ISO 7704:2023
(Main)Water quality — Requirements for the performance testing of membrane filters used for direct enumeration of microorganisms by culture methods
Water quality — Requirements for the performance testing of membrane filters used for direct enumeration of microorganisms by culture methods
This document specifies the requirements for the performance testing of membrane filters used for the retention followed by direct enumeration of microorganisms by culture methods. This document is applicable to membrane filters which are used for retention followed by direct enumeration of specific microorganisms on solid media or on other devices containing media, like absorbent pads[19]. This document is not applicable for membrane filters used for concentration and elution or for qualitative methods. These tests are applicable to the membrane filters intended for the microbiological analysis of different types of water, such as: — drinking water, bottled water and other types of water with expected low numbers of microorganisms; — water with expected higher numbers of microorganisms, for example, surface water and process water. These tests are intended to demonstrate the suitability of the whole system (membrane filter together with the culture medium including the filtration step) required for the specific tests described in References [3], [6], [8], [10], [12] and [13]. This document applies to: — manufacturers producing membrane filters; — microbiological laboratories using membrane filters for their own testing or providing these to other end users.
Qualité de l'eau — Exigences relatives aux essais de performance des membranes filtrantes utilisées pour le dénombrement direct des micro-organismes par des méthodes de culture
Le présent document spécifie les exigences pour les essais de performance des membranes filtrantes utilisées pour la rétention suivie d'un dénombrement direct des micro-organismes par des méthodes de culture. Le présent document s'applique aux membranes filtrantes qui sont utilisées pour la rétention suivie d'un dénombrement direct de micro-organismes spécifiques sur des milieux solides ou sur d'autres dispositifs contenant des milieux, comme des pads en papier absorbants [19]. Le présent document ne s'applique pas aux membranes filtrantes utilisées pour la concentration et l'élution ou pour des méthodes qualitatives. Les essais s'appliquent aux membranes filtrantes destinées à l'analyse microbiologique de différents types d'eau, tels que: — l'eau potable, l'eau embouteillée et d'autres types d'eau dans laquelle un faible nombre de micro-organismes est attendu; — l'eau dans laquelle un plus grand nombre de micro-organismes est attendu, par exemple l'eau de surface et l'eau de process. Ces essais sont destinés à démontrer l'adéquation de l'ensemble du système (membrane filtrante et milieu de culture, y compris l'étape de filtration) requis pour les essais spécifiques décrits dans les Références [3], [6], [8], [10], [12] et [13]. Le présent document s'applique: — aux fabricants produisant des membranes filtrantes; — aux laboratoires de microbiologie utilisant des membranes filtrantes pour leurs propres essais ou les fournissant à d'autres utilisateurs finaux.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 7704
Second edition
2023-01
Water quality — Requirements for
the performance testing of membrane
filters used for direct enumeration of
microorganisms by culture methods
Qualité de l'eau — Exigences relatives aux essais de performance
des membranes filtrantes utilisées pour le dénombrement direct des
micro-organismes par des méthodes de culture
Reference number
© ISO 2023
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Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vii
1 S c op e . 1
2 Nor m at i ve r ef er enc e s . 1
3 T erms and definitions . 1
3.1 G eneral terminology . 2
3.2 T erminology of performance testing . 3
3.3 T erminology for test microorganisms . 4
4 P r i nc iple . 5
4.1 General . 5
4 .1.1 I nt r o duc t ion . 5
4.1.2 Batch testing . 6
4.1.3 Supplementary testing . 6
4.2 P erformance testing . 7
4.2.1 M odules for batch and supplementary testing . 7
4.2.2 A bsence of microbial contamination . 7
5 A pparatus and glassware .8
6 C ulture media and diluents .8
7 P reparation of microorganisms for performance testing . 8
7.1 G eneral . 8
7. 2 R ef er enc e c ou nt . 8
7.2.1 Q uantitative productivity testing . 8
7.2.2 Q ualitative selectivity testing . 9
7.2.3 Qualitative specificity testing . 9
7.3 P reparation of a standardized test suspension using a working culture . 9
7.3.1 General . 9
7.3.2 Preparation of the working culture . 9
7.3.3 Preparation of a standardized test suspension (inoculum) for the test . 10
7.4 P reparation of a test suspension using reference material . 10
8 S ampling of membrane filters for testing .10
9 P rocedure .11
9.1 G eneral . 11
9.2 I noculation by spread plate technique . 11
9.2.1 G eneral . 11
9.2.2 Inoculation .12
9.3 I noculation by membrane filtration technique .12
9.3.1 General .12
9.3.2 Inoculation .12
9.4 I ncubation and counting . 13
9.5 T est for absence of microbial contamination . 13
10 C alculation, expression and interpretation of results .13
10.1 G eneral .13
10.2 P roductivity testing . 13
10.3 S electivity testing . 14
10.4 S pecificity testing . 14
11 Documentation of test results .14
11.1 Te s t r ep or t . 14
11.2 I nformation provided by the manufacturer . 15
11.3 T raceability . 15
iii
Annex A (normative) Diagram of the procedure for batch testing .16
Annex B (informative) Example of a card for recording test results from batch testing .17
Annex C (informative) Quantitative supplementary testing of membrane filters .18
Annex D (informative) Qualitative supplementary testing of membrane filters .21
Annex E (informative) Practical example of quantitative batch testing and quantitative
supplementary testing by the end user .25
Bibliography .35
iv
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 4,
Microbiological methods, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN)
Technical Committee CEN/TC 230, Water analysis, in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 7704:1985), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— the scope has been changed to cover the requirements for the performance testing of membrane
filters used for retention and direct enumeration;
— clauses have been added for terms and definitions, microorganisms, sampling and replicates,
procedure, inoculation and incubation, counting, calculation and documentation;
— the clauses referencing to culture media and diluents, test strain preparation, performance testing
and procedure have been revised to align with ISO 8199 and ISO 11133;
— Annex A has been added with a diagram of the batch testing;
— Annex B has been added to give an example of a card to record the test results from batch testing
and supplementary testing of membrane filters;
— Annex C has been added to describe the quantitative additional testing of membrane filters including
a diagram of the procedure;
— Annex D has been added to describe the qualitative supplementary testing of membrane filters;
— Annex E has been added to give a practical example of batch testing and quantitative additional
testing by the end user including a diagram of the procedure;
— the Bibliography has been added.
v
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
vi
Introduction
In laboratories carrying out microbiological examinations, the main objectives are to either capture,
resuscitate, grow, detect or enumerate, or all, a wide variety of microorganisms. Membrane filters are
used in many traditional microbiological culture techniques and are commercially available in various
brands and types. Many comparison studies of membrane filters which have been reported in the
literature show differences in their ability to recover bacteria from water samples, see References [22],
[23], [28], [30], [31], [32], [33] and [34]. The complex manufacturing process means that the chemical
composition, pore size and pore structure can vary, depending on the brands, and even on the lot of
material. Furthermore, the manufacturing process can also release leachables that can potentially
interfere with the recovery of microorganisms.
Thus, it is very important to standardize the performance testing of membrane filters as much as
possible, not only to provide consistent results, but also to enable the development of standardized
procedures for enumerating specific microorganisms.
vii
INTERNATIONAL STANDARD ISO 7704:2023(E)
Water quality — Requirements for the performance
testing of membrane filters used for direct enumeration of
microorganisms by culture methods
1 S cope
This document specifies the requirements for the performance testing of membrane filters used for the
retention followed by direct enumeration of microorganisms by culture methods.
This document is applicable to membrane filters which are used for retention followed by direct
enumeration of specific microorganisms on solid media or on other devices containing media, like
[19]
absorbent pads .
This document is not applicable for membrane filters used for concentration and elution or for
qualitative methods.
These tests are applicable to the membrane filters intended for the microbiological analysis of different
types of water, such as:
— drinking water, bottled water and other types of water with expected low numbers of
microorganisms;
— water with expected higher numbers of microorganisms, for example, surface water and process
water.
These tests are intended to demonstrate the suitability of the whole system (membrane filter together
with the culture medium including the filtration step) required for the specific tests described in
References [3], [6], [8], [10], [12] and [13].
This document applies to:
— manufacturers producing membrane filters;
— microbiological laboratories using membrane filters for their own testing or providing these to
other end users.
2 Normat ive references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 8199:2018, Water quality — General requirements and guidance for microbiological examinations by
culture
ISO 11133:2014, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production,
storage and performance testing of culture media
3 T erms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
3.1 General terminolo gy
3.1.1
membrane filter
porous hydrophilic filtration matrix, composed of different polymers with filtration characteristics
equivalent to its/their rated nominal pore sizes, typically ranging from 0,1 µm to 1,2 µm, which is
intended to be used for the retention of microorganisms
Note 1 to entry: The membrane filter ensures the effective retention of microorganisms depending on the
membrane pore size when a differential (positive or negative) pressure is applied.
Note 2 to entry: The type of membrane filter to be used for a certain microbiological method is described in the
corresponding specific standard (3.1.7).
3.1.2
culture medium
formulation of substances, in liquid, semi-solid or solid form, which contain either natural and/
or synthetic constituents intended to support the multiplication (with or without constituents for
inhibition of certain microorganisms), identification or preservation of viability of microorganisms
Note 1 to entry: The culture medium to be used for a certain microbiological method is described in the
corresponding specific standard (3.1.7), see specific culture medium (3.1.3).
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.3.1, modified — “constituents for” has been included and Note 1 to entry
has been replaced.]
3.1.3
specific culture medium
culture medium (3.1.2), usually selective, as designated in a specific standard (3.1.7) for use with
membrane filters (3.1.1)
[8]
EXAMPLE 1 Chromogenic coliform agar (CCA) used with membrane filters in accordance with ISO 9308-1 .
[6]
EXAMPLE 2 Slanetz and Bartley medium used with membrane filters in accordance with ISO 7899-2 .
3.1.4
reference medium
culture medium (3.1.2), usually non-selective, for determination of the reference count (3.3.8) and
supplementary quantitative testing (3.2.2)
Note 1 to entry: The reference medium is usually a non-selective culture medium (3.1.2), which is different to the
culture medium under test and has been demonstrated to be suitable for use in the performance testing.
EXAMPLE Tryptone soya agar (TSA) is in accordance with ISO 11133.
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.3.4.13, modified — Note 1 to entry has been added and "is in accordance
with ISO 11133" has been added in the example.]
3.1.5
batch of membrane filter
lot of membrane filter
homogeneous and fully traceable units of membrane filter (3.1.1) referring to a defined amount of bulk,
semi-finished product or end product, which is consistent in type and quality, and which has been
produced within one defined production period, having been assigned the same batch (or lot) number
3.1.6
batch of culture medium
lot of culture medium
homogeneous and fully traceable units of a culture medium (3.1.2) referring to a defined amount of
bulk, semi-finished product or end product, which is consistent in type and quality, and which has been
produced within one defined production period, having been assigned the same batch (or lot) number
Note 1 to entry: If the user does not define the batch or lot of culture medium used for performance testing of
membrane filters as the “end product”, it is important to demonstrate that the production process is sufficiently
controlled to produce culture media of consistent quality (e.g. by monitoring culture media performance testing
results).
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.1.2, modified — "medium" has been changed to "culture medium" and
Note 1 to entry has been added.]
3.1.7
specific standard
International Standard or guidance document describing the microbiological analysis of different types
of water for the detection or enumeration of a specific microorganism (or group of microorganisms)
3.2 T erminology of performance testing
3.2.1
batch testing
test of units of membrane filters (3.1.1) from a batch of membrane filter (3.1.5) for its/their intended use
with the specific culture medium (3.1.3) and determination of reference count (3.3.6)
3.2.2
supplementary quantitative testing
test of units of membrane filters (3.1.1) from a batch of membrane filter (3.1.5) for its/their intended use
with the specific culture medium (3.1.3), determination of reference count (3.3.6), test of the membrane
filters on a non-selective culture medium and test of the culture medium without membrane filter
Note 1 to entry: Annex C gives detailed description of the supplementary quantitative testing.
Note 2 to entry: Supplementary quantitative testing is used when a new type of a membrane filter(s) (3.1.1), or a
new manufacturer is tested initially, or when a problem in the day-to-day use or batch testing (3.2.1) of membrane
filters is noticed.
3.2.3
performance of the membrane filter
response of a membrane filter (3.1.1) challenged by a test organism (3.3.3) under defined conditions
Note 1 to entry: The defined conditions are described in the specific standard (3.1.7) for the intended use of
the membrane filter (3.1.1), like: test organism (3.3.3), specific culture medium (3.1.3), reference medium (3.1.4),
productivity (3.2.5), selectivity (3.2.6), specificity (3.3.7), incubation time and temperature.
3.2.4
performance of the culture medium
response of a culture medium (3.1.2) to challenge by test organisms (3.3.3) under defined conditions
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.1]
3.2.5
productivity
level of recovery of a target microorganism (3.3.1) from the culture medium (3.1.2) with the membrane
filter (3.1.1) under defined conditions
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.4, modified — "with the membrane filter" has been added to the term
and the definition.]
3.2.6
selectivity
degree of inhibition of a non-target microorganism (3.3.2) on or in a selective culture medium (3.1.2)
with the membrane filter (3.1.1) under defined conditions
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.5, modified — "with the membrane filter" has been added to the term
and the definition.]
3.2.7
specificity
demonstration, under defined conditions, that non-target microorganisms (3.3.2), if able to grow on the
medium, do not show the same visual characteristics as the target microorganisms (3.3.1) on the culture
medium (3.1.2) with membrane filter (3.1.1) under defined conditions
3.3 T erminology for test microorganisms
3.3.1
target microorganism
microorganism or group of microorganisms to be detected or enumerated which can be expected to
grow under defined conditions
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.2, modified — "which can be expected to grow under defined conditions"
has been added to the definition.]
3.3.2
non-target microorganism
microorganism that is suppressed by the medium and/or conditions of incubation or does not show
expected characteristics of the target microorganism
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.3]
3.3.3
test microorganism
control strain
microorganism generally used for performance testing of membrane filters (3.1.1) and/or culture media
(3.1.2)
Note 1 to entry: Test microorganisms/control strains are further defined according to their source (see
3.3.4 to 3.3.10).
3.3.4
reference strain
microorganism obtained directly from a reference culture collection and defined to at least the species
level
Note 1 to entry: A reference culture collection is a culture collection which is a member of the World Federation
of Culture Collections (WFCC) or the European Culture Collections’ Organization (ECCO).
Note 2 to entry: A reference strain is catalogued and described according to its characteristics and preferably
originating from water as applicable.
3.3.5
reference stock
set of separate identical cultures obtained by a single subculture from the reference strain (3.3.4) either
in the laboratory or from a supplier
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.3]
3.3.6
stock culture
primary subculture from a reference stock (3.3.5)
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.4]
3.3.7
working culture
subculture from a reference stock (3.3.5) or stock culture (3.3.6) or a reference material (3.3.9) or a
certified reference material (3.3.10)
Note 1 to entry: Multi-strain reference material (3.3.9) and multi-strain certified reference material (3.3.10) can
also be used for the preparation of working cultures.
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.4, modified — "certified or not" has been replaced with " or a certified
reference material" Note 1 to entry has been added.]
3.3.8
reference count
inoculum level
total count of colonies on a reference medium (3.1.4) obtained without usage of a membrane filter (3.1.1)
3.3.9
reference material
RM
microbiological material containing a quantity of revivable microorganisms, sufficiently homogenous
and stable with respect to the quantity of revivable microorganisms, which has been established to be
fit for its intended use in a measurement process
[15]
Note 1 to entry: See ISO Guide 30 .
Note 2 to entry: For in-house prepared quality control reference materials (QRMs), often so-called “in-house
[18]
reference materials” or “internal RM”, see ISO Guide 80 and References [23], [25], [27] and [28].
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.6, modified — the reference in Note 1 to entry has been updated and
Note 2 to entry has been added.]
3.3.10
certified reference material
CRM
microbiological reference material (3.3.9) characterized by a metrologically valid procedure for the
quantity of revivable microorganisms
[15]
Note 1 to entry: See ISO Guide 30 .
Note 2 to entry: Metrologically valid procedures for the production and certification of RMs are given in, among
[14] [16] [17]
others, ISO 17034, ISO Guide 31 and ISO Guide 35 .
Note 3 to entry: A microbiological CRM is accompanied by a certificate that provides the value of the specified
quantity of revivable microorganisms, its associated uncertainty and a statement of metrological traceability.
A CRM is certified only for the method/methods and media that were included in the certification process,
otherwise its function is like an (ordinary) reference material (3.3.9).
4 Principle
4.1 General
4.1.1 Introduction
Membrane filters are used for retention followed by direct enumeration of microorganisms in water
samples. Many materials, pore sizes and brands are commercially available and designed for specific
growth purposes. In laboratories carrying out the microbiological examination of water, the main
objectives are to capture and retain, resuscitate, grow, detect and/or enumerate a wide variety of
microorganisms. Membrane filters which meet the required performance criteria are therefore a
prerequisite for any reliable microbiological work.
Direct enumeration includes all colony-count methods following retention of the microorganisms on the
membrane filters and placement of the membrane filters on solid media or on other devices containing
[3] [6] [8] [10] [12] [13]
culture media, see ISO 6461-2 , ISO 7899-2 , ISO 9308-1 , ISO 11731 , ISO 14189 , ISO 16266
and Reference [19]. The direct enumeration is a quantitative method.
Sufficient performance testing should be carried out to demonstrate that a batch is ‘fit for purpose’
and that the filter can produce consistent results for the specific analysis. The quality of the membrane
filters shall be tested together with the intended specific culture medium to demonstrate their
suitability for use in a so-called “microbiological function test”.
This implies that batch testing should demonstrate the suitability of the whole system (membrane
filter in combination with the specific culture medium including the filtration step). It is not required to
evaluate the performance of the membrane filter separately to the performance of the culture medium.
It is expected that suitable media, incubation temperature, incubation duration, incubation atmosphere
and controls will be used for the specific applications. Results obtained from one species or group of
microorganisms may not be valid for other groups.
Suitable specification and acceptance criteria are given in the corresponding specific standard, or
ISO 11133:2014, Annex F and ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex F.
The testing for meeting the performance criteria is an essential part of the quality assurance procedure
and appropriate documentation is necessary.
It is the responsibility of the end user to ensure all required combinations of test strains, microbiological
culture media, and membrane filters have been tested before use. If testing before use is not possible
due to the lability of the culture medium, parallel performance testing alongside the sample testing
shall be performed.
NOTE Annex E gives a practicable example for the testing of the membrane filters by the end user.
4.1.2 Batch testing
The batch testing is required when a different batch or lot of a membrane filter is tested.
The batch testing needs to be performed for each batch of membrane filters with each batch of culture
medium that is used in the quantitative analysis within the procedure of the enumeration method
required. This shall be done before usage of the combination membrane filter/culture medium by the
manufacturer or by the user.
Therefore, the batch testing needs to be adjusted to the procedure of the applicable standard in terms of
culture media, incubation temperature and time as well as suitable test microorganism. The procedure
for batch testing is described in Clause 9.
If the criteria for the batch testing of membrane filters given in the corresponding specific standard,
or ISO 11133:2014, Annex F and ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex F are not achieved, the laboratory
should assess the discrepancies between the results by supplementary testing given in 4.1.3.
4.1.3 Supplementary testing
Supplementary quantitative testing can be used when a new type of a membrane filter or a new
manufacturer is initially tested, or when a problem in the day-to-day use or batch testing is noticed.
The procedure for supplementary quantitative testing is described in Annex C. Supplementary
qualitative testing for a membrane filter is appropriate to consider when there are discrepancies in
colony appearance between different membrane filter brands, types or lots. Some qualitative aspects
for a membrane filter used in combination with the culture medium (e.g. colony characteristics and
morphology) and how they can be checked by use of scores are described in Annex D.
NOTE For the supplementary testing on homogeneity based on a microbiological culture method, see
Reference [29].
4.2 Performance testing
4.2.1 Modules for batch and supplementary testing
The quantitative testing procedure of the membrane filters consists of four different modules, see
Table 1. Depending upon the purpose of the testing, different modules are required:
— for batch testing of the membrane filters, modules 1 and 2 shall be tested simultaneously;
— for supplementary quantitative testing of the membrane filters, the modules 1, 2, 3 and 4 shall be
tested simultaneously.
From the counts achieved in modules 1 and 2, the productivity ratio can be calculated for the membrane
filter used in combination with the specific culture medium. The productivity shall reach a defined
minimum limit, in accordance with the corresponding standard, or ISO 11133:2014, Annex F and
ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex F.
Information on sampling of membrane filters for the testing is given in Clause 8.
Table 1 — Modules for batch and supplementary quantitative testing
Required for
Module
Testing purpose Testing procedure
Batch Supplementary
no.
testing quantitative testing
Count obtained on a non-selective
Determination of the reference culture medium using
1 x x
reference count spread plate technique without a
membrane filter
Productivity,
Membrane filter used with the
a a
selectivity , specificity
2 specific culture medium using x x
of the membrane filter in
membrane filtration technique
its intended use
Membrane filter used with a
Detection of inhibition of
non-selective culture medium
3 target organisms due to — x
using membrane filtration tech-
the membrane filter
nique
Detection of inhibition
Specific culture medium using
of target organisms due
4 spread plate technique without a — x
to the specific (selective)
membrane filter
culture medium
a
If applicable.
4.2.2 Absence of microbial contamination
For testing the absence of microbial contamination, an appropriate quantity of membrane filters shall
be tested by incubation under appropriate conditions.
If a batch of membrane filters is specified by the supplier as sterilized in a validated sterilization cycle,
a test for absence of microbial contamination by the end user is not required.
5 A pparatus and glassware
Appropriate apparatus and glassware are stated in the corresponding specific standards or in ISO 8199.
6 C ulture media and diluents
Appropriate culture media and diluents are stated in the corresponding specific standards or in
ISO 8199.
For the preparation, production, storage and performance testing of culture media and diluents, follow
the procedures given in the corresponding specific standards, ISO 11133 or ISO 8199. Before use, allow
the agar plates to equilibrate at room temperature if stored at a lower temperature.
Appropriate culture media for estimation of the reference count are stated in the corresponding specific
standards, or ISO 11133:2014, Annex F and ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex F.
In order to ensure the reliability of results of performance testing, the reference medium used shall be
of consistent high quality. Examples of aspects to be considered by the user are given in ISO 11133:2014,
6.3.2.
7 Pr eparation of microorganisms for performance testing
7.1 General
This protocol requires the use of a quantified bacterial suspension (which can be a quantitative
reference material) with an appropriate colony count of a target strain.
Guidance for procedures suitable for preservation and maintenance of microorganisms is stated in
ISO 11133.
Appropriate microorganisms for performance testing are stated in corresponding standards, or
ISO 11133:2014, Annex F and ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex F. Where the standards list more than
one control strain for each aspect of performance testing (e.g. productivity, selectivity, specificity),
the minimum number of strains to be used is indicated. Usually at least one or two strains that are
considered typical target or non-target microorganisms are used in the performance testing.
A complete list of culture media and reagents used in Technical Committee ISO/TC 147, Water quality,
Subcommittee SC 4, Microbiological methods, with their names of control strains and their World Data
Centre for Microorganisms (WDCM) collection numbers that should be used for testing the performance
of culture media and reagents can be found in Reference [35].
NOTE 1 Well-characterized strains isolated by the laboratory can be included additionally.
NOTE 2 ISO 11133:2014, Annex J and ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex J provides instructions for the
creation of new microbiological performance criteria, methods and control strains if these are not given in a
specific standard, or ISO 11133:2014, Annex F and ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annex F.
7.2 Reference count
7.2.1 Quantitative productivity testing
For all quantitative tests, the use of a quantified inoculum of the specified microorganisms is needed.
Follow the procedures in accordance with ISO 11133:2014, 5.4.2.5 and ISO 11133:2014/Amd1: 2018,
5.4.2.5. The inoculum can be prepared by the laboratory or from a RM or a CRM.
NOTE 1 For the laboratory-prepared inoculum, additional information on “Quality Control Materials” (QCMs)
[17]
used for specific in-house quality control applications is given in ISO Guide 80 .
The reference count of the laboratory-prepared inoculum or RM is determined in relation to recovery on
a non-selective reference culture medium. Follow the procedures in accordance with ISO 11133:2014,
7.2.2. Appropriate reference media are given in the corresponding specific standard or ISO 11133.
The quantitative enumeration test using membrane filters on productivity requires a level of
approximately 100 colony forming units (cfu) to achieve sufficient precision, see ISO 11133:2014,
Table 1. A practicable range to be used will be 80 cfu to 120 cfu. If more colonies are counted, the
precision is increased.
NOTE 2 By assuming Poisson distribution in a sample, which is usually relevant, colony numbers on membrane
[11]
filters from several aliquots from the sample can be added, see ISO 13843:2017, Clause A.2 .
NOTE 3 ISO 11133:2014, Table 1 shows the 95 % confidence intervals associated with colony counts.
As guidance, the general upper limit for counting on membrane filters with a diameter of 47 mm to
50 mm can be regarded as 80 cfu, see ISO 8199:2018, 9.1.4.2.
However, for certain parameters lower, or even higher, upper limits are more appropriate, see the
specific standards and NOTE 4.
Thus, more than one membrane filter can be required to reach a total of approximately 100 cfu for
counting. Two membrane filters are enough with approximately 50 target colonies on each. Three and
four membrane filters are necessary when about 35 and 25 target colonies, respectively, appear on
each.
NOTE 4 It can be difficult to count a minimum of 50 cfu per membrane filter for bacteria that form large
colonies, such as Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Their performance tests are easier to read with
three plates with approximately 30 cfu per membrane filter or four plates with approximately 25 cfu per
membrane filter to reach a total of approximately 100 cfu. The opposite applies to enterococci: due to their small
and defined colonies, these can often be easily counted when approximately 100 cfu or greater are present on a
single membrane filter.
7.2.2 Qualitative selectivity testing
For the qualitative selectivity testing using membrane filters in combination with the specific culture
medium, a suspension of the non-target microorganism containing at least 10 cfu is inoculated
by membrane filtration. Follow the procedures in accordance with ISO 11133:2014, 5.4.2.5.1.2 and
ISO 11133:2014/Amd1: 2018, 5.4.2.5.1.2.
7.2.3 Qualitative specificity testing
For the qualitative specificity testing using membrane filters together with the specific culture medium,
a suspension of the non-target microorganism containing at least 10 cfu is inoculated by membrane
filtration. Follow the procedures in accordance with ISO 11133:2014, 5.4.2.5.1.3.
7.3 Pr eparation of a standardized test suspension using a working culture
7.3.1 General
The following guidance is given as an example of a procedure suitable for producing standardized test
suspensions for the performance testing of membrane filters. These procedures are generally applicable
but some microorganisms can require special conditions. For example, the culture of anaerobes may
require special conditions (e.g. anaerobic atmosphere, nutritional requirements).
7.3.2 Preparation of the working culture
The test microorganism is obtained as a reference strain and stored as a reference stock. From the
reference stock, a stock culture by using a solid medium is prepared and used for the preparation of
a working culture. A working culture shall be prepared from the reference stock or from the stock
culture as a pure stationary phase culture in a non-selective broth.
All details for the steps of preparation and maintenance of the test microorganisms including different
methods are described in detail in ISO 11133:2014, 5.4.2 and Annex B and ISO 11133:2014/Amd1: 2018,
5.4.2. For Legionella spp. working culture and test suspension, follow the procedures in accordance
[10]
with ISO 11731:2017, 11.3 .
Although various techniques can be used, they shall be applied in a standardized way to guarantee
both purity and known inoculum level.
NOTE Annex E gives an example of the preparation of the working cultures for the performance testing in
[8]
accordance with ISO 9308-1 .
For the preparation of a test suspension using reference material, see 7.4.
7.3.3 Preparation of a standardized test suspension (inoculum) for the test
From the working culture, prepare serial dilutions in a suitable diluent, for example, quarter-strength
Ringer’s solution, peptone salt solution, see ISO 8199:2018, Annex D. Use the most suitable dilution step
for the target level of microorganisms (cfu) in a specified volume or refer to the supplier.
For every test microorganism, the suitable dilution to use as a test suspension (inoculum) should be
determined from previous tests conducted under strictly standardized conditions f
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 7704
Deuxième édition
2023-01
Qualité de l'eau — Exigences relatives
aux essais de performance des
membranes filtrantes utilisées pour
le dénombrement direct des micro-
organismes par des méthodes de
culture
Water quality — Requirements for the performance testing of
membrane filters used for direct enumeration of microorganisms by
culture methods
Numéro de référence
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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
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Tél.: +41 22 749 01 11
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Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vii
1 Domaine d'application .1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions . 2
3.1 Terminologie générale . 2
3.2 Terminologie relative aux essais de performance . 3
3.3 Terminologie relative aux micro-organismes d'essai . 4
4 Principe. 6
4.1 Généralités . 6
4.1.1 Introduction . 6
4.1.2 Essai par lots . 6
4.1.3 Essais supplémentaires . 7
4.2 Essais de performance . 7
4.2.1 Modules pour les essais par lots et les essais supplémentaires . 7
4.2.2 Absence de contamination microbienne . 8
5 Appareillage et verrerie. 8
6 Milieux de culture et diluants .8
7 Préparation de micro-organismes pour les essais de performance .9
7.1 Généralités . 9
7.2 Nombre de référence . 9
7.2.1 Essais quantitatifs de productivité . 9
7.2.2 Essai qualitatif de sélectivité . 10
7.2.3 Essai qualitatif de spécificité . 10
7.3 Préparation d'une suspension d'essai normalisée à l'aide d'une culture de travail . 10
7.3.1 Généralités . 10
7.3.2 Préparation de la culture de travail . 10
7.3.3 Préparation d'une suspension d'essai normalisée (inoculum) pour l'essai . 11
7.4 Préparation d'une suspension d'essai à l'aide du matériau de référence . 11
8 Échantillonnage des membranes filtrantes pour les essais .11
9 Procédure .12
9.1 Généralités .12
9.2 Inoculation par la technique par étalement .12
9.2.1 Généralités .12
9.2.2 Inoculation .13
9.3 Inoculation par la technique de filtration sur membrane.13
9.3.1 Généralités .13
9.3.2 Inoculation .13
9.4 Incubation et dénombrement . 14
9.5 Essai d'absence de contamination microbienne . 14
10 Calcul, expression et interprétation des résultats .14
10.1 Généralités . 14
10.2 Essai de productivité . 14
10.3 Essai de sélectivité . 15
10.4 Essai de spécificité . 15
11 Documentation des résultats d'essai .15
11.1 Rapport d'essai . 15
11.2 Informations fournies par le fabricant. 16
11.3 Traçabilité . 16
iii
Annexe A (normative) Diagramme de la procédure d'essai par lots .17
Annexe B (informative) Exemple de fiche de contrôle pour l'enregistrement des résultats
des essais par lots .18
Annexe C (informative) Essai quantitatif supplémentaire des membranes filtrantes .19
Annexe D (informative) Essai qualitatif supplémentaire des membranes filtrantes .22
Annexe E (informative) Exemple pratique d'essai quantitatif par lots et d'essai quantitatif
supplémentaire par l'utilisateur final .26
Bibliographie .37
iv
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l'intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l'Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: www.iso.org/iso/fr/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité
SC 4, Méthodes microbiologiques, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 230, Analyse de l'eau,
du Comité européen de normalisation (CEN), conformément à l'Accord de coopération technique entre
l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 7704:1985), qui a fait l'objet d'une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— modification du domaine d'application afin de couvrir les exigences relatives aux essais de
performance des membranes filtrantes utilisées pour la rétention et le dénombrement direct;
— ajout d'articles/paragraphes pour les termes et définitions, les micro-organismes, l'échantillonnage
et les répliques, la procédure, l'inoculation et l'incubation, le dénombrement, le calcul et la
documentation;
— révision des articles/paragraphes relatifs aux milieux de culture et diluants, à la préparation
des souches d'essai, aux essais de performance et à la procédure, de manière à être conformes à
l'ISO 8199 et à l'ISO 11133;
— ajout de l'Annexe A avec un diagramme pour les essais par lots;
— ajout de l'Annexe B afin de donner un exemple de fiche de contrôle pour l'enregistrement des
résultats des essais par lots et des essais supplémentaires des membranes filtrantes;
— ajout de l'Annexe C afin de décrire l'essai quantitatif supplémentaire des membranes filtrantes, y
compris un diagramme de la procédure;
v
— ajout de l'Annexe D afin de décrire l'essai qualitatif supplémentaire des membranes filtrantes;
— ajout de l'Annexe E afin de donner un exemple pratique d'essais par lots et d'essai quantitatif
supplémentaire par l'utilisateur final, y compris un diagramme de la procédure;
— ajout de la Bibliographie.
Il convient que l'utilisateur adresse tout retour d'information ou toute question concernant le présent
document à l'organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l'adresse https://www.iso.org/fr/members.html.
vi
Introduction
Dans les laboratoires pratiquant des examens microbiologiques, les principaux objectifs sont la capture,
la revivification, la croissance, la recherche ou le dénombrement, voire tout cela à la fois, d'une grande
variété de micro-organismes. Les membranes filtrantes sont utilisées dans de nombreuses techniques
traditionnelles de culture microbiologique et sont commercialisées sous différents types et marques.
De nombreuses études comparatives de membranes filtrantes publiées dans la littérature font état
de différences dans leur capacité à récupérer les bactéries des échantillons d'eau; voir les Références
[22], [23], [28], [30], [31], [32], [33] et [34]. En raison de la complexité du processus de fabrication,
la composition chimique, la taille des pores et la structure des pores peuvent varier en fonction des
marques, voire du lot de matériau. Par ailleurs, le processus de fabrication peut également libérer
des substances lixiviables qui peuvent potentiellement interférer avec la récupération des micro-
organismes.
Il est par conséquent primordial de normaliser, autant que possible, les essais de performance des
membranes filtrantes, non seulement afin de fournir des résultats cohérents, mais également afin de
permettre la mise en place de procédures normalisées pour le dénombrement de micro-organismes
spécifiques.
vii
NORME INTERNATIONALE ISO 7704:2023(F)
Qualité de l'eau — Exigences relatives aux essais de
performance des membranes filtrantes utilisées pour
le dénombrement direct des micro-organismes par des
méthodes de culture
1 Domaine d'application
Le présent document spécifie les exigences pour les essais de performance des membranes filtrantes
utilisées pour la rétention suivie d'un dénombrement direct des micro-organismes par des méthodes
de culture.
Le présent document s'applique aux membranes filtrantes qui sont utilisées pour la rétention suivie
d'un dénombrement direct de micro-organismes spécifiques sur des milieux solides ou sur d'autres
[19]
dispositifs contenant des milieux, comme des pads en papier absorbants .
Le présent document ne s'applique pas aux membranes filtrantes utilisées pour la concentration et
l'élution ou pour des méthodes qualitatives.
Les essais s'appliquent aux membranes filtrantes destinées à l'analyse microbiologique de différents
types d'eau, tels que:
— l'eau potable, l'eau embouteillée et d'autres types d'eau dans laquelle un faible nombre de micro-
organismes est attendu;
— l'eau dans laquelle un plus grand nombre de micro-organismes est attendu, par exemple l'eau de
surface et l'eau de process.
Ces essais sont destinés à démontrer l'adéquation de l'ensemble du système (membrane filtrante et
milieu de culture, y compris l'étape de filtration) requis pour les essais spécifiques décrits dans les
Références [3], [6], [8], [10], [12] et [13].
Le présent document s'applique:
— aux fabricants produisant des membranes filtrantes;
— aux laboratoires de microbiologie utilisant des membranes filtrantes pour leurs propres essais ou
les fournissant à d'autres utilisateurs finaux.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu'ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 8199:2018, Qualité de l’eau — Exigences et lignes directrices générales pour les examens
microbiologiques sur milieu de culture
ISO 11133:2014, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l'eau — Préparation,
production, stockage et essais de performance des milieux de culture
I S O 11133:2014/A md1: 2018 , Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau —
Préparation, production, stockage et essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
L'ISO et l'IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l'adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l'adresse https:// www .electropedia .org/
3.1 Terminologie générale
3.1.1
membrane filtrante
matrice de filtration hydrophile poreuse, composée de différents polymères présentant des
caractéristiques de filtration équivalentes à leurs tailles nominales de pores, généralement comprises
entre 0,1 µm et 1,2 µm, destinée à être utilisée pour la rétention des micro-organismes
Note 1 à l'article: La membrane filtrante assure la rétention effective des micro-organismes en fonction de la
taille des pores de la membrane quand une pression différentielle (positive ou négative) est appliquée.
Note 2 à l'article: Le type de membrane filtrante à utiliser pour une méthode microbiologique donnée est décrit
dans la norme spécifique (3.1.7) correspondante.
3.1.2
milieu de culture
mélange de substances, sous forme liquide, semi-solide ou solide, qui contient des constituants naturels
et/ou synthétiques permettant la croissance des micro-organismes (avec ou sans constituants pour
l'inhibition de certains d'entre eux), leur identification ou leur conservation
Note 1 à l'article: Le milieu de culture à utiliser pour une certaine méthode microbiologique est décrit dans la
norme spécifique (3.1.7) correspondante, voir milieu de culture spécifique (3.1.3).
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.3.1, modifiée — ajout de «constituants pour» et remplacement de la Note 1
à l'article.]
3.1.3
milieu de culture spécifique
milieu de culture (3.1.2), généralement sélectif, tel que désigné dans une norme spécifique (3.1.7) pour
utilisation avec des membranes filtrantes (3.1.1)
EXEMPLE 1 La gélose chromogène pour bactéries coliformes (CCA) utilisée avec des membranes filtrantes
[8]
conformément à l'ISO 9308-1 .
EXEMPLE 2 Milieu de Slanetz et de Bartley utilisé avec des membranes filtrantes conformément à l'
[6]
ISO 7899-2 .
3.1.4
milieu de référence
milieu de culture (3.1.2), en général non sélectif, utilisé pour la détermination du nombre de référence
(3.3.8) et les essais quantitatifs supplémentaires (3.2.2)
Note 1 à l'article: Le milieu de référence est généralement un milieu de culture (3.1.2) non sélectif, qui est
différent du milieu de culture soumis à l'essai et dont l'aptitude à être utilisé dans les essais de performance a été
démontrée.
EXEMPLE La gélose tryptone soja (TSA) est conforme à l'ISO 11133.
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.3.4.13, modifiée — ajout de la Note 1 à l'article et ajout de «est conforme à
l'ISO 11133» dans l'exemple.]
3.1.5
lot de membranes filtrantes
unités de membrane filtrante (3.1.1) homogènes et conformes aux exigences de traçabilité,
correspondant à une quantité définie de produits en vrac, de produits semi-finis ou finis, de type et
de qualité homogènes, qui a été produite au cours d'une période définie et identifiée sous un même
numéro de lot
3.1.6
lot de milieu de culture
unités de milieu de culture (3.1.2) homogène et conforme aux exigences de traçabilité, correspondant à
une quantité définie de produits en vrac, de produits semi-finis ou finis, de type et de qualité homogènes,
qui a été produite au cours d'une période définie et identifiée sous un même numéro de lot
Note 1 à l'article: Si l'utilisateur ne définit pas le lot de milieu de culture utilisé pour les essais de performance
des membranes filtrantes comme le «produit fini», il est important de démontrer que le processus de production
est suffisamment contrôlé pour obtenir des milieux de culture de qualité constante (par exemple en surveillant
les résultats des essais de performance des milieux de culture).
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.1.2, modifiée — remplacement de «milieu» par «milieu de culture» et ajout
de la Note 1 à l'article.]
3.1.7
normes spécifiques
norme internationale ou document d'orientation décrivant l'analyse microbiologique de différents
types d'eau en vue de la recherche ou du dénombrement d'un micro-organisme déterminé (ou d'un
groupe de micro-organismes)
3.2 Terminologie relative aux essais de performance
3.2.1
essai par lots
essai d'unités de membranes filtrantes (3.1.1) provenant d'un lot de membranes filtrantes (3.1.5) en vue
de leur utilisation prévue avec le milieu de culture spécifique (3.1.3) et détermination du nombre de
référence (3.3.8)
3.2.2
essai quantitatif supplémentaire
essai d'unités de membranes filtrantes (3.1.1) provenant d'un lot de membranes filtrantes (3.1.5) en
vue de leur utilisation prévue avec le milieu de culture spécifique (3.1.3), détermination du nombre de
référence (3.3.6), essai des membranes filtrantes sur un milieu de culture non sélectif et essai du milieu
de culture sans membrane filtrante
Note 1 à l'article: L'Annexe C donne une description détaillée des essais quantitatifs supplémentaires.
Note 2 à l'article: Des essais quantitatifs supplémentaires sont utilisés lorsqu'un nouveau type de membrane
filtrante (3.1.1) ou un nouveau fabricant est soumis à des essais initiaux, ou lorsqu'un problème est constaté dans
l'utilisation quotidienne ou les essais par lots (3.2.1) des membranes filtrantes.
3.2.3
performance de la membrane filtrante
réponse d'une membrane filtrante (3.1.1) soumise à une souche test (3.3.3) dans des conditions définies
Note 1 à l'article: Les conditions définies sont décrites dans la norme spécifique (3.1.7) pour l'utilisation prévue
de la membrane filtrante (3.1.1), comme: souche test (3.3.3), milieu de culture spécifique (3.1.3), milieu de référence
(3.1.4), productivité (3.2.5), sélectivité (3.2.6), spécificité (3.2.7), durée et température d'incubation.
3.2.4
performance du milieu de culture
réponse d'un milieu de culture (3.1.2) soumis à une souche test (3.3.3) dans des conditions définies
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.1]
3.2.5
productivité
taux de récupération d'un micro-organisme cible (3.3.1) à partir du milieu de culture (3.1.2) avec la
membrane filtrante (3.1.1) dans des conditions définies
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.4, modifiée — ajout de «avec la membrane filtrante» dans la définition.]
3.2.6
sélectivité
degré d'inhibition d'un micro-organisme non cible (3.3.2) sur ou dans un milieu de culture (3.1.2) sélectif
avec la membrane filtrante (3.1.1) dans des conditions définies
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.5, modifiée — ajout de «avec la membrane filtrante» dans la définition.]
3.2.7
spécificité
démonstration, dans des conditions définies, que le micro-organisme non cible (3.3.2), s'il est capable de
se développer sur le milieu, ne présente pas les mêmes caractéristiques visuelles que le micro-organisme
cible (3.3.1), sur le milieu de culture (3.1.2) avec membrane filtrante (3.1.1) dans des conditions définies
3.3 Terminologie relative aux micro-organismes d'essai
3.3.1
micro-organisme cible
micro-organisme ou groupe de micro-organismes à rechercher ou à dénombrer, dont la croissance peut
être attendue dans des conditions définies
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.2, modifiée — ajout de «dont la croissance peut être attendue dans des
conditions définies» dans la définition.]
3.3.2
micro-organisme non cible
micro-organisme qui est supprimé par le milieu et/ou les conditions d'incubation ou qui ne présente
pas les caractéristiques attendues du micro-organisme cible
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.2.3]
3.3.3
souche test
souche de contrôle
micro-organisme utilisé en général pour les essais de performance des membranes filtrantes (3.1.1) et/
ou des milieux de culture (3.1.2)
Note 1 à l'article: Les souches test/souches de contrôle sont définies en fonction de leur provenance (voir 3.3.4 à
3.3.10).
3.3.4
souche de référence
micro-organisme obtenu directement auprès d'une collection de culture de référence et défini au moins
par son espèce
Note 1 à l'article: Une collection de culture de référence est une collection de culture qui est membre de la World
Federation of Culture Collections (WFCC) (Fédération mondiale des collections de culture) ou de l'European
Culture Collections' Organisation (ECCO) (Organisation européenne des collections de culture).
Note 2 à l'article: Une souche de référence est classée et décrite selon ses caractéristiques et issue, de préférence,
d'eau, le cas échéant.
3.3.5
stock de référence
ensemble de cultures identiques distinctes obtenues à partir d'une subculture de la souche de référence
(3.3.4) préparée au laboratoire ou obtenue auprès d'un fournisseur
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.3]
3.3.6
culture mère
subculture primaire obtenue à partir d'un stock de référence (3.3.5)
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.4]
3.3.7
culture de travail
subculture issue d'un stock de référence (3.3.5), d'une culture mère (3.3.6), d'un matériau de référence
(3.3.9) ou d'un matériau de référence certifié (3.3.10)
Note 1 à l'article: Le matériau de référence (3.3.9) multi-souches et le matériau de référence certifié (3.3.10) multi-
souches peuvent également être utilisés pour la préparation des cultures de travail.
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.4, modifiée — remplacement de «certifié ou non» par «ou d'un matériau
de référence certifié» et ajout de la Note 1 à l'article.]
3.3.8
nombre de référence
niveau d'inoculum
nombre total de colonies sur un milieu de référence (3.1.4) obtenu sans l'utilisation d'une membrane
filtrante (3.1.1)
3.3.9
matériau de référence
MR
matériau microbiologique contenant une quantité suffisamment homogène et stable de micro-
organismes revivifiables définie pour être adaptée à son application prévue dans un processus de
mesurage
[15]
Note 1 à l'article: Voir le Guide ISO 30 .
Note 2 à l'article: Pour les matériaux de référence de contrôle de qualité préparés en interne, souvent appelés
[18]
«matériaux de référence internes» ou «MR internes», voir le Guide ISO 80 et les Références [23], [25], [27] et
[28].
[SOURCE: ISO 11133:2014, 3.4.6, modifiée — mise à jour de la référence de la Note 1 à l'article et ajout de
la Note 2 à l'article.]
3.3.10
matériau de référence certifié
MRC
matériau de référence microbiologique (3.3.9) caractérisé par une procédure métrologique validée pour
la quantité de micro-organismes revivifiables
[15]
Note 1 à l'article: Voir le Guide ISO 30 .
Note 2 à l'article: Des procédures métrologiquement valides applicables à la production et à la certification de MR
[14] [16] [17]
sont données, entre autres, dans l'ISO 17034, le Guide ISO 31 et le Guide ISO 35 .
Note 3 à l'article: Un MRC microbiologique est accompagné d'un certificat donnant la valeur de la quantité
spécifiée de micro-organismes revivifiables, son incertitude associée et une déclaration de sa traçabilité
métrologique. Un MRC est certifié uniquement pour la/les méthode(s) et les milieux qui ont été inclus dans le
processus de certification. Autrement, sa fonction est celle d'un matériau de référence (3.3.9) (ordinaire).
4 Principe
4.1 Généralités
4.1.1 Introduction
Les membranes filtrantes sont utilisées pour la rétention puis le dénombrement direct des micro-
organismes dans les échantillons d'eau. De nombreux matériaux, tailles de pores et marques sont
commercialisés et conçus pour des objectifs de croissance spécifiques. Dans les laboratoires pratiquant
des examens microbiologiques de l'eau, les principaux objectifs sont la capture et la rétention, la
revivification, la croissance, la recherche et/ou le dénombrement d'une grande variété de micro-
organismes. Par conséquent, des membranes filtrantes qui satisfont aux critères de performance requis
constituent une condition préalable à tout travail microbiologique fiable.
Le dénombrement direct comprend toutes les méthodes de dénombrement des colonies après rétention
des micro-organismes sur les membranes filtrantes et placement des membranes filtrantes sur
[3]
des milieux solides ou sur d'autres dispositifs contenant des milieux de culture; voir l'ISO 6461-2,
[6] [8] [10] [12] [13]
l'ISO 7899-2, l'ISO 9308-1, l'ISO 11731, l'ISO 14189, l'ISO 16266 et la Référence [19]. Le
dénombrement direct est une méthode quantitative.
Il convient de réaliser des essais de performance suffisants afin de démontrer qu'un lot est «adapté à
l'usage prévu» et que le filtre peut produire des résultats cohérents pour l'analyse spécifique. La qualité
des membranes filtrantes doit être soumise à essai avec le milieu de culture spécifique prévu, afin de
démontrer leur aptitude à l'usage prévu dans le cadre d'un «essai de fonctionnement microbiologique».
Par conséquent, il convient que les essais par lots démontrent l'adéquation de l'ensemble du système
(membrane filtrante en combinaison avec le milieu de culture spécifique, y compris l'étape de filtration).
Il n'est pas requis d'évaluer la performance de la membrane filtrante séparément de la performance du
milieu de culture.
Il est prévu d'utiliser des milieux, une température d'incubation, une durée d'incubation, une
atmosphère d'incubation et des contrôles appropriés pour les applications spécifiques. Les résultats
obtenus à partir d'une espèce ou d'un groupe de micro-organismes peuvent ne pas être valables pour
d'autres groupes.
Les spécifications et les critères d'acceptation appropriés sont donnés dans la norme spécifique
correspondante, ou dans l'ISO 11133:2014, Annexe F et l'ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annexe F.
L'essai pour répondre aux critères de performance constitue une partie essentielle de la procédure
d'assurance qualité et une documentation appropriée est nécessaire.
Il incombe à l'utilisateur final de s'assurer que toutes les combinaisons requises de souches d'essai,
de milieux de culture microbiologique et de membranes filtrantes ont été soumises à essai avant
utilisation. S'il est impossible de mener des essais avant l'utilisation en raison de la labilité du milieu
de culture, des essais de performance en parallèle doivent être réalisés avec les essais des échantillons.
NOTE L'Annexe E donne un exemple pratique d'essai des membranes filtrantes par l'utilisateur final.
4.1.2 Essai par lots
L'essai par lots est requis lorsqu'un lot de membranes filtrantes différent est soumis à essai.
L'essai par lots doit être effectué pour chaque lot de membranes filtrantes avec chaque lot de milieu de
culture utilisé pour l'analyse quantitative dans le cadre de la procédure de la méthode de dénombrement
requise. Cela doit être effectué avant l'utilisation de la combinaison membrane filtrante/milieu de
culture par le fabricant ou par l'utilisateur.
Par conséquent, les essais par lots doivent être adaptés à la procédure de la norme applicable en matière
de milieu de culture, de température et de durée d'incubation ainsi que de souche test appropriée. La
procédure d'essai par lots est décrite à l'Article 9.
Si les critères relatifs à l'essai par lots des membranes filtrantes (indiqués dans la norme spécifique
correspondante, ou dans l'ISO 11133:2014, Annexe F et l'ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annexe F) ne sont
pas respectés, il convient que le laboratoire évalue les divergences entre les résultats par des essais
supplémentaires donnés en 4.1.3.
4.1.3 Essais supplémentaires
Des essais quantitatifs supplémentaires peuvent être utilisés lorsqu'un nouveau type de membrane
filtrante ou un nouveau fabricant est soumis à des essais initiaux, ou lorsqu'un problème est constaté
dans l'utilisation quotidienne ou les essais par lots. La procédure d'essai quantitatif supplémentaire est
décrite à l'Annexe C. Des essais qualitatifs supplémentaires pour une membrane filtrante sont à prendre
en considération en cas de divergences dans l'apparence des colonies entre différentes marques, types
ou lots de membranes filtrantes. L'Annexe D décrit certains aspects qualitatifs d'une membrane filtrante
utilisée en association avec le milieu de culture (par exemple, les caractéristiques et la morphologie des
colonies) et la manière dont ils peuvent être vérifiés à l'aide de scores.
NOTE Pour l'essai supplémentaire concernant l'homogénéité fondé sur une méthode de culture
microbiologique, voir la Référence [29].
4.2 Essais de performance
4.2.1 Modules pour les essais par lots et les essais supplémentaires
La procédure d'essai quantitatif des membranes filtrantes comprend quatre modules différents; voir le
Tableau 1. En fonction de l'objectif de l'essai, différents modules sont requis:
— pour les essais par lots des membranes filtrantes, les modules 1 et 2 doivent être soumis à essai
simultanément;
— pour les essais quantitatifs supplémentaires des membranes filtrantes, les modules 1, 2, 3 et 4
doivent être soumis à essai simultanément.
Pour les dénombrements obtenus avec les modules 1 et 2, le ratio de productivité peut être calculé pour
la membrane filtrante utilisée conjointement avec le milieu de culture spécifique. La productivité doit
atteindre une limite minimale définie, conformément à la norme correspondante, ou à l'ISO 11133:2014,
Annexe F et à l'ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annexe F.
L'Article 8 donne des informations relatives à l'échantillonnage des membranes filtrantes pour les
essais.
Tableau 1 — Modules pour les essais par lots et les essais quantitatifs supplémentaires
Requis pour
N° du
Objectif de l'essai Procédure d'essai
Essai Essai quantitatif
module
par lots supplémentaire
Nombre obtenu sur un milieu de
Détermination du culture de référence non sélectif à
1 x x
nombre de référence l'aide de la technique par étalement
sans membrane filtrante
Productivité,
a a
sélectivité , spécificité Membrane filtrante utilisée avec le
2 de la membrane filtrante milieu de culture spécifique à l'aide de x x
dans le cadre de la technique de la membrane filtrante
l'utilisation prévue
Détection de l'inhibition Membrane filtrante utilisée avec le
des organismes cibles milieu de culture non sélectif à l'aide
3 — x
due à la membrane fil- de la technique de la membrane
trante filtrante
Détection de l'inhibition
Milieu de culture spécifique utilisant
des organismes cibles
4 la technique par étalement sans mem- — x
due au milieu de culture
brane filtrante
spécifique (sélectif)
a
Le cas échéant.
4.2.2 Absence de contamination microbienne
Afin de vérifier l'absence de contamination microbienne, une quantité appropriée de membranes
filtrantes doit être soumise à des essais par incubation dans des conditions appropriées.
Si un lot de membranes filtrantes est spécifié par le fournisseur comme étant stérilisé selon un cycle
de stérilisation validé, un essai d'absence de contamination microbienne par l'utilisateur final n'est pas
nécessaire.
5 Appareillage et verrerie
L'appareillage et la verrerie appropriés sont indiqués dans les normes spécifiques correspondantes ou
dans l'ISO 8199.
6 Milieux de culture et diluants
Les milieux de culture et les diluants appropriés sont indiqués dans les normes spécifiques
correspondantes ou dans l'ISO 8199.
Pour la préparation, la production, le stockage et les essais de performance des milieux de culture et
des diluants, suivre les procédures décrites dans les normes spécifiques correspondantes, l'ISO 11133
ou l'ISO 8199. Avant utilisation, laisser les boîtes de gélose s'équilibrer à température ambiante si elles
sont stockées à une température inférieure.
Les milieux de culture appropriés pour l'estimation du nombre de référence sont donnés dans les
normes spécifiques correspondantes, ou dans l'ISO 11133:2014, Annexe F, et l'ISO 11133:2014/Amd1:
2018, Annexe F.
Afin de garantir la fiabilité des résultats des essais de performance, le milieu de référence utilisé doit
être de haute qualité. L'ISO 11133:2014, 6.3.2, donne des exemples d'aspects à prendre en compte par
l'utilisateur.
7 Préparation de micro-organismes pour les essais de performance
7.1 Généralités
Le présent protocole requiert l'utilisation d'une suspension bactérienne quantifiée (qui peut être un
matériau de référence quantitatif) avec un nombre de colonies approprié d'une souche cible.
Les recommandations relatives aux procédures appropriées pour la conservation et l'entretien des
micro-organismes sont indiquées dans l'ISO 11133.
Les micro-organismes appropriés pour les essais de performance sont indiqués dans les normes
correspondantes, ou dans l'ISO 11133:2014, Annexe F et l'ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annexe F.
Lorsque les normes mentionnent plus d'une souche de contrôle pour chaque aspect des essais de
performance (par exemple productivité, sélectivité, spécificité), le nombre minimum de souches à
utiliser est indiqué. En règle générale, au moins une ou deux souches considérées comme des micro-
organismes cibles ou non cibles typiques sont utilisées dans l'essai de performance.
Une liste complète des milieux de culture et des réactifs utilisés par le comité technique ISO/TC 147,
Qualité de l'eau, sous-comité SC 4, Méthodes microbiologiques, avec le nom des souches de contrôle et
leur numéro de collection du World Data Centre for Microorganisms (WDCM) (Centre de données
mondial sur les micro-organismes), qu'il convient d'utiliser pour les essais de performance des milieux
de culture et des réactifs, peut être consultée à la Référence [35].
NOTE 1 Les souches bien caractérisées isolées par le laboratoire peuvent également être incluses.
NOTE 2 L'ISO 11133:2014, Annexe J et l'ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annexe J donnent des instructions
relatives à la création de nouveaux critères de performance microbiologique, de méthodes et de souches de
contrôle si ceux-ci ne sont pas donnés dans une norme spécifique, ou dans l'ISO 11133:2014, Annexe F et
l'ISO 11133:2014/Amd1: 2018, Annexe F.
7.2 Nombre de référence
7.2.1 Essais quantitatifs de productivité
Pour tous les essais quantitatifs, l'utilisation d'un inoculum quantifié des micro-organismes spécifiés est
nécessaire. Suivre les procédures conformément à l'ISO 11133:2014, 5.4.2.5 et à l'ISO 11133:2014/Amd1:
2018, 5.4.2.5. L'inoculum peut être préparé par le laboratoire ou à partir d'un MR ou d'un MRC.
NOTE 1 Pour l'inoculum préparé en laboratoire, des informations supplémentaires relatives aux «matériaux
de contrôle de la qualité» utilisés pour des applications spécifiques de contrôle de la qualité en interne sont
[17]
données dans le Guide ISO80 .
Le nombre de référence de l'inoculum préparé en laboratoire ou du MR est déterminé par rapport à la
récupération sur un milieu de culture de référence non sélectif. Suivre les procédures conformément
à l'ISO 11133:2014, 7.2.2. Les milieux de référence appropriés sont donnés dans la norme spécifique
correspondante ou dans l'ISO 11133.
L'essai de dénombrement quantitatif à l'aide de membranes filtrantes sur la productivité nécessite
un niveau d'environ 100 UFC (unités formant colonie) pour obtenir une précision suffisante; voir
l'ISO 11133:2014, Tableau 1. Une plage pratique à utiliser se situera entre 80 UFC et 120 UFC. Si
davantage de colonies sont dénombrées, la précision augmente.
NOTE 2 En supposant une distribution de Poisson dans un échantillon, ce qui est généralement pertinent,
les nombres de colonies sur les membranes filtrantes de plusieurs aliquotes de l'échantillon peuvent être
[11]
additionnés; voir l'ISO 13843:2017, paragraphe A.2 .
NOTE 3 L'ISO 11133:2014, Tableau 1, montre les intervalles de confiance à 95 % relatifs au nombre de colonies.
À titre indicatif, la limite supérieure générale pour le dénombrement sur les membranes filtrantes d'un
diamètre de 47 mm à 50 mm peut être considérée comme étant de 80 UFC; voir l'ISO 8199:2018, 9.1.4.2.
Toutefois, pour certains paramètres, des
...
Questions, Comments and Discussion
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