulées dans les matières premières, les produits intermédiaires ou produits finis. L'utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.

General Information

Status
Published
Publication Date
12-Mar-2019
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
13-Mar-2019
Completion Date
13-Mar-2019
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ISO 20976-1:2019 - Microbiology of the food chain -- Requirements and guidelines for conducting challenge tests of food and feed products
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ISO 20976-1:2019 - Microbiologie de la chaîne alimentaire -- Exigences et lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologique
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20976-1
First edition
2019-03
Microbiology of the food chain —
Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and
feed products —
Part 1:
Challenge tests to study growth
potential, lag time and maximum
growth rate
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des tests d'épreuve microbiologique —
Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le
temps de latence et le taux de croissance maximal
Reference number
ISO 20976-1:2019(E)
ISO 2019
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ISO 20976-1:2019(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2019

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

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Published in Switzerland
ii © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20976-1:2019(E)
Contents Page

Foreword ..........................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 4

4.1 General ........................................................................................................................................................................................................... 4

4.2 Estimation of the growth potential ....................................................................................................................................... 6

4.3 Estimation of the growth kinetics parameters (lag time and maximum growth rate) ............. 7

5 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 7

6 Culture media and reagents ...................................................................................................................................................................... 7

7 Study design and sampling ........................................................................................................................................................................ 8

7.1 General .......................................................................................................................................................................................................... 8

7.2 Setting decision criteria for growth potential .............................................................................................................. 8

7.3 Number of batches and selection criteria ........................................................................................................................ 8

7.4 Preparation of the test units ........................................................................................................................................................ 8

7.5 Number of test units to be inoculated................................................................................................................................. 9

8 Selection of strains ............................................................................................................................................................................................. 9

9 Preparation of the inoculum .................................................................................................................................................................10

9.1 General .......................................................................................................................................................................................................10

9.2 Preparation of the vegetative cell suspensions ........................................................................................................10

9.3 Preparation of the spore suspensions .............................................................................................................................10

10 Inoculation of the tests units ................................................................................................................................................................10

11 Controls .......................................................................................................................................................................................................................11

11.1 Food controls .........................................................................................................................................................................................11

11.2 Control units...........................................................................................................................................................................................11

12 Storage of the test units ..............................................................................................................................................................................12

12.1 General ........................................................................................................................................................................................................12

12.2 Estimation of growth potential ..............................................................................................................................................12

12.3 Estimation of growth kinetics parameters (lag time and growth rate) ..............................................12

13 Analysis .......................................................................................................................................................................................................................12

14 Expression of the results ...........................................................................................................................................................................13

14.1 General ........................................................................................................................................................................................................13

14.2 Growth potential (Δ) .......................................................................................................................................................................13

14.3 Growth kinetics parameters (lag time and growth rate) .................................................................................14

15 Test report ................................................................................................................................................................................................................14

15.1 General ........................................................................................................................................................................................................14

15.2 Aim of the study and type of challenge test ................................................................................................................14

15.3 Experimental protocol ...................................................................................................................................................................15

15.4 Sample analysis ...................................................................................................................................................................................15

15.5 Results .........................................................................................................................................................................................................15

15.6 Conclusions .............................................................................................................................................................................................16

15.7 Reference documents .....................................................................................................................................................................16

Annex A (informative) Inter-batch variability assessment based on pH and a .................................................17

Annex B (normative) Minimum number of units to prepare for the challenge test study ........................18

Annex C (informative) Examples of protocols to prepare inocula ......................................................................................19

© ISO 2019 – All rights reserved iii
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ISO 20976-1:2019(E)
Annex D (informative) Examples of how to estimate growth potential, lag time and

maximum growth rate from results of challenge tests ..............................................................................................22

Annex E (informative) Use of simulation to assess a microbial population under different

temperature conditions .............................................................................................................................................................................26

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................27

iv © ISO 2019 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 20976-1:2019(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso

.org/iso/foreword .html.

This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,

Microbiology.
A list of all the parts in the ISO 20976 series can be found on the ISO website.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/members .html.
© ISO 2019 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 20976-1:2019(E)
Introduction

Under the general principles of the Codex Alimentarius on food hygiene, it is the responsibility of food

business operators (FBOs) to control microbiological hazards in foods and to manage microbial risks.

[11]

Therefore, FBOs implement validated control measures within the hazard analysis and critical

control point (HACCP) system, and conduct studies in order to investigate compliance with the food

safety criteria throughout the food chain.

In the framework of microbial risk assessment (MRA), several complementary approaches are developed

to estimate risks posed by pathogens or spoilage microorganisms in the food chain. MRA is adopted by

regulators under the auspices of the international agency for setting food standards. Challenge testing

is one of the recognized approaches used to validate control measures within the HACCP system, as

well as to assess microbiological safety and quality of food, food production processes, food storage

conditions and food preparation recommendations for consumers.

This document provides technical rules, calculations and approaches to investigate the ability of

inoculated microorganism(s) of concern to grow, survive or be inactivated in raw materials and

intermediate or end products under reasonably foreseeable food processes, storage and use conditions.

The objective and the scope of the document are to determine the experimental design and the selection

of the study conditions. Regulatory authorities can have different recommendations, and these

differences have been included as much as possible. It is, however, possible that specific requirements

should be incorporated to get regulatory approval of the challenge test.

As growth and inactivation kinetics are clearly different, the ISO 20976 series consists of two parts,

under the general title, Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for conducting

challenge tests of food and feed products:

— Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and maximum growth rate

— Part 2: Challenge tests to study inactivation potential and kinetics parameters (to be developed)

The use of the ISO 20976 series involves expertise in relevant areas, such as food microbiology, food

science, food processing and statistics. The statistical expertise encompasses an understanding of

sampling theory and design of experiments, statistical analysis of microbiological data and overview

of scientifically recognized and available mathematical concepts used in predictive modelling. Even

though many mathematical models are available to describe and predict bacterial growth, the gamma-

[22]

concept (γ-concept) is particularly useful for further simulations using the data generated from

the challenge test, e.g. to assess the growth at storage temperatures other than the one(s) tested, or in

helping to design better food formulations and storage conditions, and thus improving the microbial

quality and/or safety of the food under consideration.
For practical reasons, the term “food” includes feed.
vi © ISO 2019 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20976-1:2019(E)
Microbiology of the food chain — Requirements and
guidelines for conducting challenge tests of food and feed
products —
Part 1:
Challenge tests to study growth potential, lag time and
maximum growth rate
1 Scope

This document specifies protocols for conducting microbiological challenge tests for growth studies on

vegetative and spore-forming bacteria in raw materials and intermediate or end products.

The use of this document can be extended to yeasts that do not form mycelium.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for

microbiological examinations

ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and

performance testing of culture media
ISO 18787:2017, Foodstuffs — Determination of water activity
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
3.1
bacterial spore
resistant form of bacteria that is dormant until the germination (3.9) step
3.2
batch

group or set of identifiable food obtained through a given process under practically identical

circumstances and produced in a given place within one defined production period

Note 1 to entry: The batch is determined by parameters established beforehand by the organization and may be

described by other terms, e.g. lot.
[SOURCE: Commission Regulation (EC) No 2073/2005]
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 20976-1:2019(E)
3.3
cardinal value

estimated minimal, optimal and maximal values of physico-chemical factors (e.g. temperature, pH, a )

that characterize the growth of a given microbial strain
3.4
control unit

unit of food identical to the test unit (3.24) but not artificially contaminated (used as a blank)

3.5
challenge test

study of the growth or inactivation of microorganism(s) artificially inoculated in food

3.6
experimental datapoint

result of analysis of a test unit (3.24) per unit weight (log cfu/g), per unit volume (log cfu/ml), or per

10 10
unit area (log cfu/cm )

Note 1 to entry: For specific cases, the enumeration results may be expressed in log MPN.

3.7
exponential growth phase

phase in which the microbial population is exponentially multiplying as rapidly as possible; growth is

dependent on the growth medium and environment (temperature, humidity, etc.)

Note 1 to entry: Figure 1 describes the three phases of microbial growth kinetics.

3.8
generation time

time it takes for the microorganisms to increase by a factor 2, also known as doubling time

3.9
germination

mechanism in which a bacterial spore (3.1) starts becoming a vegetative cell (3.25)

3.10
growth potential

difference between the decimal logarithm of the highest concentration of the target microbial population

(log ) and the decimal logarithm of the initial concentration of this microbial population (log )

max i

Note 1 to entry: The log and log refer to concentrations and are expressed in log cfu/g or log cfu/ml or

max i 10 10
log cfu/cm
3.11
maximum growth rate

kinetics parameter to characterize the exponential growth phase (3.7), represented by the slope of

the curve showing the evolution of the natural logarithm (μ ) or decimal logarithm (V ) of the

max max
population as a function of time, under constant growth conditions
3.12
inoculum

microbial suspension at the desired concentration used to contaminate test units (3.24)

3.13
lag phase

phase, directly after inoculation, during which the microbial population is adapting to the environment,

before it enters the exponential growth phase (3.7)

Note 1 to entry: Figure 1 describes the three phases of microbial growth kinetics.

2 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 20976-1:2019(E)
3.14
lag time
kinetics parameter in time unit to characterize the lag phase (3.13)
3.15
pH value

measure of the concentration of acidity or alkalinity of a material in an aqueous solution

[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modified — Notes 1 and 2 to entry have been removed.]

3.16
primary model

mathematical model describing the changes of microbial counts as a function of time

3.17
organizing laboratory
laboratory with responsibility for managing the challenge tests (3.5)
3.18
sampling

selection of one or more units or portions of food such that the units or portions selected are

representative of that food
3.19
sampling point

time at which the test units (3.24) are analysed and which are represented as experimental datapoints

(3.6) on the kinetics graph
3.20
secondary model

mathematical model describing the effects of the environmental factors (e.g. temperature, pH, a ) on

the parameters of the primary model (3.16) (e.g. growth rate)
3.21
sporulation
mechanism by which vegetative cell (3.25) forms spore
3.22
stationary phase
phase in which the microbial population is at its maximum level

Note 1 to entry: Figure 1 describes the three phases of microbial growth kinetics.

3.23
test portion

measured (volume or mass) representative sample taken from the test unit (3.24) for use in the analysis

[SOURCE: ISO 6887-1:2017, 3.5, modified — The end of the definition has been changed from “taken

from the laboratory sample for use in the preparation of the initial suspension” and the Note 1 to entry

has been removed.]
3.24
test unit
measured (volume or mass) amount of the food used for inoculation
3.25
vegetative cell

state of microbial form that is capable of growing under favourable environmental conditions

© ISO 2019 – All rights reserved 3
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ISO 20976-1:2019(E)
3.26
water activity

ratio of the water-vapour pressure in the foodstuff to the vapour pressure of pure water at the same

temperature

[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1, modified — The definition has been condensed and the formula and

Notes 1 and 2 to entry have been removed.]
4 Principle
4.1 General

The aim of the study shall be clearly defined (e.g. assessment/validation of the food shelf-life as a control

measure, assessment of microbial stability). The experimental design shall be in accordance with that

purpose and shall take into account the steps of the food chain for which microbial growth is assessed.

The decision criteria shall be clearly defined (see 7.2).

Knowledge from the FBO on its products (e.g. characteristics or production process) shall be combined

with expertise in food microbiology and analytical sciences to ensure the robustness of the study. The

organizing laboratory shall have knowledge and skills in food microbiology, food science and technology,

and statistics to design and conduct the studies, interpret the results and draw the conclusions. The

analyses shall be conducted under a quality assurance system (e.g. in accordance with ISO/IEC 17025).

Challenge tests aim at studying the growth potential or growth kinetics (lag time and maximum

growth rate) in order to assess, for example, the food shelf-life as a control measure or the microbial

stability of a food.
Growth potential studies are most appropriate to:

— validate the microbiological shelf-life of a food under reasonably foreseeable conditions of use and

storage between production and consumption, ensuring relevant microbiological criteria are met

throughout the product shelf-life;

— assess if a product, tested under specific conditions, supports the growth of the inoculated

microorganism.

Such challenge tests will only validate the specific food characteristics and conditions applied for the

study. When microbiological criteria are not fulfilled or conditions (e.g. food formulation, physico-

chemical characteristics, type and/or concentration of preservatives added, packaging, storage

temperature) are changed, a new growth potential study needs to be carried out in order to validate

the new conditions.
Growth kinetics studies are most appropriate for:

— assessing the effect(s) of intrinsic (e.g. pH, a , preservatives) and extrinsic characteristics (e.g.

gas composition, temperature) that have a significant impact on the behaviour of the target

microorganism;

— providing data for developed models to simulate the effect of such factors on microbial behaviour in

the studied food under reasonably foreseeable storage conditions (time and temperature);

— comparing the simulation results to ensure that relevant microbiological criteria are met throughout

the food shelf-life.

Growth kinetics studies are used to estimate and validate the microbiological shelf-life of a food.

They are particularly suitable in the last steps of the food development, including reformulation, new

packaging, and alternative processing conditions.
4 © ISO 2019 – All rights reserved
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ISO 20976-1:2019(E)

A growth kinetics study can be more informative than a growth potential study. However, growth

kinetics studies are more complex in terms of study design, execution, results interpretation and

exploitation, particularly in cases where various factors are included.

The behaviour of a microbial population in a food, i.e. microbial growth kinetics, is dependent on the

characteristics of the food (e.g. a , pH, preservatives concentrations), the food storage conditions

(temperature, packaging format and gas composition), the food processes, the physiological state of the

microorganism and interactions with the natural background microorganisms.
Microbial growth kinetics are defined by three major phases (see Figure 1).

a) Lag phase: This phase is characterized by the lag time (λ), which corresponds to the intersection

between the exponential growth phase line (plotted in semi-log coordinates) and the horizontal

[15][18]

line crossing through the initial cell concentration . For spore-forming microorganisms, lag

time includes spore germination and outgrowth.

Lag time is dependent on the food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological),

inoculation levels and storage conditions (e.g. temperature, relative humidity, gas composition).

Lag time is also dependent on the physiological state of the microorganism contaminating the food

and any stress experienced by these cells or spores.

b) Exponential growth phase: This phase is characterized by the growth rate (µ or V ), which

max max

corresponds to the maximum increase in natural or decimal logarithm of cell number per unit of time.

The growth rate corresponds to the slope of the curve showing the evolution of the natural

logarithm (µ ) or decimal logarithm (V ) of the population over time during the exponential

max max

phase. The food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological) and storage conditions

(e.g. temperature, relative humidity, gas composition) can significantly influence microbial growth

rates. The growth rate of a microbial population is unaffected by its initial concentration and

physiological states.
The relationship between the generation time (Tg) and µ is given by Formula (1):
max
μ =ln 2 /Tg (1)
max

The slope of the curve plotting the log of the microbial population against time, V , and its

10 max
relationship to maximum growth rate is given by Formula (2):
μ =⋅V ln 10 (2)
maxmax

c) Stationary phase: In this phase, the microbial population is at its maximum level.

© ISO 2019 – All rights reserved 5
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ISO 20976-1:2019(E)
Key
Y log (cfu/g)
X time (days)
1 lag phase
2 exponential growth phase
3 stationary phase
Figure 1 — Microbial growth kinetics with three major phases
4.2 Estimation of the growth potential

The food characteristics (e.g. physico-chemical and microbiological) and storage conditions (e.g.

temperature, relative humidity, gas composition) can significantly influence the microbial growth

potential.

The inoculum shall be adapted to conditions that mimic the microbial cell or spore injury induced by

food handling/processing or any phenomena that can trigger subsequent adaptive responses to growth

conditions, in order to mimic natural microbial behaviour in the food.

This type of test is designed to estimate the changes in concentration of the microbial population during

the challenge test. These tests can be used to determine whether there is significant microbial growth

in a foodstuff and to quantify the increase in the microbial population under a given set of storage

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20976-1
Première édition
2019-03
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Exigences et lignes
directrices pour la réalisation des
tests d'épreuve microbiologique —
Partie 1:
Tests de croissance pour étudier le
potentiel de croissance, le temps
de latence et le taux de croissance
maximal
Microbiology of the food chain — Requirements and guidelines for
conducting challenge tests of food and feed products —
Part 1: Challenge tests to study growth potential, lag time and
maximum growth rate
Numéro de référence
ISO 20976-1:2019(F)
ISO 2019
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ISO 20976-1:2019(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

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y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 20976-1:2019(F)
Sommaire Page

Avant-propos ................................................................................................................................................................................................................................v

Introduction ................................................................................................................................................................................................................................vi

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 4

4.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 4

4.2 Estimation du potentiel de croissance ............................................................................................................................... 6

4.3 Estimation des paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux

de croissance maximal) ................................................................................................................................................................... 7

5 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 7

6 Milieux de culture et réactifs ................................................................................................................................................................... 8

7 Plan de l’étude et échantillonnage ..................................................................................................................................................... 8

7.1 Généralités .................................................................................................................................................................................................. 8

7.2 Définition des critères de décision concernant le potentiel de croissance ......................................... 8

7.3 Nombre de lots et critères de sélection ............................................................................................................................. 8

7.4 Préparation des unités pour essai .......................................................................................................................................... 9

7.5 Nombre d’unités pour essai à inoculer .............................................................................................................................. 9

8 Choix des souches ................................................................................................................................................................................................ 9

9 Préparation de l’inoculum.......................................................................................................................................................................10

9.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................10

9.2 Préparation des suspensions de cellules végétatives .........................................................................................10

9.3 Préparation des suspensions de spores .........................................................................................................................11

10 Inoculation des unités pour essai ....................................................................................................................................................11

11 Témoins .......................................................................................................................................................................................................................12

11.1 Aliments témoins ...............................................................................................................................................................................12

11.2 Unités témoins ......................................................................................................................................................................................12

12 Conservation des unités pour essai ...............................................................................................................................................12

12.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................12

12.2 Estimation du potentiel de croissance ............................................................................................................................13

12.3 Estimation des paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux

de croissance) .......................................................................................................................................................................................13

13 Analyse .........................................................................................................................................................................................................................13

14 Expression des résultats............................................................................................................................................................................14

14.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................14

14.2 Potentiel de croissance (Δ) ........................................................................................................................................................14

14.3 Paramètres de la cinétique de croissance (temps de latence et taux de croissance) ..............14

15 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................15

15.1 Généralités ...............................................................................................................................................................................................15

15.2 Objectif de l’étude et type de test de croissance .....................................................................................................15

15.3 Protocole expérimental ................................................................................................................................................................15

15.4 Analyse d’échantillon .....................................................................................................................................................................16

15.5 Résultats ....................................................................................................................................................................................................16

15.6 Conclusions .............................................................................................................................................................................................17

15.7 Documents de référence ..............................................................................................................................................................17

Annexe A (informative) Évaluation de la variabilité inter-lots prenant en compte le pH et l’a ........18

Annexe B (normative) Nombre minimum d’unités à préparer pour l’étude du test de croissance .19

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ISO 20976-1:2019(F)

Annexe C (informative) Exemples de protocoles de préparation des inocula ........................................................20

Annexe D (informative) Exemples de procédures permettant d’estimer le potentiel de

croissance, le temps de latence et le taux de croissance maximal à partir des tests

de croissance .........................................................................................................................................................................................................23

Annexe E (informative) Utilisation de la simulation pour évaluer une population

microbienne pour différentes conditions de température ...................................................................................27

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................28

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ISO 20976-1:2019(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/directives).

L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/iso/fr/avant -propos.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-

comité SC 9, Microbiologie.

Une liste de toutes les parties de la série ISO 20976 se trouve sur le site web de l’ISO.

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/fr/members .html.
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ISO 20976-1:2019(F)
Introduction

Selon les principes généraux du Codex Alimentarius sur l’hygiène alimentaire, il est de la responsabilité

des exploitants du secteur alimentaire de maîtriser les dangers microbiologiques dans les aliments

et de gérer les risques microbiens. Par conséquent, l’exploitant du secteur alimentaire doit mettre en

[11]

place des mesures de maîtrise validées, au sein du système HACCP (analyse des dangers et points

critiques pour leur maîtrise), et conduire des études afin d’évaluer la conformité aux critères de sécurité

alimentaire tout au long de la chaîne alimentaire.

Dans le cadre de l’évaluation des risques microbiens, plusieurs approches complémentaires sont

développées afin d’estimer les risques posés par les microorganismes pathogènes ou d’altération

dans la chaîne alimentaire. L’évaluation des risques microbiens est adoptée par les organismes de

réglementation sous les auspices de l’agence internationale chargée des normes alimentaires. Le test

de croissance fait partie des approches reconnues utilisées pour valider les mesures de maîtrise au sein

du système HACCP, ainsi que pour évaluer la sécurité microbiologique et la qualité des aliments, les

procédés de production alimentaire, les conditions de stockage des aliments et les recommandations

relatives à la préparation des aliments pour les consommateurs.

Le présent document fournit les règles techniques, calculs et approches pour l’évaluation de la capacité

des microorganismes inoculés à croître, survivre ou être inactivés dans les matières premières, les

produits intermédiaires ou produits finis pendant toute la durée de conservation des produits soit

dans des conditions de transformation, de distribution, d’entreposage et d’utilisation des aliments

raisonnablement prévisibles. L’objectif et le domaine d’application du document sont la détermination

du plan expérimental et la sélection des conditions de l’étude. Les autorités réglementaires peuvent

avoir des recommandations différentes et ces différences ont été incluses dans la mesure du

possible. Toutefois, il convient parfois d’intégrer des exigences spécifiques pour obtenir l’approbation

réglementaire du test de croissance.

Les cinétiques de croissance et d’inactivation étant clairement différentes, la série ISO 20976 est

constituée de deux parties, sous le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et

lignes directrices pour la réalisation des tests d’épreuve microbiologique:

— Partie 1: Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance, le temps de latence et le taux de

croissance maximal

— Partie 2: Tests d’inactivation pour étudier le potentiel d’inactivation et les paramètres de cinétique

(à venir)

L’utilisation de la série ISO 20976 nécessite une expertise dans les secteurs pertinents tels que la

microbiologie des aliments, la science des aliments, la transformation des aliments et les statistiques.

L’expertise statistique englobe la compréhension de la théorie d’échantillonnage et des plans

d’expérience, l’analyse statistique des données microbiologiques et une vue d’ensemble des concepts

mathématiques scientifiquement reconnus et disponibles employés en microbiologie prévisionnelle.

Même si de nombreux modèles mathématiques sont disponibles pour décrire et prévoir la croissance

[22]

bactérienne, le concept gamma (concept γ) est particulièrement utile pour la réalisation de

simulations en utilisant les données générées à partir du test de croissance, par exemple pour évaluer

la croissance à des températures de conservation autres que celles soumises à essai, ou pour aider à

concevoir de meilleures formulations et conditions de conservation des aliments, et ainsi améliorer la

qualité microbienne et/ou la sécurité de l’aliment considéré.

Pour des raisons pratiques, le terme «aliment» inclut l’alimentation humaine et animale.

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NORME INTERNATIONALE ISO 20976-1:2019(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Exigences et
lignes directrices pour la réalisation des tests d'épreuve
microbiologique —
Partie 1:
Tests de croissance pour étudier le potentiel de croissance,
le temps de latence et le taux de croissance maximal
1 Domaine d’application

Le présent document spécifie les protocoles de mise en œuvre de tests de croissance sur les bactéries

végétatives et sporulées dans les matières premières, les produits intermédiaires ou produits finis.

L’utilisation du présent document peut être étendue aux levures qui ne forment pas de mycélium.

2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations

ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation, production,

stockage et essais de performance des milieux de culture

ISO 18787:2017, Produits agricoles et alimentaires — Détermination de l'activité de l'eau

3 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp;

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/.
3.1
spore bactérienne

forme de résistance prise par certaines bactéries qui reste en état de dormance jusqu’à l’étape de

germination (3.9)
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ISO 20976-1:2019(F)
3.2
lot

groupe ou série de produits identifiables obtenus par un procédé donné dans des conditions

pratiquement identiques et produits dans un endroit donné et au cours d’une période de production

déterminée

Note 1 à l'article: Le lot est déterminé par des paramètres établis au préalable par l’organisation et il peut être

décrit par d’autres termes.
[SOURCE: Règlement (CE) n 2073/2005 de la Commission]
3.3
valeur cardinale

valeurs minimale, optimale et maximale d’un paramètre physico-chimique (par exemple, température,

pH, a ) caractérisant la croissance d’une souche microbienne donnée
3.4
unité témoin

unité d’aliment identique à l’unité pour essai (3.24), mais qui n’est pas contaminée artificiellement

(utilisée comme blanc)
3.5
test d’épreuve microbiologique

étude de la croissance ou étude de l’inactivation d’un ou plusieurs microorganismes inoculés

artificiellement dans un aliment, la première s’effectuant lors d’un test de croissance, la seconde lors

d’un test d’inactivation
3.6
point expérimental

résultat d’analyse d’une unité pour essai (3.24) par unité de poids (log ufc/g), par unité de volume

(log ufc/ml) ou par unité de surface (log ufc/cm )
10 10

Note 1 à l'article: Pour des cas spécifiques, les résultats de dénombrement peuvent être exprimés en log NPP.

3.7
phase de croissance exponentielle

phase dans laquelle la population microbienne se multiplie exponentiellement aussi rapidement que

possible; la croissance dépend du milieu et de l’environnement de croissance (température, humidité, etc.)

Note 1 à l'article: La Figure 1 décrit les trois phases de la cinétique de croissance microbienne.

3.8
temps de génération

temps nécessaire à la multiplication par 2 des microorganismes, également désigné par temps de

doublement
3.9
germination

mécanisme dans lequel une spore bactérienne (3.1) germe pour devenir une cellule végétative (3.25)

3.10
potentiel de croissance

différence entre le logarithme décimal de la concentration la plus élevée de la population microbienne

cible (log ) et le logarithme décimal de la concentration initiale de cette population microbienne (log )

max i

Note 1 à l'article: Le log et le log font référence à des concentrations et sont exprimés en log ufc/g ou

max i 10
log ufc/ml ou log ufc/cm .
10 10
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ISO 20976-1:2019(F)
3.11
taux de croissance maximal

paramètre de cinétique caractérisant la phase de croissance exponentielle (3.7), représenté par la pente

de la courbe montrant l’évolution du logarithme naturel (μ ) ou du logarithme décimal (V ) de la

max max
population en fonction du temps, dans des conditions de croissance constantes
3.12
inoculum

suspension microbienne à la concentration souhaitée utilisée pour contaminer les unités pour essai (3.24)

3.13
phase de latence

phase, directement après l’inoculation, durant laquelle la population microbienne s’adapte à

l’environnement, avant d’entrer en phase de croissance exponentielle (3.7)

Note 1 à l'article: La Figure 1 décrit les trois phases de la cinétique de croissance microbienne.

3.14
temps de latence

paramètre de cinétique en unité de temps qui caractérise la phase de latence (3.13)

3.15
valeur de pH

mesure de la concentration d’acidité ou de basicité d’un matériau en solution aqueuse

[SOURCE: ISO 5127:2017, 3.12.2.29, modifié — Les Notes 1 et 2 à l’article ont été supprimées.]

3.16
modèle primaire

modèle mathématique décrivant les changements du dénombrement de la population microbienne en

fonction du temps
3.17
laboratoire organisateur

laboratoire ayant la responsabilité de gérer les tests d'épreuve microbiologique (3.5)

3.18
échantillonnage

sélection d’une ou plusieurs unités ou portions d’aliment, de telle sorte que les unités ou portions

sélectionnées sont représentatives de cet aliment
3.19
point d’échantillonnage

moment auquel les unités pour essai (3.24) sont analysées et qui est représenté en tant que point

expérimental (3.6) sur le graphique de cinétique
3.20
modèle secondaire

modèle mathématique décrivant les effets des facteurs environnementaux (par exemple, température,

pH, a ) sur les paramètres du modèle primaire (3.16) (par exemple, le taux de croissance)

3.21
sporulation
mécanisme par lequel une cellule végétative (3.25) forme une spore
3.22
phase stationnaire
phase dans laquelle la population microbienne est à son niveau maximal

Note 1 à l'article: La Figure 1 décrit les trois phases de la cinétique de croissance microbienne.

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3.23
prise d’essai

échantillon représentatif mesuré (volume ou masse) et prélevé sur l’unité pour essai (3.24) pour servir

à l’analyse

[SOURCE: ISO 6887‑1:2017, 3.5, modifié — La fin de la définition, «sur l’échantillon pour laboratoire pour

servir à la préparation de la suspension mère», a été modifiée, et la Note 1 à l’article a été supprimée.]

3.24
unité pour essai
quantité (volume ou masse) mesurée de l’aliment utilisé pour l’inoculation
3.25
cellule végétative

état d’une forme microbienne qui est capable de croître dans des conditions environnementales

favorables
3.26
activité de l’eau

rapport entre la pression de vapeur d’eau dans la denrée alimentaire et la pression de vapeur de l’eau

pure à la même température

[SOURCE: ISO 18787:2017, 3.1, modifié — La définition a été condensée, et la formule et les Notes 1 et 2

à l’article ont été supprimées.]
4 Principe
4.1 Généralités

L’objectif de cette étude doit être clairement défini (par exemple, évaluation/validation de la durée de

conservation de l’aliment en tant que mesure de maîtrise, évaluation de la stabilité microbienne). Le

plan expérimental doit être en conformité avec cet objectif et doit tenir compte des étapes de la chaîne

alimentaire pour lesquelles la croissance microbienne est évaluée. Les critères de décision doivent être

clairement définis (voir 7.2).

La connaissance de l’exploitant du secteur alimentaire concernant ses produits (par exemple,

caractéristiques ou procédé de production) doit être combinée avec l’expertise en microbiologie des

aliments et sciences analytiques pour garantir la robustesse de l’étude. Le laboratoire organisateur doit

avoir des connaissances et compétences en microbiologie des aliments, sciences et technologies des

aliments, ainsi qu’en statistique pour concevoir et conduire les études, interpréter les résultats et tirer

les conclusions. Les analyses doivent être conduites dans le cadre d’un système d’assurance qualité (par

exemple, conformément à l’ISO/IEC 17025).

Les tests de croissance visent à étudier le potentiel de croissance ou la cinétique de croissance (temps

de latence et taux de croissance maximal), afin d’évaluer par exemple la durée de conservation de

l’aliment en tant que mesure de maîtrise, ou la stabilité microbienne d’un aliment.

Les études du potentiel de croissance sont particulièrement appropriées pour:

— valider la durée de conservation microbiologique d’un aliment dans des conditions raisonnablement

prévisibles d’utilisation et de conservation entre la production et la consommation, en garantissant

que les critères microbiologiques pertinents sont satisfaits tout au long de la durée de conservation

du produit;

— évaluer si un produit, soumis à essai dans des conditions spécifiques, permet la croissance du

microorganisme inoculé.

Un potentiel de croissance ne sera valide que pour les caractéristiques spécifiques de l’aliment et

les conditions appliquées pour l’étude. Si les critères microbiologiques ne sont pas satisfaits ou si

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ISO 20976-1:2019(F)

les conditions (par exemple, formulation de l’aliment, caractéristiques physico-chimiques, type et/

ou concentration des conservateurs ajoutés, conditionnement, température de conservation) sont

modifiées, une nouvelle étude du potentiel de croissance doit être conduite afin de valider ces nouvelles

conditions.
Les études de cinétique de croissance sont particulièrement appropriées pour:

— évaluer le ou les effets des caractéristiques intrinsèques (par exemple, pH, a , conservateurs) et

extrinsèques (par exemple, composition en gaz, température) ayant un impact significatif sur le

comportement du microorganisme cible;

— fournir des données pour les modèles développés pour simuler l’impact de ces facteurs sur le

comportement microbien dans l’aliment étudié pour des conditions de conservation raisonnablement

prévisibles (temps et température);

— comparer les résultats de simulation pour garantir que les critères microbiologiques pertinents

sont satisfaits tout au long de la durée de conservation de l’aliment.

Les études de cinétique de croissance sont utilisées pour estimer et valider la durée de conservation

microbiologique d’un aliment. Elles sont particulièrement adaptées dans les dernières étapes du

développement d’un aliment, y compris la reformulation, un nouveau conditionnement et d’autres

conditions de transformation.

Une étude de cinétique de croissance peut fournir davantage d’informations qu’une étude de potentiel

de croissance. Toutefois, les études de cinétique de croissance sont plus complexes en termes de plan de

l’étude, d’exécution, d’interprétation et d’exploitation des résultats, en particulier dans le cas où divers

facteurs sont inclus.

Le comportement d’une population microbienne dans un aliment, c’est-à-dire la cinétique de croissance

du microorganisme, dépend des caractéristiques de l’al
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.