ISO 16266:2006

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration

ISO 16266:2006 specifies a method for the isolation and enumeration of Pseudomonas aeruginosa in samples of bottled water by a membrane filtration technique. This method can also be applied to other types of water with a low background flora, for example, pool waters and waters intended for human consumption.

Qualité de l'eau — Détection et dénombrement de Pseudomonas aeruginosa — Méthode par filtration sur membrane

L'ISO 16266:2006 spécifie une méthode permettant d'isoler et de dénombrer Pseudomonas aeruginosa dans des échantillons d'eau embouteillée, par filtration sur membrane. Cette méthode peut également être appliquée à d'autres types d'eau présentant une faible flore interférente, par exemple les eaux de piscine et les eaux destinées à la consommation humaine.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 19-Apr-2006
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 4 - Microbiological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 4 - Microbiological methods
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 22-Mar-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16266
First edition
2006-04-15


Water quality — Detection and
enumeration of Pseudomonas
aeruginosa — Method by membrane
filtration
Qualité de l'eau — Recherche et dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Méthode par filtration sur membrane





Reference number
ISO 16266:2006(E)
©
ISO 2006

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ISO 16266:2006(E)
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Published in Switzerland

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ISO 16266:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 2
4 Principle. 2
5 Diluents, culture media and reagents. 2
6 Apparatus and glassware . 5
7 Sampling. 5
8 Procedure . 6
9 Expression of results . 7
10 Test report . 8
11 Performance data. 8
12 Interferences . 9
13 Quality assurance. 9
Annex A (informative) Further information about Pseudomonas aeruginosa. 10
Annex B (informative) Alternative media . 11
Bibliography . 12

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ISO 16266:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16266 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods.
This International Standard is the equivalent of EN 12780:2002.
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ISO 16266:2006(E)
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen of man that is capable of growth in water at very low
nutrient concentrations. At source and during marketing, a natural mineral water or a spring water is to be free
[1]
from Pseudomonas aeruginosa in any 250 ml sample examined (see, e.g. Council Directive 80/777/EEC and
[2]
Council Directive 96/70/EC ). Other bottled waters offered for sale are also to be free of Pseudomonas
[3]
aeruginosa in any 250 ml sample (see, e.g. Council Directive 98/83/EC ). Other waters, including pool waters
and water for human consumption, may sometimes be tested for Pseudomonas aeruginosa for reasons of public
health. In these cases, it is typical to examine 100 ml volumes.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16266:2006(E)

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa — Method by membrane filtration
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This standard does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with
its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices and to
ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the isolation and enumeration of Pseudomonas aeruginosa in
samples of bottled water by a membrane filtration technique. This method can also be applied to other types of
water with a low background flora, for example, pool waters and waters intended for human consumption.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 5667-1, Water quality — Sampling — Part 1: Guidance on the design of sampling programmes and
sampling techniques
1)
ISO 5667-2 , Water quality — Sampling — Part 2: Guidance on sampling techniques
ISO 5667-3, Water quality — Sampling — Part 3: Guidance on the preservation and handling of water samples
ISO 6887-1, Microbiology of food and feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 7704, Water quality — Evaluation of membrane filters used for microbiological analyses
ISO 8199, Water quality — General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture
2)
ISO 19458 , Water quality — Sampling for microbiological analysis

1) ISO 5667-1 and ISO 5667-2 are currently undergoing joint revision, which will be published as ISO 5667-1.
2) To be published.
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ISO 16266:2006(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Pseudomonas aeruginosa
micro-organisms that grow on selective media containing cetrimide and produce pyocyanin, or
micro-organisms that grow on selective media containing cetrimide, are oxidase positive, fluoresce under UV
radiation (360 ± 20) nm, and are able to produce ammonia from acetamide
4 Principle
4.1 Filtration
A measured volume of the water sample, or a dilution of the sample, is filtered through a membrane filter of
0,45 µm. The membrane filter is placed on the selective medium and incubated under the conditions specified
for the medium.
4.2 Enumeration
The numbers of presumptive Pseudomonas aeruginosa are obtained by counting the number of characteristic
colonies on the membrane filter after incubation. Pyocyanin-producing colonies are considered as confirmed
Pseudomonas aeruginosa but other fluorescing or reddish brown colonies require confirmation.
4.3 Confirmation
Subcultures of colonies requiring confirmation are made from the membrane filter onto plates of nutrient agar
(but see Annex B). After incubation, cultures that were not initially fluorescent are tested for the oxidase
reaction, and oxidase-positive cultures are tested for the production of fluorescein and the ability to produce
ammonia from acetamide. Cultures that were fluorescent initially are tested for the ability to produce ammonia
from acetamide.
5 Diluents, culture media and reagents
Use reagents of analytical reagent quality in the preparation of culture media and diluents, unless otherwise
specified. Prepare the medium as follows and add the selective agents as supplements at the given
concentrations or use commercially available media and reagents prepared according to the manufacturer’s
instructions. Prepare media and reagents using water grade 3 as specified in ISO 3696, or water of equivalent
purity and free from substances which might inhibit growth under the conditions of the test.
5.1 Culture medium
Use the following medium for the determination of Pseudomonas aeruginosa.
5.1.1 Pseudomonas agar base/CN-agar
5.1.1.1 Composition
Gelatin peptone 16,0 g
Casein hydrolysate 10,0 g
Potassium sulfate (anhydrous) (K SO) 10,0 g
2 4
2 © ISO 2006 – All rights reserved

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ISO 16266:2006(E)
Magnesium chloride (anhydrous) (MgCl) 1,4 g
2
Glycerol 10 ml
Agar 11,0 g to 18,0 g
Water (distilled or equivalent) 1 000 ml
NOTE The amount of agar required depends on the gel strength. Follow the manufacturer’s instructions for the agar
used.
CN supplement
Hexadecyltrimethyl ammonium bromide (cetrimide) 0,2 g
Nalidixic acid 0,015 g
5.1.1.2 Preparation
Suspend the peptone, casein hydrolysate, potassium sulfate, magnesium chloride and agar in 1 000 ml of
distilled water (or equivalent). Add 10 ml of glycerol. Heat to boiling in order to dissolve completely and
sterilize by autoclaving at (121 ± 3) °C for 15 min. Allow the medium to cool to (45 to 50) °C. Add the CN
supplement rehydrated in 2 ml of sterile distilled water, mix well and add to the sterile molten basal medium.
Mix well and pour into sterile Petri dishes to give a depth of at least 5 mm of agar. The final pH of the solidified
medium should correspond to 7,1 ± 0,2 at 25 °C. Store prepared plates in the dark protected from desiccation
at (5 ± 3) °C and use within 1 month. Do not keep the agar molten for
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16266
Première édition
2006-04-15


Qualité de l'eau — Détection et
dénombrement de Pseudomonas
aeruginosa — Méthode par filtration sur
membrane
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas
aeruginosa — Method by membrane filtration




Numéro de référence
ISO 16266:2006(F)
©
ISO 2006

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ISO 16266:2006(F)
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E-mail [e-mail]
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Version française parue en 2007
Publié en Suisse

ii © ISO 2006 – Tous droits réservés

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ISO 16266:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 2
4 Principe. 2
5 Diluants, milieux de culture et réactifs. 2
6 Appareillage et verrerie. 6
7 Échantillonnage . 6
8 Mode opératoire . 6
9 Expression des résultats . 8
10 Rapport d'essai . 9
11 Données de performance. 9
12 Interférences . 9
13 Assurance de la qualité. 9
Annexe A (informative) Informations complémentaires sur Pseudomonas aeruginosa. 10
Annexe B (informative) Autres milieux . 11
Bibliographie . 12

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii

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ISO 16266:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16266 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 4,
Méthodes microbiologiques.
La présente Norme internationale est l'équivalent de l'EN 12780:2002.
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés

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ISO 16266:2006(F)
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est un organisme pathogène pour l'homme, capable de croître dans l'eau à de très
faibles concentrations nutritives. Il convient que toute eau minérale naturelle et toute eau de source soient
exemptes de Pseudomonas aeruginosa à la source ainsi qu'à la date de commercialisation, dans 250 ml
[1] [2]
d'échantillon examiné (voir, par exemple, les directives du Conseil 80/777/CEE et 96/70/CE ). Les autres
eaux commercialisées en bouteilles doivent aussi être exemptes de Pseudomonas aeruginosa, dans 250 ml
[3]
d'échantillon (voir, par exemple, la directive du Conseil 98/83/CE ). D'autres eaux, dont les eaux de piscine
et les eaux destinées à la consommation humaine, peuvent parfois, pour des raisons de santé publique, faire
l'objet d'une recherche de Pseudomonas aeruginosa. Des volumes de 100 ml sont alors généralement
étudiés.

© ISO 2006 – Tous droits réservés v

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NORME INTERNATIONALE ISO 16266:2006(F)

Qualité de l'eau — Détection et dénombrement de
Pseudomonas aeruginosa — Méthode par filtration sur
membrane
AVERTISSEMENT — Il convient que l'utilisateur de la présente Norme internationale connaisse bien
les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter
tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur
de la présente Norme internationale d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de
sécurité et de s'assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais conduits conformément à la présente
Norme internationale soient exécutés par du personnel ayant reçu une formation adéquate.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode permettant d'isoler et de dénombrer Pseudomonas
aeruginosa dans des échantillons d'eau embouteillée, par filtration sur membrane. Cette méthode peut
également être appliquée à d'autres types d'eau présentant une faible flore interférente, par exemple les eaux
de piscine et les eaux destinées à la consommation humaine.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
ISO 5667-1, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 1: Lignes directrices pour la conception des
programmes et des techniques d'échantillonnage
1)
ISO 5667-2:— , Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 2: Guide général sur les techniques
d'échantillonnage
ISO 5667-3, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 3: Lignes directrices pour la conservation et la
manipulation des échantillons d'eau
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 7704, Qualité de l'eau — Évaluation des membranes filtrantes utilisées pour les analyses
microbiologiques

1) L'ISO 5667-1 et l'ISO 5667-2, faisant actuellement l'objet d’une révision conjointe, seront publiées sous le

numéro ISO 5667-1.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1

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ISO 16266:2006(F)
ISO 8199, Qualité de l'eau — Lignes directrices générales pour le dénombrement des micro-organismes sur
milieu de culture
2)
ISO 19458:— , Qualité de l'eau — Échantillonnage pour analyse microbiologique
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Pseudomonas aeruginosa
micro-organismes se développant sur des milieux sélectifs contenant du cétrimide et produisant de la
pyocyanine ou micro-organismes se développant sur des milieux sélectifs contenant du cétrimide, oxydase
positive, donnant lieu à une fluorescence sous rayonnement ultraviolet (360 ± 20) nm et également capables
de produire de l'ammoniac à partir d'acétamide
4 Principe
4.1 Filtration
Un volume mesuré de l'échantillon d'eau ou une dilution de l'échantillon est filtré sur une membrane filtrante
de porosité 0,45 µm. La membrane filtrante est placée sur le milieu sélectif et incubée dans les conditions
spécifiées pour le milieu.
4.2 Dénombrement
Le nombre de Pseudomonas aeruginosa présumés est obtenu par comptage du nombre de colonies
caractéristiques formées sur la membrane filtrante après incubation. Les colonies produisant de la pyocyanine
sont considérées comme Pseudomonas aeruginosa confirmés mais les colonies qui produisent une
fluorescence ou celles de couleur brun rougeâtre nécessitent une confirmation.
4.3 Confirmation
Repiquage des colonies à confirmer à partir de la membrane sur des boîtes de gélose nutritive (mais voir
Annexe B). Après incubation, les cultures qui ne présentaient initialement pas de fluorescence sont soumises
au test de recherche de l'oxydase, puis les cultures oxydase positive sont soumises au test de production de
fluorescéine et examinées pour déceler leur aptitude éventuelle à produire de l'ammoniac à partir d'acétamide.
Les cultures qui présentaient initialement une fluorescence sont examinées pour déceler leur aptitude
éventuelle à produire de l'ammoniac à partir d'acétamide.
5 Diluants, milieux de culture et réactifs
Sauf spécifications contraires, utiliser des réactifs de qualité analytique pour la préparation des milieux de
culture et des diluants. Préparer le milieu comme suit et ajouter les agents sélectifs aux concentrations
données ou utiliser des milieux et réactifs disponibles dans le commerce, préparés conformément aux
instructions du fabricant. Préparer les milieux et réactifs en utilisant de l'eau de qualité 3 spécifiée dans
l'ISO 3696 ou de l'eau de pureté équivalente et exempte de substances pouvant inhiber la croissance dans
les conditions de l'essai.


2) En cours de publication.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés

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ISO 16266:2006(F)
5.1 Milieu de culture
Pour déterminer Pseudomonas aeruginosa, utiliser le milieu suivant.
5.1.1 Base gélosée pour Pseudomonas/gélose CN
5.1.1.1 Composition
Peptone de gélatine 16,0 g
Hydrolysat de caséine 10,0 g
Sulfate de potassium (anhydre) (K SO ) 10,0 g
2 4
Chlorure de magnésium (anhydre) (MgCl ) 1,4 g
2
10 ml
Glycérol
11,0 g à 18,0 g
Gélose
1 000 ml
Eau (distillée ou l'équivalent)
NOTE La quantité de gélose requise dépend du pouvoir gélifiant. Respecter les instructions du fabricant de la gélose
utilisée.
Supplément CN
Bromure d'hexadécyltriméthyl ammonium (cétrimide) 0,2 g
Acide nalidixique 0,015 g
5.1.1.2 Préparation
Mettre en suspension la peptone, l'hydrolysat de caséine, le sulfate de potassium, le chlorure de magnésium
et la gélose dans 1 000 ml d'eau distillée (ou l'équivalent). Ajouter 10 ml de glycérol. Porter à ébullition jusqu'à
dissolution complète et stériliser à l'autoclave à (121 ± 3) °C pendant 15 min. Laisser le milieu refroidir
à (45 à 50) °C. Ajouter le supplément CN réhydraté dans 2 ml d'eau distillée stérile, bien mélanger et ajouter
au milieu de base stérile fondu. Mélanger de nouveau et verser dans des boîtes de Petri stériles de façon à
obtenir une épaisseur minimale de gélose de 5 mm. Il convient que le pH final du milieu solidifié soit égal
à 7,1 ± 0,2 à 25 °C. Conserver les boîtes ainsi préparées à l'abri de la lumière, en évitant toute dessiccation, à
une température de (5 ± 3) °C et les utiliser dans un délai d'un mois. Ne pas conserver la gélose fondue
pendant plus de 4 h. Ne pas faire fondre de nouveau le milieu.
© ISO 2006 – Tous droits réservés 3

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