ISO 9936:2016

Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography

ISO 9936:2016 specifies a method for the determination of the contents of free α-, β-, γ-, and δ-tocopherols and tocotrienols (referred to jointly as tocols) in animal and vegetable fats and oils (referred to hereinafter as fats) by high-performance liquid chromatography (HPLC). For products containing tocopherol or tocotrienol esters, it is necessary to carry out a preliminary saponification. Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the Scope of this International Standard. NOTE A suitable method involving a cold saponification procedure is described in Annex B for information only.

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination des teneurs en tocophérols et en tocotriénols par chromatographie en phase liquide à haute performance

ISO 9936:2016 spécifie une méthode pour la détermination des teneurs en α-, β-, γ- et δ-tocophérols et tocotriénols libres (appelés globalement tocols) des graisses et des huiles (appelés corps gras dans la suite du texte) d'origines animale et végétale, par chromatographie en phase liquide haute performance (CLHP). Pour les produits contenant des esters de tocophérols ou de tocotriénols, il est nécessaire qu'ils subissent une saponification préalable. Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du domaine d'application de la présente Norme internationale. NOTE Une méthode appropriée incluant un protocole de saponification à froid est décrite, pour information uniquement, dans l'Annexe B.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-Mar-2016
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 16-Jul-2021

Relations

• Revises: ISO 9936:2006 - Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography
• Effective Date: 04-Nov-2015
• Revises: ISO 9936:2006/Amd 1:2011 - Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography — Amendment 1: Updating of reagents and confirmation of statistical data validity
• Effective Date: 05-Nov-2015

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 9936
Third edition
2016-04-01
Animal and vegetable fats and
oils — Determination of tocopherol
and tocotrienol contents by high-
performance liquid chromatography
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination des
teneurs en tocophérols et en tocotriénols par chromatographie en
phase liquide à haute performance
Reference number
ISO 9936:2016(E)
©
ISO 2016

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ISO 9936:2016(E)

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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ISO 9936:2016(E)

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
6 Apparatus . 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 3
9 Procedure. 3
9.1 Preparation of calibration solutions . 4
9.1.1 Stock calibration solutions . 4
9.1.2 Standard solution . 4
9.2 Optimization of working parameters . 4
9.3 Preparation of test solution . 5
9.4 Determination . 5
10 Expression of results . 6
11 Precision . 6
11.1 Interlaboratory test. 6
11.2 Repeatability . 6
11.3 Reproducibility . 7
12 Test report . 7
Annex A (informative) Examples of chromatograms . 8
Annex B (informative) Saponification .10
Annex C (informative) Results of interlaboratory tests .12
Bibliography .16
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ISO 9936:2016(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This third edition cancels and replaces the second edition (ISO 9936:2006), which has been technically
revised. It also incorporates the Amendment ISO 9936:2006/Amd.1:2011 and the Technical Corrigendum
ISO 9936:2006/Cor.1:2008. A non-applicability statement for milk and milk products has been added to
the Scope.
iv © ISO 2016 – All rights reserved

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 9936:2016(E)
Animal and vegetable fats and oils — Determination of
tocopherol and tocotrienol contents by high-performance
liquid chromatography
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the contents of free α-, β-, γ-,
and δ-tocopherols and tocotrienols (referred to jointly as tocols) in animal and vegetable fats and oils
(referred to hereinafter as fats) by high-performance liquid chromatography (HPLC).
For products containing tocopherol or tocotrienol esters, it is necessary to carry out a preliminary
saponification.
Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the Scope of this
International Standard.
NOTE A suitable method involving a cold saponification procedure is described in Annex B for
information only.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
tocol content
mass fraction of the individual tocols, determined using the method specified in this International
Standard
Note 1 to entry: The content is expressed in milligrams per kilogram as a whole number.
4 Principle
A test portion is dissolved in n-heptane and the individual tocols are separated by high-performance
liquid chromatography (HPLC). The content of each tocol is calculated using calibration factors
determined from calibration solutions.
5 Reagents
Use only reagents of HPLC grade or equivalent.
5.1 α-, β-, γ- and δ-tocopherol and tocotrienol standards.
If tocopherol standards are not available, a blend of wheat germ and soya bean oil may be used to
identify α-, β-, γ- and δ-tocopherols.
© ISO 2016 – All rights reserved 1

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ISO 9936:2016(E)

If tocotrienol standards are not available, palm oil may be used to identify α- and γ-tocotrienols. The
chromatograms obtained can be used to assist peak identification in test sample chromatograms, in
which case the calibration factors for the corresponding tocopherols should be used.
1)
NOTE α-, β-, γ- and δ-tocopherol and tocotrienol standards can be obtained from Merck ; α-tocopherol
2)
can be obtained from various suppliers. Tocotrienol standards are available from Sigma Aldrich . It has been
reported that the purity of some commercially available tocopherol standards may vary between 85 % and
100 %. Thus, it is important to determine the concentration of prepared calibration solutions by UV spectrometry
(see 9.1.1).
5.2 Tetrahydrofuran, filtered through an HPLC nylon filter (0,45 µm).
5.3 n-Heptane, filtered through an HPLC nylon filter (0,45 µm).
5.4 HPLC mobile phase.
Any suitable mixture of solvents that has been proven to reach a chromatographic resolution of peaks
as good as the one presented in Table 2 (relative retention time of tocopherols and tocotrienols) and in
Annex A (chromatograms of a mixture of vegetable oils), should be used (see Table C.3).
A good separation of γ-tocopherol and β-tocotrienol can be achieved by using a mixture of 5 % volume
fraction t-butyl methyl ether + 95 % volume fraction n-heptane and a diol-column.
The preparation of a suitable mobile phase, 3,85 % (volume fraction) tetrahydrofuran solution in
n-heptane, is as follows. Using a 1 000 ml graduated cylinder (6.5), introduce 1 000 ml of n-heptane
(5.3) in a 2 litre bottle. Add twice 20 ml of tetrahydrofuran (5.2) using a 20 ml volumetric pipette (6.6).
Homogenize the mobile phase by means of an ultrasonic bath (6.8) for 15 min.
5.5 Methanol.
6 Apparatus
Usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 HPLC system, consisting of a high-pressure pump, a sample injection device, column thermostat
adjusted to 25 °C (optional), a fluorescence detector with the excitation wavelength set at 295 nm and
emission wavelength at 330 nm, and a recording integrator.
An ultraviolet (UV) detector may be used if a fluorescence detector is not available but it is not
recommended. However, if a UV detector is used, the wavelength should be set at 292 nm.
6.2 HPLC analytical column, two types are possible:
— 250 mm × 4 mm, packed with microparticulate diol having a mean particle size of about 5 µm, or
— 250 mm × 4,6 mm, packed with microparticulate silica having a mean particle size of about 5 µm.
1) Merck Tocopherol set 613424 is available from Calbiochem (www.calbiochem.com). It contains one 50 mg
vial each of dl-α-tocopherol, d-β-tocopherol, d-γ-tocopherol, and d-δ-tocopherol with a purity of 95 % by HPLC (for
each component). Merck Tocotrienol set 613432 is available from Calbiochem also. It contains one 50 mg vial each of
α-tocotrienol, β-tocotrienol, γ-tocotrienol, and δ-tocotrienol with a purity of 95 % by HPLC (75 % for γ-tocotrienol).
This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by
ISO of the products named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
2) Tocotrienols are available from Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) and from Chromadex (www.chromadex.
com) with purities between 65 % and 98 %. This information is given for the convenience of users of this document
and does not constitute an endorsement by ISO of the products named. Equivalent products may be used if they can
be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2016 – All rights reserved

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ISO 9936:2016(E)

NOTE 1 Suitable diol silica column packing material available commercially is 5 µm LiChrospher 100 Diol;
3)
suitable silica column packing materials available commercially are 5 µm LiChrosob SI 60 and Kromasil 100 .
When β-tocotrienol is expected in the sample, the diol silica column is preferred as γ-tocopherol and β-tocotrienol
are co-eluted when using the silica column.
NOTE 2 The length and the diameter of the column can be varied according to the HPLC technique used.
NOTE 3 Both types of columns have been used for the evaluation of the precision data (Annex C).
6.3 UV spectrometer, capable of absolute measurement of absorbance at precisely defined
wavelengths, with a 10-mm path length cell.
6.4 Rotary evaporator.
6.5 Graduated cylinder, of 1 000 ml capacity.
6.6 Volumetric pipettes, of 5 ml, 10 ml and 20 ml capacities.
6.7 Volumetric flasks, 50 ml and 25 ml capacities.
6.8 Ultrasonic bath.
7 Sampling
A representative sample should be sent to the laboratory. It is important that the sample has not been
damaged or changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
method is given in ISO 5555.
8 Preparation of test sample
In the case of liquid laboratory samples, prepare the test sample by homogenization as described in
ISO 661, except that filtration should be avoided.
In the case of solid samples, transfer a representative portion (i.e. not less than 10 % by mass of the
laboratory sample) to a glass beaker and carefully homogenize by melting, with gentle mixing, in a
water bath at a temperature not exceeding 40 °C.
Preparation of the test samples should be carried out, as far as is practicable, in subdued light and in all
cases out of direct sunlight.
9 Procedure
IMPORTANT — In general, the oxidation of tocols during the analysis may lead to low results.
The rate of oxidation is increased in the presence of alkalis, or under the influence of heat or
light, and measures should be taken to guard against these influences.
3) These types of columns are examples of suitable products available commercially. This information is given for
the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
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ISO 9936:2016(E)

9.1 Preparation of calibration solutions
9.1.1 Stock calibration solutions
Prepare a stock solution of each tocol by weighing 10 mg ± 1 mg of the standard (5.1) into a 50 ml
volumetric flask (6.7) and diluting to the mark with n-heptane (5.3).
Pipette 5 ml (6.6) of this solution into an amber glass round-bottomed flask and remove all n-heptane on
a rotary evaporator (6.4) under vacuum at a temperature not greater than 40 °C. Restore atmospheric
pressure with nitrogen and remove the flask from the evaporator as soon as all the solvent has been
removed. Pipette into the flask 10 ml (6.6) of methanol (5.5) and swirl to dissolve the residue. Measure
the maximum absorbance of this solution in a wavelength range between 270 nm and 310 nm (see
appropriate wavelength in Table 1) using the UV spectrometer (6.3) with a 10-mm path length cell. The
measured absorbance should be between 0,2 and 0,8. Calculate the concentration (in micrograms per
millilitre) by dividing the absorbance value by the appropriate factor given in Table 1.
Table 1 — Division factors
Wavelength
Tocopherol Division factor
nm
292 α-tocopherol 0,007 6
296 β-tocopherol 0,008 9
298 γ-tocopherol 0,009 1
298 δ-tocopherol 0,008 7
NOTE The factors quoted are derived from the E values (1 %/1 cm) of the tocopherols.
For example, the E value (1 %/1 cm) of α-tocopherol is 76 at 292 nm (in methanol);
therefore a 1 µg/ml solution of α-tocopherol will have an absorbance of 0,007 6 at 292 nm.
9.1.2 Standard solution
A suitable standard solution should be prepared, according to the sensitivity of the fluorescence
detector used.
The following preparation of working solution is given as an example: mix appropriate volumes, for
example 1 ml, of the stock calibration solutions (see 9.1.1) to obtain a mixed tocol standard solution,
and dilute with n-heptane to give a solution containing between 1 µg and 5 µg of each standard per
millilitre.
The standard solution shall be freshly prepared each working day.
Protect all solutions from light and store them at between 0 °C and 4 °C.
Stock standard solutions can be satisfactorily stored in amber glassware for up to 1 week if refrigerated.
Flasks may be wrapped in aluminium foil.
NOTE If a UV detector is used, a more concentrated solution might be needed.
9.2 Optimization of working parameters
9.2.1 If the column (6.2) is new or of unknown history, or if for any other reason it is necessary to
condition it, wash and condition it for about 10 min with methanol, then dichloromethane, followed by
n-hepta
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 9936
Troisième édition
2016-04-01
Corps gras d’origines animale et
végétale — Détermination des teneurs
en tocophérols et en tocotriénols par
chromatographie en phase liquide à
haute performance
Animal and vegetable fats and oils — Determination of tocopherol
and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography
Numéro de référence
ISO 9936:2016(F)
©
ISO 2016

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ISO 9936:2016(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
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l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 9936:2016(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 1
6 Appareillage . 2
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 3
9 Mode opératoire. 4
9.1 Préparation des solutions d’étalonnage . 4
9.1.1 Solutions étalons mères . . 4
9.1.2 Solution étalon . 4
9.2 Optimisation des paramètres de travail . 5
9.3 Préparation de la solution d’essai . 5
9.4 Détermination . 6
10 Expression des résultats. 6
11 Fidélité . 7
11.1 Essai interlaboratoires . 7
11.2 Répétabilité . 7
11.3 Reproductibilité . 7
12 Rapport d’essai . 7
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes . 9
Annexe B (informative) Saponification .11
Annexe C (informative) Résultats des essais interlaboratoires .13
Bibliographie .17
© ISO 2016 – Tous droits réservés iii

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ISO 9936:2016(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation
de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation
mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien
suivant: Avant-propos — Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette troisième édition annule et remplace la deuxième édition (ISO 9936:2006), qui a fait l’objet
d’une révision technique. Elle incorpore également l’Amendement ISO 9936:2006/Amd.1:2011 et le
Rectificatif technique ISO 9936:2006/Cor.1:2008. Un énoncé relatif à la non applicabilité au lait et aux
produits laitiers a été ajouté au Domaine d’application.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

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NORME INTERNATIONALE ISO 9936:2016(F)
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination
des teneurs en tocophérols et en tocotriénols par
chromatographie en phase liquide à haute performance
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la détermination des teneurs en α-, β-, γ-
et δ-tocophérols et tocotriénols libres (appelés globalement tocols) des graisses et des huiles (appelés
corps gras dans la suite du texte) d’origines animale et végétale, par chromatographie en phase liquide
haute performance (CLHP).
Pour les produits contenant des esters de tocophérols ou de tocotriénols, il est nécessaire qu’ils
subissent une saponification préalable.
Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du
domaine d’application de la présente Norme internationale.
NOTE Une méthode appropriée incluant un protocole de saponification à froid est décrite, pour information
uniquement, dans l’Annexe B.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
teneur en tocol
fraction massique des différents tocols, déterminée suivant la méthode spécifiée dans la présente
Norme internationale
Note 1 à l’article: Cette teneur est exprimée en milligrammes par kilogramme, en nombre entier.
4 Principe
Une prise d’essai est dissoute dans du n-heptane et les différents tocols sont séparés par chromatographie
en phase liquide à haute performance (CLHP). La teneur de chaque tocol est calculée à l’aide de facteurs
d’étalonnage déterminés à partir de solutions étalons.
5 Réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité CLHP ou équivalente.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1

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ISO 9936:2016(F)

5.1 Étalons α-, β-, γ- et δ-tocophérol et -tocotriénol.
Si l’on ne dispose pas d’étalons pour les tocophérols, il est possible d’utiliser un mélange d’huile de
germe de blé et d’huile de soja pour identifier les α-, β-, γ- et δ-tocophérols.
Si l’on ne dispose pas d’étalons pour les tocotriénols, il est possible d’utiliser de l’huile de palme pour
identifier les α- et γ-tocotriénols. Les chromatogrammes obtenus peuvent aider à l’identification des
pics sur les chromatogrammes des échantillons pour essai, auquel cas il convient d’utiliser les facteurs
d’étalonnage correspondant aux différents tocophérols.
1)
NOTE Les étalons α-, β-, γ- et δ-tocophérol et tocotriénol peuvent être obtenus auprès de Merck ;
α-tocophérol étant disponible auprès de différents fournisseurs. Les étalons tocotriénol peuvent être obtenus
2)
auprès de Sigma Aldrich . Une certaine variabilité de la pureté des étalons du commerce, qui peut aller de 85 %
à 100 %, a été signalée dans plusieurs cas. Il est par conséquent important de déterminer la concentration des
solutions d’étalonnage préparées par spectrométrie UV (voir 9.1.1).
5.2 Tétrahydrofuranne, filtré à travers un filtre en nylon pour CLHP (0,45 µm).
5.3 n-Heptane, filtré à travers un filtre en nylon pour CLHP (0,45 µm).
5.4 Phase mobile de la CLHP.
Il convient d’utiliser tout mélange approprié de solvants atteignant une résolution chromatographique
des pics aussi bonne que celle présentée dans le Tableau 2 (temps de rétention relatifs des tocophérols
et des tocotriénols) et dans l’Annexe A (chromatogrammes d’un mélange d’huiles végétales) (voir
Tableau C.3).
Une bonne séparation du γ-tocophérol et du β-tocotriénol peut être obtenue à l’aide d’un mélange 5 %
méthyl t-butyl éther (fraction volumique) + 95 % n-heptane (fraction volumique) et d’une colonne de
silice greffée par des groupements diols.
La préparation d’une phase mobile appropriée, solution à 3,85 % (fraction volumique) de
tétrahydrofuranne dans le n-heptane, est indiquée ici. À l’aide d’une éprouvette graduée de 1 000 ml
(6.5), introduire 1 000 ml de n-heptane (5.3) dans un flacon de 2 l. Ajouter deux fois 20 ml de
tétrahydrofuranne (5.2) à l’aide d’une pipette jaugée de 20 ml (6.6). Homogénéiser la phase mobile en la
plaçant pendant 15 min dans un bain à ultrasons (6.8).
5.5 Méthanol.
6 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
1) Le mélange commercial de tocophérols Merck 613424 est disponible auprès de Calbiochem (www.calbiochem.
com). Il se compose de flacons contenant chacun 50 mg de dl-α-tocophérol, d-β-tocophérol, d-γ-tocophérol et
d-δ-tocophérol d’une pureté de 95 % par CLHP (pour chaque composant). Le mélange commercial de tocotriénols
Merck 613432 est également disponible auprès de Calbiochem. Il se compose de flacons contenant chacun 50 mg de
α-tocotriénol, β-tocotriénol, γ-tocotriénol et δ-tocotriénol d’une pureté de 95 % par CLHP (75 % pour le γ-tocotriénol).
Cette information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO
approuve ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
2) Les tocotriénols sont disponibles auprès de Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) et de Chromadex (www.
chromadex.com) avec des puretés comprises entre 65 % et 98 %. Cette information est donnée à l’intention des
utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve ou recommande l’emploi exclusif
des produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux
mêmes résultats.
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6.1 Système CLHP, comprenant une pompe haute-pression, un dispositif d’injection de l’échantillon,
un chauffe-colonne réglé sur 25 °C (facultatif), un fluorimètre dont la longueur d’onde d’excitation est
réglée sur 295 nm et la longueur d’onde d’émission sur 330 nm, et un intégrateur enregistreur.
Si l’on ne dispose pas d’un fluorimètre, il est admis, mais non recommandé, d’utiliser un détecteur UV.
Toutefois, si un détecteur à UV est utilisé, il convient de régler sa longueur d’onde sur 292 nm.
6.2 Colonne analytique pour CLHP, deux types sont possibles:
— colonne de 250 mm × 4 mm, garnie de microparticules de silice greffée par des groupements
diols d’un diamètre moyen de 5 μm environ, ou
— colonne de 250 mm × 4,6 mm, garnie de microparticules de silice d’un diamètre moyen de 5 µm
environ.
NOTE 1 Le LiChrospher 100 Diol (diamètre de 5 μm) disponible dans le commerce convient pour le garnissage
3)
de la colonne de silice greffée par des groupements diols, le LiChrosob SI 60 et le Kromasil 100 également
disponibles dans le commerce convenant pour le garnissage de la colonne de silice. Si l’on s’attend à la présence
de β-tocotriénol dans l’échantillon, il convient de choisir la colonne de silice greffée par des groupements diols
car le γ-tocophérol et le β-tocotriénol sont coélués en cas d’utilisation de la colonne de silice.
NOTE 2 La longueur et le diamètre de la colonne peuvent être adaptés en fonction de la technique CLHP
employée.
NOTE 3 Les deux types de colonnes ont été utilisés pour évaluer les données de fidélité (Annexe C).
6.3 Spectromètre UV, permettant le mesurage absolu de l’absorbance à des longueurs d’onde définies
avec précision, avec une cellule de 10 mm de longueur de trajet.
6.4 Évaporateur rotatif.
6.5 Éprouvette graduée, d’une capacité de 1 000 ml.
6.6 Pipettes jaugées, d’une capacité de 5 ml, 10 ml et 20 ml.
6.7 Fioles jaugées, d’une capacité de 50 ml et 25 ml.
6.8 Bain à ultrasons.
7 Échantillonnage
Il convient qu’un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire et qu’il n’ait été ni endommagé
ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
méthode d’échantillonnage recommandée est indiquée dans l’ISO 5555.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Dans le cas d’échantillons pour laboratoire liquides, préparer l’échantillon pour essai par
homogénéisation, comme décrit dans l’ISO 661. Il convient toutefois d’omettre la filtration.
Dans le cas d’échantillons solides, placer une portion représentative (c’est-à-dire au moins égale à 10 %
en masse de l’échantillon pour laboratoire) dans un bécher en verre et homogénéiser soigneusement
3) Ces types de colonnes sont des exemples de produits appropriés disponibles dans le commerce. Cette
information est donnée à l’intention des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l’ISO approuve
ou recommande l’emploi exclusif des produits ainsi désignés.
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en laissant fondre dans un bain d’eau réglé à une température de 40 °C maximum, tout en mélangeant
doucement.
Dans la mesure du possible, il convient de préparer les échantillons pour essai en lumière atténuée
mais, en aucun cas, à la lumière directe du soleil.
9 Mode opératoire
IMPORTANT — D’une manière générale, l’oxydation des tocols au cours de l’analyse peut conduire
à l’obtention de résultats anormalement faibles. L’oxydation par l’oxygène étant accélérée par la
présence de substances basiques, la chaleur ou l’exposition à la lumière, il convient de prendre
les mesures nécessaires pour empêcher l’action de ces facteurs.
9.1 Préparation des solutions d’étalonnage
9.1.1 Solutions étalons mères
Préparer une solution étalon mère de chacun des tocols: pour ce faire, peser 10 mg ± 1 mg de l’étalon (5.1)
et les placer dans une fiole jaugée de 50 ml (6.7), puis compléter jusqu’au trait avec du n-heptane (5.3).
Transférer à la pipette (6.6) 5 ml de cette solution dans un ballon à fond rond en verre ambré et éliminer
totalement le n-heptane dans un évaporateur rotatif (6.4) sous vide et à une température inférieure ou
égale à 40 °C. Rétablir la pression atmosphérique avec de l’azote et sortir le ballon de l’évaporateur dès
élimination complète du solvant. Introduire à la pipette (6.6) 10 ml de méthanol (5.5) dans le ballon
et remuer pour dissoudre le résidu. Mesurer l’absorbance maximum de cette solution à une longueur
comprise entre 270 nm et 310 nm (voir la longueur d’onde appropriée dans le Tableau 1) à l’aide du
spectromètre UV (6.3) avec une cellule de 10 mm de longueur de trajet. Il convient que la différence
d’absorbance soit comprise entre 0,2 et 0,8. Calculer la concentration (en microgrammes par millilitre)
en divisant la valeur de l’absorbance par le facteur approprié donné dans le Tableau 1.
Tableau 1 — Facteurs de division
Longueur d’onde
Tocophérol Facteur de division
nm
292 α-tocophérol 0,007 6
296 β-tocophérol 0,008 9
298 γ-tocophérol 0,009 1
298 δ-tocophérol 0,008 7
NOTE  Les facteurs indiqués sont calculés à partir de la valeur E (1 %/1 cm) des
tocophérols. La valeur E (1 %/1 cm) de l’α-tocophérol, par exemple, est égale à 76 à
292 nm (dans le méthanol); une solution à 1 µg/ml solution d’α-tocophérol aura donc une
absorbance de 0,007 6 à 292 nm.
9.1.2 Solution étalon
Il convient de préparer une solution étalon appropriée, en fonction de la sensibilité du fluorimètre
utilisé.
La préparation suivante d’une solution de travail est donnée à titre d’exemple: mélanger des volumes
appropriés, par exemple 1 ml, des solutions étalons mères (voir 9.1.1) pour obtenir une solution étalon
contenant un mélange de tocols, et diluer avec du n-heptane de façon à obtenir une solution contenant
entre 1 μg et 5 μg de chaque étalon par millilitre.
La solution étalon doit être préparée chaque jour ouvré.
Protéger toutes les solutions de la lumière et les stocker à une température comprise entre 0 °C et 4 °C.
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Les solutions étalons mères se conservent convenablement pendant 1 semaine si elles sont réfrigérées
et stockées dans des fioles en verre ambré. Les fioles peuvent être enveloppées dans des feuilles
d’aluminium.
NOTE Si un détecteur UV est utilisé, il peut être nécessaire de travailler avec des solutions plus concentrées.
9.2 Optimisation des paramètres de travail
9.2.1 Si la colonne (
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