ISO 22196:2007
(Main)Plastics — Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces
Plastics — Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces
ISO 22196:2007 specifies a method of evaluating the antibacterial activity of antibacterial-treated plastic products (including intermediate products). It is not intended to be used to evaluate the effects and propagation of bacteria on plastics without antibacterial treatments. ISO 846 describes tests to evaluate the effects and propagation of bacteria on plastics, which are different from those covered by ISO 22196. Secondary effects of antibacterial treatments, such as the prevention of biodeterioration and odour, are not covered by the standard, which is not intended to be used or referenced as a method to document or claim biodegradability of plastics. The standard does not concern plastic building materials, such as PVC or composites, unless they act in the same way as treated articles.
Plastiques — Mesurage de l'action antibactérienne sur les surfaces en plastique
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 22196
Первое издание
2007-10-15
Пластмассы. Измерение
противобактериальной активности на
пластмассовых поверхностях
Plastics – Measurement of antibacterial activity on plastics surfaces
Ответственность за подготовку русской версии несёт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьёй 18.1 Устава ISO
Ссылочный номер
ISO 22196:2007
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на интегрированные шрифты и они не будут установлены на компьютере, на котором ведется редактирование. В
случае загрузки настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение
лицензионных условий фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe - торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованные для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.
ДОКУМЕНТ ОХРАНЯЕТСЯ АВТОРСКИМ ПРАВОМ
© ISO 2007
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
предварительного письменного согласия ISO, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного по
адресу, приведенному ниже, или в комитет-член ISO в стране запрашивающей стороны.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 734 09 47
E-mail copyright @ iso.org
Web www.iso.org
Опубликовано в Швейцарии
ii © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .1
4 Материалы .2
4.1 Бактерии, используемые в анализе .2
4.2 Реактивы, питательные среды и растворы.3
5 Аппаратура.5
6 Стерилизация оборудования и хранение исходных культур .5
6.1 Стерилизация сухим жаром .5
6.2 Стерилизация паром под давлением .6
6.3 Подготовка стеклянной посуды .6
6.4 Поддержание исходных культур.6
7 Проведение анализа .6
7.1 Предварительный посев бактерий.6
7.2 Подготовка образцов для анализа .6
7.3 Подготовка посевного материала для анализа.7
7.4 Посев на испытуемые образцы.7
7.5 Инкубирование засеянных испытуемых образцов.8
7.6 Выделение бактерий на испытуемых образцах .8
7.7 Определение количества жизнеспособных бактерий подсчетом на чашках.9
8 Обработка результатов.9
8.1 Определение количества жизнеспособных бактерий .9
8.2 Условия получения достоверных результатов анализа.10
8.3 Расчет противобактериальной активности .10
8.4 Эффективность противобактериального вещества .11
9 Повторяемость и воспроизводимость .11
10 Протокол испытания.11
Приложение А (нормативное) Качество биологических материалов.12
Приложение В (информативное) Повторяемость и воспроизводимость.13
Библиография.16
© ISO 2007 – Все права сохраняются iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) представляет собой всемирную федерацию,
состоящую из национальных органов по стандартизации (комитеты-члены ISO). Работа по разработке
международных стандартов обычно ведется Техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в теме, для решения которой образован данный технический комитет, имеет право
быть представленным в этом комитете. Международные организации, правительственные и
неправительственные, поддерживающие связь с ISO, также принимают участие в работе. ISO тесно
сотрудничает с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам
стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, установленными в Части 2
Директив ISO/IEC.
Основное назначение технических комитетов заключается в разработке международных стандартов.
Проекты международных стандартов, принятые Техническими комитетами, направляются комитетам-
членам на голосование. Для их опубликования в качестве международных стандартов требуется
одобрение не менее 75 % комитетов-членов, участвовавших в голосовании.
Внимание обращается на тот факт, что отдельные элементы данного документы могут составлять
предмет патентных прав. ISO не несет ответственность за идентификацию каких-либо или всех
подобных патентных прав.
ISO 22196 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 61, Пластмассы, Подкомитетом SC 6,
Старение, стойкость к воздействию химических веществ и внешнему воздействию.
iv © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 4 ----------------------
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ ISO 22196:2007(R)
Пластмассы. Измерение противобактериальной активности
на пластмассовых поверхностях
1 Область применения
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Работа с потенциально опасными микроорганизмами требует высокой
степени технической компетенции и может быть предметом действующего национального
законодательства и регламентов. Подобную работу может осуществлять только персонал,
обученный технике работы с микробиологическим материалом. Необходимо строго соблюдать
правила дезинфекции, стерилизации и личной гигиены.
Настоящий международный стандарт устанавливает метод оценки противобактериальной активности
обработанных противобактериальными средствами пластмассовых продуктов (включая
промежуточные продукты).
ПРИМЕЧАНИЕ Стандарт также можно применять к некоторым непористым материалам.
Данный стандарт не предназначен для оценки воздействия и распространения бактерий на пластмассах без
[6]
противобактериальной обработки. ISO 846 описывает испытания для оценки воздействия и
распространения бактерий на пластмассах, которые отличаются от материалов, подпадающих под действие
настоящего международного стандарта. Заинтересованные данной проблемой пользователи могут
обратиться к стандарту ISO 846:1997, метод C.
Вторичные эффекты противобактериальной обработки, такие как предотвращение биоразложения и
появления запаха, не охватываются данным международным стандартом, которые не предназначен для
применения или ссылки как на метод описания биоразложения пластмасс. В отношении биологического
разложения см. ISO 14851, ISO 14852 и ISO 14855 (см. Библиографию) и связанные с ними стандарты.
Настоящий международный стандарт не касается пластмассовых строительных материалов, таких как
ПВХ или композиты, если они не рассматриваются как обработанные изделия.
Все результаты, полученные с применением данного международного стандарта, рекомендуется
относить к данному стандарту и используемым в нем условиям. Результаты, полученные с
применением данного стандарта, указывают на противобактериальную активность в установленных
условиях эксперимента и не отражают активность в других условиях, в которых необходимо учитывать
различные факторы, такие как температура, влажность, различные виды бактерий, условия питания и
т.д. В данном методе необходимо также учитывать минимальную диффузию противобактериальных
средств, химических веществ в испытуемый посевной материал.
Рекомендуется для работы пользоваться ISO 7218.
2 Нормативные ссылки
Следующие ссылочные документы необходимы для применения данного документа. Для
датированных ссылок применяется только издание, указанное ниже. Для недатированных ссылок
применяют самое последнее издание ссылочного документа (включая все изменения).
ISO 7218, Микробиология продуктов питания и кормов для животных. Общие требования и правила
микробиологических исследований
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
© ISO 2007 – Все права сохраняются 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
3.1
противобактериальный (бактерицидный)
antibacterial
термин, описывающий состояние, в котором рост бактерий на поверхностях изделий подавляется, или
описывающий влияние вещества, которое подавляет рост бактерий на поверхностях изделий
3.2
противобактериальное (бактерицидное) вещество
antibacterial agent
вещество, которое подавляет рост бактерий на поверхностях изделий при противобактериальной
обработке поверхности, лекарственное средство
3.3
противобактериальная (бактерицидная) активность
antibacterial activity
разность логарифмов количества жизнеспособных бактериальных клеток, обнаруженных на
поверхности изделия, подвергшегося противобактериальной обработке, и на поверхности
необработанного изделия после посева и инкубации микроорганизмов
3.4
противобактериальная (бактерицидная) эффективность
antibacterial effectiveness
способность противобактериального вещества подавлять рост бактерий на поверхности пластмассы,
обработанной бактерицидным веществом, определенная по значению противобактериальной активности
4 Материалы
4.1 Бактерии, используемые в анализе
Необходимо использовать в анализе бактерии двух следующих видов:
a) Стафилококки, Staphylococcus aureus;
b) Кишечные палочки, Escherichia coli.
В дополнение к приведенным выше двум видам бактерий можно использовать другие виды, если
требуется. Если используют другие виды, то эти виды и причину их использования необходимо
включить в протокол испытания.
В Таблице 1 показаны бактериальные штаммы, предлагаемые для использования в анализе. Если
используются бактериальные штаммы от культур, отличных от приведенных в Таблице 1, эти культуры
необходимо получать в агентстве, являющемся членом Всемирной федерации коллекции культур (the
World Federation for Culture Collections (WFCC)) или Японском обществе коллекций культур (the Japan
Society for Culture Collections (JSCC)) и должны быть такими же штаммами, как показаны в Таблице 1.
Исходные (чистые) культуры указанных видов выращивают в соответствии с инструкциями
поставщика.
2 © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
Таблица 1 — Бактериальные штаммы для применения в анализе
Наименование Штамм
ATCC 6538P
CIP 53.156
Staphylococcus aureus DSM 346
NBRC 12732
NCIB 8625
ATCC 8739
CIP 53.126
Escherichia coli DSM 1576
NBRC 3972
NCIB 8545
4.2 Реактивы, питательные среды и растворы
Воду необходимо использовать дистиллированную или деионизированную, имеющую
электропроводность < 1 МкСм/см.
Все реактивы должны быть аналитической чистоты и/или специального класса для
микробиологических исследований.
4.2.1 Неионное поверхностно-активное вещество (сурфактант)
Используют полиоксиэтилен сорбитан моноолеат.
4.2.2 Биологические материалы
Требуются следующие биологические материалы:
⎯ лецитин;
⎯ D-глюкоза;
⎯ дрожжевой экстракт;
⎯ мясной экстракт (см. Приложение A);
⎯ пептон (см. Приложение A);
⎯ казеиновый пептон;
⎯ соевый пептон;
⎯ триптон.
4.2.3 Питательная среда
4.2.3.1 Общие положения
Необходимо использовать питательную среду, описанную ниже. Питательную среду можно получить
от поставщиков. В этом случае ее необходимо готовить для применения в соответствии с
инструкциями изготовителя.
4.2.3.2 Суспензия — питательный бульон 1/500 (1/500 NB)
Готовят питательный бульон путем растворения 3,0 г мясного экстракта, 10,0 г пептона и 5,0 г хлорида натрия
в 1 000 мл дистиллированной или деионизированной воды. Разбавляют питательный бульон
дистиллированной или деионизированной водой до 500-кратного объема и регулируют pH до значения от 6,8
© ISO 2007 – Все права сохраняются 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
до 7,2 гидроксидом натрия или соляной кислотой. Стерилизуют в автоклаве (см. 6.2). Если среду не
используют немедленно после приготовления, ее хранят при температуре от 5 °C до 10 °C. Бульон 1/500 NB,
который хранили в течение одной недели или больше после приготовления, использовать нельзя.
4.2.3.3 Питательный агар
Питательный агар готовят путем растворения 5,0 г мясного экстракта, 10,0 г пептона, 5,0 г хлорида
натрия и 15,0 г порошка агара в 1 000 мл дистиллированной или деионизированной воды. Нагревают
при помешивании на нагревательной плитке или на кипящей водяной бане, пока агар не растворится.
Регулируют pH до значения от 7,0 до 7,2 (при температуре 25 °C) с помощью гидроксида натрия или
соляной кислоты. Стерилизуют в автоклаве (см. 6.2). Если среду не используют немедленно после
приготовления, ее хранят при температуре от 5 °C до 10 °C. Питательный агар, который хранили в
течение одного месяца или больше после приготовления, использовать нельзя.
4.2.3.4 Агаризованная питательная среда для подсчета микроорганизмов в чашках
Питательную агаризованную среду в чашках готовят путем растворения 2,5 г дрожжевого экстракта, 5,0 г
триптона, 1,0 г глюкозы и 15,0 г порошка агара в 1 000 мл дистиллированной или деионизированной воды.
Нагревают при помешивании на нагревательной плитке или на кипящей водяной бане, пока агар не
растворится. Регулируют pH до значения от 7,0 до 7,2 (при температуре 25 °C) с помощью гидроксида натрия
или соляной кислоты. Стерилизуют в автоклаве (см. 6.2). Если среду не используют немедленно после
приготовления, ее хранят при температуре от 5 °C до 10 °C. Питательную агаризованную среду в чашках,
которую хранили в течение одного месяца или больше после приготовления, использовать нельзя.
4.2.3.5 Скошенная питательная среда
Заливают от 6 мл до 10 мл питательного агара, который нагревали до растворения, в пробирку с
завинчивающейся крышкой. Стерилизуют в автоклаве (см. 6.2). После стерилизации помещают
пробирку под углом наклона поверхности 15° к горизонтали и дают содержимому застыть. Если среду
не используют немедленно после приготовления, ее хранят при температуре от 5 °C до 10 °C.
Скошенную питательную среду, которую хранили в течение одного месяца или больше после
приготовления, использовать нельзя.
4.2.3.6 Бульон на основе перевара соевого пептона и казеина с лецитином и полиоксиэтилен
сорбитан моноолеатом (бульон SCDLP)
Готовят бульон SCDLP путем растворения 17,0 г казеинового пептона, 3,0 г соевого пептона, 5,0 г
хлорида натрия, 2,5 г гидрофосфата натрия, 2,5 г глюкозы и 1,0 г лецитина в 1 000 мл
дистиллированной или деионизированной воды. Тщательно перемешивают и добавляют 7,0 г
неионного сурфактанта. Регулируют pH до значения от 6,8 до 7,2 (при температуре 25 °C) с помощью
гидроксида натрия или соляной кислоты. Стерилизуют в автоклаве (см 6.2). Если среду не используют
немедленно после приготовления, ее хранят при температуре от 5 °C до 10 °C. Бульон SCDLP,
который хранили в течение одного месяца или больше после приготовления, использовать нельзя.
ПРИМЕЧАНИЕ SCDLP в большинстве случаев является обычным нейтрализатором. Дополнительную
информацию в отношении подбора и оценки альтернативных противобактериальных нейтрализующих средств
[4] [5]
можно получить в стандартах ASTM E 1054 и EN 1040 .
4.2.3.7 Фосфатный буферный раствор
Готовят фосфатный буферный раствор следующим образом: помещают 34,0 г дигидрофосфата калия
в мерную колбу вместимостью 1 000 мл. Добавляют 500 мл дистиллированной или деионизированной
воды и перемешивают до растворения. Регулируют pH до значения от 6,8 до 7,2 (при температуре
25 °C) с помощью гидроксида натрия. Добавляют дистиллированной или деионизированной воды,
чтобы довести объем до 1 000 мл. Стерилизуют в автоклаве (см 6.2). Фосфатный буферный раствор
нельзя использовать после хранения в течение месяца или больше после приготовления.
4 © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
4.2.3.8 Физиологический солевой раствор на основе фосфатного буфера
Готовят физиологический солевой раствор, поместив 8,5 г хлорида натрия в 1 000 мл
дистиллированной или деионизированной воды и перемешав до растворения. Разбавляют фосфатный
буферный раствор, приготовленный в 4.2.3.7, физиологическим солевым раствором до 800-кратного
объема. Стерилизуют физиологический раствор с фосфатным буфером в автоклаве (см. 6.2). Если
раствор не используют немедленно после приготовления, его хранят при температуре от 5 °C до 10 °C.
физиологический солевой раствор на основе фосфатного буфера, который хранился после
приготовления в течение одного месяца или больше, использовать нельзя.
5 Аппаратура
Если нет иных указаний, используют следующее оборудование и материалы:
5.1 Стерилизатор сухим жаром, обеспечивающий поддержание температуры от 160 °C до 180 °C в
пределах ± 2 °C от установленного значения в условиях равновесия.
5.2 Автоклавe, обеспечивающий поддержание температуры (121 ± 2) °C и давления (103 ± 5) кПа.
5.3 Нагревательная плитка со смесителем, или водяная баня.
5.4 pH-метр, обеспечивающий измерение до ± 0,2 единиц рН.
5.5 Весы, обеспечивающие взвешивание до ± 0,01 г.
5.6 Устройство для пипетирования, стерильное, с наконечниками по 1 000 мкл.
5.7 Инкубатор (термостат), обеспечивающий поддержание температуры в пределах ± 1 °C от
установленного значения в условиях равновесия.
5.8 Вихревой смеситель, если требуется (см. 7.6.1).
5.9 Ультразвуковой аппарат, если требуется (см. 7.6.1).
5.10 Бактериологические петли для посева, с диаметром кольца 4 мм, стерильные.
5.11 Закрывающая пленка, не влияющая на рост бактерий и не поглощающая влагу
(изготовленная из полиэтилена, полипропилена или полиэфира [поли(этилен терефталат)].
Рекомендуется использовать пленку толщиной от 0,05 мм до 0,10 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ Также подойдет пленка, отрезанная от пакетов для гомогенизатора Stomacher.
5.12 Пробирки с завинчивающейся крышкой.
5.13 Чашки Петри, стерильные, диаметром 90 мм - 100 мм.
5.14 Марля или гигроскопическая вата.
5.15 Мерная колба вместимостью 1 000 мл.
5.16 Колбы Эрленмейера с пробкой или флаконы для среды, необходимые для приготовления
питательной среды.
6 Стерилизация оборудования и хранение исходных культур
6.1 Стерилизация сухим жаром
Помещают подлежащие стерилизации объекты в стерилизатор, используют минимальную
продолжительность стерилизации для указанной температуры:
© ISO 2007 – Все права сохраняются 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
Минимальная продолжительность
Температура
стерилизации
180 °C 30 минут
170 °C 60 минут
160 °C 120 минут
6.2 Стерилизация паром под давлением
Помещают подлежащие стерилизации объекты в автоклав и поддерживают температуру (121 ± 2) °C в
течение не менее 15 мин.
6.3 Подготовка стеклянной посуды
Тщательно моют щелочным или нейтральным средством, затем тщательно споласкивают дистиллированной
или деионизированной водой. Перед применением стерилизуют сухим жаром или в автоклаве.
6.4 Поддержание исходных культур
Исходные культуры необходимо хранить при температуре от 5 °C до 10 °C на подходящей питательной
среде и ежемесячно пересевать. После пяти пересевов или по прошествии более одного месяца исходную
культуру выбрасывают и заменяют на свежую, полученную из института или коллекции культур.
7 Проведение анализа
7.1 Предварительный посев бактерий
С помощью бактериологической стерильной петли для посева переносят бактерии из исходной культуры
на скошенную агаризованную среду (4.2.3.5) и инкубируют при температуре (35 ± 1) °C в течении от 16 ч до
24 ч. Из этой культуры и помощью, бактериологической стерильной петли для посева переносят бактерии
на свежую скошенную среду и инкубируют при температуре (35 ± 1) °C в течении от 16 ч до 20 ч.
7.2 Подготовка образцов для анализа
Необходимо проанализировать не менее трех образцов от каждого обработанного испытуемого
материала. Требуется также не менее шести образцов необработанного материала. Половину образцов
необработанного материала используют для подсчета жизнеспособных клеток немедленно после посева, а
вторую половину для подсчета жизнеспособных клеток после инкубации в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ Применение более трех образцов обработанного испытуемого материала в параллельном
анализе может сократить изменчивость результатов, особенно для материалов, которые демонстрируют меньшее
противомикробное воздействие.
При испытании серии противобактериальных веществ для одного полимера, каждую
противобактериальную обработку можно сравнивать с отдельным набором необработанных образцов,
если все анализы выполняются одновременно, используя один и тот же посевной материал.
Готовят плоские образцы размером (50 ± 2) мм × (50 ± 2) мм обработанного и необработанного посевного
материала. Толщина образцов должна быть не более 10 мм. Если затруднительно или невозможно
разрезать испытуемый материал на квадраты указанного размера, то можно использовать образцы другой
2
формы и размера, но так чтобы их можно было накрыть пленкой площадью поверхности от 400 мм до
2
1 600 мм . Предпочтительно готовить образцы для испытания из самого конечного продукта. Однако, если
форма изделия этого не позволяет, то образцы можно приготовить в формате, удобном для анализа,
используя те же самые исходные материалы и методы обработки, которые обычно используют для
производства испытываемого изделия. Если образец отличается от квадрата размером 50 мм × 50 мм, то в
протоколе испытания необходимо указать фактические использованные размеры.
При подготовке образцов необходимо следить, чтобы избежать загрязнения их микроорганизмами или
органическими веществами извне. Аналогично нельзя допускать соприкосновения образцов между
собой. Если используется металлическое оборудование, то чтобы избежать перекрестного
6 © ISO 2007 – Все права сохраняются
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
загрязнения, необходимо убедиться, что металл не обладает противобактериальным воздействием.
Если требуется, образцы для испытания можно очистить/дезинфицировать/стерилизовать перед
испытанием (например, протерев 70 %-ным раствором этанола в воде).
Очистка испытуемых образцов может привести к размягчению, растворению поверхностного покрытия
или элюирования компонентов, поэтому очистки рекомендуется избегать. Если очистка требуется в
результате сильного загрязнения, метод очистки должен быть указан в протоколе испытания.
7.3 Подготовка посевного материала для анализа
С помощью бактериологической стерильной петли для посева переносят одну петлю бактерий, предварительно
инкубированных в соответствии с 7.1 в небольшое количество бульона 1/500 NB, приготовленного в
соответствии с 4.2.3.2. Необходимо убедиться, что бактерии для анализа распределены равномерно, и оценить
количество бактерий, используя непосредственное наблюдение под микроскопом и счетную камеру или другой
подходящий метод (например, спектрофотометрический). Разбавляют суспензию бульоном 1/500 NB,
насколько необходимо для оценки концентрации бактерий, чтобы получить значение концентрации от
5 5 5
2,5 × 10 клеток/мл до 10 × 10 клеток/мд, при целевой концентрации 6 × 10 клеток/мл. Используют этот раствор
как посевной материал. Если посевной материал не используется немедленно, его необходимо охладить на
льду (0 °C) и использовать в течение 2 ч с момента приготовления.
7.4 Посев на испытуемые образцы
Исследуемой поверхностью является открытая наружная поверхность изделия. Не требуется
анализировать поперечные сечения изделия. Помещают каждый испытуемый образец, подготовленный в
соответствии с 7.2, в отдельную стерильную чашку Петри анализируемой поверхностью вверх. Пипеткой
наносят 0,4 мл посевного материала для анализа, приготовленного в 7.3, на испытуемую поверхность.
Накрывают посевной материал кусочком пленки (5.11) размерами 40 мм × 40 мм и осторожно прижимают
пленку, так чтобы анализируемый посевной материал распределился к краям поверхности образца.
Необходимо убедиться, что анализируемый посевной материал не вытек за края пленки. После посева на
образец и помещения сверху пленки закрывают чашку Петри крышкой (см. Рисунок 1).
Размеры в миллиметрах
Обозначение
1 накрывающая пленка
2 анализируемый посевной материал (0,4 мл)
3 испытуемый образец
4 чашка Петри
5 крышка чашки Петри
Рисунок 1 — Посев на испытуемый образец и накрывание посевного материала пленкой
© ISO 2007 – Все права сохраняются 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 22196:2007(R)
Если нет иных указаний, накрывающая пленка должна представлять собой квадрат размерами
(40 ± 2) мм × (40 ± 2) мм для испытуемого образца размером 50 мм × 50 мм. Если испытуемый образец
нестандартного размера, то размер пленки необходимо уменьшить прямо пропорционально размеру
2
образца. Однако, не допускается уменьшение размеров пленки до площади менее 400 мм , а края
накрывающей пленки должны отстоять на 2,5 мм - 5,0 мм от каждого края испытуемого образца. Если
размер накрывающей пленки отличается от 40 мм × 40 мм, то в протоколе испытания необходимо
указать фактический размер пленки. Использованный объем посевного материала необходимо
отрегулировать таким образом, чтобы он был пропорционален площади накрывающей пленки, и
занести в протокол испытания.
Важно, чтобы посевной материал не вытекал за края накрывающей пленки. Для некоторых
поверхностей (например, очень гигроскопических), бывает трудно предотвратить такую утечку. Если
это происходит, используют вариант 1 ниже по тексту. Если утечка все же продолжается с
вариантом 1, используют вариант 2. Если используют один из указанных вариантов для обеспечения
отсутствия утечки, это необходимо отразить в протоколе испытания.
⎯ Вариант 1: Сокращают объем посевного материала, наносимого на испытуемую поверхность.
Однако, нельзя использовать менее 0,1 мл посевного материала. Если объем посевного
материала уменьшают, то концентрация бактериальных клеток в посевном материале должна
увеличиваться, чтобы обеспечить такое же количество клеток, как в обычном объеме наносимого
посевного материала.
⎯ Вариант 2: Увеличивают вязкость посевного материала путем добавления инертного загустителя,
такого как агар, или другого материала.
7.5 Инкубирование засеянных испытуемых образцов
Если нет иных указаний, инкубируют чашки Петри с засеянными испытуемыми образцами (включая
половину необработанных образцов) при температуре (35 ± 1) °C и относительной влажности не менее
90 % в течение (24 ± 1) ч. Противобактериальную эффективность продукта оценивают на основе
значения противобактериальной активности, полученного в испытании при заданной температуре
инкубации. Можно использовать другие температуры, если это согласовано между всеми сторонами.
Если используемая темп
...
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 22196
First edition
2007-10-15
Plastics — Measurement of antibacterial
activity on plastics surfaces
Plastiques — Mesurage de l'action antibactérienne sur les surfaces en
plastique
Reference number
ISO 22196:2007(E)
©
ISO 2007
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat
accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In
the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2007
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or
ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .2
4 Materials .2
4.1 Bacteria to be used for the tests.2
4.2 Reagents, culture media and solutions.3
5 Apparatus .5
6 Sterilization of apparatus and storage of stock cultures .5
6.1 Dry-heat sterilization .5
6.2 High-pressure steam sterilization.6
6.3 Preparation of glassware .6
6.4 Maintenance of stock cultures .6
7 Procedure .6
7.1 Pre-culture of bacteria.6
7.2 Preparation of test specimens .6
7.3 Preparation of test inoculum.7
7.4 Inoculation of test specimens .7
7.5 Incubation of the inoculated test specimens.8
7.6 Recovery of bacteria from test specimens .8
7.7 Determining the viable bacteria count by the pour plate culture method .9
8 Expression of results .9
8.1 Determination of the number of viable bacteria .9
8.2 Conditions for a valid test.9
8.3 Calculation of the antibacterial activity.10
8.4 Effectiveness of the antibacterial agent.10
9 Repeatability and reproducibility.10
10 Test report .11
Annex A (normative) Quality of biological materials.12
Annex B (informative) Repeatability and reproducibility .13
Bibliography .16
© ISO 2007 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 22196 was prepared by Technical Committee ISO/TC 61, Plastics, Subcommittee SC 6, Ageing, chemical
and environmental resistance.
iv © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 22196:2007(E)
Plastics — Measurement of antibacterial activity on plastics
surfaces
1 Scope
WARNING — Handling and manipulation of microorganisms which are potentially hazardous requires
a high degree of technical competence and may be subject to current national legislation and
regulations. Only personnel trained in microbiological techniques should carry out such tests.
Appropriate practices for disinfection, sterilization and personal hygiene must be strictly observed.
This International Standard specifies a method of evaluating the antibacterial activity of antibacterial-treated
plastic products (including intermediate products).
NOTE It may also be suitable for other non-porous materials.
It is not intended to be used to evaluate the effects and propagation of bacteria on plastics without
[6]
antibacterial treatments. ISO 846 describes tests to evaluate the effects and propagation of bacteria on
plastics, which are different from those covered by this International Standard. Those who are interested are
referred to ISO 846:1997, method C.
Secondary effects of antibacterial treatments, such as the prevention of biodeterioration and odour, are not
covered by this International Standard, which is not intended to be used or referenced as a method to
document or claim biodegradability of plastics. For biodegradation, refer to ISO 14851, ISO 14852 and
ISO 14855 (see the Bibliography) and related standards.
This International Standard does not concern plastic building materials, such as PVC or composites, unless
they act in the same way as treated articles.
Any results obtained with this International Standard should always refer to this standard and the conditions
used. Results obtained with this International Standard indicate antibacterial activity under the specified
experimental conditions used herein, and do not reflect activity under other circumstances where a variety of
factors, such as temperature, humidity, different bacterial species, nutrient conditions, etc., have to be
considered. A minimum diffusion of the antibacterial agents/chemicals into the test inoculum is necessary with
this procedure.
It is recommended that workers consult ISO 7218.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
© ISO 2007 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
antibacterial
term describing a state where growth of bacteria on the surfaces of products is suppressed or describing the
effect of an agent which suppresses the growth of bacteria on the surfaces of products
3.2
antibacterial agent
agent that inhibits the growth of bacteria on the surfaces of products by the use of an antibacterial surface
treatment or a compounded agent
3.3
antibacterial activity
difference in the logarithm of the viable cell count found on an antibacterial-treated product and an untreated
product after inoculation with and incubation of bacteria
3.4
antibacterial effectiveness
ability of an antibacterial agent to inhibit the growth of bacteria on the surface of a plastic treated with the
agent, as determined by the value of the antibacterial activity
4 Materials
4.1 Bacteria to be used for the tests
Both of the following species of bacteria shall be used:
a) Staphylococcus aureus;
b) Escherichia coli.
In addition to the above two species of bacteria, other species can be used, if required. If other species are
used, the species and the reason for their use shall be included in the test report.
The bacterial strains to be used are shown in Table 1. If bacterial strains obtained from culture collections
other than those shown in Table 1 are used, they shall be obtained from a member agency of the World
Federation for Culture Collections (WFCC) or of the Japan Society for Culture Collections (JSCC) and shall be
the same strains as those shown in Table 1. Prepare stock cultures of these species in accordance with the
supplier’s directions.
Table 1 — Bacterial strains to be used
Name Strain
ATCC 6538P
CIP 53.156
Staphylococcus aureus DSM 346
NBRC 12732
NCIB 8625
ATCC 8739
CIP 53.126
Escherichia coli DSM 1576
NBRC 3972
NCIB 8545
2 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
4.2 Reagents, culture media and solutions
Any water used shall be distilled or deionized and have a conductivity of < 1 µS/cm.
All reagents shall be of analytical grade and/or of a grade appropriate for microbiological purposes.
4.2.1 Nonionic surfactant
Use polyoxyethylene sorbitan monooleate.
4.2.2 Biological materials
The following biological materials are required:
⎯ lecithin;
⎯ D-glucose;
⎯ yeast extract;
⎯ meat extract (see Annex A);
⎯ peptone (see Annex A);
⎯ casein peptone;
⎯ soybean peptone;
⎯ tryptone.
4.2.3 Culture medium
4.2.3.1 General
The culture medium specified below shall be used. The medium may be obtained from commercial suppliers.
If so, it shall be prepared for use in accordance with the manufacturer’s instructions.
4.2.3.2 Suspension medium — 1/500 nutrient broth (1/500 NB)
Prepare nutrient broth by dissolving 3,0 g of meat extract, 10,0 g of peptone and 5,0 g of sodium chloride in
1 000 ml of distilled or deionized water. Dilute the nutrient broth with distilled or deionized water to a 500-fold
volume and adjust the pH to a value between 6,8 and 7,2 with sodium hydroxide or hydrochloric acid. Sterilize
by autoclaving (see 6.2). If it is not used immediately after preparation, preserve it at 5 °C to 10 °C. Never use
a 1/500 NB that has been kept for one week or longer after preparation.
4.2.3.3 Nutrient agar
Prepare nutrient agar by dissolving 5,0 g of meat extract, 10,0 g of peptone, 5,0 g of sodium chloride and
15,0 g of agar powder in 1 000 ml of distilled or deionized water. Heat, with stirring, on a hotplate or in a
boiling-water bath until the agar has dissolved. Adjust the pH to a value between 7,0 and 7,2 (at 25 °C) with
sodium hydroxide or hydrochloric acid. Sterilize by autoclaving (see 6.2). If it is not used immediately after
preparation, then preserve it at 5 °C to 10 °C. Never use a nutrient agar that has been kept for one month or
longer after preparation.
© ISO 2007 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
4.2.3.4 Plate count agar
Prepare plate count agar by dissolving 2,5 g of yeast extract, 5,0 g of tryptone, 1,0 g of glucose and 15,0 g of
agar powder in 1 000 ml of distilled or deionized water. Heat, with stirring, on a hotplate or in a boiling-water
bath until the agar has dissolved. Adjust the pH to a value between 7,0 and 7,2 (at 25 °C) with sodium
hydroxide or hydrochloric acid. Sterilize by autoclaving (see 6.2). If it is not used immediately after
preparation, preserve it at 5 °C to 10 °C. Never use a plate count agar that has been kept for one month or
longer after preparation.
4.2.3.5 Slant culture medium
Pour 6 ml to 10 ml of nutrient agar, which has been warmed to dissolve, into a screw-capped test tube.
Sterilize by autoclaving (see 6.2). After sterilization, place the test tube at a slant angle of about 15° to the
horizontal and allow the contents to solidify. If it is not used immediately after preparation, preserve it at 5 °C
to 10 °C. Never use a slant culture medium kept for one month or longer after preparation.
4.2.3.6 Soybean casein digest broth with lecithin and polyoxyethylene sorbitan monooleate
(SCDLP broth)
Prepare SCDLP broth by dissolving 17,0 g of casein peptone, 3,0 g of soybean peptone, 5,0 g of sodium
chloride, 2,5 g of disodium hydrogen phosphate, 2,5 g of glucose and 1,0 g of lecithin in 1 000 ml of distilled or
deionized water. Mix thoroughly and add 7,0 g of nonionic surfactant. Adjust the pH to a value between 6,8
and 7,2 (at 25 °C) with sodium hydroxide or hydrochloric acid. Sterilize by autoclaving (see 6.2). If it is not
used immediately after preparation, preserve it at 5 °C to 10 °C. Never use an SCDLP broth kept for one
month or longer after preparation.
NOTE SCDLP is the default neutralizer in the majority of circumstances. Information about selection and evaluation
[4] [5]
of alternative antibacterial neutralizing agents can be found in ASTM E 1054 and EN 1040 .
4.2.3.7 Phosphate buffer solution
Prepare phosphate buffer solution by placing 34,0 g of potassium dihydrogen phosphate in a 1 000 ml
volumetric flask. Add 500 ml of distilled or deionized water and mix to dissolve. Adjust the pH to a value
between 6,8 and 7,2 (at 25 °C) with sodium hydroxide. Add distilled or deionized water to make up to
1 000 ml. Sterilize by autoclaving (see 6.2). Never use a phosphate buffer solution kept for one month or
longer after preparation.
4.2.3.8 Phosphate-buffered physiological saline
Prepare physiological saline by placing 8,5 g of sodium chloride in 1 000 ml of distilled or deionized water and
mixing to dissolve. Dilute the phosphate buffer solution prepared in 4.2.3.7 with the physiological saline to an
800-fold volume. Sterilize the phosphate-buffered physiological saline solution by autoclaving (see 6.2). If this
solution is not used immediately after preparation, preserve it at 5 °C to 10 °C. Never use a phosphate-
buffered physiological saline kept for one month or longer after preparation.
4 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
5 Apparatus
Unless otherwise specified, use the following apparatus and materials:
5.1 Dry-heat sterilizer, capable of maintaining the temperature at a value between 160 °C and 180 °C
within ± 2 °C of the set point at equilibrium conditions.
5.2 Autoclave, capable of maintaining a temperature of (121 ± 2) °C and a pressure of (103 ± 5) kPa.
5.3 Hotplate with stirrer, or hot-water bath.
5.4 pH-meter, capable of measuring to ± 0,2 units.
5.5 Balance, capable of weighing to ± 0,01 g.
5.6 Pipetters, sterile, with 1 000 µl tips.
5.7 Incubator, capable of maintaining the temperature within ± 1 °C of the set point at equilibrium
conditions.
5.8 Vortex mixer, if required (see 7.6.1).
5.9 Sonicator, if required (see 7.6.1).
5.10 Inoculating loops, 4 mm in ring diameter, sterile.
5.11 Cover film, that does not affect bacterial growth or absorb water (made of polyethylene,
polypropylene or polyester [poly(ethylene terephthalate)]. Film that is 0,05 mm to 0,10 mm thick is
recommended.
NOTE Films cut from Stomacher bags are also suitable.
5.12 Screw-capped test tubes.
5.13 Petri dishes, sterile, 90 mm to 100 mm in diameter.
5.14 Gauze or absorbent cotton.
5.15 1 000 ml volumetric flask.
5.16 Stoppered Erlenmeyer flasks or media bottles, as required for preparation of media.
6 Sterilization of apparatus and storage of stock cultures
6.1 Dry-heat sterilization
Place objects to be sterilized in a dry-heat sterilizer, using the following minimum times for the given
temperature:
Temperature Minimum sterilization time
180 °C 30 minutes
170 °C 60 minutes
160 °C 120 minutes
© ISO 2007 – All rights reserved 5
---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
6.2 High-pressure steam sterilization
Put the objects to be sterilized in an autoclave and maintain at (121 ± 2) °C for at least 15 min.
6.3 Preparation of glassware
Wash well with alkali or neutral detergent, then rinse well with distilled or deionized water. Sterilize using dry
heat or an autoclave prior to use.
6.4 Maintenance of stock cultures
Stock cultures shall be stored at 5 °C to 10 °C on an appropriate medium and transferred monthly. After five
transfers or if more than one month has passed between transfers, the stock culture shall be discarded and
replaced with a fresh culture, obtained from the institute or culture collection concerned.
7 Procedure
7.1 Pre-culture of bacteria
Using a sterile inoculating loop, transfer bacteria from the stock culture to the slant culture medium (4.2.3.5)
and incubate at (35 ± 1) °C for 16 h to 24 h. From this culture, use a sterile inoculating loop to transfer bacteria
onto fresh slant culture medium and incubate at (35 ± 1) °C for 16 h to 20 h.
7.2 Preparation of test specimens
Testing shall be performed on at least three specimens from each treated test material. At least six specimens
of the untreated material are required. Half of the untreated test specimens are used to measure viable cells
immediately after inoculation and half are used to measure viable cells after incubation for 24 h.
NOTE Use of more than three replicate specimens of the treated test material may help reduce variability, especially
for materials that show smaller antimicrobial effects.
When testing a series of antibacterial treatments for a single polymer, each antibacterial treatment may be
compared to a single set of untreated specimens if all tests are conducted at the same time using the same
test inoculum.
Prepare flat (50 ± 2) mm × (50 ± 2) mm specimens of the treated and untreated test materials. Specimens
should be no more than 10 mm in thickness. If it is difficult or impossible to cut the product into a square of
this size, then test specimens of other sizes and shapes may be used, as long as they can be covered with a
2 2
film of surface area between 400 mm and 1 600 mm . It is preferable to prepare test specimens from the final
product itself. However, if the shape of the product prevents this, then the test specimens may be prepared in
a format suitable for testing using the same raw materials and processing methods as are normally used for
the product. If the test specimen differs from the 50 mm × 50 mm square dimensions, the actual dimensions
used shall be stated in the test report.
When preparing specimens, take care to avoid contamination with microorganisms or extraneous organic
debris. Similarly, do not allow specimens to come into contact with each other. If metal apparatus is used to
avoid cross-contamination, it is necessary to ensure that the metal does not have any antibacterial effect. If
necessary, test specimens can be cleaned/disinfected/sterilized prior to testing (e.g. by wiping with 70 %
ethanol in water).
Cleaning of the test specimen can cause softening, dissolution of the surface coating or elution of components
so should be avoided. If cleaning is required due to gross contamination, the cleaning method shall be stated
in the test report.
6 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
7.3 Preparation of test inoculum
Using a sterile inoculating loop, transfer one loop of the test bacteria pre-incubated as specified in 7.1 into a
small amount of 1/500 NB prepared in accordance with 4.2.3.2. Make sure that the test bacteria are evenly
dispersed, and estimate the number of bacteria using direct microscopic observation and a counting chamber
or another appropriate method (e.g. spectrophotometrically). Dilute this suspension with 1/500 NB, as
appropriate for the estimated bacterial concentration, to obtain a bacterial concentration that is between
5 5 5
2,5 × 10 cells/ml and 10 × 10 cells/ml, with a target concentration of 6 × 10 cells/ml. Use this solution as the
test inoculum. If the test inoculum is not used immediately, then chill it on ice (0 °C) and use it within 2 h of
preparation.
7.4 Inoculation of test specimens
The surface to be tested is the exposed outer surface of the product. Do not test cross-sections of the product.
Place each test specimen prepared in 7.2 into a separate sterile Petri dish with the test surface uppermost.
Pipette 0,4 ml of the test inoculum prepared in 7.3 onto the test surface. Cover the test inoculum with a piece
of film (5.11) that measures 40 mm × 40 mm and gently press down on the film so that the test inoculum
spreads to the edges. Make sure that the test inoculum does not leak beyond the edges of the film. After the
specimen has been inoculated and the cover film applied, replace the lid of the Petri dish (see Figure 1).
Dimensions in millimetres
Key
1 cover film
2 test inoculum (0,4 ml)
3 test specimen
4 Petri dish
5 lid of Petri dish
Figure 1 — Inoculation of test specimen and placement of cover film
© ISO 2007 – All rights reserved 7
---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
Unless otherwise specified, the standard size of the cover film shall be a square of (40 ± 2) mm × (40 ± 2) mm
for the 50 mm × 50 mm test specimen. If the test specimen is not of a standard size, then the size of the film
2
shall be reduced in direct proportion. Do not, however, reduce the size of film to less than 400 mm and the
edges of the cover film shall always be 2,5 mm to 5,0 mm inside the edge of the test specimen on all sides. If
the size of the cover film differs from 40 mm × 40 mm, the actual size used shall be stated in the test report.
The volume of inoculum used shall also be adjusted to be proportional to the area of the cover film used and
recorded in the test report.
It is essential that the test inoculum does not leak beyond the edges of the cover film. For some surfaces (e.g.
those that are very hydrophilic), it might be difficult to prevent such leakage. When this occurs, use option 1
below. If leakage still occurs with option 1, use option 2. If one of these options is used to ensure that leaking
does not occur, it shall be described in the test report.
⎯ Option 1: Reduce the volume of test inoculum applied to the test surface. Do not use less than 0,1 ml of
test inoculum, however. When the volume of test inoculum is decreased, the concentration of the
bacterial cells in the inoculum shall be increased to provide the same number of bacterial cells as when
the normal volume of test inoculum is applied.
⎯ Option 2: Increase the viscosity of the test inoculum by adding an inert thickener such as agar or another
material.
7.5 Incubation of the inoculated test specimens
Unless otherwise specified, incubate the Petri dishes containing the inoculated test specimens (including half
of the untreated test specimens) at a temperature of (35 ± 1) °C and a relative humidity of not less than 90 %
for (24 ± 1) h. The antibacterial effectiveness of a product is evaluated based on the value of the antibacterial
activity obtained from the test at the incubation temperature specified. Other temperatures may be used if
agreed upon by all parties. If a temperature other than (35 ± 1) °C is used, it shall be included in the test
report.
NOTE If incubation temperatures of less than 35 °C are used, the total count of the viable bacteria may be reduced.
This may affect the antibacterial activity compared to measurements conducted using a 35 °C incubation temperature.
7.6 Recovery of bacteria from test specimens
7.6.1 Test specimens immediately after inoculation
Immediately after inoculation, process half of the untreated test specimens by adding 10 ml of either SCDLP
broth (4.2.3.6) or a suitable, validated neutralizer to the Petri dish containing the test specimen. This value will
be used to determine the recovery rate of the bacteria from the test specimens under investigation. It is
important to ensure that the neutralizer completely washes the specimens by using a pipette to collect and
release the SCDLP broth at least four times.
Special consideration may be required to achieve sufficient recovery, especially if option 2 in 7.4 has been
taken and the viscosity of the inoculum has been increased. In this case, mechanical agitation may be
required, such as stomaching, vortexing or sonicating. If these show a recovery rate equivalent to or superior
to that obtained using the method above, such methods may be used. If an alternative recovery method is
used, it shall be described in the test report. If it is difficult to recover the test bacteria with 10 ml of the
neutralizer due to the size and characteristics of the test specimen, then the volume of solution may be
increased. If the volume of the neutralizer used is different from 10 ml, the actual volume used shall be
included in the test report and taken account of in the calculation of the antibacterial effect.
Use of alternative washing procedures may affect the measured antibacterial activity and shall therefore be
fully validated.
8 © ISO 2007 – All rights reserved
---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 22196:2007(E)
7.6.2 Test specimens after incubation
After the incubation in 7.5, process the remaining test specimens in accordance with 7.6.1. Proceed
immediately to count the viable bacteria recovered from the test specimen (see 7.7).
7.7 Determining the viable bacteria count by the pour plate culture method
Enumerate viable bacteria by performing 10-fold serial dilutions of the SCDLP in phosphate-buffered
physiological saline (4.2.3.8). Place 1 ml of each dilution, as well as 1 ml of the SCDLP recovered from the
test specimen, into separate sterile Petri dishes. Pour 15 ml of plate count agar (4.2.3.4) into each Petri dish
and swirl gently to disperse the bacteria. All plating shall be performed in duplicate. Invert the Petri dishes and
incubate them at (35 ± 1) °C for 40 h to 48 h.
After incubation, count the
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.