ISO 11816-2:2024
(Main)Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase activity — Part 2: Fluorimetric method for cheese
Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase activity — Part 2: Fluorimetric method for cheese
This document specifies a fluorimetric method for the determination of alkaline phosphatase (ALP) (EC 3.1.3.1) activity in cheese. This method is applicable to soft cheeses, semi-hard and hard cheeses provided that the mould is only on the surface of the cheese and not also in the inner part (e.g. blue veined cheeses). For large hard cheeses, specific conditions of sampling apply (see Clause 7). The instrument used for the determination of ALP can read activities in the supernatant up to 7 000 milliunits per litre (mU/kg).
Lait et produits laitiers — Détermination de l'activité de la phosphatase alcaline — Partie 2: Méthode fluorimétrique pour le fromage
Le présent document spécifie une méthode fluorimétrique de détermination de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) (EC 3.1.3.1) dans le fromage. La présente méthode est applicable aux fromages à pâte molle, pâte pressée non cuite et pâte pressée cuite, à condition que la moisissure ne soit présente que sur la surface du fromage et ne se soit pas propagée à l’intérieur, comme dans le cas des fromages veinés de bleu, par exemple. Pour les gros fromages à pâte pressée cuite, des conditions d’échantillonnage spécifiques s’appliquent (voir l’Article 7). L’instrument utilisé pour la détermination de l’ALP peut lire des activités jusqu’à 7 000 mU/kg (milliunités par kilogramme).
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 11816-2
IDF 155-2
Third edition
Milk and milk products —
2024-01
Determination of alkaline
phosphatase activity —
Part 2:
Fluorimetric method for cheese
Lait et produits laitiers — Détermination de l'activité de la
phosphatase alcaline —
Partie 2: Méthode fluorimétrique pour le fromage
Reference numbers
IDF 155-2:2024(en) © ISO and IDF 2024
IDF 155-2:2024(en)
© ISO and IDF 2024
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Published in Switzerland
ii
IDF 155-2:2024(en)
Contents Page
Forewords .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling . 4
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure . 5
9.1 Verification of instrument performance .5
9.1.1 General .5
9.1.2 Daily instrument tests .5
9.1.3 Using FLM200 .5
9.1.4 Using FLM300 .5
9.1.5 Controls .6
9.2 Reagent controls to test the suitability of ready-to-use working substrate (5.3) .6
9.3 Calibration .6
9.3.1 General .6
9.3.2 Using FLM200 .7
9.3.3 Using FLM300 .7
9.4 Determination .7
9.5 Test-sample-related controls .8
9.5.1 Recommended negative and positive control tests .8
9.5.2 Interfering substance test .9
9.5.3 Heat-stable microbial ALP control test .9
10 Calculation and expression of results . 9
10.1 Calibration ratio .9
10.2 Calculation .10
10.2.1 Supernatant .10
10.2.2 Cheese .10
10.3 Expression of test results.10
11 Precision .11
11.1 Interlaboratory study .11
11.2 Repeatability .11
11.3 Reproducibility .11
12 Test report .11
Annex A (informative) Interlaboratory study .12
Annex B (informative) Examples of preparation of a test sample . 14
Bibliography .16
iii
IDF 155-2:2024(en)
Forewords
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
https://www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF), in collaboration with the European
Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 302, Milk and milk products — Methods
of sampling and analysis, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO and CEN
(Vienna Agreement). It is being published jointly by ISO and IDF.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 11816-2 | IDF 155-2:2016), which has been
technically revised.
The main changes are as follows:
— the FLM200 instrument (which has been discontinued) has been replaced by the FLM300 version;
— the instructions for use of the instrument and the flow of those instructions have been revised in
accordance with FLM300, which has an upgraded user interface and electronics (there has been no
change to the assay or the test procedure with the changes to the interface and software);
— the instrument now includes the heater block which was a separate item previously.
A list of all parts in the ISO 11816 | IDF 155 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
IDF 155-2:2024(en)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national interest
groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and governments/
food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis and
sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International Standards
using the logos and reference numbers of both organizations.
IDF draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). IDF takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, IDF had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Processing Aids
and Indicators and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products. It is being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the IDF/ISO Action Team P19 of the Standing Committee on Analytical Methods
for Processing Aids and Indicators under the aegis of its project leader Mr Rick Zampa (US).
v
International Standard
IDF 155-2:2024(en)
Milk and milk products — Determination of alkaline
phosphatase activity —
Part 2:
Fluorimetric method for cheese
1 Scope
This document specifies a fluorimetric method for the determination of alkaline phosphatase (ALP)
(EC 3.1.3.1) activity in cheese.
This method is applicable to soft cheeses, semi-hard and hard cheeses provided that the mould is only on the
surface of the cheese and not also in the inner part (e.g. blue veined cheeses). For large hard cheeses, specific
conditions of sampling apply (see Clause 7).
The instrument used for the determination of ALP can read activities in the supernatant up to 7 000 milliunits
per litre (mU/kg).
2 Normative references
There are no normative references in this document.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1
alkaline phosphatase activity
ALP activity
activity of the enzyme present in the product, determined by the specified procedure
Note 1 to entry: The ALP activity is expressed as milliunits of enzyme activity per gram of sample (mU/kg).
4 Principle
The ALP activity of the sample is measured by a continuous fluorimetric direct kinetic assay. A non-
fluorescent aromatic monophosphoric ester substrate, 2′-[2-benzothiazolyl]-6′-hydroxybenzothiazole
phosphate, in the presence of any ALP derived from the sample, undergoes hydrolysis of its phosphate
radical, producing a highly fluorescent product. Fluorimetric measurement of ALP activity is measured at
IDF 155-2:2024(en)
®1)
38 °C over a 3 min period when using a Fluorophos . This includes pre-incubation of substrate and sample,
followed by multiple kinetic readings of the reaction rate.
NOTE Although this is a 3 min test, the first minute is an equilibration period to ensure that the sample is at 38 °C.
Measurements of activity are actually made from the beginning of the second minute to the end of the third minute
(i.e. over a 2 min period).
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
The reagents specified in 5.1 to 5.7 and the apparatus specified in 6.1 to 6.4 (except 6.3.1) comprise the
2) ®
Fluorophos Test System . The manufacturer can change the packaging configurations supplied with ®
Fluorophos Test system. The user should refer to the manufacturer’s instructions for preparing reagents if
different from those specified herein.
® ®
5.1 Fluorophos substrate, in bottles, each containing 144 mg of Fluorophos substrate powder, molar
mass of 580 g/mol.
This is a non-fluorescent aromatic monophosphoric ester substrate, 2′-[2-benzothiazolyl]-6′-
hydroxybenzothiazole phosphate.
This substrate remains stable for two years from the date of manufacture, provided it is stored in unopened
bottles at between 2 °C and 8 °C. Protect against light.
5.2 Substrate buffer solution, diethanolamine (DEA) buffer solution, c(DEA) = 2,4 mol/l, with pH-
value 10,0.
The substrate buffer solution remains stable for two years from the date of manufacture, provided it is
stored in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C. Protect against light.
5.3 Working substrate. ®
Allow the Fluorophos substrate (5.1) and the substrate buffer solution (5.2) to come to room temperature. ®
Add the content of one bottle of substrate buffer solution (240 ml) (5.2) to that of one bottle of Fluorophos
substrate (144 mg) (5.1) and mix well by inversion for 3 min. Use amber glass to protect against light.
Allow the obtained solution to stand at room temperature for at least 30 min prior to use.
Use the analogue-to-digital (A/D) test given in 9.1.3 to test the suitability of the ready-to-use working
substrate. Do not use the working substrate if a reading above 1 200 FLU (fluorescence units) is obtained.
The working substrate remains stable for 60 days when protected from light and stored at between 2 °C and
8 °C, or for 6 h when stored at 38 °C. ®
1) Fluorophos is the registered trademark of a product supplied by Advanced Instruments, LLC. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product
named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results. ®
2) The Fluorophos Test System is the trade name of a product supplied by Advanced Instruments, LLC. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
IDF 155-2:2024(en)
®3)
5.4 Calibrator solutions, Fluoroyellow (FY) [2′-(2-benzothiazolyl)-6′-hydroxybenzothiazole] in
substrate buffer solution (5.2).
The calibrator solutions remain stable for 18 months from the date of manufacture, provided they are stored
in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C.
Mix gently prior to use to ensure optimal results. ®
5.4.1 Calibrator solution A, containing 0 μmol/l of Fluoroyellow .
−3 ®
5.4.2 Calibrator solution B, containing 17,24 × 10 μmol/l of Fluoroyellow .
−3 ®
5.4.3 Calibrator solution C, containing 34,48 × 10 μmol/l of Fluoroyellow .
−3 ®
5.5 Daily instrument control solution, containing 34,48 × 10 μmol/l of Fluoroyellow .
The daily instrument control solution remains stable for 18 months from the date of manufacture, provided
it is stored in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C. Mix gently prior to use to ensure optimal results. ®
5.6 Fluorophos cheese extraction buffer, diethanolamine (DEA) buffer, pH-value 8,0 with magnesium
and Triton X-100.
The cheese extraction buffer remains stable for three years from the date of manufacture, provided it is
stored in unopened bottles at between 2 °C and 8 °C.
4)
5.7 Positive, negative and PhosphaCheck-N™ controls .
6 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following shall be used.
6.1 Filter fluorimeter, with thermostatically controlled cuvette holder, capable of operating at
38 °C ± 1 °C and right-angle optics, allowing excitation at a wavelength of 440 nm and emission between ®
520 nm and 560 nm [e.g. Fluorophos instrument].
6.2 Cuvettes, disposable, non-fluorescent glass, of diameter 12 mm and of length 75 mm.
6.3 Pipettes.
6.3.1 Pipette, of capacity 2,0 ml and 3,0 ml.
6.3.2 Positive-displacement or air-displacement pipette, of capacity 0,075 ml.
6.4 Heating block, capable of maintaining a temperature of 38 °C ± 1 °C, suitable for holding cuvettes.
®5)
6.5 Plastic paraffin film (e.g. Parafilm ) or other suitable laboratory-grade film. ®
3) Fluoroyellow is the registered trademark of a product supplied by Advanced Instruments, LLC. This information is
given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the products
named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
4) The controls and instrument performance check instructions are products supplied by Advanced Instruments, LLC.
This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO
or IDF of the products named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results. ®
5) Parafilm is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
IDF 155-2:2024(en)
6.6 Vortex mixer.
6.7 Grinding device.
6.8 Glass beaker, of capacity 5 ml (of approximately diameter 20 mm and length 30 mm) and 10 ml (of
approximately diameter 25 mm and length 30 mm).
®6)
6.9 High-speed homogenizer (e.g. ULTRA-TURRAX ) provided with the stem of diameter of
approximately 6 mm to 8 mm.
6.10 One-mark volumetric flasks, of capacity 25 ml.
6.11 Centrifuge, capable of centrifuging at 1 000 g at 4 °C.
6.12 Glass test tube, of approximately diameter 12 mm and length 10 cm.
6.13 Glass Pasteur pipette; an air-displacement pipette can also be used.
6.14 Water bath, capable of maintaining a temperature of 63 °C ± 1 °C
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this document. A recommended sampling method is given in
ISO 707 | IDF 50.
However, ISO 707 | IDF 50 is not suitable for large hard cheeses where the whey curd mixture has been scalded
at temperatures above 50 °C. If the cheese is made from raw milk, the ALP activity is not homogenously
distributed within these cheeses. The activity is high in the outer layer of the cheese wheel, between 0 cm to
4 cm below the rind of the round side, but very low or even undetectable in the core.
Samples of large hard cheeses, therefore, shall be sampled by taking a portion of 1 cm, taken at 0,5 cm below
the rind of the round side (see Figure B.1).
In case of doubt regarding the type of cheese, between a hard and a semi-hard cheese, proceed to the
sampling as described for large hard cheeses.
8 Preparation of test sample
Remove the rind or the surface from the test sample with a clean knife. Ensure that the test sample is not
contaminated with surface microflora during its preparation. Especially for soft cheese with moulded
surface, remove all the rind but in a layer as thin as possible, so as to avoid eliminating the fat layer under the
mould surface (see Figure B.2). For large hard cheeses, proceed as described under Clause 7. Grind the test
sample by means of a grinding mill or other appropriate device (6.7) and mix thoroughly. Keep the prepared
sample in an airtight container. Examples of preparation of a test sample of a large hard cheese (Figure B.1),
a soft cheese (Figure B.2) and a semi-hard cheese (Figure B.3) are given in Annex B. ®
6) ULTRA-TURRAX is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
IDF 155-2:2024(en)
9 Pr
...
Norme
internationale
ISO 11816-2
FIL 155-2
Troisième édition
Lait et produits laitiers —
2024-01
Détermination de l'activité de la
phosphatase alcaline —
Partie 2:
Méthode fluorimétrique pour le
fromage
Milk and milk products — Determination of alkaline phosphatase
activity —
Part 2: Fluorimetric method for cheese
Numéros de référence
FIL 155-2:2024(fr) © ISO et FIL 2024
FIL 155-2:2024(fr)
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Fax: + 32 2 325 67 41
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Web: www.iso.org Web: www.fil-idf.org
Publié en Suisse
© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
ii
FIL 155-2:2024(fr)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire . 5
9.1 Vérification des performances de l’instrument.5
9.1.1 Généralités .5
9.1.2 Essais de contrôle quotidien des instruments .5
9.1.3 Utilisation du FLM200 .5
9.1.4 Utilisation du FLM300 .5
9.1.5 Contrôles.6
9.2 Contrôles de réactifs pour évaluer l’adéquation du substrat de travail prêt à
l’emploi (5.3) .6
9.3 Étalonnage .6
9.3.1 Généralités .6
9.3.2 Utilisation du FLM200 .7
9.3.3 Utilisation du FLM300 .7
9.4 Détermination .7
9.5 Contrôles relatifs aux échantillons pour essai .9
9.5.1 Essais recommandés de contrôle négatif et positif .9
9.5.2 Essai de substance interférente .9
9.5.3 Essais de contrôle de l’ALP microbienne stable à la chaleur .9
10 Calcul et expression des résultats . 9
10.1 Rapport d’étalonnage .9
10.2 Calcul .10
10.2.1 Surnageant .10
10.2.2 Fromage . .10
10.3 Expression des résultats d’essai .11
11 Fidélité .11
11.1 Essai interlaboratoires .11
11.2 Répétabilité .11
11.3 Reproductibilité . .11
12 Rapport d’essai .11
Annexe A (informative) Essai interlaboratoires .13
Annexe B (informative) Exemples de préparation d’un échantillon pour essai .15
Bibliographie . 17
© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
iii
FIL 155-2:2024(fr)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de brevet.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5,
Lait et produits laitiers, et par la Fédération Internationale du Lait (FIL), en collaboration avec le comité
technique CEN/TC 302, Lait et produits laitiers — Méthodes d’échantillonnage et d’analyse, du Comité européen
de normalisation (CEN), conformément à l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de
Vienne). Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 11816-2 | FIL 155-2:2016), qui a fait
l’objet d’une révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— l’instrument FLM200 (qui a été abandonné) a été remplacé par la version FLM300;
— les instructions d’utilisation de l’instrument et le flux de ces instructions ont été révisés conformément
au FLM300, qui dispose d’une interface utilisateur et d’un système électronique améliorés (l’essai ou la
procédure d’essai n’ont pas été modifiés à la suite des modifications apportées au logiciel et à l’interface);
— le bloc chauffant, qui était un élément séparé, fait désormais partie de l’instrument.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 11816 | FIL 155 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
iv
FIL 155-2:2024(fr)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente les
intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont organisés
en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de groupes d’intérêt
nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des acteurs de l’industrie
de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des universitaires et des
représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d’analyse et d’échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
La FIL attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. La FIL ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, la FIL n'avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l'adresse
www.iso.org/brevets. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie
de tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent de la FIL chargé des Méthodes d’analyse pour
les auxiliaires technologiques et indicateurs et par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l’ISO et la FIL.
L’ensemble des travaux a été confié au groupe de travail mixte ISO/FIL P19 du Comité permanent chargé des
Méthodes d’analyse pour les auxiliaires technologiques et indicateurs, sous la conduite de son chef de projet,
M. Rick Zampa (États-Unis).
© ISO et FIL 2024 – Tous droits réservés
v
Norme internationale
FIL 155-2:2024(fr)
Lait et produits laitiers — Détermination de l'activité de la
phosphatase alcaline —
Partie 2:
Méthode fluorimétrique pour le fromage
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode fluorimétrique de détermination de l’activité de la phosphatase
alcaline (ALP) (EC 3.1.3.1) dans le fromage.
La présente méthode est applicable aux fromages à pâte molle, pâte pressée non cuite et pâte pressée cuite,
à condition que la moisissure ne soit présente que sur la surface du fromage et ne se soit pas propagée à
l’intérieur, comme dans le cas des fromages veinés de bleu, par exemple. Pour les gros fromages à pâte
pressée cuite, des conditions d’échantillonnage spécifiques s’appliquent (voir l’Article 7).
L’instrument utilisé pour la détermination de l’ALP peut lire des activités jusqu’à 7 000 mU/kg (milliunités
par kilogramme).
2 Références normatives
Le présent document ne contient aucune référence normative.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
3.1
activité de la phosphatase alcaline
activité ALP
activité de l’enzyme présente dans le produit, déterminée suivant le mode opératoire spécifié
Note 1 à l'article: L’activité ALP est exprimée en milliunités d’activité enzymatique par kilogramme d’échantillon (mU/
kg).
4 Principe
L’activité ALP de l’échantillon se mesure en effectuant un essai cinétique direct fluorimétrique continu. Un
substrat d’ester monophosphorique aromatique non fluorescent, 2′-[2-benzothiazolyl]-6′-hydroxybenzothi
azole phosphate, en présence d’ALP issue de l’échantillon, subit une hydrolyse de son radical phosphate et
produit un composé hautement fluorescent. Le mesurage fluorimétrique de l’activité ALP est effectué à 38 °C
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®1)
sur une période de 3 min lorsque l’on utilise un Fluorophos . Ce mesurage comprend la préincubation du
substrat et de l’échantillon, suivie de plusieurs lectures cinétiques de la vitesse de réaction.
NOTE Bien que l’essai dure 3 min, la première minute est une période d’équilibrage afin de s’assurer que
l’échantillon est à 38 °C. Les mesurages d’activité sont en effet réalisés du début de la deuxième minute à la fin de la
troisième minute (c’est-à-dire sur une période de 2 min).
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, sauf indication contraire, et de l’eau distillée
ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente. ®
Les réactifs spécifiés en 5.1 à 5.7 et les appareils spécifiés en 6.1 à 6.4 (sauf 6.3.1) comprennent le Fluorophos
2) ®
Test System . La configuration des emballages fournis avec le Fluorophos Test System peut être modifiée
par le fabricant. II convient que l’utilisateur se réfère aux instructions du fabricant pour la préparation des
réactifs s’ils se révèlent différents de ceux spécifiés dans le présent document.
® ®
5.1 Substrat Fluorophos en flacons, contenant chacun 144 mg de poudre de substrat Fluorophos ,
masse molaire de 580 g/mol.
Il s’agit d’un substrat d’ester monophosphorique aromatique non fluorescent,
2’-[2-benzothiazolyl]-6’-hydroxybenzothiazole phosphate.
Ce substrat reste stable pendant 2 ans après sa date de fabrication lorsqu’il est conservé, dans le flacon non
ouvert, entre 2 °C et 8 °C. Garder à l’abri de la lumière.
5.2 Solution tampon de substrat, solution tampon de diéthanolamine (DEA), c(DEA) = 2,4 mol/l, avec
valeur de pH 10,0.
La solution tampon de substrat reste stable pendant 2 ans après sa date de fabrication lorsqu’elle est
conservée, dans le flacon non ouvert, entre 2 °C et 8 °C. Garder à l’abri de la lumière.
5.3 Substrat de travail ®
Amener le substrat Fluorophos (5.1) et la solution tampon de substrat (5.2) à température ambiante. Ajouter ®
le contenu d’un flacon de solution tampon de substrat (240 ml) (5.2) à un flacon de substrat Fluorophos
(144 mg) (5.1) et mélanger avec soin en retournant pendant 3 min. Utiliser du verre de couleur ambre pour
protéger le produit de la lumière.
Laisser la solution ainsi obtenue reposer à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.
Utiliser l’essai analogique/numérique (A/D) donné en 9.1.3 pour vérifier que le substrat de travail prêt
pour utilisation est bon. Ne pas utiliser le substrat de travail en cas d’obtention d’une valeur supérieure à
1 200 FLU (unités de fluorescence).
Le substrat de travail reste stable pendant 60 jours lorsqu’il est conservé à l’abri de la lumière entre 2 °C et
8 °C, ou pendant 6 h lorsqu’il est conservé à 38 °C. ®
1) Fluorophos est la marque déposée d’un produit distribué par Advanced Instruments, LLC. Cette information est
donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve l’emploi
du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils aboutissent aux mêmes
résultats. ®
2) Le Fluorophos Test System est l’appellation commerciale d’un produit distribué par Advanced Instruments, LLC.
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la
FIL approuve l’emploi du produit ainsi désigné. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils
aboutissent aux mêmes résultats.
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®3)
5.4 Solutions étalons, Fluoroyellow (FY) [2’-(2-benzothiazolyl)-6’-hydroxybenzothiazole] dans une
solution tampon de substrat (5.2).
Les solutions étalons restent stables pendant 18 mois après leur date de fabrication lorsqu’elles sont
conservées dans des flacons non ouverts entre 2 °C et 8 °C.
Mélanger doucement avant utilisation pour obtenir des résultats optimaux. ®
5.4.1 Solution étalon A, contenant 0 μmol/l de Fluoroyellow .
−3 ®
5.4.2 Solution étalon B, contenant 17,24 × 10 μmol/l de Fluoroyellow .
−3 ®
5.4.3 Solution étalon C, contenant 34,48 × 10 μmol/l de Fluoroyellow .
-3 ®
5.5 Solution de contrôle quotidien des instruments, contenant 34,48 × 10 µmol/l de Fluoroyellow .
La solution de contrôle quotidien des instruments reste stable pendant 18 mois après sa date de fabrication
lorsqu’elle est conservée dans des flacons non ouverts entre 2 °C et 8 °C. Mélanger doucement avant
utilisation pour obtenir des résultats optimaux. ®
5.6 Tampon d’extraction de fromage Fluorophos , tampon de diéthanolamine (DEA), valeur de pH 8,0
avec magnésium et Triton X-100.
Le tampon d’extraction de fromage reste stable pendant 3 ans après sa date de fabrication lorsqu’il est
conservé, dans le flacon non ouvert, entre 2 °C et 8 °C.
4)
5.7 Contrôles positif, négatif et PhosphaCheck-N™ .
6 Appareillage
Utiliser le matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Fluorimètre à filtre, avec un support de cuvettes à contrôle thermostatique, capable de fonctionner à
38 °C ±1 °C et avec une optique à angle droit, permettant une excitation à une longueur d’onde de 440 nm et ®
une émission entre 520 nm et 560 nm [instrument Fluorophos ) par exemple].
6.2 Cuvettes, jetables, en verre non fluorescent, de 12 mm de diamètre et de 75 mm de longueur.
6.3 Pipettes
6.3.1 Pipettes, de 2,0 ml et 3,0 ml de capacité.
6.3.2 Pipette à déplacement positif ou pipette à piston, de 0,075 ml de capacité.
6.4 Bloc chauffant, pouvant maintenir une température de 38 °C ±1 °C et pouvant contenir des cuvettes. ®
3) Fluoroyellow est la marque déposée d’un produit distribué par Advanced Instruments, LLC. Cette information
est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuvent
ou recommandent l’emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est
démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
4) Les contrôles et les instructions de contrôle des performances de l’instrument sont disponibles auprès d’Advanced
Instruments. LLC. Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l’emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents
peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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®5)
6.5 Film plastique de paraffine (par exemple Parafilm ) ou autre film approprié de qualité pour
laboratoire.
6.6 Agitateur/mélangeur vortex
6.7 Broyeur
6.8 Bécher en verre, de 5 ml (d’environ 20 mm de diamètre et 30 mm de longueur) et 10 ml (d’environ
25 mm de diamètre et 30 mm de longueur) de capacité.
®6)
6.9 Homogénéisateur à haute vitesse (par exemple ULTRA-TURRAX ) fourni avec une tige d’environ
6 mm à 8 mm de diamètre.
6.10 Fioles jaugées à un trait, de 25 ml de capacité.
6.11 Centrifugeuse, pouvant centrifuger à 1 000 g à 4 °C.
6.12 Tube à essai en verre, d’environ 12 mm de diamètre et 10 cm de longueur.
6.13 Pipette Pasteur en verre, une pipette à piston peut également être utilisée.
6.14 Bain d’eau, pouvant maintenir une température de 63 °C ±1 °C.
7 Échantillonnage
Il convient qu’un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu’il n’ait été ni
endommagé ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Une méthode
d’échantillonnage recommandée est fournie dans l’ISO 707 | FIL 50.
Toutefois, l’ISO 707|FIL 50 ne convient pas pour les gros fromages à pâte pressée cuite où le mélange de
caillé et de lactosérum a été chauffé à des températures supérieures à 50 °C. Si le fromage est fabriqué à
partir de lait cru, l’activité ALP n’est pas répartie de façon homogène dans ces fromages. L’activité est élevée
dans la couche externe de la meule, entre 0 cm et 4 cm sous la croûte du bord arrondi, mais très faible ou
même indétectable au centre.
Par conséquent, les échantillons de gros fromages à pâte pressée cuite doivent être recueillis en prélevant
une portion de 1 cm à 0,5 cm sous la croûte du bord arrondi (voir Figure B.1).
En cas de doute concernant le type de fromage (fromage à pâte pressée cuite ou fromage à pâte pressée non
cuite), procéder à l’échantillonnage décrit pour les gros fromages à pâte pressée cuite.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Retirer la croûte ou la surface de l’échantillon pour essai avec un couteau propre. S’assurer que l’échantillon
pour essai n’est pas contaminé par des micro-organismes de surface pendant sa préparation. En particulier
pour les fromages à pâte molle dont la surface est fleurie, retirer toute la croûte mais sur une partie aussi
fine que possible, de façon à ne pas éliminer la partie grasse sous la surface fleurie (voir Figure B.2). Pour ®
5) Parafilm est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l’intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve l’emploi du produit ainsi
désigné. ®
6) ULTRA-TURRAX est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à
l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO ou la FIL approuve l’emploi du produit
ainsi désigné.
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les gros fromages à pâte pressée cuite, procéder comme décrit à l’Article 7. Broyer l’échantillon pour essai à
l’aide d’un mixer ou de tout autre dispositif approprié (6.7) et bien mélanger. Conserver l’échantillon préparé
dans un récipient étanche à l’air. Des exemples pour la préparation d’un échantillon pour essai d’un gros
fromage à pâte pressée cuite (Figure B.1), d’un fromage à pâte molle (Figure B.2) et d’un fromage à pâte
pressée non cuite (Figure B.3) sont donnés à l’Annexe B.
9 Mode opératoire
9.1 Vérification des performances de l’instrument
9.1.1 Généralités
Il est important de vérifier les performances de l’instrument en matière d’écarts, de lumière parasite et de
stabilité avant de procéder à l’analyse des échantillons pour essai. Veiller à utiliser le fluorimètre à filtre
(6.1) conformément aux principes de bonnes pratiques de laboratoire.
Les essais réalisés dans le cadre du contrôle qualité comprennent:
a) l’essai quotidien
...
Questions, Comments and Discussion
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