ISO/FDIS 7358

Essential oils of bergamot, lemon, bitter orange and lime, fully or partially reduced in bergapten -- Determination of bergapten content by high-performance liquid chromatography (HPLC)

Huiles essentielles de bergamote, de citron, de bigarade et de limette complètement ou partiellement privées de bergaptène -- Détermination de la teneur en bergaptène par chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

Standards Content (sample)

FINAL
INTERNATIONAL ISO/FDIS
DRAFT
STANDARD 7358
ISO/TC 54
Essential oils of bergamot, lemon,
Secretariat: UNE
bitter orange and lime, fully or
Voting begins on:
2021­02­18 partially reduced in bergapten —
Determination of bergapten
Voting terminates on:
2021­04­15
content by high-performance liquid
chromatography (HPLC)
Huiles essentielles de bergamote, de citron, de bigarade et de
limette complètement ou partiellement privées de bergaptène —
Détermination de la teneur en bergaptène par chromatographie
liquide à haute performance (CLHP)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO
SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION
OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPOR TING
DOCUMENTATION.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
Reference number
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNO­
ISO/FDIS 7358:2021(E)
LOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES,
DRAFT INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON
OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE
LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STAN­
DARDS TO WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
NATIONAL REGULATIONS. ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2021

All rights reserved. Unless otherwise specified, or required in the context of its implementation, no part of this publication may

be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting

on the internet or an intranet, without prior written permission. Permission can be requested from either ISO at the address

below or ISO’s member body in the country of the requester.
ISO copyright office
CP 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH­1214 Vernier, Geneva
Phone: [phone]
Email: [e-mail]
Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Reagents ........................................................................................................................................................................................................................ 1

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 2

6.1 Common laboratory equipment ............................................................................................................................................... 2

6.2 HPLC system.............................................................................................................................................................................................. 3

7 Sample preparation ........................................................................................................................................................................................... 3

8 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

8.1 Operating conditions ......................................................................................................................................................................... 3

8.2 Determination ......................................................................................................................................................................................... 3

8.2.1 HPLC in normal phase ................................................................................................................................................. 3

8.2.2 HPLC in reversed phase ............................................................................................................................................. 5

9 Calculation — Normal phase or reversed phase HPLC ................................................................................................. 7

9.1 Internal standard method ............................................................................................................................................................. 7

9.2 External standard method ............................................................................................................................................................ 7

10 Precision — Repeatability .......................................................................................................................................................................... 7

11 Test report ................................................................................................................................................................................................................... 8

Annex A (informative) Typical chromatogram of the reference substances using high-

performance liquid chromatography (HPLC) of reference compounds in reversed phase ...9

Annex B (informative) Berpapten UV-Vis spectrum ..........................................................................................................................10

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................11

© ISO 2021 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non­governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www .iso .org/

iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 54, Essential oils.

This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 7358:2002), which has been technically

revised.
The main change to the previous edition is as follows:
— the addition of an alternative method using a reversed phase column.

Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A

complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
FINAL DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/FDIS 7358:2021(E)
Essential oils of bergamot, lemon, bitter orange and lime,
fully or partially reduced in bergapten — Determination
of bergapten content by high-performance liquid
chromatography (HPLC)
1 Scope

This document specifies a high-performance liquid chromatographic (HPLC) method, using either an

internal standard or external standard, for the determination of the bergapten content in essential

oil of bergamot [Citrus aurantium ssp. bergamia (Risso et Poit.) Wight et Arn. ex Engl.], in essential

oil of lemon [Citrus limon (L.) Burm. f.], in essential oil of bitter orange (Citrus bigaradia Risso) and in

essential oil of lime [Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle and Citrus latifolia Tanaka], all of them fully

or partially reduced in bergapten.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 356, Essential oils — Preparation of test samples

ISO 8432, Essential oils — Analysis by high performance liquid chromatography — General method

3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Principle

The bergapten contents of test samples to be measured are determined after dilution by reversed phase

HPLC or by normal phase HPLC with gradient elution, using an internal standardization method or an

external standardization method and diode-array UV spectrometric detection.
5 Reagents
Use only the following reagents of recognized analytical grade.

5.1 Reference substance: bergapten (5-Methoxypsoralen), C H O , MW = 216,19 g/mol of known

12 8 4
purity ≥ 95 %.

5.2 Internal standard: coumarin (1-Benzopyran-2-one), C H O , MW = 146,14 g/mol of known

9 6 2
purity ≥ 98 %.
© ISO 2021 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(E)
5.3 Solvents.
5.3.1 Solvents for normal phase HPLC.

5.3.1.1 Chloroform, of analytical purity, containing less than 2 % (volume fraction) of ethanol, for use

in preparing the sample of essential oil containing the bergapten and internal standard as well as the

mobile phase.
5.3.1.2 Hexane, HPLC grade, for use in the mobile phase (5.3.1.4).
5.3.1.3 Ethyl acetate, HPLC grade, for use in the mobile phase (5.3.1.4).

5.3.1.4 Mobile phase. Use solvents of a quality compatible with the detection system and prepare

sufficient quantities for the complete analysis. Mix, for example, one of the following:

5.3.1.4.1 Hexane (5.3.1.2) and ethyl acetate (5.3.1.3), mixed in proportions of 80:20 by volume.

5.3.1.4.2 Hexane (5.3.1.2) and chloroform (5.3.1.1), mixed in proportions of 85:15 by volume.

5.3.2 Solvents for reversed phase HPLC. The solvent used for the mobile phase is a ternary mobile

phase prepared with these three solvents as described in Table 1 (see 8.2.2.3).
5.3.2.1 HPLC grade distilled water, to be used in the mobile phase (5.3.1.4).
5.3.2.2 HLPC grade acetonitrile, to be used in the mobile phase (5.3.1.4).
5.3.2.3 HLPC grade methanol, to be used in the mobile phase (5.3.1.4).

5.3.2.4 Dilution solvent, mixture of methanol (5.3.2.3) and acetonitrile (5.3.2.2) in proportions of

80:20 by volume.
6 Apparatus
Use the usual laboratory apparatus and, in particular, the following.
6.1 Common laboratory equipment
6.1.1 Volumetric flasks: 100 ml, 50 ml, 10 ml.

6.1.2 Pasteur pipettes; volumetric pipettes: 1 ml, 5 ml, 10 ml and 20 ml; micropipette: 500 µl.

6.1.3 Single-use syringes.
6.1.4 PTFE filter: 0,45 µm.
6.1.5 Vials for HPLC injection.
6.1.6 Precision balance.
2 © ISO 2021 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(E)
6.2 HPLC system
6.2.1 Liquid chromatograph.

6.2.2 Column for HPLC in normal phase, made of stainless steel, of length between 150 mm and

250 mm, having an internal diameter between 4 mm and 5 mm and packed with a stationary phase

consisting of granulated silica of HPLC quality, with a grain size of approximately 5 µm.

6.2.3 Column for HPLC in reversed phase, made of stainless steel, of length 150 mm (or 250 mm),

having an internal diameter 4,6 mm and packed with a stationary phase C18 type with a grain size of

approximately 3,5 µm (or 5 µm), for example Zorbax Eclipse Plus C:18: 3,5 µm (4,6 × 150) mm agilent.

6.2.4 A te
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 7358
ISO/TC 54
Huiles essentielles de bergamote,
Secrétariat: UNE
de citron, de bigarade et de limette
Début de vote:
2021-02-18 complètement ou partiellement
privées de bergaptène —
Vote clos le:
2021-04-15
Détermination de la teneur en
bergaptène par chromatographie
liquide à haute performance (CLHP)
Essential oils of bergamot, lemon, bitter orange and lime, fully or
partially reduced in bergapten — Determination of bergapten
content by high-performance liquid chromatography (HPLC)
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 7358:2021(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
TION NATIONALE. ISO 2021
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2021

Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette

publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,

y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut

être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

5 Réactifs ........................................................................................................................................................................................................................... 1

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 2

6.1 Matériel courant de laboratoire ............................................................................................................................................... 2

6.2 Système de CLHP ................................................................................................................................................................................... 3

7 Préparation de l’échantillon .................................................................................................................................................................... 3

8 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

8.1 Conditions opératoires ..................................................................................................................................................................... 3

8.2 Détermination ......................................................................................................................................................................................... 3

8.2.1 CLHP en phase normale ............................................................................................................................................. 3

8.2.2 CLHP en phase inverse ............................................................................................................................................... 5

9 Calculs — CLHP en phase normale ou inverse ....................................................................................................................... 7

9.1 Méthode de l’étalon interne ......................................................................................................................................................... 7

9.2 Méthode de l’étalon externe ........................................................................................................................................................ 8

10 Fidélité — Répétabilité .................................................................................................................................................................................. 8

11 Rapport d’essai ....................................................................................................................................................................................................... 8

Annexe A (informative) Chromatogramme type des substances de référence par

chromatographie liquide haute performance (CLHP) en phase inverse ...................................................9

Annexe B (Informative) Spectre UV/VIS du bergaptène ...............................................................................................................10

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................11

© ISO 2021 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets rédigées par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, de la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de

l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les

obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 54, Huiles essentielles.

Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 7358:2002), qui a fait l’objet d'une

révision technique.
La principale modification par rapport à l’édition précédente est la suivante:
— ajout d’une méthode alternative utilisant une colonne en phase inverse.

Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent

Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent

document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes

se trouve à l’adresse www .iso .org/ members .html.
iv © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 7358:2021(F)
Huiles essentielles de bergamote, de citron, de bigarade
et de limette complètement ou partiellement privées de
bergaptène — Détermination de la teneur en bergaptène
par chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
1 Domaine d’application

La présente Norme internationale spécifie une méthode d’analyse par chromatographie liquide haute

performance (CLHP), en utilisant soit un étalon interne, soit un étalon externe, pour la détermination

de la teneur en bergaptène des huiles essentielles de bergamote [Citrus aurantium ssp. bergamia (Risso

et Poit.) Wight et Arn. ex Engl.], de citron [Citrus limon (L.) Burm. f.], de bigarade (Citrus bigaradia

Risso) et de limette [Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle et Citrus latifolia Tanaka], complètement ou

partiellement privées de bergaptène.
2 Références normatives

Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur

contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.

Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les

éventuels amendements).
ISO 356, Huiles essentielles — Préparation des échantillons pour essai

ISO 8432, Huiles essentielles — Analyse par chromatographie liquide sous pression — Méthode générale

3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:

— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp

— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
4 Principe

Les teneurs en bergaptène des échantillons à doser sont déterminées après dilution par CLHP en phase

inverse ou par CLHP en phase normale avec gradient d’élution, par une méthode d’étalonnage interne

ou externe et une détection par spectromètre UV à barrettes de diodes.
5 Réactifs
Utiliser uniquement les réactifs de qualité analytique reconnue suivants.

5.1 Substance de référence: bergaptène (5-Méthoxypsoralène), C H O , masse molaire = 216,19 g/

12 8 4
mol de pureté connue ≥ 95 %.

5.2 Étalon interne: coumarine (1-Benzopyran-2-one), C H O , masse molaire = 146,14 g/mol de

9 6 2
pureté connue ≥ 98 %.
© ISO 2021 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(F)
5.3 Solvants.
5.3.1 Solvants pour CLHP en phase normale.

5.3.1.1 Chloroforme, de pureté analytique, contenant moins de 2 % (fraction volumique) d’éthanol,

à utiliser lors de la préparation de l’échantillon d’huile essentielle contenant du bergaptène, l’étalon

interne et la phase mobile.
5.3.1.2 Hexane, de qualité CLHP, à utiliser dans la phase mobile (5.3.1.4).

5.3.1.3 Acétate d'éthyle, de qualité CLHP, à utiliser dans la phase mobile (5.3.1.4).

5.3.1.4 Phase mobile. Utiliser des solvants de qualité compatible avec le système de détection utilisé

et les préparer en quantité suffisante pour l’ensemble de l’analyse. Préparer, à titre indicatif, un des

mélanges suivants:

5.3.1.4.1 Hexane (5.3.1.2) et acétate d'éthyle (5.3.1.3), mélangés dans un rapport volumique de 80:20.

5.3.1.4.2 Hexane (5.3.1.2) et chloroforme (5.3.1.1), mélangés dans un rapport volumique de 85:15.

5.3.2 Solvants pour CLHP en phase inverse. Le solvant utilisé pour la phase mobile est un mélange

ternaire préparé à partir de ces trois solvants ci-dessous, comme décrit dans le Tableau 1 (voir 8.2.2.3).

5.3.2.1 Eau distillée, de qualité CLHP, à utiliser dans la phase mobile (5.3.1.4).

5.3.2.2 Acétonitrile, de qualité CLHP, à utiliser dans la phase mobile (5.3.1.4).

5.3.2.3 Méthanol, de qualité CLHP, à utiliser dans la phase mobile (5.3.1.4).

5.3.2.4 Solvant de dilution, méthanol (5.3.2.3) et d’acétonitrile (5.3.2.2) mélangés dans un rapport

volumique de 80:20.
6 Appareillage
Utiliser le matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Matériel courant de laboratoire
6.1.1 Fioles jaugées: 100 ml, 50 ml, 10 ml.

6.1.2 Pipettes Pasteur; pipettes jaugées: 1 ml, 5 ml, 10 ml et 20 ml; micropipette: 500 µl.

6.1.3 Seringues à usage unique.
6.1.4 Filtre PTFE: 0,45 µm.
6.1.5 Flacons pour injection en CLHP.
6.1.6 Balance de précision.
2 © ISO 2021 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/FDIS 7358:2021(F)
6.2 Système de CLHP
6.2.1 Chromatographe pour phase liquide.

6.2.2 Colonne pour CLHP en phase normale, en acier inoxydable, d’une longueur comprise entre

150 mm et 250 mm, de diamètre intérieur compris entre 4 mm et 5 mm et garnie d’une phase stationnaire

de silice granulée de qualité CLHP, présentant une granulométrie voisine de 5 µm.

6.2.3 Colonne pour CLHP en phase inverse, en acier inoxydable, d’une longueur de 150 mm (ou

250 mm), de diamètre intérieur de 4,6 mm et garnie d’une phase stationnaire de type C18 présentant

une granulométrie voisine de 3,5 µm (ou 5 µm), par exemple Zorbax Eclipse Plus C18: 3,5 µm

(4,6 × 150) mm d’Agilent.

6.2.4 Système à pompe ternaire permettant la programmation de gradients de solvants.

6.2.5 Système de dégazage des solvants (facultatif), par exemple une cuve à ultrasons.

6.2.6 Système de détection, pouvant êt
...