ISO 6391:1988

Meat and meat products — Enumeration of Escherichia coli — Colony count technique at 44 degrees C using membranes

Viande et produits à base de viande — Dénombrement des Escherichia coli — Méthode par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 degrés C

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 23-Nov-1988
• Withdrawal Date: 23-Nov-1988
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 6 - Meat, poultry, fish, eggs and their products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 6 - Meat, poultry, fish, eggs and their products
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 04-Dec-1997

Relations

• Revised: ISO 6391:1997 - Meat and meat products — Enumeration of Escherichia coli — Colony-count technique at 44 degrees C using membranes
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

IS0
INTERNATIONAL STANDARD
6391
First edition
1 988- 1 1 - 1 5
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXRYHAPOfiHAR OPrAHM3AL\MR no CTAHBAPTM3AL\MM
Meat and meat products - Enumeration of Escherichia
coli - Colony count technique at 44 OC using
membranes
Viandes et produits à base de viande - Dénombrement des Escherichia coli - Méthode
par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 OC
Reference number
IS0 6391 : 1988 (E)

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IS0 6391 : 1988 (E)
Foreword
IS0 (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of
national standards bodies (IS0 member bodies). The work of preparing International
Standards is normally carried out through IS0 technical committees. Each member
body interested in a subject for which a technical committee has been established has
the right to be represented on that committee. International organizations, govern-
mental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. IS0
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are circulated to
the member bodies for approval before their acceptance as International Standards by
the IS0 Council. They are approved in accordance with IS0 procedures requiring at
least 75 % approval by the member bodies voting.
International Standard IS0 6391 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34,
Agricultural food products.
Annex A forms an integral part of this International Standard.
0 International Organization for Standardization, 1988 0
Printed in Switzerland
ii

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IS0 6391 : 1988 (E)
Introduction
Although, for well-accepted statistical reasons, the limit for the lowest number of col-
onies counted per plate of selective medium is set at 15, for practical purposes it is
of lower numbers of Escherichia col.
often desirable to establish an estimated count
The confidence limits of such determinations (reported as "estimated count") are
given in annex A.
iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
a

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IS0 ô391 : 1988 (El
I NTER NATIONAL STAN DAR D
Meat and meat products - Enumeration of Escherichia
coli - Colony count technique at 44 OC using
membranes
1 Scope 4 Principle
0 This International Standard specifies a reference method for
In general, the detection of E coli requires three successive
the enumeration of viable Escherichia coli present in meat and stages.
meat products.
The method will detect both typical E coli (biotype 1) and lac-
4.1 Resuscitation
tose non-fermenting or anaerogenic variantsi).
Inoculation of a specified quantity of the test sample, if the pro-
duct is liquid, or of a specified quantity of an initial suspension,
2 Normative references
in the case of other products, onto cellulose acetate mem-
branes overlaid on mineral modified glutamate agar and incu-
The following standards contain provisions which, through
OC for 4 h.
bation at 37
reference in this text, constitute provisions of this International
Standard. At the time of publication, the editions indicated
NOTE - This procedure enables E. coli damaged by storage under
were valid. All standards are subject to revision, and parties to frozen, dried or chill conditions or damaged by heat or chemical pro-
agreements based on this International Standard are encour- cesses to be resuscitated. It also permits the diffusion of high concen-
trations of any fermentable carbohydrate present in the test sample
aged to investigate the possibility of applying the most recent
which would otherwise interfere with indole production during the
editions of the standards listed below. Members of IEC and IS0
subsequent isolation stage.
maintain registers of currently valid International Standards.
IS0 3100-1 : -2b, Meat and meat products - Sampling and
4.2 isolation
preparation of test samples - Part I : Sampling.
Transfer of membranes from the resuscitation stage on the
0 IS0 3100-2 : 1988, Meat and meat products - Sampling and
mineral modified glutamate agar to tryptone-bile agar. Incu-
preparation of test samples - Part2: Preparation of test
bation at 44 OC for 18 h to 20 h.
samples for microbiological examination.
IS0 6887 : 1983, Microbiology - General guidance for the
4.3 Detection
preparation of dilutions for microbiological examination.
Demonstration of the presence of E. coli on the membrane by
the production of indole by each colony.
3 Definition
For the purposes of this International Standard, the following
definition applies. 4.4 Calculation
Escherichia coli: Bacteria which at 44 OC form indole-positive
Calculation of the number of E. coli per millilitre or per gram of
(pink) colonies on cellulose acetate membranes overlaid on sample from the number of indole-positive colonies obtained
in this Inter- on membranes at dilution levels chosen to give a significant
tryptone-bile agar, under the conditions specified
national Standard. result.
1) ANDERSON, J.M. and BAIRD-PARKER, A.C. J. Appl. Bacterial. 39, 1975: 111-117.
2) To be published.
1

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IS0 6391 : 1988 (E)
so that after sterilization it is 6,7 at 25 OC. Transfer 100 ml
5 Diluent, culture media, and reagent
volumes of the medium to suitable containers (6.6) and sterilize
in the autoclave (6.1) for 10 min at 115 Oc.
5.1 Basic materials
Preparation of agar plates
In order to improve the reproducibility of the results, it is
recommended that for the preparation of culture media,
Add to sterile Petri dishes (6.7) 12 ml to 15 ml of the medium,
dehydrated basic components or complete dehydrated media
cooled to approximately 45 OC, and allow to solidify. The plates
should be used. The manufacturer’s instructions shall be
may be stored at O OC to +5 OC for up to 4 days.
rigorously followed.
Immediately before use, dry the plates carefully in the cabinet
The chemicals used shall be of recognized analytical quality.
50 OC, preferably with the lids off and agar sur-
or oven (6.5) at
The water used shall be distilled or deionized water, and shall face downwards.
be free from substances that might inhibit growth of E. coli
under the test conditions. NOTE - The agar should be dry enough not to allow excess moisture
to appear within 15 min of spreading the inoculum (1 ml).
Measure the pH of the medium so that after sterilization it is at
the pH required.
5.4 Selective medium - Tryptone-bile agar31
If culture media and the prepared reagent are not used im-
Composition
mediately, they shall, unless otherwise indicated, be kept in the
dark at a temperature between O OC and + 5 OC, in conditions
Tryptone 20,o 94)
that prevent any change in their composition. They shall not be
Bile salts (refined) 1,5 95)
kept for longer than 1 month.
Agar 12 g to 18 92)
Water 1000ml
5.2 Diluent
Preparation
See IS0 6887.
Dissolve the components in the water by bringing to the boil.
5.3 Resuscitation medium - Mineral modified
Adjust the pH so that after sterilization it is 7,2 at 25 OC.
glutamate agar
Transfer 100 ml volumes of the medium to suitable containers,
at
and sterilize the medium in the autoclave (6.1) for 15 min
Composition 1 )
121 OC.
Sodium glutamate 63 g
Add 12 ml to 15 ml of the medium, at approximately 46 OC, to
Lactose 10,o g
sterile Petri dishes and allow to solidify. These plates may be
Sodium formate 025 g
stored at O OC to +5 OC for up to 4 days.
L( -)-cystine 0,02 9
L( - Laspartic acid 0,02 9
Immediately before use, dry the plates carefully in the cabinet
L( + )-arginine 0,024 g
or oven (6.5) at 50 OC, with the lids off and agar surface
Thiamine 0,001 g
downwards, for 30 min or until the surface of the agar is seen
Nicotinic acid 0,001 g 0
to be dry.
Pantothenic acid 0,001 g
Magnesium sulfate (MgS047H20) 0,100 9
5.5 Indole detection reagent
Ammonium iron(ll1) citrate [at least 15 % Fe (m/m)l
0,010 g
0,010 g
Calcium chloride (CaCI2.2H20)
Composition
Dipotassium hydrogen phosphate or90 g
Ammonium chloride 23 g
12 g to 18 92) p-Dimethylaminobenzaldehyde
Agar
59
Water 1 000 ml Hydrochloric acid, c(HCI) = 1 mol/l 100 ml
Preparation
Preparation
Dissolve the reagent in the hydrochloric acid solution and store
Dissolve the ammonium chloride in the water. Add the other
components and dissolve by bringing to the boil. Adjust the pH between O OC and +5 OC.
1) The bacteriological examination of drinking water supplies, 1982 Report No. 71. London, Her Majesty’s Stationery Office.
2) According to the manufacturer’s instructions.
3) DELANEY, J.E., MCCARTHY, J.A. and GRASSO, R.J. Waf. Sewage Wks., 1962: 109; 289.
4) Some commercial brands which favour indole formation are not satisfactory.
5) Oxoid Bile salts No. 3 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does n
...

34
IS0
NORME INTERNATIONALE
6391
Première édition
1988-1 1-15
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION
ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION
MEXAYHAPOAHAR OPrAHM3AuMR Il0 CTAHnAPTM3AUMM
Viandes et produits à base de viande - Dénombrement
des Escherichia coli - Méthode par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 OC
Meat and meat products - Enumeration of Escherichia coli - Colony count technique at
44 OC using membranes
Numéro de référence
IS0 6391 : 1988 (F)

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IS0 ô391 : 1988 (FI
l Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
I’ISO). L‘élaboration
d‘organismes nationaux de normalisation (comités membres de
des Normes internationales est en général confiée aux comités techniques de 1’60.
Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité
technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
I’ISO participent également aux travaux. L‘ISO col-
gouvernementales, en liaison avec
labore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale IS0 6391 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
L‘annexe A fait partie intégrante de la présente Norme internationale.
@ Organisation internationale de normalisation, 1988 0
Imprimé en Suisse
ii

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IS0 6391 : 1988 (FI
Introduction
Bien que, pour des raisons d’ordre statistique bien admises, le plus petit nombre de
colonies susceptible d’être compté sur boîte de milieu sélectif ait été fixé à 15, il est
souvent souhaitable, à des fins pratiques, d‘estimer la présence d’Escherichia coli
en-dessous de ce seuil. Les limites de confiance de telles estimations figurent en
A.
annexe
iii

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IS0 ô391 : 1988 (FI
NORME INTERNATIONALE
Viandes et produits à base de viande - Dénombrement
des Escherichia coli - Méthode par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 OC
1 Domaine d'application tate de cellulose appliquées sur gélose tryptonée biliée, dans les
conditions spécifiées dans la présente Norme internationale.
La présente Norme internationale prescrit une méthode pour le
dénombrement des Escherichia coli dans la viande et les pro-
4 Principe
duits à base de viande.
*
En général, la recherche d'E. coli nécessite trois étapes succes-
La méthode permet de rechercher les E. coli typiques (bio-
type 1) et les variantes lactose négatif ou anaérogènes.1) sives.
4.1 Revivification
2 Références normatives
Inoculation d'une quantité spécifiée de i'échantillon pour essai,
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par
si le produit considéré est liquide, ou avec une quantité déter-
suite de la référence qui en est faite, constituent des disposi-
minée de suspension mère, dans le cas d'autres produits, sur
tions valables pour la présente Norme internationale. Au
des membranes en acétate de cellulose appliquées sur gélose
moment de la publication de cette norme, les éditions indiquées
au glutamate modifiée et incubation à 37 OC pendant 4 h.
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les par-
ties prenantes des accords fondés sur cette Norme inter-
NOTE - Ce mode opératoire permet la revivification des E. coli
à rechercher la possibilité'd'appliquer les
nationale sont invitées
ayant été endommagés par le froid ou la dessiccation au cours d'un
éditions les plus récentes des normes indiquées ci-après. Les
stockage, ou ayant subi l'action de la chaleur ou un traitement chimi-
membres de la CE1 et de I'ISO possèdent le registre des Normes que. II permet également la diffusion de concentrations élevées
internationales en vigueur à un moment donné. d'hydrates de carbone fermentescibles présents dans l'échantillon pour
essai, ce qui évite leur interférence avec la production d'indole au
moment de l'isolement.
IS0 3100-1 : -2), Viandes et produits à base de viande -
Échantillonnage et préparation des échantillons pour essai -
Partie I : Échantillonnage.
4.2 Isolement
O
IS0 3100-2 : 1988, Viandes et produits à base de viande -
Après la revivification, transfert des membranes de la gélose au
Échantillonnage et préparation des échantillons pour essai -
glutamate modifiée, sur la gélose tryptonée biliée. Incubation à
Partie 2 : Préparation des échantillons pour essai pour l'examen
44 OC pendant 18 h à 20 h.
microbiologique.
4.3 Recherche
IS0 6837 : 1983, Microbiologie - Directives générales pour la
préparation des dilutions en vue de l'examen microbiologique.
Mise en évidence de la présence d'E. coli sur membrane par la
production d'indole à partir de chaque colonie.
3 Définition
4.4 Calcul
Pour les besoins de la présente Norme internationale, la défini-
tion suivante s'applique. Calcul du nombre d'E. coli par millilitre ou par gramme
d'échantillon à partir du nombre de colonies indole-positives
Escherichia coli: Bactéries qui, à 44 OC, forment des colonies obtenues sur les membranes à des niveaux de dilutions choisis
pour donner un résultat significatif.
indole-positives (roses) caractéristiques sur membranes en acé-
1) ANDERSON, J.M. et BAIRD-PARKER, A.C. J. Appl. Bacteriol. 39, 1975: 111-117.
2) A publier.
1

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IS0 6391 : 1988 (FI
Préparation
5 Diluant, milieux de culture et réactif
Dissoudre le chlorure d'ammonium dans l'eau. Ajouter les
5.1 Composants de base
autres composants et les dissoudre en les portant à ébullition.
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 6,7 à
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
25 OC. Répartir, par quantités de 100 ml, dans des récipients
mandé d'utiliser, pour la préparation du diluant et des milieux
appropriés (6.61, et stériliser à l'autoclave (6.1 à 115 OC pen-
de culture, des composants de base déshydratés ou des milieux
dant 10 min.
complets déshydratés. Les prescriptions du fabricant doivent
être suivies scrupuleusement.
Préparation des bones de gélose
Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analyti-
Répartir le milieu refroidi à environ 45 OC, par quantités de
que reconnue.
12 ml à 15 ml dans les boîtes de Petri stériles 16.7) et laisser se
solidifier. Les boîtes peuvent être conservées entre O OC et
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou déminéralisée,
+5 OC pendant 4 jours.
exempte de substances susceptibles d'inhiber la croissance des
E. coli dans les conditions de l'essai.
Juste au moment de l'emploi, faire sécher soigneusement les
Mesurer le pH du milieu, de sorte qu'après stérilisation il soit au
boîtes dans une étuve (6.5) à 50 OC, de préférence couvercles
pH demandé.
entr'ouverts et surface de la gélose retournée.
Si le diluant et les milieux ne sont pas utilisés extemporané-
NOTE - La gélose doit être suffisamment sèche, pour éviter un excès
ment, ils doivent, sauf spécifications contraires, être conservés
d'humidité au cours des 15 min qui suivent l'étalement de I'inoculum
à l'obscurité entre O OC et 5 OC pendant 1 mois au maximum,
il ml).
dans des conditions évitant toute modification de leur composi-
tion.
5.4 Milieu sélectif - Gélose tryptonée biliée3)
5.2 Diluant
Composition
Voir IS0 6887.
20,o g4)
Tryptone
5.3 Milieu de revivification - Gélose au
Sels biliaires (purifiés) 1,5 g5)
glutamate modifiée
12gà18g2)
Agar-agar
Eau 1 O00 ml
Composition 1)
Préparation
Glutamate de sodium
Lactose
Dissoudre les composants dans l'eau en les portant à ébullition.
Formiate de sodium
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit de 7,2 à
L( - )-cystine
25 OC. Répartir le milieu par quantités de 100 ml dans des fioles
L( - )-acide aspartique
appropriées et stériliser à l'autoclave (6.1) pendant 15 min à
L( + )-arginine
121 oc.
Thiamine
Acide nicotinique
Répartir le milieu refroidi à environ 45 OC, par quantités de
Acide pantothénique
12 ml à 15 ml dans des boîtes de Petri stériles (6.71 et laisser se
Sulfate de magnésium (MgS0~7H20)
O OC et
solidifier. Les boîtes peuvent être conservées entre
Citrate ammoniacal de fer(lll) [au moins
+5 OC pendant 4 jours.
0,010 g
15 % Fe(mlmi1
Chlorure de calcium (CaCI22H20) 0,010 g
Juste avant l'emploi, sécher soigneusement les boîtes de
Monohydrogénophosphate de potassium O,% €I
gélose dans l'étuve (6.5) à 50 OC pendant 30 min ou jusqu'à
Chlorure d'ammonium
23
Agar-agar 12 à 18 g2) séchage de la gélose, après avoir retiré les couvercles et
retourné les boîtes.
I O00 ml
Eau
1) The bacteriological examination of drinking water supplies, 1982 Report No. 71, London, Her Majesty's Stationery Office.
du fabricant.
2) Selon les prescriptions
3) DELANEY, J.E., MCCARTHY, J.A. et GRAsSO, R.J. Waf. Sewage Wks, 1962: 109; 289.
4) Certaines marques, favorisant la production d'indole, ne donnent pas de résultats satisfaisants.
5) Le sel biliaire Oxoid NO 3 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs
de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que I'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit ainsi désigné.
2

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IS0 ô391 : 1988 (FI
5.5 Réactif pour la recherche de I'indole 6.9 Pipettes, étalonnées spécialement pour l'usage bactério-
logique, de 1 ml de capacité nominale, graduées en 0,l ml et
Composition dont l'orifice d'écoulement a un diamètre de 2 mm à 3 mm.
p-
...