ISO 21528-1:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection of Enterobacteriaceae
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection of Enterobacteriaceae
ISO 21528-1:2017 specifies a method, with enrichment, for the detection of Enterobacteriaceae. It is applicable to - products intended for human consumption and the feeding of animals, and - environmental samples in the area of primary production, food production and food handling. This method is applicable - when the microorganisms sought are expected to need resuscitation by enrichment, and - when the number sought is expected to be below 100 per millilitre or per gram of test sample. A limitation on the applicability of ISO 21528-1:2017 is imposed by the susceptibility of the method to a large degree of variability (see Clause 11). NOTE Enumeration can be carried out by calculation of the most probable number (MPN) after incubation in liquid medium. See Annex A.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale par la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae — Partie 1: Recherche des Enterobacteriaceae
L'ISO 21528-1:2017 spécifie une méthode pour la recherche des Enterobacteriaceae avec enrichissement. Elle est applicable: - aux produits destinés à l'alimentation humaine et animale, et - aux échantillons d'environnement pour la production au stade primaire, la production des aliments et la distribution des aliments. Cette méthode est applicable: - lorsque les micro-organismes recherchés nécessitent une revivification par enrichissement, et - lorsque le nombre recherché est supposé être inférieur à 100 par millilitre ou par gramme d'échantillon pour essai. Des limites sont imposées aux possibilités d'application de l'ISO 21528-1:2017 du fait que ces méthodes sont sujettes à de grandes variations (voir l'Article 11). NOTE Le dénombrement peut être effectué en calculant le nombre le plus probable (NPP) après incubation en milieu liquide. Voir l'Annexe A.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21528-1
Second edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the detection
and enumeration of
Enterobacteriaceae —
Part 1:
Detection of Enterobacteriaceae
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale par
la recherche et le dénombrement des Enterobacteriaceae —
Partie 1: Recherche des Enterobacteriaceae
Reference number
ISO 21528-1:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 21528-1:2017(E)
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ISO 21528-1:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
4.1 Enrichment in non-selective medium . 2
4.2 Isolation and selection for confirmation . 2
4.3 Confirmation . 2
5 Diluent, culture media and reagent . 2
6 Equipment and consumables . 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 3
9 Procedure. 3
9.1 General . 3
9.2 Test portion and initial suspension . 4
9.3 Enrichment . 4
9.4 Isolation and selection for confirmation . 4
9.4.1 Isolation . 4
9.4.2 Selection of colonies for confirmation . 4
9.5 Subculturing selected colonies. 4
9.6 Biochemical confirmation tests . 4
9.6.1 Oxidase reaction . 4
9.6.2 Fermentation test . 5
10 Expression of results . 5
11 Precision . 5
11.1 Interlaboratory study . 5
11.2 Sensitivity . 5
11.3 Specificity . 5
12 Test report . 5
13 Quality assurance . 6
Annex A (informative) Enumeration by MPN technique . 7
Annex B (normative) Culture media and reagents .10
Annex C (informative) Method validation studies and performance characteristics .15
Bibliography .17
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ISO 21528-1:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the
agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 21528-1:2004), which has been technically
revised with the following main changes:
— the MPN method has become an informative Annex A;
— the pre-enrichment step in BPW followed by enrichment in EE broth has been changed to enrichment
[7]
in BPW and confirmation now takes place in Glucose OF medium instead of using glucose agar;
— performance testing for the quality assurance of the culture media has been added;
— performance characteristics for this method have been added to Annex C.
A list of all the parts in the ISO 21528 series can be found on the ISO website.
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ISO 21528-1:2017(E)
Introduction
This document is intended to provide general guidance for the examination of products not dealt
with by existing International Standards and to be taken into account by organizations preparing
microbiological test methods for application to foods or animal feeding stuffs. Because of the large
variety of products within this field of application, these guidelines may not be appropriate in every
detail for certain products, and for some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases, every attempt will be made to apply the guidelines provided
as far as possible and that deviations from them will only be made if absolutely necessary for technical
reasons.
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO 21528-1:2004
are considered as major (see ISO 17468).
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21528-1:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the detection and enumeration of Enterobacteriaceae —
Part 1:
Detection of Enterobacteriaceae
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that tests for
detecting Enterobacteriaceae are only undertaken in properly equipped laboratories under the
control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all incubated
materials. Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.
This document does not purport to address all of the safety aspects, if any, associated with its
use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.
1 Scope
This document specifies a method, with enrichment, for the detection of Enterobacteriaceae. It is
applicable to
— products intended for human consumption and the feeding of animals, and
— environmental samples in the area of primary production, food production and food handling.
This method is applicable
— when the microorganisms sought are expected to need resuscitation by enrichment, and
— when the number sought is expected to be below 100 per millilitre or per gram of test sample.
A limitation on the applicability of this document is imposed by the susceptibility of the method to a
large degree of variability (see Clause 11).
NOTE Enumeration can be carried out by calculation of the most probable number (MPN) after incubation in
liquid medium. See Annex A.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
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ISO 21528-1:2017(E)
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
Enterobacteriaceae
microorganism that forms characteristic colonies on violet red bile glucose agar and that ferment
glucose and show a negative oxidase reaction when the tests are carried out in accordance with the
methods specified in this document
3.2
detection of Enterobacteriaceae
determination of Enterobacteriaceae (3.1), in a particular mass or volume of product or surface area,
when tests are carried out in accordance with this document
4 Principle
4.1 Enrichment in non-selective medium
Buffered peptone water (BPW) is inoculated with the test portion, and then incubated at 37 °C (or
30 °C) for 18 h.
NOTE The incubation temperature of 37 °C for enrichment and isolation/enumeration on plating medium is
generally used when the detection and enumeration of Enterobacteriaceae is for a hygiene indicator. Alternatively,
a temperature of 30 °C can be chosen when the detection or enumeration of Enterobacteriaceae is conducted for
technological purposes and includes psychrotrophic Enterobacteriaceae. In this document, 37 °C will be used
throughout the text.
4.2 Isolation and selection for confirmation
Violet red bile glucose (VRBG) agar is inoculated with the culture obtained after enrichment in
BPW, then incubated at 37 °C. It is examined after 24 h to detect the presence of typical colonies of
presumptive Enterobacteriaceae.
4.3 Confirmation
Typical colonies of presumptive Enterobacteriaceae are subcultured onto non-selective medium, and
confirmed by means of tests for the fermentation of glucose and the presence of oxidase.
5 Diluent, culture media and reagent
For current laboratory practice, see ISO 7218.
Composition of culture media and reagents and their preparation are specified in Annex B.
For performance testing of culture media, see ISO 11133 and Annex B.
6 Equipment and consumables
Disposable equipment is an acceptable alternative to reusable glassware if it has suitable specifications.
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave), as specified in ISO 7218.
6.2 Incubator, capable of operating at 37 °C ± 1 °C (or 30 °C ± 1 °C).
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6.3 Drying cabinet (ventilated by convection) or incubator, capable of operating between 25 °C
and 50 °C.
6.4 Water bath, or similar apparatus, capable of being maintained between 47 °C to 50 °C.
6.5 Containers (e.g. bottles, tubes, flasks), suitable for the sterilization and storage of culture media.
6.6 Test tubes or flasks of appropriate capacity.
6.7 Petri dishes, made of glass or plastics, of diameter 90 mm to 100 mm.
6.8 Loops (of diameter approximately 3 mm) and wires, made of platinum/iridium or
nickel/chromium, or glass rods, or equivalent sterile disposable loops or inoculating needles.
6.9 Graduated pipettes or automatic pipettes, of nominal capacities 10 ml, 1 ml and 0,1 ml.
6.10 pH-meter, accurate to within ±0,1 pH unit at 25 °C.
6.11 Homogenizer, as specified in ISO 7218.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with the
sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement
on this subject.
Recommended sampling techniques are given in:
— ISO/TS 17728 for food and animal feed;
— ISO 13307 for primary production stage;
— ISO 17604 for carcasses;
— ISO 18593 for environmental samples.
It is important that the laboratory receives a sample that is representative and the sample should not
have been damaged or changed during transport or storage.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the
product concerned. If there is no specific International Standard available, it is recommended that the
parties concerned come to an agreement on this subject.
9 Procedure
9.1 General
See ISO 7218.
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ISO 21528-1:2017(E)
9.2 Test portion and initial suspension
In general, an amount of test portion (mass or volume) is added to a quantity of BPW (mass or volume)
to yield a 10-fold dilution. For example, a 10 g test portion is mixed with 90 ml of BPW.
This document has been validated for test portions of 10 g or ml. A smaller test portion may be
used, without the need for additional validation/verification, providing that the same ratio between
enrichment broth and test portion is maintained. A larger test portion than that initially validated may
be used, if a validation/verification study has shown that there are no adverse effects on the detection
of Enterobacteriaceae.
NOTE Validation can be conducted in accordance with the appropriate documents of ISO 16140 (all parts).
Verification for pooling samples can be conducted in accordance with the protocol described in ISO 6887-1:2017,
Annex D.
9.3 Enrichment
Incubate the initial suspension (9.2) at 37 °C for 18 h ± 2 h.
Continue the procedure with isolation and selection of colonies for confirmation (9.4).
9.4 Isolation and selection for confirmation
9.4.1 Isolation
Using a loop (6.8), streak from the incubated enrichment medium (see 9.3) the surface of a plate
containing the selective medium (B.2) and incubate the plate at 37 °C (see note in Clause 4) for 24 h ± 2 h.
9.4.2 Selection of colonies for confirmation
Characteristic colonies are pink to red or purple (with or without precipitation haloes).
Mark suspect colonies from the incubated plates (see 9.4.1). Select at least one typical or suspect colony
for subculture (see 9.5) and biochemical confirmation tests (see 9.6). If this is negative, select up to four
more suspect colonies.
If more than one morphology is present among the colonies, select one colony of each morphology for
subculture.
Certain Enterobacteriaceae may cause decolouration of their colonies or of the medium. Therefore,
when no characteristic colonies are present, choose whitish colonies for confirmation.
9.5 Subculturing selected colonies
Streak onto non-selective medium (e.g. nutrient agar plates) (B.3) each of the colonies selected for
confirmation (see 9.4.2).
Incubate these plates at 37 °C for 24 h ± 2 h.
Select a well-isolated colony from each of the incubated plates for the biochemical confirmation tests
(see 9.6).
9.6 Biochemical confirmation tests
9.6.1 Oxidase reaction
Using a platinum/iridium loop, wire or glass rod (6.8), take a portion of each well-isolated colony (see
9.5) and streak onto a filter paper moistened with the oxidase reagent (B.5) or onto a commercially
available disc or stick. A nickel/chromium loop or wire shall not be used.
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ISO 21528-1:2017(E)
Consider the test to be negative if the colour of the filter paper does not turn dark blue purple within 10 s.
Consult the manufacturer’s instructions for ready-to-use discs or sticks.
9.6.2 Fermentation test
Using a wire (6.8), stab the same colonies selected in 9.6 that gave a negative oxidase test into tubes
containing Glucose OF medium (B.4). Overlay the surface of the medium with minimal 1 cm of sterile
mineral oil (B.6).
Incubate these tubes at 37 °C for 24 h ± 2 h.
If a yellow colour develops throughout the content of the tube, regard the reaction as being positive.
10 Expression of results
If any of the selected typical colonies (see 9.4.2) from a subculture (see 9.4.1) is oxidase-negative and
glucose-positive, the sample from which the subculture was derived shall be regarded as being positive
for Enterobacteriaceae. In accordance with the interpretation of the results, indicate Enterobacteriaceae
detected or not detected in a test portion of x g or x ml of product, or on the surface area swabbed, or in
entire objects (e.g. boot socks).
11 Precision
11.1 Interlaboratory study
The performance characteristics of the method were determined in an interlaboratory study to
determine the specificity, sensitivity and the LOD of the method. The data are summarized in
50
Annex C. The values derived from the interlaboratory study may not be applicable to food types other
than those given in Annex C.
NOTE In this document, the word “type” is combined with “food” to improve the readability of this document.
However, the word “food” is interchangeable with “feed” and the other areas of the food chain as mentioned in
the scope of this document.
11.2 Sensitivity
The sensitivity is defined as the number of samples found positive divided by the number of samples
tested at a given level of contamination. The results are thus dependent on the level of contamination of
the sample.
11.3 Specificity
The specificity is defined as the number of samples found negative divided by the number of true
negative (or blank) samples tested.
12 Test report
The test report shall specify:
— the test method used, with a reference to this document, i.e. ISO 21528–1;
— the sampling method used, if known;
— the size of the test portion and/or the nature of the objects examined (for detection methods only);
— all operating conditions not specified in this document, or regarded as optional, together with
details of any incidents which may have influenced the test result(s);
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ISO 21528-1:2017(E)
— any deviations (e.g. in the media or the incubation conditions used);
— all information necessary for the complete identification of the sample;
— the test result(s) obtained.
13 Quality assurance
The laboratory should have a clearly defined quality control system to ensure that the equipment,
reagents and techniques are suitable for the test. The use of positive controls, negative controls and
blanks are part of the test. Performance testing of culture media is specified in Annex B and described
in ISO 11133.
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ISO 21528-1:2017(E)
Annex A
(informative)
Enumeration by MPN technique
A.1 General
The most probable number (MPN) technique can be used when the number of Enterobacteriaceae sought
is expected to be in the range 1 to 100 per millilitre or per gram of test sample. The MPN technique
follows the same principles as the detection method, but several dilutions are tested. It is known that
wide variations in results can occur using this technique for enumeration. The MPN technique can
however be used when low numbers are expected or because of the nature of the product under test,
according to the instructions in this annex.
A.2 Principle
A.2.1 Enrichment
A test portion of x g is added to 9 × x ml of buffered peptone water (BPW) and homogenized. One or
more 10-fold dilutions (according to the expected level of contamination) are prepared in BPW. Aliquots
(10 ml) of this initial dilution are transferred to three tubes. Then 3 × 1 ml of the initial dilution are
added to 9 ml of BPW and 3 × 1 ml of each further dilution are added to 9 ml of BPW. These tubes are
incubated 37 °C for 18 h ± 2 h.
A.2.2 Isolation and selection for confirmation
A selective solid medium (violet red bile glucose agar) is inoculated with a loop from each of the
incubated cultures obtained after enrichment in BPW, then incubated at 37 °C (or 30 °C, see note in
Clause 4). It is examined after 24 h ± 2 h to detect for the presence of presumptive Enterobacteriaceae
colonies.
A.2.3 Confirmation
Colonies of presumptive Enterobacteriaceae are subcultured on a non-selective medium and then
confirmed by means of tests for the fermentation of glucose and the presence of oxidase.
A.2.4 Calculation
The most probable number of Enterobacteriaceae per millilitre or per gram of the test sample is
calculated from the number of confirmed positive tubes using a MPN table (see ISO 7218).
A.3 Procedure (see Figure A.1)
A.3.1 Test portion, initial suspension and further dilutions
Depending on the desired accuracy of the results, inoculate an appropriate number of flasks or tubes
with the same dilution (e.g. three, five or 10 flasks or tubes). As a general rule, the techniques specified
require three flasks or tubes per dilution.
For preparation of the initial suspensions and further dilutions, use the enrichment medium (B.1).
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ISO 21528-1:2017(E)
To prepare the initial suspension, take a test portion of x g or x ml and homogenize in 9 × x ml of buffered
−1
peptone water (BPW) (B.1). A 10 dilution is thus obtained.
−1
NOTE 10 ml of the 10 dilution contain the equivalent of 1 g or 1 ml of sample.
−1
Prepare further dilutions by taking 1 ml of the 10 dilution and add to 9 ml of BPW. Repeat to make
further necessary decimal dilutions.
−1 −1
Transfer three 10 ml volumes of the 10 suspension to tubes (6.6) and three 1 ml volumes of the 10
dilution to tubes containing 9 ml of BPW (B.1).
A.3.2 Enrichment
Incubate the initial suspensions and dilutions (total 9 tubes) (see 9.4.1) at 37 °C for 18 h ± 2 h.
A.3.3 Isolation, subculturing and confirmation
See 9.4, 9.5 and 9.6.
A.4 Expression of results
Count the number of tubes giving a positive confirmed reaction for each dilution. Calculate the MPN
from the number of positive confirmed tubes at each dilution.
For the calculation of the MPN, the formulas given in ISO 7218 can be used. As no “standard” MPN
1)
tables are known to be available for the dilutions used, a software program for use in Excel® has been
written that can handle up to 10 levels of serial dilutions. It is highly recommended that this program be
used rather than other programs, since the results for any specific combination of results derived with
three dilutions will be the same as those in the tables published in ISO 7218. Details of the calculations
are described in Reference [7] and the software is freely available for download from:
http:// standards .iso .org/ iso/ 7218
A.5 Precision
It is known that wide variations in results can occur with the MPN technique. Results obtained by this
method s
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21528-1
Deuxième édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
par la recherche et le dénombrement
des Enterobacteriaceae —
Partie 1:
Recherche des Enterobacteriaceae
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
detection and enumeration of Enterobacteriaceae —
Part 1: Detection of Enterobacteriaceae
Numéro de référence
ISO 21528-1:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 21528-1:2017(F)
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21528-1:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Enrichissement en milieu non sélectif. 2
4.2 Isolement et sélection pour confirmation . 2
4.3 Confirmation . 2
5 Diluants, milieux de culture et réactifs . 2
6 Matériel et consommables . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
9 Mode opératoire. 4
9.1 Généralités . 4
9.2 Prise d’essai et suspension mère. 4
9.3 Enrichissement . 4
9.4 Isolement et sélection pour confirmation . 4
9.4.1 Isolement . 4
9.4.2 Sélection des colonies pour confirmation . 4
9.5 Repiquage des colonies sélectionnées . 5
9.6 Essais de confirmation biochimiques. 5
9.6.1 Réaction à l’oxydase . 5
9.6.2 Essai de fermentation . 5
10 Expression des résultats. 5
11 Fidélité . 5
11.1 Essai interlaboratoires . 5
11.2 Sensibilité . 6
11.3 Spécificité . 6
12 Rapport d’essai . 6
13 Assurance qualité . 6
Annexe A (informative) Dénombrement à l’aide de la technique NPP . 7
Annexe B (normative) Milieux de culture et réactifs .10
Annexe C (informative) Études de validation de la méthode et caractéristiques de performance .16
Bibliographie .19
© ISO 2017 – Tous droits réservés iii
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ISO 21528-1:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre noter des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ patents).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute autre information au sujet de
l’adhésion de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les
obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires
— Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 21528-1:2004) qui a fait l’objet
d’une révision technique en appliquant les modifications principales suivantes:
— la méthode NPP est devenue une Annexe informative A;
— l’étape de pré-enrichissement dans l’EPT suivie de l’enrichissement dans le milieu EE a été remplacée
[7]
par un enrichissement dans de l’EPT et la confirmation a désormais lieu dans le milieu OF glucosé
au lieu de la gélose au glucose;
— des essais de performance pour l’assurance qualité des milieux de culture ont été ajoutés;
— des caractéristiques de performance applicables à la présente méthode ont été ajoutées dans
l’Annexe C.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 21528 est disponible sur le site Internet de l’ISO.
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21528-1:2017(F)
Introduction
Le présent document est destiné à fournir des directives générales pour l’examen des produits non
concernés par les Normes internationales existant actuellement et devant être prises en considération
par les organismes élaborant des méthodes d’essai microbiologiques applicables aux aliments et
aliments pour animaux. En raison de la grande diversité des produits entrant dans ce domaine
d’application, il est possible que ces directives, dans tout leur détail, ne conviennent pas à certains
produits et que, pour certains autres produits, il soit nécessaire d’employer des méthodes différentes.
Néanmoins, il est à espérer que, dans tous les cas, tous les efforts seront faits pour appliquer, chaque
fois qu’il sera possible, les directives données et qu’il sera fait recours à des dérogations que si cela est
absolument nécessaire pour des raisons techniques.
Les principales modifications, énumérées dans l’avant-propos, introduites dans le présent document
par rapport à l’ISO 21528-1:2004, sont considérées comme majeures (voir l’ISO 17468).
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être immédiate et, pour certains groupes de produits, des
Normes internationales et/ou nationales existent peut-être déjà, qui ne concordent pas avec la présente
méthode horizontale. Lorsque de telles normes seront en révision, il serait souhaitable de les modifier
de façon à se conformer au présent document si bien que, au final, les seules divergences restantes par
rapport à la présente méthode horizontale seront celles nécessaires pour des raisons techniques bien
établies.
© ISO 2017 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 21528-1:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale par la recherche et le dénombrement des
Enterobacteriaceae —
Partie 1:
Recherche des Enterobacteriaceae
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais de recherche des Enterobacteriaceae ne soient réalisés que dans des laboratoires
équipés à cet effet, sous la surveillance d’un microbiologiste expérimenté, et qu’un grand soin
soit apporté à la mise au rebus de tous les éléments incubés. Il convient que les utilisateurs du
présent document connaissent bien les pratiques courantes de laboratoire. Le présent document
n’a pas pour but de traiter de tous les aspects de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son
utilisation. Il incombe à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en
matière d’hygiène et de sécurité.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode pour la recherche des Enterobacteriaceae avec
enrichissement. Elle est applicable:
— aux produits destinés à l’alimentation humaine et animale, et
— aux échantillons d’environnement pour la production au stade primaire, la production des aliments
et la distribution des aliments.
Cette méthode est applicable:
— lorsque les micro-organismes recherchés nécessitent une revivification par enrichissement, et
— lorsque le nombre recherché est supposé être inférieur à 100 par millilitre ou par gramme
d’échantillon pour essai.
Des limites sont imposées aux possibilités d’application du présent document du fait que ces méthodes
sont sujettes à de grandes variations (voir l’Article 11).
NOTE Le dénombrement peut être effectué en calculant le nombre le plus probable (NPP) après incubation
en milieu liquide. Voir l’Annexe A.
2 Références normatives
Les documents suivants sont référencés dans le texte de sorte qu’une partie ou la totalité de leur
contenu constitue les exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée
s’applique. Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y
compris les éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties), Microbiologie de la chaîne alimentaire— Préparation des échantillons, de la
suspension mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
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ISO 21528-1:2017(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
3.1
Enterobacteriaceae
micro-organisme formant des colonies caractéristiques sur gélose au cristal violet, à la bile et au glucose,
fermentant le glucose et donnant une réaction oxydase négative lorsque les essais sont effectués selon
les méthodes spécifiées dans le présent document
3.2
recherche des Enterobacteriaceae
détermination d’Enterobacteriaceae (3.1), dans une masse ou un volume déterminé de produit ou une
unité de surface, lorsque les essais sont effectués conformément au présent document
4 Principe
4.1 Enrichissement en milieu non sélectif
Ensemencement de la prise d’essai dans l’eau peptonée tamponnée (EPT), puis incubation à 37 °C (ou
30 °C) pendant 18 h.
NOTE La température d’incubation de 37 °C pour l’enrichissement et l’isolement/le dénombrement sur boîte
est généralement utilisée lorsque les Enterobacteriaceae sont recherchées et dénombrées en tant qu’indicateur
d’hygiène. Sinon, une température de 30 °C peut être choisie lorsque la détection ou le dénombrement des
Enterobacteriaceae est entrepris(e) dans le cadre d’un procédé technologique et comprend des Enterobacteriaceae
psychrotrophes. Dans le présent document, une température de 37 °C sera utilisée tout au long du texte.
4.2 Isolement et sélection pour confirmation
Ensemencement de la gélose à la bile, au cristal violet et au glucose (VRBG) avec la culture obtenue
après enrichissement dans de l’EPT, puis incubation à 37 °C. Examen après 24 h pour rechercher la
présence de colonies typiques d’Enterobacteriaceae présumées.
4.3 Confirmation
Repiquage des colonies typiques d’Enterobacteriaceae présumées sur milieu non sélectif et confirmation
au moyen de tests de fermentation du glucose et de l’oxydase.
5 Diluants, milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 7218.
La composition des milieux de culture et des réactifs et leur préparation sont spécifiées dans l’Annexe B.
Pour les essais de performance des milieux de culture, voir l’ISO 11133 et l’Annexe B.
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ISO 21528-1:2017(F)
6 Matériel et consommables
Le matériel à usage unique est acceptable au même titre que la verrerie réutilisable, si les spécifications
sont appropriées. Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218), et en particulier, ce
qui suit.
6.1 Appareil de stérilisation en chaleur sèche (four) et en chaleur humide (autoclave), tel que
spécifié dans l’ISO 7218.
6.2 Étuve, réglable à 37 °C ± 1 °C (ou 30 °C ± 1 °C).
6.3 Enceinte de séchage (ventilée par convection) ou étuve réglable entre 25 °C et 50 °C.
6.4 Bain d’eau, ou un appareil similaire, réglable entre 47 °C et 50 °C.
6.5 Récipients (par exemple flacons, tubes à essai, fioles) convenant pour la stérilisation et la
conservation des milieux de culture.
6.6 Tubes à essai, ou flacons, de capacité appropriée.
6.7 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, de 90 mm à 100 mm de diamètre.
6.8 Anses (de 3 mm de diamètre environ) et fils droits, en platine iridié ou en nickel-chrome, ou
inoculateurs en verre, ou anses ou aiguilles d’ensemencement stériles jetables.
6.9 Pipettes graduées ou pipettes automatiques, de capacités nominales de 10 ml, 1 ml et 0,1 ml.
6.10 pH mètre, précis à ± 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.11 Homogénéisateur, tel que spécifié dans l’ISO 7218.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage n’entre pas dans le cadre de la méthode spécifiée dans le présent document. Voir
la Norme internationale spécifique au produit concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale
spécifique à l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se
mettent d’accord à ce sujet.
Des techniques d’échantillonnage recommandées sont données dans:
— l’ISO/TS 17728 applicable aux aliments destinés à l’alimentation humaine et animale;
— l’ISO 13307 applicable au stade de production primaire;
— l’ISO 17604 applicable aux carcasses;
— l’ISO 18593 applicable aux échantillons d’environnement.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon représentatif et non endommagé ou modifié
pendant le transport ou le stockage.
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ISO 21528-1:2017(F)
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique au produit
concerné. S’il n’existe pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties
concernées se mettent d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire
9.1 Généralités
Voir l’ISO 7218.
9.2 Prise d’essai et suspension mère
En général, une quantité de prise d’essai (masse ou volume) est ajoutée à une quantité d’EPT (masse ou
volume) pour produire une dilution décimale correspondante. Par exemple, une prise d’essai de 10 g
est mélangée avec 90 ml d’EPT.
Le présent document a été validé pour des prises d’essai de 10 g ou 10 ml. Une prise d’essai de taille
inférieure peut être utilisée, sans avoir besoin de validation/vérification supplémentaire, à condition de
maintenir le même rapport entre bouillon d’enrichissement et prise d’essai. Une prise d’essai de taille
supérieure à celle validée au départ peut être utilisée, si une étude de validation/vérification n’a révélé
aucun effet indésirable sur la recherche des Enterobacteriaceae.
NOTE La validation peut être effectuée conformément aux documents appropriés de l’ISO 16140 (toutes les
parties). La vérification applicable au regroupement d’échantillons peut être réalisée conformément au protocole
décrit dans l’ISO 6887-1:2017, Annexe D.
9.3 Enrichissement
Incuber la suspension mère (9.2) à 37 °C pendant 18 h ± 2 h.
Poursuivre le mode opératoire en procédant à l‘isolement et à la sélection des colonies pour
confirmation (9.4).
9.4 Isolement et sélection pour confirmation
9.4.1 Isolement
À l’aide d’une anse (6.8), ensemencer, en stries, à partir du milieu d’enrichissement incubé (voir en 9.3),
la surface d’une boîte contenant le milieu sélectif (B.2) et incuber la boîte à 37 °C (voir la note dans
l’Article 4) pendant 24 h ± 2 h.
9.4.2 Sélection des colonies pour confirmation
Les colonies caractéristiques sont de couleur rose à rouge ou violette (avec ou sans halo de précipitation).
Marquer les colonies suspectes provenant des boîtes incubées (voir en 9.4.1). Choisir au moins une
colonie typique ou suspecte pour le repiquage (voir en 9.5) et les essais de confirmation biochimiques
(voir en 9.6). Si elle est négative, choisir jusqu’à quatre colonies suspectes de plus.
Si plus d’un type morphologique est présent parmi les colonies, sélectionner une colonie de chaque
morphologie pour en faire le repiquage.
Certaines Enterobacteriaceae peuvent causer une décoloration de leurs colonies ou du milieu. Par
conséquent, si aucune colonie caractéristique n’est présente, choisir les colonies blanchâtres pour la
confirmation.
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9.5 Repiquage des colonies sélectionnées
Ensemencer, en stries, sur un milieu non sélectif (par exemple, des boîtes de gélose nutritive) (B.3)
chacune des colonies sélectionnées pour la confirmation (voir en 9.4.2).
Incuber ces boîtes à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
Sélectionner une colonie bien isolée à partir de chacune des boîtes incubées en vue des essais de
confirmation biochimiques (voir en 9.6).
9.6 Essais de confirmation biochimiques
9.6.1 Réaction à l’oxydase
À l’aide d’une anse ou d’un fil en platine iridié ou d’un inoculateur en verre (6.8), prélever une fraction
de chaque colonie bien isolée (voir en 9.5) et la déposer sur un morceau de papier filtre humecté de
réactif à l’oxydase (B.5) ou sur un disque ou une bandelette disponible dans le commerce. Il ne faut pas
utiliser d’anse ni de fil en nickel-chrome.
Considérer l’essai comme négatif si la couleur du papier filtre ne devient pas bleu foncé-pourpre dans
les 10 s.
Pour les disques ou bandelettes prêt(e)s à l’emploi, se conformer aux instructions du fabricant.
9.6.2 Essai de fermentation
Repiquer, par piqûre à l’aide d’un fil droit (6.8), les mêmes colonies que celles sélectionnées en 9.6 qui
ont donné un résultat négatif à l’essai de l’oxydase dans des tubes contenant le milieu OF glucosé (B.4).
Recouvrir la surface du milieu avec au moins 1 cm d’huile minérale stérile (B.6).
Incuber ces tubes à 37 °C pendant 24 h ± 2 h.
Si une couleur jaune se développe dans la totalité du contenu du tube, la réaction est considérée comme
positive.
10 Expression des résultats
Si l’une des colonies caractéristiques sélectionnées (voir en 9.4.2) d’un repiquage (voir en 9.4.1)
est oxydase négative et glucose positive, l’échantillon à partir duquel le repiquage a été obtenu est
considéré comme contenant des Enterobacteriaceae. Selon l’interprétation des résultats, indiquer si des
Enterobacteriaceae sont détectées ou non dans une prise d’essai de x g ou x ml de produit, ou sur la
surface prélevée, ou dans des objets entiers (par exemple, chaussettes de prélèvement).
11 Fidélité
11.1 Essai interlaboratoires
Les caractéristiques de performance de la méthode ont été déterminées lors d’un essai interlaboratoires
pour déterminer la spécificité, la sensibilité et la LOD de la méthode. Les données sont récapitulées
50
dans l’Annexe C. Les valeurs extraites de l’essai interlaboratoires peuvent ne pas s’appliquer aux types
de produits alimentaires autres que ceux données dans l’Annexe C.
NOTE Dans le présent document, le terme «type» est associé au terme «aliment» pour améliorer la lisibilité
du présent document. Cependant, le terme «aliment» peut être remplacé par «aliment pour animaux» et par les
autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés dans le domaine d’application du présent document.
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11.2 Sensibilité
La sensibilité est définie comme étant le nombre d’échantillons positifs divisé par le nombre
d’échantillons soumis à essai à un niveau de contamination précis. Les résultats dépendent donc du
niveau de contamination de l’échantillon.
11.3 Spécificité
La spécificité est définie comme étant le nombre d’échantillons négatifs divisé par le nombre de vrais
négatifs (ou blancs) soumis à essai.
12 Rapport d’essai
Le rapport d’essai doit indiquer:
— la méthode d’essai utilisée, avec une référence au présent document, c’est-à-dire, ISO 21528-1;
— la méthode d’échantillonnage utilisée, si elle est connue;
— la taille de la prise d’essai et/ou la nature des objets examinés (pour les méthodes de détection
uniquement).
— toutes les conditions opératoires non spécifiées dans le présent document, ou considérées comme
facultatives, ainsi que les détails de tous les incidents susceptibles d’avoir influencé le(s) résultat(s)
d’essai;
— tout écart (par exemple par rapport au milieu ou aux conditions d’incubation utilisé(es));
— toutes les informations nécessaires à l’identification complète de l’échantillon;
— le(s) résultat(s) d’essai obtenu(s).
13 Assurance qualité
Il convient que le laboratoire soit doté d’un système de contrôle de la qualité clairement défini
garantissant que le matériel, les réactifs et les techniques sont adaptés à l’essai. L’utilisation de contrôles
positifs, de contrôles négatifs et de blancs fait partie de l’essai. Les essais de performance des milieux
de culture sont spécifiés dans l’Annexe B et décrits dans l’ISO 11133.
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ISO 21528-1:2017(F)
Annexe A
(informative)
Dénombrement à l’aide de la technique NPP
A.1 Généralités
La technique du nombre le plus probable (NPP) peut être utilisée lorsque le nombre d’Enterobacteriaceae
recherchées est censé se situer entre 1 et 100 par millilitre ou par gramme d’échantillon pour essai. La
technique NPP suit les mêmes principes que la méthode de détection, hormis que plusieurs dilutions
sont soumises à essai. Il est bien connu que des variations importantes peuvent être observées au
niveau des résultats avec cette technique de dénombrement. La technique NPP peut toutefois être
utilisée lorsque de faibles nombres sont prévus ou en raison de la nature du produit soumis à essai,
selon les instructions données dans la présente annexe.
A.2 Principe
A.2.1 Enrichissement
Ajout d’une prise d’essai de x g à 9 × x ml d’eau peptonée tamponnée (EPT) et homogénéisation.
Préparation d’une ou plusieurs dilutions décimales (en fonction du niveau de contamination supposé)
dans l’EPT. Transfert d’aliquotes (10 ml) de cette dilution mère dans trois tubes. Puis ajout de 3 × 1 ml de
la dilution mère à 9 ml d’EPT et ajout de 3 × 1 ml de chaque dilution successive à 9 ml d’EPT. Incubation
de ces tubes à 37 °C pendant 18 h ± 2 h.
A.2.2 Isolement et sélection pour confirmation
Ensemencement d’un milieu sélectif solide (gélose à la bile, au cristal violet et au glucose) au moyen d’une
anse à partir de chaque culture incubée obtenue après enrichissement dans de l’EPT puis incubation à
37 °C (ou 30 °C, voir la note dans l’Article 4). Examen après 24 h ± 2 h pour rechercher la présence de
colonies d’Enterobacter
...
Questions, Comments and Discussion
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