ISO 20130:2018

Soil quality - Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using colorimetric substrates in micro-well plates

This document specifies a method for the measurement of several hydrolase activities (arylamidase, arylsulfatase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-glucosaminidase, acid, alkaline and global phosphatases, urease) simultaneously (or not) in soil samples, using colorimetric substrates. Enzyme activities of soil vary seasonally and depend on soil chemical, physical and biological characteristics. This method can be applied either to detect harmful effects on soil enzyme activities derived from toxic substances or other anthropogenic agents in contaminated soils against a control soil, or to test chemicals.

Qualité du sol — Mesure de l'activité enzymatique dans des échantillons de sol en utilisant des substrats colorimétriques

Le présent document spécifie une méthode de mesure simultanée (ou non) de plusieurs activités des hydrolases (arylamidase, arylsulfatase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acétylglucosaminidase, phosphatases acides, alcalines et globales, uréase) dans des échantillons de sol en utilisant des substrats colorimétriques. Les activités enzymatiques du sol varient en fonction des saisons et dépendent des caractéristiques chimiques, physiques et biologiques du sol. Cette méthode peut être appliquée soit pour la détection des effets nocifs de substances toxiques ou d'autres agents anthropiques dans un sol contaminé par comparaison avec un sol de référence, soit pour la réalisation d'essais sur des produits chimiques.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 17-Jul-2018
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 4 - Effects on soil micro-organisms
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 09-Jan-2024
• Completion Date: 13-Dec-2025

Overview

ISO 20130:2018 - "Soil quality - Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using colorimetric substrates in micro‑well plates" - specifies a laboratory method to measure multiple soil hydrolase activities using colorimetric substrates and 96‑well microplates. The standard describes simultaneous (or individual) assays for key extracellular enzymes that mediate carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur cycling in soils, providing a reproducible approach for comparing enzyme activity patterns across samples, seasons and treatments.

Key topics and requirements

• Enzymes covered: arylamidase (ARN), arylsulfatase (ARS), β‑galactosidase (β‑GAL), α‑glucosidase (α‑GLU), β‑glucosidase (β‑GLU), N‑acetyl‑glucosaminidase (NAG), acid/alkaline/global phosphatases (PAC/PAK/PHOS), and urease (URE).
• Method principle: incubate soil suspensions with colorimetric substrates in micro‑well plates, stop reactions, centrifuge, transfer supernatants and read absorbance on a microplate UV/Vis spectrophotometer.
• Laboratory conditions: incubation at 25 °C ± 2 °C or 37 °C ± 2 °C; use of deionized water as medium to evaluate native soil enzyme activity at in‑situ pH.
• Reagents and buffers: Tris buffers at defined pH values (e.g., pH 5.5, 7.5, 11, 12) for specific enzymes, calcium chloride, stop/revealing reagents (e.g., salicylate, cyanurate), ethanol/acidified ethanol and colorimetric standards.
• Sample preparation and calibration: standardized soil:water suspension ratio (4 g soil : 25 ml water), establishment of calibration curves (p‑nitrophenol, β‑naphthylamine, ammonia standards), absorbance measurements and result calculations.
• Quality and validation: validity criteria, interlaboratory validation (ring test) and annexes providing validation data and intralaboratory tests.

Applications and who uses it

ISO 20130:2018 is designed for:

• Environmental and soil testing laboratories conducting soil enzyme assays and biological soil quality assessments.
• Ecotoxicologists and regulators assessing soil contamination effects or testing chemicals for adverse impacts on soil biochemical functioning.
• Researchers and agronomists monitoring soil health, nutrient cycling activity, seasonal dynamics of microbial function, and remediation progress. Practical uses include screening contaminated soils versus controls, monitoring remediation or land‑use changes, and generating comparable enzyme activity datasets across studies.

Related standards

• ISO 18400‑206: Soil quality - Sampling - Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for assessment of microbiological processes (normative reference cited in ISO 20130).
• ISO/TC 190: Technical Committee for Soil quality (developmental context).

Keywords: ISO 20130:2018, soil quality, soil enzyme activity, colorimetric substrates, micro‑well plates, hydrolase activities, soil testing, ecotoxicology, soil health.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20130
First edition
2018-07
Soil quality — Measurement of
enzyme activity patterns in soil
samples using colorimetric substrates
in micro-well plates
Qualité du sol — Mesure de l'activité enzymatique dans des
échantillons de sol en utilisant des substrats colorimétriques
Reference number
©
ISO 2018
© ISO 2018
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Published in Switzerland
ii © ISO 2018 – All rights reserved

Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions, symbols and abbreviated terms . 1
3.1 Terms and definitions . 1
3.2 Symbols and abbreviated terms. 1
4 Principle . 2
5 Reactives . 2
5.1 Buffers and reageants . 2
5.2 Substrates and standards . 5
5.2.1 Preparation of standard solutions . 5
5.2.2 Preparation of substrate solutions . 5
6 Apparatus and materials. 7
7 Procedure. 8
7.1 Establishment of calibration curves . 8
7.1.1 General. 8
7.1.2 Solution of PNP . . 8
7.1.3 Solution of β-naphthylamine . 8
7.1.4 Solution of ammonium chloride . 8
7.2 Sampling . 9
7.2.1 Sample preparation . 9
7.2.2 Addition of substrate .10
7.2.3 Absorbance measurements .11
7.2.4 Measurements of urease activities .12
8 Calculation of results .12
9 Expression of results .12
10 Validity criteria .12
11 Interlaboratory validation .13
12 Test report .13
Annex A (informative) Validation of the method and intralaboratory tests for evaluating
soil enzymatic activities with colorimetric method .14
Annex B (informative) International ring test for evaluating soil enzymatic activities
with colorimetric method .19
Bibliography .28
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: www .iso .org/iso/foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4,
Biological characterization.
iv © ISO 2018 – All rights reserved

Introduction
Microorganisms are responsible for many key processes in the cycle of elements. Enzymes are
responsible for the degradation of organic molecules and their mineralization. The main postulate is the
microbial origin of soil enzymes, even if plant root exudates include enzymes. Extracellular enzymes in
soil play key roles in the biodegradation of organic macromolecules. The simultaneous monitoring of
several enzyme activities important in the biodegradation of organic compounds and mineralization
of carbon, nitrogen, phosphorus and sulfur in soil may reveal harmful effects caused by chemicals
and other anthropogenic impacts. However, the measurements carried out under selected laboratory
conditions using artificial substrates cannot be a substitute for the actual rate of enzymatic processes
in soil in situ.
INTERNATIONAL STANDARD ISO 20130:2018(E)
Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns
in soil samples using colorimetric substrates in micro-
well plates
1 Scope
This document specifies a method for the measurement of several hydrolase activities (arylamidase,
arylsulfatase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, N-acetyl-glucosaminidase, acid, alkaline
and global phosphatases, urease) simultaneously (or not) in soil samples, using colorimetric substrates.
Enzyme activities of soil vary seasonally and depend on soil chemical, physical and biological
characteristics. This method can be applied either to detect harmful effects on soil enzyme activities
derived from toxic substances or other anthropogenic agents in contaminated soils against a control
soil, or to test chemicals.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 18400-206, Soil quality — Sampling — Part 206: Collection, handling and storage of soil under aerobic
conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory
3 Terms and definitions, symbols and abbreviated terms
3.1 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http: //www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at https: //www .iso .org/obp
3.2 Symbols and abbreviated terms
ARN Arylamidase
ARS Arylsulfatase
E.C. Enzyme code number by the Nomenclature Committee of the International Union of Bio-
chemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB)
NAG N-acetyl-glucosaminidase
PAC acid phosphatase
PAK alkaline phosphatase
PHOS phosphatase
URE urease
β−GAL β-galactosidase
α−GLU α-glucosidase
β−GLU β-glucosidase
4 Principle
This document describes a method for the simultaneous measurement of several enzymes in soil
samples (see Table 1). It is based on the use of soil samples solutions and colorimetric substrates,
which are incubated during specific times at 25 °C ± 2 °C or 37 °C ± 2 °C in multi-well plates. After
the incubation, reactions are stopped, plates are then centrifuged and supernatants transferred into
new plates. The intensities of the coloration are measured with absorbance with a 96 wells microplate
spectrophotometer UV/visible.
Table 1 — Enzymatic activity measurements with colorimetric method
Enzyme Abbreviation N° Soil cycle Macromolecule degraded
Arylamidase ARN E.C. 3.4.11.2 Nitrogen
Arylsulfatase ARS E.C. 3.1.6.1 Sulfur Mineralization of organic sulfur
β-Galactosidase βGAL E.C. 3.2.1.22 Carbon Hemicellulose
α-Glucosidase αGLU E.C. 3.2.1.20 Carbon Starch and glycogen
β-Glucosidase βGLU E.C. 3.2.1.21 Carbon Cellulose
N-acetyl- NAG E.C. 3.2.1.52 Carbon Chitin and other β-1,4-linked
glucosaminidase glucosamine polymers
Phosphatase PHOS E.C. 3.1.4.1 Phosphorus Phosphate esters
Acid phosphatase PAC E.C. 3.1.4.1 Phosphorus Phosphate esters
Alkaline phosphatase PAK E.C. 3.1.4.1 Phosphorus Phosphate esters
Urease URE E.C. 3.5.1.5 Nitrogen Urea
An interlaboratory trial was carried out for the validation of the standard; summary of the international
ring test is given in Table 8, and the whole data of the interlaboratory validation are described in
Annex B.
5 Reactives
5.1 Buffers and reageants
5.1.1 General
The choice is made to use deionized water as medium to evaluate native soil enzyme activities at soil pH
and also to allow the analysis of multiple enzymes using the same soil suspension. The soil (in g)/water
(in ml) ratio (4:25) is optimized to maximize reaction, sensitivity and facilitate pipetting technique.
The use of the same soil solution for analysing multiple enzymes also makes data more comparable.
Arylamidase is measured with Tris buffer 50 mmol/l, pH 7,5 and acid and alkaline phosphatases are
involved with the use of Tris-HCl 50 mmol/l at pH 5,5 and Tris base 50 mmol/l at pH 11, respectively.
NOTE The volume can be adapted according to needs.
5.1.2 Tris hydrochloride 50 mmol/l pH 5,5 ± 0,1.
— Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (CAS N°: 1185-53-1 – Mw: 157 ,6): 7,88 g;
2 © ISO 2018 – All rights reserved

— deionized water: 1 000 ml;
— hydrochloric acid (HCl) (CAS N°7647-01-0) 1 mol/l.
Dissolve 7,88 g of Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride into 800 ml deionized water and
adjust to pH 5,5 with hydrochloric acid (1 mol/l). Fill in to 1 000 ml. The storage duration shall not
exceed one month at 4 °C ± 2 °C in glass or polypropylene bottle.
5.1.3 Tris base 50 mmol/l pH 11 ± 0,1.
— Tris(hydroxymethyl)aminomethane (CAS N°: 77-86-1 - Mw: 121 ,14): 6,06 g;
— deionized water: 1 000 ml;
— sodium hydroxide (CAS N° 1310-73-2) (1 mol/l).
Dissolve 6,06 g of Tris(hydroxymethyl)aminomethane into 800 ml deionized water and adjust to pH 11
with sodium hydroxide (1 mol/l). Fill in to 1 000 ml. The storage duration shall not exceed one month
at 4 °C ± 2 °C.
5.1.4 Tris base 50 mmol/l pH 7,5 ± 0,1.
— Tris(hydroxymethyl)aminomethane (CAS N°: 77-86-1 - Mw: 121 ,14): 6,06 g;
— deionized water: 1 000 ml;
— hydrochloric acid (HCl) (CAS N°7647-01-0) 1 mol/l.
Dissolve 6,06 g of Tris(hydroxymethyl)aminomethane into 800 ml deionized water and adjust to pH 7,5
with hydrochloric acid (1 mol/l). Fill in to 1 000 ml. The storage duration shall not exceed one month at
4 °C ± 2 °C.
5.1.5 Tris base 100 mmol/l pH 12 ± 0,1.
— Tris(hydroxymethyl)aminomethane (CAS N°: 77-86-1 - Mw: 121 ,14): 12,11 g;
— deionized water: 1 000 ml;
— sodium hydroxide (CAS N° 1310-73-2) (5 mol/l).
Dissolve 12,11 g of Tris(hydroxymethyl)aminomethane into 800 ml deionized water and adjust to pH
12 with sodium hydroxide (5 M). Fill in to 1 000 ml. The storage duration shall not exceed one month at
4 °C ± 2 °C.
5.1.6 Calcium chloride dihydrate 0,5 mol/l.
— calcium chloride dihydrate (CAS N°: 10035-04-8 - Mw: 147 ,01): 14,7 g;
— Deionized water: 200 ml.
Dissolve 14,7 g of calcium chloride dihydrate in 200 ml of deionized water. The storage duration shall
not exceed one month at 4 °C ± 2 °C.
5.1.7 Salicylate reagent.
— sodium salicylate 270 mmol/l (CAS N°: 54-21-7 - Mw: 160 ,1): 865 mg;
— tri sodium citrate 145 mmol/l (CAS N°: 6132-04-3 - Mw: 294 ,1): 853 mg;
— di sodium tartrate 60 mmol/l (CAS N°: 6106-24-7 - Mw: 230 ,08): 276 mg;
— sodium nitroferricyanide 2 mmol/l (CAS N°: 13755-38-9 - Mw: 297 ,95): 12 mg;
— deionized water: 20 ml.
Salicylate reagent is prepared with the 4 compounds listed above just before analysis; dissolve 865 mg
of sodium salicylate, 853 mg of tri sodium citrate, 276 mg of di sodium tartrate and 12 mg of sodium
nitroferricyanide in 20 ml of deionized water.
5.1.8 Cyanurate reagent.
— tri sodium citrate 580 mmol/l (CAS N°: 6132-04-3 - Mw: 294 ,1): 3,4 g;
— di sodium tartrate 90 mmol/l (CAS N°: 6106-24-7 - Mw: 230 ,08): 414 mg;
— lithium hydroxide 280 mmol/l (CAS N° : 1310-65-2 - Mw: 23 ,95): 134 mg;
— dichloroisocyanurate 10 mmol/l (CAS N° : 51580-86-0 - Mw: 255 ,98): 51 mg;
— deionized water: 20 ml.
Cyanurate reagent is prepared with the 4 compounds listed above just before analysis; dissolve
3,4 g of tri sodium citrate, 414 mg of di sodium tartrate, 134 mg of lithium hydroxide and 51 mg of
dichloroisocyanurate in 20 ml of deionized water.
5.1.9 Ethanol, 96 %.
— Ethanol 96 % (CAS N° 41340-36-7).
5.1.10 Acidified ethanol (0,26 mol/l HCl).
— Hydrochloric acid ACS reagent, 37 % (CAS N°7647-01-0) 4,32 ml;
— Ethanol 96 % (CAS N° 41340-36-7).
Dilute 4,32 mL of concentrated HCl into 200 ml ethanol 96 %. The storage duration shall not exceed one
month at 4 °C ± 2 °C.
5.1.11 p-dimethylaminocinnamaldehyde (DMCA) (3,5 mmol/l).
— DMCA (CAS N°: 6203-18-5 - Mw: 175 ,23): 0,12 g;
— Ethanol 96 % (CAS N° 41340-36-7).
Dissolve 0,12 g of DMCA into 200 ml ethanol 96 %. The storage duration shall not exceed one week at
−20 °C ± 2 °C.
Table 2 — Buffer utilization for enzymatic activity measurement
ARS; α-GLU;
β-GLU; β-GAL; ARN URE PAC PAK
NAG; PHOS;
Soil solution deionized water Tris base deionized water Tris HCl Trisbase
50 mmol/l, pH 7,5 50 mmol/l, 50 mmol/l, pH 11
pH 5,5
Stop/ Tris 100 mmol/l Ethanol 96 % salicylate reagent Tris 100 mmol/l pH 12
revelation pH12 Acidified ethanol
CaCl 0,5 mol/l DMCA cyanurate reagent CaCl 0,5 mol/l
2 2
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5.2 Substrates and standards
5.2.1 Preparation of standard solutions
5.2.1.1 Para-nitrophenol (CAS N°: 100-02-7 - PNP) at 3,6 mmol/l.
— para-nitrophenol (PNP) (Mw: 139 ,11): 10 mg;
— deionized water: 20 ml.
PNP as a powder should be stored at −20 °C ± 2 °C and protected from light. Weigh PNP carefully and
dissolve it into deionized water. Working concentration is 0,36 mM (i.e. dilution of the concentrated
solution 1/10). The storage of the concentrated and working concentrations shall not exceed two years
at −20 °C ± 2 °C. Solutions could be aliquoted for one use or maximum 3 freeze/defreeze cycles.
NOTE Paranitrophenol can cause damage to organs through prolonged or repeated exposure if swallowed
(H373) and harmful if swallowed, in contact with skin or if inhaled (H302, H312, and H332). Appropriated
ventilation and protections need to be used.
5.2.1.2 Ammonium chloride (NH Cl) at 62 mmol/l.
— ammonium chloride (CAS N°: 12125-02-9 - Mw: 53 ,49): 66,4 mg;
— deionized water: 20 ml.
Ammonium chloride as a powder can be stored at room temperature and protected from light. Weigh
ammonium chloride carefully and dissolve it into water. The concentrated solution should be stored
at −20 °C ± 2 °C for two years. The storage of the concentrated solution shall not exceed two years
at −20 °C ± 2 °C. Working concentration is 0,62 mmol/l (dilution 1/100). The storage of the working
concentration shall not exceed two years at −20 °C ± 2 °C.
5.2.1.3 β-naphthylamine, 1 mmol/l.
— β-naphthylamine (CAS N°: 91-59-8 - Mw: 143 ,19): 35,8 mg;
— ethanol 96 %: 20 ml;
— deionized water.
Dissolve 35,8 mg of β-naphthylamine into 50 ml ethanol 96 % (0,071 %). This 5 mmol/l stock solution
shall be stored at −20 °C for one year. Working concentration is 1 mmol/l (dilution 1/5 in water) and
shall be stored at −20 °C ± 2 °C for one year.
NOTE β-Naphtylamine has acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4, respiratory sensitization,
1)
category 1, and hazardous to the aquatic environment. Eyeshields , full-face particle respirator type N100
2) 3)
(US) , appropriated ventilation, specific gloves , glasses and protective screen need to be used.
5.2.2 Preparation of substrate solutions
Commercially available colorimetric substrates are delivered as powders that should be stored,
according to the specifications, frozen at −20 °C ± 2 °C or cooled at 4 °C ± 2 °C or stored at room
1) https: //www .sigmaaldrich .com/labware/labware -products .html ?TablePage = 20009868
2) http: //www .sigmaaldr ich .com/catalog/sear ch ?int erf ace = Substance & t erm =
msaadvantageseries1000fullfacerespirator1234598765+OR+msaultratwinfullfacerespirator1234598765 & focus =
product & mode = boolean
3) http: //www .sigmaaldrich .com/labware/labware -products .html ?TablePage = 9577418
temperature (RT). All the substrates should be prepared in advance according to the requirements of
Table 3.
NOTE The volume needs to be sufficient for reliable weighing and measurement of substrates. It depends
also on the number of plates needed. Examples are given in Table 3.
Table 3 — Colorimetric substrates available commercially for enzymatic activity measurements
and their preparation for measures
a
Enzyme Substrate Molar Concentration Examples of Storage of solu-
(Storage temperature) mass preparation tions
g/mol mol/l Temperature,
duration
Arylamidase L-leucine 292,8 0,008 Dissolve −20 °C ± 2 °C
β-naphthylamide 0,2342 g in
1 year
hydrochloride 50 ml of
deionized
(−20 °C ± 2 °C)
water
CAS N°: 893–36–7
Arylsulfatase Potassium 4-nitrophenyl 257,26 0,025 Dissolve −20 °C ± 2 °C
sulfate 0,322 g in
1 year
50 ml of
(−20 °C ± 2 °C)
deionized
water
CAS N°: 6217–68–1
β-Galactosidase p-nitrophenyl β-D-ga- 301,25 0,05 Dissolve −20 °C ± 2 °C
lactopyranoside 0,753 g in
1 year
50 ml of
(−20 °C ± 2 °C)
deionized
CAS N°: 3150–24–1 water
α-Glucosidase 4-nitrophenyl α-D-glu- 301,25 0,025 Dissolve −20 °C ± 2 °C
copyranoside 0,375 g in
1 year
50 ml of
(−20 °C ± 2 °C)
deionized
water
CAS N°: 3767–28–0
β-Glucosidase 4-nitrophenyl β-D-glu- 301,25 0,05 Dissolve −20 °C ± 2 °C
copyranoside 0,753 g in
1 year
50 ml of
(−20 °C ± 2 °C)
deionized
CAS N°: 2492–87–7 water
a
Sigma-Aldrich is an example of producer of colorimetric substrates. This information is given for the convenience of
users of this international standard and does not constitute an endorsement by ISO of these products. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
NOTE  All Substrates need to be manipulated with appropriated ventilation, specific gloves, and protective screen.
6 © ISO 2018 – All rights reserved

Table 3 (continued)
a
Enzyme Substrate Molar Concentration Examples of Storage of solu-
(Storage temperature) mass preparation tions
g/mol mol/l Temperature,
duration
N-acetyl- para-nitrophenyl N-acethyl 342,31 0,01 Dissolve −20 °C ± 2 °C
glucosaminidase β-D glucopyranoside 0,171 g in
1 year
50 ml of
(−20 °C ± 2 °C)
deionized
CAS N°: 3459–18–5 water
Phosphatase 4-nitro-phenylphosphate 371,12 0,05 Dissolve −20 °C ± 2 °C
disodium salt 0,928 g in
Acid phosphatase 1 year
hexahydrate 50 ml of
and deionized
(+4 °C ± 2 °C)
water
Alkaline
CAS N°: 333338–18–4
phosphatase
Urease Urea > 98 % 60,06 0,4 Dissolve +4 °C
0,480 5 g in
(RT) 1 week
20 ml of
deionized
CAS N°: 57–13–6
water
a
Sigma-Aldrich is an example of producer of colorimetric substrates. This information is given for the convenience of
users of this international standard and does not constitute an endorsement by ISO of these products. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
NOTE  All Substrates need to be manipulated with appropriated ventilation, specific gloves, and protective screen.
6 Apparatus and materials
In addition to usual laboratory equipment the following materials are required:
6.1 Sieves, with grid size 2 mm, up to 5 mm according to soil texture and humidity.
NOTE Other grid sizes can be used depending on the soil texture.
6.2 Balance (±0,001 g).
6.3 Orbital shaker.
6.4 Multi-well plates, 96 wells, polystyrene, with flat bottoms but without treatment, with lids.
6.5 Automatic dispenser for water (optional).
NOTE Compared with manual pipetting, an automatic dispenser decreases the uncertainty of volumes
dispensed significantly.
6.6 Multichannel micropipettes (50 µL and 200 µL).
6.7 Incubators, set at 25 °C ± 2 °C and 37 °C ± 2 °C.
6.8 Plate centrifuge, with temperature regulation at 20 °C and acceleration of 1 500 g.
6.9 Plate reading spectrophotometer, with reading at 405 nm ± 5 nm, 540 nm ± 5 nm and
650 nm ± 5 nm (monochromator or BP ± 10 nm).
7 Procedure
7.1 Establishment of calibration curves
7.1.1 General
Calibration curves require several concentrations of para-nitro phenol (PNP), ammonium chloride
(NH Cl) or β-naphthylamine, at least in duplicates, preferably in triplicates; all the volumes are given
per well. Homogenizations are realized with a micropipette and 2 or 3 aspirations/ejections. Exposure
to light shall be limited during preparation of standard curves. Examples of calibration curves are given
in Annex B.
7.1.2 Solution of PNP
The stock solution of PNP with a concentration of 0,36 mmol/l is used to establish the calibration curve.
Distribute the volumes needed into multi-well plate wells for concentrations 0 nmol/ml, 14 nmol/
ml, 29 nmol/ml, 72 nmol/ml, 140 nmol/ml, 220 nmol/ml, 290 nmol/ml and 360 nmol/ml in replicate
(Table 4).
Table 4 — Preparation of calibration curve of para-nitrophenol in 96 wells microplate
[PNP]
0 14 29 72 140 220 290 360
nmol/ml
PNP (µl) 0 5 10 25 50 75 100 125
Water (µl) 125 120 115 100 75 50 25 0
To reveal yellow coloration of PNP, 25 µl of water, 25 µl of calcium chloride and 100 µl of basic Tris base
100 mmol/l pH 12 are added. After homogenization, 200 µl are transferred in new plates and reading of
absorbance is realized with a microplate spectrophotometer at 405 nm.
7.1.3 Solution of β-naphthylamine
The working solution of β-naphthylamine with a concentration of 1 mmol/l, is used to produce the
standard curve. Distribute the volumes needed into multi-well plate wells for concentrations 0 nmol/
ml, 10 nmol/ml, 20 nmol/ml, 50 nmol/ml, 100 nmol/ml, 200 nmol/ml (Table 5).
Table 5 — Preparation of calibration curve of β-naphthylamine in 96 wells microplate
[β-Naphthylamine]
0 10 20 50 100 200
nmol/ml
β-Naphthylamine (µl) 0 1 2 5 10 20
Tris buffer 50 mmol/l pH 7,5 (µl) 50 49 48 45 40 30
Ethanol 96 % (µl) 50 50 50 50 50 50
To reveal coloration of β-naphthylamine, 100 µl acidified ethanol and 100 µl of
p-dimethylaminocinnamaldehyde (DMCA) are added and mixed. After 20 min incubation in the dark at
room temperature, the absorbance is read with a microplates spectrophotometer UV/visible at 540 nm.
7.1.4 Solution of ammonium chloride
The stock solution of ammonium chloride with a concentration of 62 mmol/l is diluted 1/100 and
working solution with 0,62 mmol/L (620 nmol/ml) is used to produce the standard curve. Distribute
the volumes needed into multi-well plate wells for concentrations 0 nmol/ml, 6 nmol/ml, 16 nmol/ml,
31 nmol/ml, 62 nmol/ml, 155 nmol/ml, 233 nmol/ml and 310 nmol/ml in replicate (Table 6).
8 © ISO 2018 – All rights reserved

Table 6 — Preparation of calibration curve of ammonium chloride in 96 wells microplate
[NH Cl]
0 6 16 31 62 155 233 310
nmol/ml
NH Cl (µl) 0 2 5 10 20 50 75 100
Water (µl) 200 198 195 190 180 150 125 100
To quantify NH Cl concentration, 40 µl of the salicylate reagent are added to each well. After a 3 min
reaction period, 40 µl of cyanurate reagent are dispensed into each well, and each well homogenized
then incubated in dark for 30 min (absorbance is stable for two hours). After incubation, plates are
homogenized with a micropipette (2 or 3 aspirations/ejections) and 200 µl are transferred in new plates
and the reading of absorbances is realized with a microplates spectrophotometer UV/visible at 650 nm.
7.2 Sampling
7.2.1 Sample preparation
7.2.1.1 Homogenization
Take and handle soil samples shall be as specified in ISO 18400-206. A composite sample taken from the
field, homogenized and sieved through 2 mm mesh (up to 5 mm according to soil texture and humidity),
has been observed to yield reasonably low uncertainty of measurement for soil samples.
To improve the link between in situ activities, samples should be stored at 15 °C ± 2 °C until four days.
But, if it is not possible, weakest modifications will occur with storage at −80 °C ± 5 °C. The storage at
−20 °C ± 2 °C before or after sieving is not suitable.
The sieved soil is homogenized, and triplicate of exactly 4 g are weighed and deposited into flat bottom
flask (30 to 60 ml). Twenty-five ml of deionized water and cross shaped stirring bars are added.
−1
Containers are closed and homogenized for 10 min on orbital agitator (250 min ).
7.2.1.2 Preparation of sample plates
Cross shaped stir bars cross are added in flat bottom flask and soil suspension shall stay under stirring
during pipetting. Use multichannel micropipettes (one to three channels) to distribute each soil
suspension in microplates, in four replicate wells, with a specific volume according to Table 7 (part A),
and place the lid on each plate. Three wells are analytical points and one well is the blank (to reveal
chemical interactions with soil compounds). Prepare a same number of plates as enzyme tested (one
plate per one enzyme).
NOTE 1 An example of plate schedule is described in Figure 1.
NOTE 2 There is a possibility that humic soils necessitate the use of enlarged cones for the pipetting.
Key
S1 sample number
a, b, c triplicate of sample
T control well for each soil
Figure 1 — Example of sample organization in plates for each enzyme
7.2.2 Addition of substrate
Simple organization would occur if one plate is used for one enzyme. When all samples are distributed
in plates, use multichannel micropipettes to distribute each substrate, in three replicates and
homogenized with 2 or 3 aspirations/ejections, and incubate the multi-well plates (Table 7 part A).
After incubation, reactions are stopped, plates are centrifuged 5 min at 1 500 g and the supernatants
are transferred in new plates. Then, absorbance is measured on a spectrophotometer for microplates.
Table 7 part B summarizes protocols for each enzyme measurement.
Table 7 — Specific experimental details for enzyme activity measurements
PHOS
A
ARN ARS β-GAL α-GLU β-GLU NAG PAC URE
INCUBATION
PAK
Soil solution (µl) 125 50
Substrate (µl) 25 40
Deionized water
0 (+40 µl in
(µl)
control wells)
Incubation time 2H 4H 2H 1H 1H 1H 0H30 3H
Incubation
37 °C 25 °C
temperature
B
STOP REACTION
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Table 7 (continued)
PHOS
A
ARN ARS β-GAL α-GLU β-GLU NAG PAC URE
INCUBATION
PAK
In each well:
In each well:
In each well:
40 µl salicylate
25 µl CaCl reagent
150 µl Ethanol
Stop reaction
96 %
100 µl Trizma pH 12 40 µl cyanurate
reagent
homogenization
homogenization
homogenization
25 µl in
Substrate 25 µl in control wells
control wells
30 min, RT,
Incubation
in dark
Centrifugation 5 min, 1 500g
Transfer 100 µl 200 µl
100 µl acidified
ethanol
Revelation 100 µl DMCA
20 min, RT,
in dark
Reading λ = 540 nm λ = 405 nm λ = 650 nm
NOTE 1 Incubation temperature affects reaction rates and optimum depends on the enzymes. For specific
purposes, a different temperature as described in this document can be used, e.g. in situ temperature.
NOTE 2 For urease activity, it is necessary to quantify free ammonium brought by urea solution and subtract
it from ammonium quantified after soil incubation to obtain specific ammonium released by urease. Urea control
is prepared with 40 µl urea, 200 µl of deionized water, 40 µl salicylate reagent and 40 µl cyanurate reagent. After
30 min of incubation, 200 µl are transferred into new wells and absorbances are reading at 650 nm.
After incubation, the reactions are stopped according to enzyme specific protocols (Table 7).
7.2.3 Absorbance measurements
7.2.3.1 Measurements of enzyme activities with PNP as reaction product (ARS, β-GAL, α-GLU,
β-GLU, NAG, PHOS, PAC, PAK)
The addition of 25 µl of calcium chloride and 100 µl of basic Tris buffer pH 12 stops the reaction, and
it is the key action to eliminate colloids which introduce turbidity in solutions and increase pH for
PNP quantification. Add 25 µl of substrate in control wells and homogenise with 2 or 3 aspirations/
rejections. Furthermore, plates are centrifuged five minutes at 1 500 g and 20 °C, and 200 µl of the
supernatant transferred in a new plate. The reading of absorbance is realized with a microplates
spectrophotometer UV/visible at λ = 405 nm.
7.2.3.2 Measurements of arylamidase activities (ARN)
After incubation, add 150 µl ethanol 96 % in each well (including controls) and 25 µl substrate solution
in control wells. The plate is centrifuged 5 min at 1500 g and 100 µl of supernatant are transferred into
a new plate. To reveal the quantity of naphthylamine produced, 100 µl of acidified ethanol and 100 µl
of DMCA were added in all wells and homogenized with a micropipette (2 aspirations/ejections). After
20 min, reading of absorbance is realized with a microplates spectrophotometer UV/visible at 540 nm.
7.2.4 Measurements of urease activities
After incubation of 3 h, 40 µl of the salicylate reagent are added to each well, including controls. After
a 3 min reaction period, 40 µl of cyanurate reagent is dispensed into each well including controls.
Colorimetric reaction is achieved in 30 min and stable for two hours. Furthermore, plates are centrifuged
five minutes at 1 500 g and 20 °C, and 200 µl of the supernatant are transferred in a new plate. The
reading of absorbance is performed with a microplate spectrophotometer UV/visible at λ = 650 nm.
8 Calculation of results
The standard curve is plotted for PNP or β-naphthylamine and ammonium chloride nanomolar
concentration (nmol/ml) versus absorbance. The PNP or β-naphthylamine or ammonium chloride
concentration of blank (C ) and sample (C ) are read from the standard curve.
b s
Examples of calibration curves are given in Annex B.
The result is calculated by subtracting measurement of blank from triplicate of sample and multiplying
the difference with dilution factor (D) and soil volume (V ), and dividing with reaction time and dry
ss
mass of sample (W ).
ds
()CC−×DV×
sb ss
A= (1)
RT×W
ds
where
A is the enzymatic activity in mU/g of dry sample (nmol/min/g of dry sample);
C is the concentration of product formed in sample (nmol/ml);
s
C is the concentration of product formed in blank (nmol/ml);
b
D is the dilution of sample in microplate;
V is the volume of sample solution (ml);
ss
RT is the reaction time (min);
W is the mass of dry sample (g).
ds
9 Expression of results
Results are expressed as milliunit for one gram of dry soil corresponding to nmole of PNP, β-naphthylamine
or ammonium chloride released per minute and g soil dry mass of sample. The measurements necessary
for each expression, percentage of dry matter determination shall be carried out.
−1
NOTE The more practical and commonly unit used for enzymatic activity is Units (U) = 1 μmol min . For
soil, activity expressed as milliunit for one gram of dry soil (mU/g DS).
Soil characteristics vary widely due to geography, climate and land use. The interpretation of results
cannot, presently, be based on set limit values for each enzyme activity. The experimental design shall
facilitate comparisons with a control soil or between samples from relevant sites.
10 Validity criteria
a) The standard curve is valid if the following criteria are met (according to the results of the ring test
summarized in Annex B):
— r ≥ 0,990;
12 © ISO 2018 – All rights reserved

— the absorbance for PNP standard curve range is within [0,04 - 1,8] ± 10 %;
— the absorbance for β-naphtylamine standard curve range is within [0,06 - 2,3] ± 10 %;
— the absorbance for ammonium standard curve range is within [0,05 - 1,6] ± 10 %.
b) For the samples:
— Triplicates % CV shall be ≤ 15 %;
— Urea blank absorbance shall be ≤ 0,2;
— For urease measurements, sample blank shall be ≤ 1;
— Differences of absorbance for sample assay and blank shall be ≥ 0,02 to 0,05 according to
spectrophotometer sensibility and repeatability.
11 Interlaboratory validation
Summary of the international ring test is given in Table 8, and the whole data of the interlaboratory
validation are described in Annex B.
Table 8 — synthetic data of interlaboratory study
α-GLU β-GLU PHOS PAC PAK ARS β-GAL NAG URE ARN
4,0 to 2,4 to 4,2 to 4,3 to 3,8 to 2,7 to 3,9 to 5,4 to 5,5 to 4,3 to
CV
r
27,7 % 15,2 % 9,7 % 13,0 % 14,1 % 10,4 % 18,4 % 23,3 % 16,2 % 13,1 %
9,7 to 9,5 to 27,4 to 12,6 to 5,7 to 15,5 to 21.7 to 9,8 to 14,0 to 15,9 to
CV
R
17,9 % 24,0 % 36,5 % 23,0 % 23,3 % 30,5 % 32,6 % 19,6 % 35,9 % 31,9 %
(Abbreviations: CVr: range of variability of the mean intralaboratory coefficients of variation for all
laboratories (calculated for each activity considering all soils and a single laboratory). CV : range of
R
variability of the mean interlaboratory coefficients of variation for all soils (calculated for each activity
considering all laboratories and a single soil)
12 Test report
The test report shall include following information:
a) a reference to this document, i.e. ISO 20130:2018;
b) adequate identification of the sample;
c) details of storage temperature and duration;
d) type of soil, soil physical and chemical characterization, water content, soil temperature at sampling
time (pH value of the soil sample);
e) incubation conditions applied;
f) test results;
g) any detail not specified in this document or which are optional, as well as any effect which may
have affected the results.
Annex A
(informative)
Validation of the method and intralaboratory tests for evaluating
soil enzymatic activities with colorimetric method
A.1 Aim
Evaluate validity of the method described in this document to assess the soil enzymatic activities in
microplates with colorimetric methods. The validation is performed with comparison tests for specificity,
sensibility, linearity, specific operating parameters and the robustness with the operator effect.
A.2 Background
The intralaboratory test is realized in ECOSYS unit, Plateforme Biochem-Env, INRA, France.
A.3 Test materials and methodology
Effect of sieving were tested on PHOS, GLU, ARS, GAL, NAG, URE and ARN activities, on 4 soils (1 sandy
soil, 1 clay loamy soil, 2 silt loam soils).
Effect of pH reaction: 2 soils were tested for each enzyme activity and prepared in water or in Tris
buffer 50 mmol/l, pH[5-9].
Incubation time effect: For each enzyme, 4 incubations times are chosen to evaluate the robustness of
the method according to Table A.1.
Table A.1 — Range of incubation time tested on enzymatic activities
PHOS-
Enzymes ARN ARS β-GAL α-GLU β-GLU NAG URE
PAC-PAK
Incubation 30–60– 60–120– 60–120– 30–60–90– 30–60–90– 30–60–90– 15–30–45– 60–120–
times (min) 120–180 180–240 180–240 120 120 120 60 180–240
Operator effect: 3 soils were analysed by four different persons for each enzyme to evaluate
operator effect.
Specificity for each enzyme is testing on a clay loamy soil with or without autoclaving.
Validation parameters: linearity of product detection: Standard curve are realized with PNP (0 µmol/l
to 600 µmol/l), ammonium chloride (0 µmol/l to 600 µmol/l) and β-naphtylamine (0 µmol/l to
300 µmol/l).
Linearity of soil response: soil solutions with 0,5 g to 12 g of soils and 25 ml of distilled water were used
for enzymatic activities measurements.
Limits of quantification and precision: dispersion parameters are determined with accuracy profile,
which combined ISO 17025 and estimation of the uncertainty of measurements. The methods based on
the use of the total error derived from performance criteria such trueness and precision [4, 12]. Four
soils (sandy, loamy, clay and humic soils) were analysed in triplicate, with 3 repetitions (repeatability)
and 6 series (intermediate precision).
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A.4 Data analysis
Robustess of the method
Operator effect: there is no operator effect, whatever enzyme considered.
Effect of sieving: no significate difference is noticed for all enzyme and all soils, except for NAG in two
soils (some examples in Table A.2).
Table A.2 — Effect of sieving on enzymatic activities
SOILS SIEVING ENZYMATIC ACTIVITIES (n = 3, mU/g of dry soil)
PHOS β-GLU ARS β-GAL NAG
sandy soil 5 mm 11,20 +/− 0,53 7,67 +/− 0,50 1,08 +/− 0,04 1,10 +/− 0,02 0,82 +/− 0,16
2 mm 10,47 +/− 1,22 7,36 +/− 0,12 1,22 +/− 0,15 1,13 +/− 0,17 0,93 +/− 0,39
clay loamy soil 5 mm 20,09 +/− 0,56 11,14 +/− 0,17 3,52 +/− 0,05 1,39 +/− 0,09 1,84 +/− 0,08
2 mm 21,82 +/− 1,37 11,70 +/− 0,12 3,69 +/− 0,07 1,55 +/− 0,09 1,49 +/− 0,03
silt loamy soil 5 mm 18,87 +/− 0,16 7,38 +/− 0,07 4,47 +/− 0,30 0,95 +/− 0,07 1,31 +/− 0,37
2 mm 17,34 +/− 0,28 7,61 +/− 1,25 4,63 +/− 0,09 0,93 +/− 0,04 1,14 +/− 0,35
silt loamy soil 5 mm 19,10 +/− 1,04 4,86 +/− 0,40 1,45 +/− 0,06 0,94 +/− 0,14 1,74 +/− 0,29
2 mm 18,39 +/− 0,66 4,75 +/− 0,10 1,47 +/− 0,08 0,97 +/− 0,09 1,05 +/− 0,22
Effect of pH reaction: for PNP enzyme model, several authors point optimal activity around pH 6(see
References [5], [22]), arylamidase and urease activity around pH 8. Results showed that for PNP enzyme
(β−GLU, α−GLU, β−GAL, PHOS, ARS, and NAG) [see Figure A.1 a)], optimal activities in Tris 50 mmol/l
pH[5 to 6,5], but higher activities with distilled water. Results for urease activities are quite similar
[Figure A.1 b)]. On the contrary, arylamidase is very sensible to pH solution/soil [Figure A.1 c)], and
optimal conditions are Tris 50 mmol/l pH[7,5 to 8].
a) Effect of buffer on activity of GLU, GAL and NAG activity
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20130
Première édition
2018-07
Qualité du sol — Mesure de l'activité
enzymatique dans des échantillons
de sol en utilisant des substrats
colorimétriques
Soil quality — Measurement of enzyme activity patterns in soil
samples using colorimetric substrates in micro-well plates
Numéro de référence
©
ISO 2018
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
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Fax: [phone]
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Publié en Suisse
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions, symboles et termes abrégés . 1
3.1 Termes et définitions . 1
3.2 Symboles et termes abrégés . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
5.1 Tampons et réactifs . 2
5.2 Substrats et solutions étalons . 5
5.2.1 Préparation des solutions étalons . 5
5.2.2 Préparation des solutions de substrats . 6
6 Appareillage et matériaux . 7
7 Mode opératoire. 8
7.1 Préparation des courbes d’étalonnage . 8
7.1.1 Généralités . 8
7.1.2 Solution de PNP . 8
7.1.3 Solution de β-naphtylamine . 8
7.1.4 Solution de chlorure d’ammonium . 9
7.2 Échantillonnage . 9
7.2.1 Préparation de l’échantillon . 9
7.2.2 Ajout des substrats .10
7.2.3 Mesures d’absorbance .12
7.2.4 Mesures des activités de l’uréase .12
8 Calcul des résultats .12
9 Expression des résultats.13
10 Critères de validité .13
11 Validation interlaboratoires .13
12 Rapport d’essai .14
Annexe A (informative) Validation de la méthode et essais intralaboratoire pour
l’évaluation des activités enzymatiques du sol par une méthode colorimétrique .15
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires international pour l’évaluation des activités
enzymatiques du sol par une méthode colorimétrique .20
Bibliographie .29
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www .iso .org/avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique.
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Introduction
Les micro-organismes sont responsables de nombreux processus clés dans le cycle des éléments. Les
enzymes sont responsables de la dégradation des molécules organiques et de leur minéralisation.
Le principal postulat énoncé est l’origine microbienne des enzymes du sol, même si les exsudats de
racines de plantes comprennent des enzymes. Les enzymes extracellulaires présentes dans le sol jouent
un rôle majeur dans la biodégradation des macromolécules organiques. La surveillance simultanée
de plusieurs activités enzymatiques importantes dans la biodégradation des composés organiques et
dans la minéralisation du carbone, de l’azote, du phosphore et du soufre dans le sol, peut révéler les
effets nocifs causés par les produits chimiques et autres impacts anthropiques. Cependant, les mesures
effectuées dans des conditions de laboratoire sélectionnées utilisant des substrats artificiels ne peuvent
pas se substituer aux vitesses effectives des processus enzymatiques se produisant in situ dans le sol.
NORME INTERNATIONALE ISO 20130:2018(F)
Qualité du sol — Mesure de l'activité enzymatique
dans des échantillons de sol en utilisant des substrats
colorimétriques
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de mesure simultanée (ou non) de plusieurs activités
des hydrolases (arylamidase, arylsulfatase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase,
N-acétylglucosaminidase, phosphatases acides, alcalines et globales, uréase) dans des échantillons de
sol en utilisant des substrats colorimétriques. Les activités enzymatiques du sol varient en fonction des
saisons et dépendent des caractéristiques chimiques, physiques et biologiques du sol. Cette méthode
peut être appliquée soit pour la détection des effets nocifs de substances toxiques ou d’autres agents
anthropiques dans un sol contaminé par comparaison avec un sol de référence, soit pour la réalisation
d’essais sur des produits chimiques.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 18400-206, Qualité du sol — Échantillonnage — Partie 206: Collecte, manipulation et conservation de
sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire
3 Termes et définitions, symboles et termes abrégés
3.1 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http: //www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https: //www .iso .org/obp
3.2 Symboles et termes abrégés
ARN Arylamidase
ARS Arylsulfatase
E.C. code d’enzyme établi par le Comité de nomenclature de l’Union internationale de biochimie
et de biologie moléculaire (NC-IUBMB)
NAG N-acétylglucosaminidase
PAC phosphatase acide
PAK phosphatase alcaline
PHOS phosphatase
URE uréase
β−GAL β-galactosidase
α−GLU α-glucosidase
β−GLU β-glucosidase
4 Principe
Le présent document décrit une méthode de mesure simultanée de plusieurs activités enzymatiques
dans des échantillons de sol (voir Tableau 1). Cette méthode repose sur l’utilisation de solutions
d’échantillons de sol et de substrats colorimétriques qui sont incubés pendant des durées spécifiques à
25 °C ± 2 °C ou à 37 °C ± 2 °C dans des plaques multipuits. Après incubation, les réactions sont arrêtées,
puis les plaques sont centrifugées et les surnageants transférés dans d’autres plaques. Les intensités de
coloration sont mesurées par absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible pour microplaques
à 96 puits.
Tableau 1 — Mesures des activités enzymatiques par une méthode colorimétrique
Cycle dans le
Enzyme Abréviation N° Macromolécule dégradée
sol
Arylamidase ARN E.C. 3.4.11.2 Azote
Arylsulfatase ARS E.C. 3.1.6.1 Soufre Minéralisation du soufre orga-
nique
β-Galactosidase βGAL E.C. 3.2.1.22 Carbone Hémicellulose
α-Glucosidase αGLU E.C. 3.2.1.20 Carbone Amidon et glycogène
β-Glucosidase βGLU E.C. 3.2.1.21 Carbone Cellulose
N-acétyl- NAG E.C. 3.2.1.52 Carbone Chitine et autres polymères de
glucosaminidase glucosamine liés en β-1,4
Phosphatase PHOS E.C. 3.1.4.1 Phosphore Esters de phosphate
Phosphatase acide PAC E.C. 3.1.4.1 Phosphore Esters de phosphate
Phosphatase alcaline PAK E.C. 3.1.4.1 Phosphore Esters de phosphate
Uréase URE E.C. 3.5.1.5 Azote Urée
Un essai interlaboratoires a été réalisé pour la validation de la courbe d’étalonnage; un récapitulatif de
l’essai interlaboratoires international est donné dans le Tableau 8 et les données de l’essai de validation
interlaboratoires sont données en totalité à l’Annexe B.
5 Réactifs
5.1 Tampons et réactifs
5.1.1 Généralités
L’eau déminéralisée est choisie comme milieu pour évaluer les activités des enzymes natives du
sol au pH du sol et également pour permettre l’analyse de plusieurs enzymes en utilisant la même
suspension de sol. Le rapport sol (en g)/eau (en ml) (4:25) est optimisé pour maximiser la réaction et la
sensibilité, et pour faciliter le pipetage. L’utilisation de la même solution de sol pour analyser plusieurs
enzymes permet d’obtenir des données plus comparables. L’arylamidase est mesurée avec un tampon
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Tris 50 mmol/l pH 7,5 et les phosphatases acides et alcalines sont respectivement mesurées avec un
tampon Tris-HCl 50 mmol/l à pH 5,5 et un tampon Tris-base 50 mmol/l à pH 11.
NOTE Le volume peut être adapté selon les besoins.
5.1.2 Tris HCl 50 mmol/l pH 5,5 ± 0,1.
— Hydrochlorure de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (numéro CAS: 1185-53-1 – PM: 157,6): 7,88 g;
— eau déminéralisée: 1 000 ml;
— acide chlorhydrique (HCl) (numéro CAS: 7647-01-0) 1 mol/l.
Dissoudre 7,88 g d’hydrochlorure de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 800 ml d’eau
déminéralisée et ajuster à pH 5,5 avec de l’acide chlorhydrique (1 mol/l). Compléter à 1 000 ml. La durée
de conservation ne doit pas dépasser un mois à 4 °C ± 2 °C dans un flacon en verre ou en polypropylène).
5.1.3 Tris base 50 mmol/l pH 11 ± 0,1.
— Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (numéro CAS: 77-86-1 – PM: 121,14): 6,06 g;
— eau déminéralisée: 1 000 ml;
— hydroxyde de sodium (numéro CAS: 1310-73-2) (1 mol/l).
Dissoudre 6,06 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 800 ml d’eau déminéralisée et ajuster à
pH 11 avec de l’hydroxyde de sodium (1 mol/l). Compléter à 1 000 ml. La durée de conservation ne doit
pas dépasser un mois à 4 °C ± 2 °C.
5.1.4 Tris base 50 mmol/l pH 7,5 ± 0,1.
— Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (numéro CAS: 77-86-1 – PM: 121,14): 6,06 g;
— eau déminéralisée: 1 000 ml;
— acide chlorhydrique (HCl) (numéro CAS: 7647-01-0) 1 mol/l.
Dissoudre 6,06 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 800 ml d’eau déminéralisée et ajuster à
pH 7,5 avec de l’acide chlorhydrique (1 mol/l). Compléter à 1 000 ml. La durée de conservation ne doit
pas dépasser un mois à 4 °C ± 2 °C.
5.1.5 Tris base 100 mmol/l pH 12 ± 0,1.
— Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (numéro CAS: 77-86-1 – PM: 121,14): 12,11 g;
— eau déminéralisée: 1 000 ml;
— hydroxyde de sodium (numéro CAS: 1310-73-2) (5 mol/l).
Dissoudre 12,11 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane dans 800 ml d’eau déminéralisée et ajuster à
pH 12 avec de l’hydroxyde de sodium (5 mol/l). Compléter à 1 000 ml. La durée de conservation ne doit
pas dépasser un mois à 4 °C ± 2 °C.
5.1.6 Chlorure de calcium dihydraté 0,5 mol/l.
— Chlorure de calcium dihydraté (numéro CAS: 10035-04-8 – PM: 147,01): 14,7 g;
— eau déminéralisée: 200 ml.
Dissoudre 14,7 g de chlorure de calcium dihydraté dans 200 ml d’eau déminéralisée. La durée de
conservation ne doit pas dépasser un mois à 4 °C ± 2 °C.
5.1.7 Réactif salicylate.
— Salicylate de sodium 270 mmol/l (numéro CAS: 54-21-7 – PM: 160,1): 865 mg;
— citrate trisodique 145 mmol/l (numéro CAS: 6132-04-3 – PM: 294,1): 853 mg;
— tartrate disodique 60 mmol/l (numéro CAS: 6106-24-7 – PM: 230,08): 276 mg;
— nitroferricyanure de sodium 2 mmol/l (numéro CAS: 13755-38-9 – PM: 297,95): 12 mg;
— eau déminéralisée: 20 ml.
Le réactif salicylate est préparé, juste avant l’analyse, avec les 4 composés énumérés ci-dessus:
dissoudre 865 mg de salicylate de sodium, 853 mg de citrate trisodique, 276 mg de tartrate disodique et
12 mg de nitroferricyanure de sodium dans 20 ml d’eau déminéralisée.
5.1.8 Réactif cyanurate.
— Citrate trisodique 580 mmol/l (numéro CAS: 6132-04-3 – PM: 294,1): 3,4 g;
— tartrate disodique 90 mmol/l (numéro CAS: 6106-24-7 – PM: 230,08): 414 mg;
— hydroxyde de lithium 280 mmol/l (numéro CAS: 1310-65-2 – PM: 23,95): 134 mg;
— dichloroisocyanurate 10 mmol/l (numéro CAS: 51580-86-0 – PM: 255,98): 51 mg;
— eau déminéralisée: 20 ml.
Le réactif cyanurate est préparé, juste avant l’analyse, avec les 4 composés énumérés ci-dessus:
dissoudre 3,4 g de citrate trisodique, 414 mg de tartrate disodique, 134 mg d’hydroxyde de lithium et
51 mg de dichloroisocyanurate dans 20 ml d’eau déminéralisée.
5.1.9 Éthanol à 96 %.
— Éthanol à 96 % (numéro CAS: 41340-36-7).
5.1.10 Éthanol acidifié (HCl à 0,26 mol/l).
— Réactif ACS acide chlorhydrique, à 37 % (numéro CAS: 7647-01-0) 4,32 ml;
— éthanol à 96 % (numéro CAS: 41340-36-7).
Diluer 4,32 ml de HCl concentré dans 200 ml d’éthanol à 96 %. La durée de conservation ne doit pas
dépasser un mois à 4 °C ± 2 °C.
5.1.11 p-diméthylaminocinnamaldéhyde (DMCA) (3,5 mmol/l).
— DMCA (numéro CAS: 6203-18-5 – PM: 175,23): 0,12 g;
— éthanol à 96 % (numéro CAS: 41340-36-7).
Dissoudre 0,12 g de DMCA dans 200 ml d’éthanol à 96 %. La durée de conservation ne doit pas dépasser
une semaine à −20 °C ± 2 °C.
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Tableau 2 — Utilisation des tampons pour la mesure des activités enzymatiques
ARS; α-GLU;
β-GLU; β-GAL; ARN URE PAC PAK
NAG; PHOS
Solution de sol Eau déminéralisée Tris base Eau déminéralisée Tris HCl Tris base
50 mmol/l, pH 7,5 50 mmol/l, 50 mmol/l, pH 11
pH 5,5
Arrêt/ Tris 100 mmol/l Éthanol à 96 % Réactif salicylate Tris 100 mmol/l pH 12
révélation pH12 Éthanol acidifié
CaCl 0,5 mol/l DMCA Réactif cyanurate CaCl 0,5 mol/l
2 2
5.2 Substrats et solutions étalons
5.2.1 Préparation des solutions étalons
5.2.1.1 Para-nitrophénol (numéro CAS: 100-02-7 - PNP) à 3,6 mmol/l.
— Para-nitrophénol (PNP) (PM: 139,11): 10 mg;
— eau déminéralisée: 20 ml.
Il convient de conserver le PNP en poudre à −20 °C ± 2 °C à l’abri de la lumière. Peser soigneusement
le PNP, puis le dissoudre dans de l’eau déminéralisée. La concentration de travail est de 0,36 mmol/l
(c’est-à-dire dilution de la solution concentrée à 1/10). La durée de conservation des solutions aux
concentrations de travail ne doit pas dépasser deux ans à −20 °C ± 2 °C. Les solutions peuvent être
aliquotées pour une utilisation ou pour un nombre maximal de trois cycles de congélation/décongélation.
NOTE Le para-nitrophénol présente un risque d’effets graves pour les organes à la suite d’expositions
répétées ou d’une exposition prolongée et il est nocif en cas d’ingestion (H373), de contact cutané ou d’inhalation
(H302, H312 et H332). Prévoir une ventilation et des protections adéquates.
5.2.1.2 Chlorure d’ammonium (NHCl) à 62 mmol/l.
— Chlorure d’ammonium (numéro CAS: 12125-02-9 – PM: 53,49): 66,4 mg;
— eau déminéralisée: 20 ml.
Il est possible de conserver le chlorure d’ammonium en poudre à température ambiante et à l’abri de la
lumière. Peser soigneusement le chlorure d’ammonium puis le dissoudre dans de l’eau déminéralisée. Il
convient de conserver la solution concentrée pendant deux ans à −20 °C ± 2 °C. La durée de conservation
de la solution concentrée ne doit pas dépasser deux ans à −20 °C ± 2 °C. La concentration de travail est
de 0,62 mmol/l (dilution à 1/100). La durée de conservation de la solution à la concentration de travail
ne doit pas dépasser deux ans à −20 °C ± 2 °C.
5.2.1.3 β-naphtylamine, 1 mmol/l.
— β-naphtylamine (numéro CAS: 91-59-8 – PM: 143,19): 35,8 mg;
— éthanol à 96 %: 20 ml;
— eau déminéralisée.
Dissoudre 35,8 mg de β-naphtylamine dans 50 ml d’éthanol à 96 % (0,071 %). Cette solution mère
à 5 mmol/l doit être conservée à −20 °C pendant un an. La concentration de travail est de 1 mmol/l
(dilution à 1/5 dans l’eau) et la solution concentrée doit être conservée à −20 °C ± 2 °C pendant un an.
NOTE La β-naphtylamine a une toxicité aiguë (ingestion, contact cutané, inhalation), catégorie 4,
sensibilisation respiratoire, catégorie 1, et effets néfastes pour l’environnement aquatique. Protecteurs
1) 2)
oculaires , respirateur intégral contre les particules de type N100 (États-Unis) ; prévoir une ventilation
3)
adéquate, des gants spécifiques , des lunettes et un écran de protection.
5.2.2 Préparation des solutions de substrats
Les substrats colorimétriques disponibles dans le commerce sont livrés sous forme de poudre qu’il
convient de conserver, conformément aux spécifications des fournisseurs, congelés à une température
de − 20 °C ± 2 °C, réfrigérés à 4 °C ± 2 °C ou entreposés à température ambiante. Il convient de préparer
tous les substrats à l’avance conformément aux exigences du Tableau 3.
NOTE Il faut que le volume soit suffisamment important pour peser et mesurer les substrats de manière
fiable. Il dépend également du nombre de plaques à réaliser. Des exemples sont donnés dans le Tableau 3.
Tableau 3 — Substrats colorimétriques disponibles dans le commerce pour les mesures des
activités enzymatiques et préparation de ces substrats pour les mesures
a
Enzyme Substrat Masse Concentration Exemples de Conservation
(Température de conserva- molaire préparation des solutions
tion)
g/mol mol/l Température,
durée
Arylamidase L-leucine 292,8 0,008 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
β-naphtylamide 0,2342 g dans
1 an
hydrochlorure 50 ml d’eau
déminéralisée
(−20 °C ± 2 °C)
Numéro CAS: 893–36–7
Arylsulfatase Potassium 4-nitrophényl 257,26 0,025 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
sulfate 0,322 g dans
1 an
50 ml d’eau
(−20 °C ± 2 °C)
déminéralisée
Numéro CAS: 6217–68–1
β-Galactosidase p-nitrophényl 301,25 0,05 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
β-D-galactopyranoside 0,753 g dans
1 an
50 ml d’eau
(−20 °C ± 2 °C)
déminéralisée
Numéro CAS: 3150–24–1
a
Sigma-Aldrich est un exemple de fournisseur de substrats colorimétriques. Cette information est donnée à l'intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des
produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils aboutissent aux mêmes
résultats.
NOTE  Tous les substrats doivent être manipulés avec une ventilation adéquate, des gants spécifiques et un écran de
protection.
1) https: //www .sigmaaldrich .com/labware/labware -products .html ?TablePage = 20009868 .
2) http: //www .sigmaaldrich .com/catalog/search ?interface = Substance & term
= msaadvantageseries1000fullfacerespirator1234598765+OR+msaultratwinfullfacerespirator1234598765 &
focus = product & mode = boolean.
3) http: //www .sigmaaldrich .com/labware/labware -products .html ?TablePage = 9577418 .
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Tableau 3 (suite)
a
Enzyme Substrat Masse Concentration Exemples de Conservation
(Température de conserva- molaire préparation des solutions
tion)
g/mol mol/l Température,
durée
α-Glucosidase 4-nitrophényl 301,25 0,025 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
α-D-glucopyranoside 0,375 g dans
1 an
50 ml d’eau
(−20 °C ± 2 °C)
déminéralisée
Numéro CAS: 3767–28–0
β-Glucosidase 4-nitrophényl 301,25 0,05 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
β-D-glucopyranoside 0,753 g dans
1 an
50 ml d’eau
(−20 °C ± 2 °C)
déminéralisée
Numéro CAS: 2492–87–7
N-acétyl- para-nitrophényl N-acéthyl 342,31 0,01 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
glucosaminidase β-D glucopyranoside 0,171 g dans
1 an
50 ml d’eau
(−20 °C ± 2 °C)
déminéralisée
Numéro CAS: 3459–18–5
Phosphatase 4-nitro-phénylphosphate sel 371,12 0,05 Dissoudre −20 °C ± 2 °C
disodique hexahydraté 0,928 g dans
Phosphatase acide 1 an
50 ml d’eau
(+4 °C ± 2 °C)
et déminéralisée
Numéro CAS: 333338–18–4
Phosphatase
alcaline
Uréase Urée > 98 % 60,06 0,4 Dissoudre +4 °C
0,480 5 g dans
(température ambiante) 1 semaine
20 ml d’eau
déminéralisée
Numéro CAS: 57–13–6
a
Sigma-Aldrich est un exemple de fournisseur de substrats colorimétriques. Cette information est donnée à l'intention
des utilisateurs du présent document et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif des
produits ainsi désignés. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il est démontré qu'ils aboutissent aux mêmes
résultats.
NOTE  Tous les substrats doivent être manipulés avec une ventilation adéquate, des gants spécifiques et un écran de
protection.
6 Appareillage et matériaux
Utiliser du matériel courant de laboratoire ainsi que ce qui suit:
6.1 Tamis, ayant une ouverture de maille de 2 mm, ou jusqu’à 5 mm selon la texture et l’humidité du sol.
NOTE D’autres ouvertures de maille peuvent être utilisées en fonction de la texture du sol.
6.2 Balance (±0,001 g).
6.3 Agitateur orbital.
6.4 Plaques multipuits, 96 puits, polystyrène, à fond plat mais sans traitement, munies de couvercles.
6.5 Distributeur automatique d’eau (facultatif).
NOTE Comparé au pipetage manuel, le distributeur automatique réduit considérablement l’incertitude des
volumes distribués.
6.6 Micropipettes multicanaux (50 µl et 200 µl).
6.7 Incubateurs, réglés à 25 °C ± 2 °C et à 37 °C ± 2 °C.
6.8 Centrifugeuse pour plaques, avec régulation de la température à 20 °C et accélération à 1 500 g.
6.9 Spectrophotomètre pour microplaques, avec lecture à 405 nm ± 5 nm, 540 nm ± 5 nm et
650 nm ± 5 nm (monochromateur ou BP ± 10 nm).
7 Mode opératoire
7.1 Préparation des courbes d’étalonnage
7.1.1 Généralités
Les courbes d’étalonnage nécessitent plusieurs concentrations de para-nitrophénol (PNP), de chlorure
d’ammonium (NH Cl) ou de β-naphtylamine, mesurées au moins en double et de préférence en triple;
tous les volumes sont donnés par puits. Les homogénéisations sont réalisées à l’aide d’une micropipette
par 2 ou 3 aspirations/refoulements. Toute exposition à la lumière doit être limitée pendant la
préparation des gammes étalons. Des exemples de courbes d’étalonnage sont donnés à l’Annexe B.
7.1.2 Solution de PNP
La solution mère de PNP à une concentration de 0,36 mmol/l est utilisée pour construire la courbe
d’étalonnage. Répartir les volumes nécessaires dans les puits des plaques multipuits pour des
concentrations de 0 nmol/ml, 14 nmol/ml, 29 nmol/ml, 72 nmol/ml, 140 nmol/ml, 220 nmol/ml,
290 nmol/ml et 360 nmol/ml en double (Tableau 4).
Tableau 4 — Préparation de la courbe d’étalonnage du para-nitrophénol dans une microplaque
à 96 puits
[PNP]
0 14 29 72 140 220 290 360
nmol/ml
PNP (µl) 0 5 10 25 50 75 100 125
Eau (µl) 125 120 115 100 75 50 25 0
Pour révéler la coloration jaune du PNP, ajouter 25 µl d’eau, 25 µl de chlorure de calcium et 100 µl de tris
base 100 mmol/l, pH 12. Après homogénéisation, transférer 200 µl dans une nouvelle plaque et lire les
valeurs d’absorbance à 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre pour microplaques.
7.1.3 Solution de β-naphtylamine
La solution de travail de β-naphtylamine à la concentration de 1 mmol/l est utilisée pour préparer
la gamme étalon. Répartir les volumes nécessaires dans les puits des plaques multipuits pour des
concentrations de 0 nmol/ml, 10 nmol/ml, 20 nmol/ml, 50 nmol/ml, 100 nmol/ml, 200 nmol/ml
(Tableau 5).
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Tableau 5 — Préparation de la courbe d’étalonnage de la β-naphtylamine dans une microplaque
à 96 puits
[β-Naphtylamine]
0 10 20 50 100 200
nmol/ml
β-Naphtylamine (µl) 0 1 2 5 10 20
Tampon Tris 50 mmol/l pH 7,5 (µl) 50 49 48 45 40 30
Éthanol à 96 % (µl) 50 50 50 50 50 50
Pour révéler la coloration de la β-naphtylamine, ajouter et mélanger 100 µl d’éthanol acidifié et 100 µl
de p-diméthylaminocinnamaldéhyde (DMCA). Au bout de 20 min d’incubation dans l’obscurité à
température ambiante, lire l’absorbance à 540 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible pour
microplaques.
7.1.4 Solution de chlorure d’ammonium
La solution mère de chlorure d’ammonium à une concentration de 62 mmol/l est diluée au 1/100 et
la solution de travail à une concentration de 0,62 mmol/l (620 nmol/ml) est utilisée pour construire
la courbe d’étalonnage. Répartir les volumes nécessaires dans les puits des plaques multipuits pour
des concentrations de 0 nmol/ml, 6 nmol/ml, 16 nmol/ml, 31 nmol/ml, 62 nmol/ml, 155 nmol/ml,
233 nmol/ml et 310 nmol/ml en double (Tableau 6).
Tableau 6 — Préparation de la courbe d’étalonnage du chlorure d’ammonium dans une
microplaque à 96 puits
[NH Cl]
0 6 16 31 62 155 233 310
nmol/ml
NH Cl (µl) 0 2 5 10 20 50 75 100
Eau (µl) 200 198 195 190 180 150 125 100
Pour déterminer quantitativement la concentration en NH Cl, ajouter 40 µl de réactif salicylate à
chaque puits. Au bout d’une période de réaction de 3 min, distribuer 40 µl de réactif cyanurate dans
chaque puits, puis bien homogénéiser et laisser incuber chaque puits dans l’obscurité pendant 30 min
(l’absorbance est stable pendant deux heures). Après incubation, homogénéiser les plaques à l’aide d’une
micropipette (2 ou 3 aspirations/refoulements) et transférer 200 µl dans une nouvelle plaque et lire les
valeurs d’absorbance à 650 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible pour microplaques.
7.2 Échantillonnage
7.2.1 Préparation de l’échantillon
7.2.1.1 Homogénéisation
Prélever et manipuler les échantillons de sol comme spécifié dans l’ISO 18400-206. Le prélèvement
d’échantillons composites sur le terrain, homogénéisés et tamisés à 2 mm (jusqu’à 5 mm selon la texture
et l’humidité du sol), induit une incertitude de mesure raisonnablement faible pour les échantillons de sol.
Pour améliorer le lien entre les activités in situ, il convient de conserver les échantillons à 15 °C ± 2 °C au
maximum pendant une durée de quatre jours. Si cela n’est pas possible, les modifications les plus faibles
seront obtenues avec une conservation des échantillons à −80 °C ± 5 °C. La conservation à −20 °C ± 2 °C,
avant ou après le tamisage, n’est pas appropriée.
Homogénéiser le sol tamisé, puis peser trois réplicats de 4 g exactement et les déposer dans un flacon
à fond plat (de 30 à 60 ml). Ajouter 25 ml d’eau déminéralisée ainsi que des barreaux magnétiques
cruciformes. Fermer les récipients et les homogénéiser pendant 10 min sur un agitateur orbital
−1
(250 min ).
7.2.1.2 Préparation des plaques d’échantillons
Ajouter les barreaux magnétiques cruciformes dans les flacons à fond plat et procéder au pipetage
tout en maintenant la suspension de sol sous agitation. Utiliser des micropipettes multicanaux (ayant
un à trois canaux) pour répartir chaque suspension de sol dans les microplaques, dans quatre puits
identiques, avec un volume spécifique, conformément au Tableau 7 (partie A), et placer le couvercle
sur chaque plaque. Trois puits représentent les points d’analyse et un puits représente le blanc (pour
révéler les interactions chimiques avec les composés du sol). Le nombre de plaques à préparer doit être
identique au nombre d’enzymes à analyser (une plaque = une enzyme).
NOTE 1 Un exemple de schéma de dépôts des échantillons dans les plaques est présenté en Figure 1.
NOTE 2 Il est possible que des sols humifères nécessitent l’utilisation de cônes évasés pour le pipetage.
Légende
S1 numéro d’échantillon
a, b, c échantillon en trois réplicats
T puits de référence pour chaque sol
Figure 1 — Exemple d’organisation des échantillons dans les plaques pour chaque enzyme
7.2.2 Ajout des substrats
L’organisation des mesures est simplifiée si une plaque est utilisée pour chaque enzyme. Une fois tous
les échantillons de sol répartis dans les plaques, utiliser des micropipettes multicanaux pour répartir
chacun des substrats, dans les trois puits et les homogénéiser avec 2 ou 3 aspirations/refoulements.
Puis, mettre à incuber les plaques multipuits (Tableau 7, partie A). Après incubation, arrêter les
réactions, centrifuger les plaques pendant 5 min à 1 500 g et transférer les surnageants dans de
nouvelles plaques. Ensuite, mesurer l’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre pour microplaques.
La partie B du Tableau 7 récapitule les protocoles pour chacune des enzymes.
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Tableau 7 — Détails expérimentaux spécifiques pour les mesures des activités enzymatiques
PHOS
A
ARN ARS β-GAL α-GLU β-GLU NAG PAC URE
INCUBATION
PAK
Solution de sol (µl) 125 50
Substrat (µl) 25 40
Eau déminéralisée
0 (+40 µl dans les
(µl)
puits témoins)
Temps d’incubation 2H 4H 2H 1H 1H 1H 0H30 3H
Température
37 °C 25 °C
d’incubation
B
ARRÊT DE LA
RÉACTION
Dans chaque puits:
Dans chaque
Dans chaque puits:
40 µl de réactif
puits:
25 µl de CaCl salicylate
Arrêt de la réaction 150 µl d’éthanol
100 µl de Tris pH 12 40 µl de réactif
à 96 %
cyanurate
homogénéisation
homogénéisation
homogénéisation
25 µl dans les
Substrat 25 µl dans les puits témoins
puits témoins
30 min, à tempé-
Incubation rature ambiante,
dans l’obscurité
Centrifugation 5 min, 1 500 g
Transvasement 100 µl 200 µl
100 µl d’éthanol
acidifié
100 µl de DMCA
Révélation
20 min, à tempé-
rature ambiante,
dans l’obscurité
Lecture λ = 540 nm λ = 405 nm λ = 650 nm
NOTE 1 La température d’incubation affecte la vitesse de réaction et l’optimum dépend des enzymes. À des
fins spécifiques, une température différente, telle que celle décrite dans le présent document, peut être utilisée,
par exemple la température in situ.
NOTE 2 Pour l’activité de l’uréase, il est nécessaire de quantifier l’ammonium libre apporté par la solution
d’urée et de le soustraire de l’ammonium quantifié après incubation du sol pour obtenir l’ammonium
spécifiquement libéré par l’uréase. Les puits témoins pour l’urée sont préparés avec 40 µl d’urée, 200 µl d’eau
déminéralisée, 40 µl de réactif salicylate et 40 µl de réactif cyanurate. Après 30 min d’incubation, 200 µl sont
transférés dans de nouveaux puits et la lecture de l’absorbance est effectuée à 650 nm.
Après incubation, les réactions sont arrêtées conformément aux protocoles spécifiques des enzymes
(Tableau 7).
7.2.3 Mesures d’absorbance
7.2.3.1 Mesures des activités enzymatiques avec le PNP comme produit de réaction (ARS,
β-GAL, α-GLU, β-GLU, NAG, PHOS, PAC, PAK)
L’ajout de 25 µl de chlorure de calcium et de 100 µl de tampon Tris base pH 12 arrête la réaction; cet ajout
est essentiel pour éliminer les colloïdes qui induisent une turbidité dans les solutions et pour augmenter
le pH pour la quantification du PNP. Ajouter 25 µl de substrat dans les puits témoins et homogénéiser
avec 2 ou 3 aspirations/refoulements. Ensuite, centrifuger les plaques pendant cinq minutes à 1 500 g
et 20 °C, et transférer 200 µl de surnageant dans une nouvelle plaque. Lire les valeurs d’absorbance à
λ = 405 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible pour microplaques.
7.2.3.2 Mesures des activités de l’arylamidase (ARN)
Après l’incubation, ajouter 150 µl d’éthanol à 96 % dans chacun des puits (y compris les puits témoins)
et 25 µl de solution de substrat dans les puits témoins. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 1 500 g et
transférer 100 µl de surnageant dans une nouvelle plaque. Pour déterminer la quantité de naphtylamine
produite, ajouter 100 µl d’éthanol acidifié et 100 µl de DMCA dans tous les puits et homogénéiser à l’aide
d’une micropipette (2 aspirations/refoulements). Après 20 min, lire les valeurs d’absorbance à 540 nm
à l’aide d’un spectrophotomètre UV/visible pour microplaques.
7.2.4 Mesures des activités de l’uréase
Après 3 h d’incubation, ajouter 40 µl de réactif salicylate à chaque puits, y compris les puits témoins.
Après une période de réaction de 3 min, introduire 40 µl de réactif cyanurate dans chaque puits
(puits témoins compris). La réaction colorimétrique s’effectue en 30 min et reste stable pendant
deux heures. Ensuite, centrifuger les plaques pendant cinq minutes à 1 500 g et 20 °C, et transférer
200 µl de surnageant dans une nouvelle plaque. Lire les valeurs d’absorbance à λ = 650 nm à l’aide d’un
spectrophotomètre UV/visible pour microplaques.
8 Calcul des résultats
Tracer la courbe d’étalonnage, donnant la concentration nanomolaire (nmol/ml) en PNP ou en
β-naphtylamine et en chlorure d’ammonium, en fonction de l’absorbance. La concentration en PNP ou
en β-naphtylamine ou en chlorure d’ammonium du blanc (C ) et la concentration de l’échantillon (C )
b s
sont lues d’après la courbe d’étalonnage.
Des exemples de courbes d’étalonnage sont donnés à l’Annexe B.
Le résultat est calculé en soustrayant la mesure du blanc des mesures des trois exemplaires de
l’échantillon et en multipliant la différence par le facteur de dilution (D) et le volume de sol (V ), puis en
ss
divisant par le temps de réaction et la masse sèche de l’échantillon (W ).
ds
()CC−×DV×
sb ss
A= (1)
RT×W
ds
où
A est l’activité enzymatique en mU/g d’échantillon sec (nmol/min/g d’échantillon sec);
C est la concentration du produit formé dans l’échantillon (nmol/ml);
s
C est la concentration du produit formé dans le blanc (nmol/ml);
b
D est la dilution de l’échantillon dans la microplaque;
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V est le volume de solution d’échantillon (ml);
ss
RT est la durée de réaction (min);
W est la masse de l’échantillon sec (g).
ds
9 Expression des résultats
Les résultats sont exprimés en milliunités par gramme de sol sec, correspondant à des nmoles de PNP,
de β-naphtylamine ou de chlorure d’ammonium libérées par minute et par gramme de masse sèche de
sol. Les mesures nécessaires pour chaque expression exigent que le pourcentage de matière sèche soit
déterminé.
−1
NOTE Unité (U) = 1 μmol min représente l’unité la plus pratique et la plus couramment utilisée pour l’activité
enzymatique. Pour le sol, l’activité est exprimée en milliunités pour un gramme de sol sec (mU/g de sol sec).
Les caractéristiques du sol peuvent varier considérablement en fonction de la géographie, du climat et
de l’utilisation du sol. Actuellement, l’interprétation des résultats ne peut pas reposer sur les valeurs
limites définies pour chaque activité enzymatique. Le plan expérimental doit faciliter les comparaisons
avec un sol de référence ou entre les échantillons de sites étudiés.
10 Critères de validité
a) La courbe d’étalonnage est valide si les critères suivants sont remplis (en fonction des résultats de
l’essai interlaboratoires décrit à l’Annexe B):
— r ≥ 0,990;
— l’absorbance pour la courbe d’étalonnage du PNP se situe dans une gamme de [0,04 - 1,8] ± 10 %;
— l’absorbance pour la courbe d’étalonnage de la β-naphtylamine se situe dans une gamme de
[0,06 – 2,3] ± 10 %;
— l’absorbance pour la courbe d’étalonnage de l’ammonium se situe dans une gamme de
[0,05 – 1,6] ± 10 %.
b) Pour les échantillons:
— le coefficient de variation (%) du triplicat échantillon doit être ≤ 15 %;
— l’absorbance du blanc pour l’urée doit être ≤ 0,2;
— pour les mesures de l’uréase, l’absorbance du blanc doit être ≤ 1;
— les différences d’absorbance entre les puits essais et témoins doivent être ≥ 0,02 à 0,05 selon la
sensibilité et la répétabilité du spectrophotomètre.
11 Validation interlaboratoires
Un récapitulatif de l’essai interlaboratoires international est donné dans le Tableau 8 et les données de
l’essai de validation interlaboratoires sont données en totalité à l’Annexe B.
Tableau 8 — Données concises de l’étude interlaboratoires
α-GLU β-GLU PHOS PAC PAK ARS β-GAL NAG URE ARN
4,0 à 2,4 à 4,2 à 4,3 à 3,8 à 2,7 à 3,9 à 5,4 à 5,5 à 4,3 à
CV
r
27,7 % 15,2 % 9,7 % 13,0 % 14,1 % 10,4 % 18,4 % 23,3 % 16,2 % 13,1 %
9,7 à 9,5 à 27,4 à 12,6 à 5,7 à 15,5 à 21,7 à 9,8 à 14,0 à 15,9 à
CV
R
17,9 % 24,0 % 36,5 % 23,0 % 23,3 % 30,5 % 32,6 % 19,6 % 35,9 % 31,9 %
(Abréviations: CV : plage de variabilité des coefficients de variation intralaboratoire moyens pour tous
r
les laboratoires (calculés pour chaque activité en tenant compte de tous les sols et d’un seul laboratoire).
CV : plage de variabilité des coefficients de variation interlaboratoires moyens pour tous les sols
R
(calculés pour chaque activité en tenant compte de tous les laboratoires et d’un seul sol)).
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit comprendre les informations suivantes:
a) une référence au présent document, à savoir l’ISO 20130:2018;
b) une identification adéquate de l’échantillon;
c) des informations sur la température et la durée de conservation;
d) le type de sol, la caractérisation physique et chimique du sol, la teneur en eau, la température du sol
au moment de l’échantillonnage (valeur du pH de l’échantillon de sol);
e) les conditions d’incubation appliquées;
f) les résultats d’essai;
g) tout détail non spécifié dans le présent document ou facultatif, ainsi que tout facteur susceptible
d’avoir influé sur les résultats.
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