ISO/TS 15216-2:2013
(Main)Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR — Part 2: Method for qualitative detection
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR — Part 2: Method for qualitative detection
ISO/TS 15216-2:2013 describes a method for qualitative detection of HAV and NoV genogroups I (GI) and II (GII), from test samples of foodstuffs or food surfaces. Following liberation of viruses from the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR. This approach is also relevant for detection of the target viruses on fomites, or of other human viruses in foodstuffs, on food surfaces or on fomites following appropriate validation and using target-specific primer and probe sets.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l'hépatite A et norovirus dans les aliments par la technique RT-PCR en temps réel — Partie 2: Méthode de détection qualitative
L'ISO/TS 15216-2:2013 décrit une méthode de détection qualitative des VHA et NoV des génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d'aliments ou sur des surfaces alimentaires. Après libération des virus contenus dans l'échantillon pour essai, l'ARN viral est extrait par lyse à l'aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l'ARN viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel. Cette approche est aussi applicable pour la détection desdits virus sur des matières contaminées, ou d'autres virus humains dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou sur les matières contaminées en suivant une validation appropriée et en utilisant des jeux d'amorces et de sondes propres à la cible.
General Information
Relations
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Standards Content (Sample)
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 15216-2
First edition
2013-03-15
Corrected version
2013-05-01
Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus in
food using real-time RT-PCR —
Part 2:
Method for qualitative detection
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2: Méthode de détection qualitative
Reference number
ISO/TS 15216-2:2013(E)
©
ISO 2013
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior
written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of
the requester.
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Published in Switzerland
ii © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .vii
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
4.1 Virus extraction . 3
4.2 RNA extraction . 3
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) . 3
4.4 Control materials . 4
4.5 Test results. 4
5 Reagents . 4
5.1 General . 4
5.2 Reagents used as supplied . 4
5.3 Prepared reagents . 6
6 Apparatus and materials. 6
7 Sampling . 8
8 Procedure. 8
8.1 General laboratory requirements . 8
8.2 Virus extraction . 8
8.3 RNA extraction .10
8.4 Real-time RT-PCR .10
9 Interpretation of results .12
9.1 General .12
9.2 Construction of process control virus RNA standard curve.12
9.3 Control for amplification efficiency .12
9.4 Calculation of extraction efficiency .13
9.5 Theoretical limit of detection .13
10 Expression of results .13
11 Test report .14
Annex A (normative) Diagram of procedure .15
Annex B (informative) Real-time RT-PCR mastermixes and cycling parameters .16
Annex C (informative) Real-time RT-PCR primers and hydrolysis probes for the detection of HAV,
norovirus GI and GII and mengo virus (process control) .17
Annex D (informative) Growth of mengo virus strain MC for use as a process control .19
0
®
Annex E (informative) RNA extraction using the BioMerieux NucliSens system .20
Annex F (normative) Composition and preparation of reagents and buffers .22
Annex G (informative) Generation of external control RNA (EC RNA) stocks .24
Annex H (informative) Typical optical plate layout .26
Bibliography .27
© ISO 2013 – All rights reserved iii
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical
experts in an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 %
of the members of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a
technical committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the
committee casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for
a further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or
ISO/TS is confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be
transformed into an International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 15216-2 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), in collaboration
with Technical committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9 Microbiology.
This corrected version of ISO/TS 15216-2:2013 incorporates the following corrections.
— Throughout, textual references have been updated to take reordering of the annexes into account.
Annex B was formerly Annex E; Annex C was formerly Annex D; Annex D was formerly Annex G;
Annex E was formerly Annex C; Annex F was formerly Annex B; Annex G was formerly Annex H;
Annex H was formerly Annex F.
−1 −1
— Where units of shaking operations are mentioned, “oscillations min ” replaces “min ”.
— Many cross-references to reagents or apparatus subclauses are added.
— A phrase citing Annex A is added to the end of the introduction.
— The definitions for “food surface” (formerly 3.2 and 3.3) are combined and expanded in a redrafted
3.2; in consequence, the following terms in Clause 3 are renumbered.
— In 3.4, Note 2, “There is only one serotype” is transposed to the end of Note 1. Also, “group 2 biological
agent by the European Union and as a risk group 2 human aetiological agent by the United States
National Institutes of Health” replaces “UK Advisory Committee on Dangerous Pathogens (ACDP)
hazard group 2 pathogen”.
iv © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
— In 3.5, Note 2, “group 2 biological agents by the European Union and as risk group 2 human
aetiological agents by the United States National Institutes of Health” replaces “ACDP hazard group
2 pathogens”.
— In 3.13, “used in” replaces “used as template in”.
— In 5.2.11, “from Aspergillus niger or A. aculeatus” is inserted after “Pectinase”.
— In 6.1,”Aerosol resistant tips should be used unless unobstructed tips are required, e.g. for
aspiration.” is inserted.
— In 6.5, “37 ± 1,0” replaces “37 ± 10”.
— A redrafted 6.10 on centrifuge(s) and rotor(s) replaces the former 6.10 and 6.11, with consequent
renumbering of the following subclauses.
— In 6.19, the square brackets are deleted.
— In 6.27, “Real-time PCR machine(s), i.e. thermal cycler(s),” replaces “Thermal cycler(s)”.
— In 6.28, “selected real-time PCR” replaces “selected PCR”.
— In 8.1, “Samples arriving already frozen should be defrosted prior to testing.” is inserted as the
second sentence.
— 8.2.3 Is redrafted.
— In 8.2.4, paragraph 2,”buffer (5.3.5) (for soft fruit samples, add 30 units pectinase from A. niger, or
1 140 units pectinase from A. aculeatus to the buffer) and” replaces “buffer (for soft fruit samples,
add 30 units pectinase to the buffer) and”.
— In 8.2.6, paragraph 2, “and the animal is supported with a rubber block” is added.
— In 8.2.6, last paragraph, “min at room temperature, decant” replaces “min, decant”
— In 8.4.2.3, paragraph 1,”using a real-time PCR machine (6.27)” is added.
— In 9.4, Note 1 “has a process control virus recovery (equal to the extraction efficiency in matrices
other than BMS) of 100 %. For a process control virus RNA standard curve with an idealized slope
of −3,32, if the C value of an undiluted sample RNA well is <6,64 greater than the C value of the
q q
undiluted process control virus RNA, the process control virus recovery for that sample is >1% and
therefore acceptable” replaces “will have an extraction efficiency of 100 %”.
— The title of Annex B has been expanded to read, “Real-time RT-PCR mastermixes and cycling parameters”.
— In Table B.1, footnote a, “real-time PCR machines” twice replaces “real-time machines”.
— In C.1, “This primer set amplifies a product of 173 bp corresponding to nucleotides 68–240 of HAV
isolate HM174 43c (GenBank accession number M59809).” is added as paragraph 2.
— In C.2, “This primer set amplifies a product of 86 bp corresponding to nucleotides 5291–5376 of
Norwalk virus (GenBank accession number M87661).” is added as paragraph 2.
— In C.3, “This primer set amplifies a product of 89 bp corresponding to nucleotides 5012–5100 of
Lordsdale virus (GenBank accession number X86557).” is added as paragraph 2.
— In C.4, “This primer set amplifies a product of 100 bp corresponding to nucleotides 110–209 of
the deletant mengo virus strain MC used in the development of this part of ISO/TS 15216. This
0
corresponds to nucleotides 110–270 of the non-deletant mengo virus isolate M (GenBank accession
number L22089).” is added as paragraph 2.
© ISO 2013 – All rights reserved v
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
— In G.5, “mastermix (if the C difference between EC RNA stock tested with heat-treated and
q
untreated mastermix is <10 for a dsDNA standard curve with an idealized slope of −3,32), the”
replaces “mastermix, the”.
ISO/TS 15216 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR:
— Part 1: Method for quantification
— Part 2: Method for qualitative detection
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
Introduction
Hepatitis A virus (HAV) and norovirus (NoV) are important agents of food-borne human viral illness.
No routine methods exist to culture these viruses from food matrices. Detection is therefore reliant on
molecular methods using the reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As many food
matrices contain substances that are inhibitory to RT-PCR, it is necessary to use an extraction method
that produces highly clean RNA preparations that are fit for purpose. For food surfaces, viruses are
removed by swabbing. For soft fruit and salad vegetables, virus extraction is by elution with agitation
followed by precipitation with PEG/NaCl. For bottled water, adsorption and elution using positively
charged membranes followed by concentration by ultrafiltration is used and for bivalve molluscan
shellfish, viruses are extracted from the tissues of the digestive glands using treatment with a proteinase
K solution. For all matrices which are not covered by this Technical Specification, it is necessary to
validate this method. All matrices share a common RNA extraction method based on virus capsid
disruption with chaotropic reagents followed by adsorption of RNA to silica particles. Real-time RT-PCR
monitors amplification throughout the PCR cycle by measuring the excitation of fluorescently labelled
molecules. In the 5’ fluorogenic nuclease real-time RT-PCR assay, the fluorescent labels are attached to
a sequence-specific nucleotide probe (hydrolysis probe) that also enables simultaneous confirmation
of target template. These modifications increase the sensitivity and specificity of the PCR method, and
obviate the need for additional amplification product confirmation steps post PCR. Due to the complexity
of the method, it is necessary to include a comprehensive suite of controls. The method described in this
part of ISO/TS 15216 enables qualitative detection of virus RNA in the test sample. A schematic diagram
of the testing procedure is shown in Annex A.
© ISO 2013 – All rights reserved vii
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 15216-2:2013(E)
Microbiology of food and animal feed — Horizontal
method for determination of hepatitis A virus and
norovirus in food using real-time RT-PCR —
Part 2:
Method for qualitative detection
1 Scope
This part of ISO/TS 15216 describes a method for qualitative detection of HAV and NoV genogroups I
(GI) and II (GII), from test samples of foodstuffs or food surfaces. Following liberation of viruses from
the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on
silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR.
This approach is also relevant for detection of the target viruses on fomites, or of other human viruses
in foodstuffs, on food surfaces or on fomites following appropriate validation and using target-specific
primer and probe sets.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 22174 and the following apply.
3.1
foodstuff
substance used or prepared for use as food
Note 1 to entry: For the purposes of this part of ISO/TS 15216, this definition includes bottled water.
3.2
food surface
surface of food, food preparation surface or food contact surface
3.3
fomite
inanimate object or material on which infectious agents can be conveyed
© ISO 2013 – All rights reserved 1
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
3.4
hepatitis A virus
HAV
member of the Picornaviridae family responsible for infectious hepatitis
Note 1 to entry: Genetically, HAV can be subdivided into six genotypes on the basis of the VP1/2A region
(genotypes 1, 2, and 3 have been found in humans, while genotypes 4, 5, and 6 are of simian origin). There is only
one serotype.
Note 2 to entry: Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact, through the
consumption of contaminated foodstuffs, contact with contaminated water or food surfaces, or contact with
contaminated fomites. Hepatitis A virus is classified as a group 2 biological agent by the European Union and as a
risk group 2 human aetiological agent by the United States National Institutes of Health.
3.5
norovirus
member of the Caliciviridae family responsible for sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis
Note 1 to entry: Genetically, norovirus can be subdivided into five separate genogroups.
Note 2 to entry: Three of these genogroups, GI, GII and GIV have been implicated in human gastrointestinal
disease. GI and GII are responsible for the vast majority of clinical cases. Transmission occurs via the faecal-oral
route by person-to-person contact, through the consumption of contaminated foodstuffs or through contact with
contaminated water or food surfaces or contact with contaminated fomites. Genogroup I and II noroviruses are
classified as group 2 biological agents by the European Union and as risk group 2 human aetiological agents by the
United States National Institutes of Health.
3.6
detection of hepatitis A virus
detection of HAV RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of food surface
3.7
detection of norovirus
detection of norovirus RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of food surface
3.8
process control virus
virus added to the sample portion at the earliest opportunity prior to virus extraction to control for
extraction efficiency
3.9
process control virus RNA
RNA released from the process control virus in order to produce standard curve data for the estimation
of extraction efficiency
3.10
negative RNA extraction control
control free of target RNA carried through all steps of the RNA extraction and detection procedure to
monitor any cross-contamination events
3.11
negative process control
target pathogen-free sample of the food matrix which is run through all stages of the analytical process
3.12
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with two fluorescent molecules which are sterically separated by the
5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
2 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
3.13
negative RT-PCR control
aliquot of highly pure water used in a real-time RT-PCR reaction to control for contamination in the real-
time RT-PCR reagents
3.14
external control RNA
reference RNA that can serve as target for the real-time PCR assay of relevance, e.g. RNA synthesized by
in-vitro transcription from a plasmid carrying a copy of the target gene, which is added to an aliquot of
sample RNA in a defined amount to serve as a control for amplification in a separate reaction
3.15
C value
q
quantification cycle; the PCR cycle at which the target is quantified in a given real-time PCR reaction
Note 1 to entry: This corresponds to the point at which reaction fluorescence rises above a threshold level.
3.16
theoretical limit of detection
tLOD
level that constitutes the smallest quantity of target that can in theory be detected
Note 1 to entry: This corresponds to one genome copy per volume of RNA tested in the target assay, but varies
according to the test matrix and the quantity of starting material.
3.17
practical limit of detection
pLOD
lowest concentration of target in a test sample that can be reproducibly detected (95 % confidence
interval) under the experimental conditions specified in the method, as demonstrated by a collaborative
trial or other validation
Note 1 to entry: The pLOD is related to the test portion, the quality or quantity of the template RNA, and the tLOD
of the method.
4 Principle
4.1 Virus extraction
The foodstuffs and food surfaces covered by this part of ISO/TS 15216 are often highly complex matrices
and the target viruses can be present at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-
specific virus extraction and/or concentration in order to provide a substrate for subsequent common
parts of the process. The choice of method depends upon the matrix.
4.2 RNA extraction
It is necessary to extract RNA using a method that yields clean RNA preparations to reduce the effect
of PCR inhibitors. In this part of ISO/TS 15216 the chaotropic agent guanidine thiocyanate is used to
disrupt the viral capsid. RNA is then adsorbed to silica to assist purification through several washing
stages. Purified viral RNA is released from the silica into a buffer prior to real-time RT-PCR.
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR)
This Technical Specification uses one-step real-time RT-PCR using hydrolysis probes. In one-step real-
time RT-PCR, reverse transcription and PCR amplification are carried out consecutively in the same tube.
Real-time PCR using hydrolysis probes utilizes a short DNA probe with a fluorescent label and a
fluorescence quencher attached at opposite ends. The assay chemistry ensures that as the quantity
© ISO 2013 – All rights reserved 3
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
of amplified product increases, the probe is broken down and the fluorescent signal from the label
increases proportionately.
Due to the low levels of virus template often present in foodstuffs and the strain diversity in the
target viruses, selection of fit-for-purpose one step real-time RT-PCR reagents and PCR primers and
hydrolysis probes for the target viruses is important. Guidelines for their selection are given in 5.2.17
and 5.2.18. Illustrative details of reagents, primers, and probes (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) are provided in Annexes B and C.
4.4 Control materials
4.4.1 Process control virus
Losses of target virus can occur at several stages during sample virus extraction and RNA extraction.
To control for these losses, samples are spiked prior to processing with a defined amount of a process
control virus. The level of recovery of the process control virus shall be determined for each sample.
The virus selected for use as a process control shall be a culturable non-enveloped positive-sense ssRNA
virus of a similar size to the target viruses to provide a good morphological and physicochemical model.
The process control virus shall exhibit similar persistence in the environment to the targets. The virus
shall be sufficiently distinct genetically from the target viruses that PCR assays for the target and
process control viruses do not cross-react, and shall not normally be expected to occur naturally in the
foodstuffs under test.
An example of the preparation of process control virus (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) is provided in Annex D.
4.4.2 External amplification control (EC) RNA control
Many foodstuffs contain substances inhibitory to RT-PCR, and there is also a possibility of carryover of
further inhibitory substances from upstream processing. In order to control for RT-PCR inhibition in
individual samples, external control (EC) RNA (an RNA species carrying the target sequence of interest,
5.3.8) is added to an aliquot of sample RNA and tested using the RT-PCR method. Comparison of the
results of this with the results of EC RNA in the absence of sample RNA enables determination of the
level of RT-PCR inhibition in each sample under test.In addition, in this method, the EC RNA control acts
as an RT-PCR positive control.
Alternative approaches for RT-PCR inhibition control that can be demonstrated to provide equivalent
performance to the use of EC RNA are permitted.
4.5 Test results
For food surfaces, this method provides a result expressed either as “virus genome detected” or “virus
genome not detected”; for other sample types, results are expressed as “virus genome detected” or
“virus genome not detected” followed by “in x ml” or “in x g”, where x is the amount of sample tested.
5 Reagents
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
[10]
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Reagents used as supplied
5.2.1 Molecular biology grade water.
4 © ISO 2013 – All rights reserved
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ISO/TS 15216-2:2013(E)
5.2.2 Polyethylene glycol (PEG), mean relative molecular mass 8 000.
5.2.3 Sodium chloride (NaCl).
5.2.4 Potassium chloride (KCl).
5.2.5 Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Beef extract powder.
5.2.10 Proteinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase from Aspergillus niger or A. aculeatus.
5.2.12 Chloroform.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Sodium hydroxide (NaOH).
5.2.15 Hydrochloric acid (HCl).
5.2.16 Silica, lysis, wash, and elution buffers for extraction of viral RNA. Reagents shall enable
processing of 500 μl of extracted virus, using lysis with a chaotropic b
...
TECHNICAL ISO/TS
SPECIFICATION 15216-2
First edition
Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination
of hepatitis A virus and norovirus in
food using real-time RT-PCR —
Part 2:
Method for qualitative detection
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche
des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2: Méthode de détection qualitative
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft Technical Specification has been developed within the European Committee for Standardization
(CEN), and processed under the CEN-lead mode of collaboration as defined in the Vienna Agreement.
This draft Technical Specification is hereby submitted to a parallel three-month P member vote in the
ISO/TC concerned and three-month vote in CEN.
PROOF/ÉPREUVE
Reference number
ISO/TS 15216-2:2012(E)
©
ISO 2012
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/TS 15216-2:2012(E)
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© ISO 2012
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 3
4.1 Virus extraction . 3
4.2 RNA extraction . 3
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) . 3
4.4 Control materials . 4
4.5 Test results. 4
5 Reagents . 4
5.1 General . 4
5.2 Reagents used as supplied . 4
5.3 Prepared reagents . 5
6 Apparatus and materials. 6
7 Sampling . 8
8 Procedure. 8
8.1 General laboratory requirements . 8
8.2 Virus extraction . 8
8.3 RNA extraction .10
8.4 Real-time RT-PCR .10
9 Interpretation of results .12
9.1 General .12
9.2 Construction of process control virus RNA standard curve.12
9.3 Control for amplification efficiency .12
9.4 Calculation of extraction efficiency .13
9.5 Theoretical limit of detection .13
10 Expression of results .13
11 Test report .13
Annex A (normative) Diagram of procedure .15
Annex B (normative) Composition and preparation of reagents and buffers .17
®
Annex C (informative) RNA extraction using the BioMerieux NucliSens system .19
Annex D (informative) Real-time RT-PCR primers and hydrolysis probes for the detection of HAV,
norovirus GI and GII and mengo virus (process control) .21
Annex E (informative) Composition of one step real-time RT-PCR mastermixes using the
TM
Invitrogen RNA Ultrasense one step qRT-PCR system and cycling parameters .23
Annex F (informative) Typical optical plate layout .24
Annex G (informative) Growth of mengo virus strain MC for use as a process control .26
0
Annex H (informative) Generation of external control RNA (EC RNA) stocks .27
Bibliography .29
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International
Standards adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting.
Publication as an International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies
casting a vote.
In other circumstances, particularly when there is an urgent market requirement for such documents, a
technical committee may decide to publish other types of document:
— an ISO Publicly Available Specification (ISO/PAS) represents an agreement between technical
experts in an ISO working group and is accepted for publication if it is approved by more than 50 %
of the members of the parent committee casting a vote;
— an ISO Technical Specification (ISO/TS) represents an agreement between the members of a
technical committee and is accepted for publication if it is approved by 2/3 of the members of the
committee casting a vote.
An ISO/PAS or ISO/TS is reviewed after three years in order to decide whether it will be confirmed for
a further three years, revised to become an International Standard, or withdrawn. If the ISO/PAS or
ISO/TS is confirmed, it is reviewed again after a further three years, at which time it must either be
transformed into an International Standard or be withdrawn.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO/TS 15216-2 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN), in collaboration
with Technical committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9 Microbiology.
ISO/TS 15216 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR:
— Part 1: Method for quantification
— Part 2: Method for qualitative detection
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
Introduction
Hepatitis A virus (HAV) and norovirus (NoV) are important agents of food-borne human viral illness.
No routine methods exist to culture these viruses from food matrices. Detection is therefore reliant on
molecular methods using the reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). As many food
matrices contain substances that are inhibitory to RT-PCR, it is necessary to use an extraction method
that produces highly clean RNA preparations that are fit for purpose. For food surfaces, viruses are
removed by swabbing. For soft fruit and salad vegetables, virus extraction is by elution with agitation
followed by precipitation with PEG/NaCl. For bottled water, adsorption and elution using positively
charged membranes followed by concentration by ultrafiltration is used and for bivalve molluscan
shellfish, viruses are extracted from the tissues of the digestive glands using treatment with a proteinase
K solution. For all matrices which are not covered by this Technical Specification, it is necessary to
validate this method. All matrices share a common RNA extraction method based on virus capsid
disruption with chaotropic reagents followed by adsorption of RNA to silica particles. Real-time RT-PCR
monitors amplification throughout the PCR cycle by measuring the excitation of fluorescently labelled
molecules. In the 5’ fluorogenic nuclease real-time RT-PCR assay, the fluorescent labels are attached to
a sequence-specific nucleotide probe (hydrolysis probe) that also enables simultaneous confirmation
of target template. These modifications increase the sensitivity and specificity of the PCR method, and
obviate the need for additional amplification product confirmation steps post PCR. Due to the complexity
of the method, it is necessary to include a comprehensive suite of controls. The method described in this
part of ISO/TS 15216 enables qualitative detection of virus RNA in the test sample.
© ISO 2012 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE v
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TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 15216-2:2012(E)
Microbiology of food and animal feed — Horizontal
method for determination of hepatitis A virus and
norovirus in food using real-time RT-PCR —
Part 2:
Method for qualitative detection
1 Scope
This part of ISO/TS 15216 describes a method for qualitative detection of HAV and NoV genogroups I
(GI) and II (GII), from test samples of foodstuffs or food surfaces. Following liberation of viruses from
the test sample, viral RNA is then extracted by lysis with guanidine thiocyanate and adsorption on
silica. Target sequences within the viral RNA are amplified and detected by real-time RT-PCR.
This approach is also relevant for detection of the target viruses on fomites, or of other human viruses
in foodstuffs, on food surfaces or on fomites following appropriate validation and using target-specific
primer and probe sets.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 22174 and the following apply.
3.1
foodstuff
substance used or prepared for use as food
NOTE For the purposes of this part of ISO/TS 15216, this definition includes bottled water.
3.2
food surface
<1> surface of food
3.3
food surface
<2> food preparation surface
3.4
fomite
inanimate object or material on which infectious agents can be conveyed
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
3.5
hepatitis A virus
HAV
member of the Picornaviridae family responsible for infectious hepatitis
NOTE 1 Genetically, HAV can be subdivided into six genotypes on the basis of the VP1/2A region (genotypes 1,
2, and 3 have been found in humans, while genotypes 4, 5, and 6 are of simian origin).
NOTE 2 There is only one serotype. Transmission occurs via the faecal-oral route by person-to-person contact,
through the consumption of contaminated foodstuffs, contact with contaminated water or food surfaces, or
contact with contaminated fomites. Hepatitis A virus is classified as a UK Advisory Committee on Dangerous
Pathogens (ACDP) hazard group 2 pathogen.
3.6
norovirus
member of the Caliciviridae family responsible for sporadic cases and outbreaks of acute gastroenteritis
NOTE 1 Genetically, norovirus can be subdivided into five separate genogroups
NOTE 2 Three of these genogroups, GI, GII and GIV have been implicated in human gastrointestinal disease.
GI and GII are responsible for the vast majority of clinical cases. Transmission occurs via the faecal-oral route
by person-to-person contact, through the consumption of contaminated foodstuffs or through contact with
contaminated water or food surfaces or contact with contaminated fomites. Genogroup I and II noroviruses are
classified as ACDP Hazard Group 2 pathogens.
3.7
detection of hepatitis A virus
detection of HAV RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of food surface
3.8
detection of norovirus
detection of norovirus RNA in a predetermined mass or volume of foodstuff, or area of food surface
3.9
process control virus
virus added to the sample portion at the earliest opportunity prior to virus extraction to control for
extraction efficiency
3.10
process control virus RNA
RNA released from the process control virus in order to produce standard curve data for the estimation
of extraction efficiency
3.11
negative RNA extraction control
control free of target RNA carried through all steps of the RNA extraction and detection procedure to
monitor any cross-contamination events
3.12
negative process control
target pathogen-free sample of the food matrix which is run through all stages of the analytical process
3.13
hydrolysis probe
fluorescent probe coupled with two fluorescent molecules which are sterically separated by the
5′-3′-exonuclease activity of the enzyme during the amplification process
3.14
negative RT-PCR control
aliquot of highly pure water used as template in a real-time RT-PCR reaction to control for contamination
in the real-time RT-PCR reagents
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
3.15
external control RNA
reference RNA that can serve as target for the real-time PCR assay of relevance, e.g. RNA synthesized by
in-vitro transcription from a plasmid carrying a copy of the target gene, which is added to an aliquot of
sample RNA in a defined amount to serve as a control for amplification in a separate reaction
3.16
C value
q
quantification cycle; the PCR cycle at which the target is quantified in a given real-time PCR reaction
NOTE This corresponds to the point at which reaction fluorescence rises above a threshold level.
3.17
theoretical limit of detection
tLOD
level that constitutes the smallest quantity of target that can in theory be detected
NOTE This corresponds to one genome copy per volume of RNA tested in the target assay, but varies according
to the test matrix and the quantity of starting material.
3.18
practical limit of detection
pLOD
lowest concentration of target in a test sample that can be reproducibly detected (95 % confidence
interval) under the experimental conditions specified in the method, as demonstrated by a collaborative
trial or other validation
NOTE The pLOD is related to the test portion, the quality or quantity of the template RNA, and the tLOD
of the method.
4 Principle
4.1 Virus extraction
The foodstuffs and food surfaces covered by this part of ISO/TS 15216 are often highly complex matrices
and the target viruses can be present at low concentrations. It is therefore necessary to carry out matrix-
specific virus extraction and/or concentration in order to provide a substrate for subsequent common
parts of the process. The choice of method depends upon the matrix.
4.2 RNA extraction
It is necessary to extract RNA using a method that yields clean RNA preparations to reduce the effect
of PCR inhibitors. In this part of ISO/TS 15216 the chaotropic agent guanidine thiocyanate is used to
disrupt the viral capsid. RNA is then adsorbed to silica to assist purification through several washing
stages. Purified viral RNA is released from the silica into a buffer prior to real-time RT-PCR.
4.3 Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR)
This Technical Specification uses one-step real-time RT-PCR using hydrolysis probes. In one-step real-
time RT-PCR, reverse transcription and PCR amplification are carried out consecutively in the same tube.
Real-time PCR using hydrolysis probes utilizes a short DNA probe with a fluorescent label and a
fluorescence quencher attached at opposite ends. The assay chemistry ensures that as the quantity
of amplified product increases, the probe is broken down and the fluorescent signal from the label
increases proportionately.
Due to the low levels of virus template often present in foodstuffs and the strain diversity in the
target viruses, selection of fit-for-purpose one step real-time RT-PCR reagents and PCR primers and
hydrolysis probes for the target viruses is important. Guidelines for their selection are given in 5.2.17
© ISO 2012 – All rights reserved PROOF/ÉPREUVE 3
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
and 5.2.18. Illustrative details of reagents, primers, and probes (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) are provided in Annexes D and E.
4.4 Control materials
4.4.1 Process control virus
Losses of target virus can occur at several stages during sample virus extraction and RNA extraction.
To control for these losses, samples are spiked prior to processing with a defined amount of a process
control virus. The level of recovery of the process control virus shall be determined for each sample.
The virus selected for use as a process control shall be a culturable non-enveloped positive-sense ssRNA
virus of a similar size to the target viruses to provide a good morphological and physicochemical model.
The process control virus shall exhibit similar persistence in the environment to the targets. The virus
shall be sufficiently distinct genetically from the target viruses that PCR assays for the target and
process control viruses do not cross-react, and shall not normally be expected to occur naturally in the
foodstuffs under test.
An example of the preparation of process control virus (used in the development of this part of
ISO/TS 15216) is provided in Annex G.
4.4.2 External amplification control (EC) RNA control
Many foodstuffs contain substances inhibitory to RT-PCR, and there is also a possibility of carryover of
further inhibitory substances from upstream processing. In order to control for RT-PCR inhibition in
individual samples, external control (EC) RNA (an RNA species carrying the target sequence of interest,
5.3.8) is added to an aliquot of sample RNA and tested using the RT-PCR method. Comparison of the
results of this with the results of EC RNA in the absence of sample RNA enables determination of the
level of RT-PCR inhibition in each sample under test.In addition, in this method, the EC RNA control acts
as an RT-PCR positive control.
Alternative approaches for RT-PCR inhibition control that can be demonstrated to provide equivalent
performance to the use of EC RNA are permitted.
4.5 Test results
For food surfaces, this method provides a result expressed either as “virus genome detected” or “virus
genome not detected”; for other sample types, results are expressed as “virus genome detected” or
“virus genome not detected” followed by “in x ml” or “in x g”, where x is the amount of sample tested.
5 Reagents
5.1 General
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
[10]
For current laboratory practice, see ISO 7218.
5.2 Reagents used as supplied
5.2.1 Molecular biology grade water.
5.2.2 Polyethylene glycol (PEG), mean relative molecular mass 8 000.
5.2.3 Sodium chloride (NaCl).
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
5.2.4 Potassium chloride (KCl).
5.2.5 Disodium hydrogenphosphate (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Potassium dihydrogenphosphate (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Beef extract powder.
5.2.10 Proteinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase.
5.2.12 Chloroform.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Sodium hydroxide (NaOH).
5.2.15 Hydrochloric acid (HCl).
5.2.16 Silica, lysis, wash, and elution buffers for extraction of viral RNA. Reagents shall enable
processing of 500 μl of extracted virus, using lysis with a chaotropic buffer containing guanidine
thiocyanate (Reference [1]) and using silica as the RNA-binding matrix. Following treatment of silica-
bound RNA with wash buffer(s) to remove impurities, RNA shall be eluted in 100 μl elution buffer.
The RNA preparation shall be of a quality and concentration suitable for the intended purpose. See
Annex C for illustrative details of RNA extraction reagents (used in the development of the method
described in this part of ISO/TS 15216).
5.2.17 Reagents for one step real-time RT-PCR. Reagents shall allow processing of 5 μl RNA in 25 μl
total volume. They shall be suitable for one step RT-PCR using hydrolysis probes (the DNA polymerase
used shall possess 5’-3’ exonuclease activity) and sufficiently sensitive for the detection of levels of virus
RNA as typically found in virus-contaminated foodstuffs. See Annex E for illustrative details of one step
real-time RT-PCR reagents (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
5.2.18 Primers and hydrolysis probes for detection of HAV and norovirus GI and GII. Primer and
hydrolysis probe sequences shall be published in a peer-reviewed journal and be verified for use against
a broad range of strains of target virus. Primers for detection of HAV shall target the 5’ non-coding region
of the genome. Primers for detection of norovirus GI and GII shall target the ORF1/ORF2 junction of the
genome. See Annex D for illustrative details of primers and hydrolysis probes (used in the development of
this part of ISO/TS 15216).
5.2.19 Primers and hydrolysis probes for detection of the process control virus. Primer and
hydrolysis probe sequences shall be published in a peer-reviewed journal and be verified for use against
the strain of process virus used. They shall demonstrate no cross-reactivity with the target virus.
5.3 Prepared reagents
Because of the large number of reagents requiring individual preparation, details of composition and
preparation are given in Annex B.
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ISO/TS 15216-2:2012(E)
5.3.1 5 × PEG/NaCl solution (500 g/l PEG 8 000, 1,5 mol/l NaCl). See B.1.
5.3.2 Chloroform/butanol mixture. See B.2.
5.3.3 Proteinase K solution. See B.3.
5.3.4 Phosphate-buffered saline (PBS). See B.4.
5.3.5 Tris/glycine/beef extract (TGBE) buffer. See B.5.
5.3.6 Process control virus material. Process control virus stock shall be diluted by a minimum factor
of 10 in a suitable buffer, e.g. PBS. This dilution shall allow for inhibition-free detection of the process
control virus genome using real-time RT-PCR, but still be sufficiently concentrated to allow reproducible
determination of the lowest dilution used for the process control virus RNA standard curve (8.4.2.2). Split
the diluted process control virus material into single use aliquots and store at (−80 ± 5) °C. See Annex G
for illustrative details of the preparation of process control virus (used in the development of the method
described in this part of ISO/TS 15216).
5.3.7 Real-time RT-PCR mastermixes for target and process control virus. Reagents shall be added
in quantities as specified by the manufacturers (5.2.17) to allow 20 μl mastermix per reaction in a 25 μl
total volume. Optimal primer and probe concentrations shall be used after determination following the
recommendations of the reagent manufacturers. See Annex E for illustrative details of real-time RT-PCR
mastermixes (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
5.3.8 External control (EC) RNA control material. Separate purified ssRNA carrying the target
sequence for each target virus shall be used. They shall contain levels of contaminating target DNA no
higher than 0,1 % and shall not cause RT-PCR inhibition. The concentrations of each EC RNA stock in
6
copies per microlitre shall be determined and stock shall be diluted to a concentration of 1 × 10 to
8
1 × 10 template copies per microlitre. Split the diluted EC RNA preparation (EC RNA control material)
into single use aliquots and store frozen at −15 °C or below. See Annex H for illustrative details of the
preparation of EC RNA (used in the development of this part of ISO/TS 15216).
6 Apparatus and materials
[10]
Standard microbiological laboratory equipment (ISO 7218) and in particular the following.
6.1 Micropipettes and tips of a range of sizes, e.g. 1 000 μl, 200 μl, 20 μl, 10 μl.
6.2 Pipette filler and pipettes of a range of sizes, e.g. 25 ml, 10 ml, 5 ml.
6.3 Vortex mi
...
SPÉCIFICATION ISO/TS
TECHNIQUE 15216-2
Première édition
2013-03-15
Version corrigée
2013-05-01
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour la
recherche des virus de l’hépatite A
et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2:
Méthode de détection qualitative
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for
determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-
time RT-PCR —
Part 2: Method for qualitative detection
Numéro de référence
ISO/TS 15216-2:2013(F)
©
ISO 2013
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2013
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vii
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
4.1 Extraction de virus . 3
4.2 Extraction d’ARN . 3
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
(RT-PCR en temps réel) . 4
4.4 Témoins . 4
4.5 Résultats des essais . 4
5 Réactifs . 5
5.1 Généralités . 5
5.2 Réactifs utilisés dans l’état . 5
5.3 Réactifs préparés . 6
6 Appareillage et matériaux . 7
7 Échantillonnage . 8
8 Mode opératoire. 8
8.1 Exigences de laboratoire générales . 8
8.2 Extraction de virus . 8
8.3 Extraction d’ARN .11
8.4 RT-PCR en temps réel .11
9 Interprétation des résultats .13
9.1 Généralités .13
9.2 Élaboration des courbes étalon d’ARN viral témoin de processus .13
9.3 Calcul de l’efficacité de l’amplification .13
9.4 Calcul du rendement d’extraction .14
9.5 Limite de détection théorique .14
10 Expression des résultats.14
11 Rapport d’essai .15
Annexe A (normative) Diagramme de mode opératoire.16
Annexe B (informative) Mélanges maîtres (MasterMix) de la technique RT-PCR en temps réel et
paramètres de cycles .17
Annexe C (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la technique RT-PCR en temps réel pour
la détection du VHA, du norovirus GI et GII et du virus Mengo(témoin de processus) .18
Annexe D (informative) Croissance de la souche du virus Mengo MC utilisé comme témoin
0
de processus .20
®
Annexe E (informative) Extraction d’ARN par l’utilisation du système NucliSens de
chez BioMerieux .21
Annexe F (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons .23
Annexe G (informative) Préparations mères d’ARN témoin externe (ARN TE) .25
Annexe H (informative) Disposition de plaque optique type .27
Bibliographie .28
© ISO 2013 – Tous droits réservés iii
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts
dans un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 %
des membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour
trois nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS
ou ISO/TS a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO/TS 15216-2 a été élaborée par le comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
La présente version corrigée de l’ISO/TS 15216-2:2013 incorpore les corrections suivantes.
— Dans l’ensemble du document, les références textuelles ont été mises à jour afin de prendre en
compte la réorganisation des annexes. Précédemment, l’Annexe B était l’Annexe E; l’Annexe C était
l’Annexe D; l’Annexe D était l’Annexe G; l’Annexe E était l’Annexe C; l’Annexe F était l’Annexe B;
l’Annexe G était l’Annexe H, l’Annexe H était l’Annexe I, l’Annexe I était l’Annexe F.
— De nombreuses références croisées aux paragraphes relatifs aux réactifs et à l’appareillage sont ajoutées.
−1 −1
— Lorsque les unités sont mentionnées pour les étapes d’agitation, «oscillations min » remplace «min ».
— Une phrase faisant référence à l’Annexe A est ajoutée à la fin de l’introduction.
— Les définitions relatives à la «surface alimentaire» (précédemment 3.2 et 3.3) ont été combinées
et développées dans un article 3.2 reformulé; en conséquence les termes suivants de l’Article 3
sont renumérotés.
— En 3.4, Note 2, «Il n’existe qu’un sérotype.» est déplacé en fin de Note 1. En outre, «un agent biologique
de groupe 2 par l’Union européenne et un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
States National Institutes of Health» remplace «un agent pathogène du groupe de risque 2 selon
l’ACDP (Advisory Committee on Dangerous Pathogens, Royaume-Uni)».
— En 3.5, Note 2, «des agents biologiques de groupe 2 par l’Union européenne et des agents pathogènes
du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health» remplace «des agents
pathogènes du groupe de risque 2 selon l’ACDP».
— En 3.13, «utilisée» remplace «utilisée à la place de l’ADN initial».
— En 5.2.11, «d’Aspergillus niger ou A. aculeatus» est ajouté après «Pectinase».
— En 6.1, «Il convient d’utiliser des pointes résistant aux aérosols sauf si des pointes dégagées sont
requises, par exemple pour l’aspiration» est ajouté.
— En 6.5, «37 ± 1,0» remplace «37 ± 10».
— Une version reformulée de 6.10 concernant les centrifugeuse(s) et rotor(s) remplace les anciens 6.10
et 6.11, avec pour conséquence la renumérotation des paragraphes suivants.
— En 6.19, les crochets sont supprimés.
— En 6.27, «Machine(s) PCR en temps réel, c’est-à-dire thermocycleur(s)» remplace «Thermocycleur(s)».
— En 6.28, «machine PCR en temps réels sélectionnée» remplace «machine PCR sélectionnée».
— En 8.1, «Il convient de décongeler les échantillons qui arrivent déjà congelés avant d’effectuer
l’essai.» est inséré en tant que deuxième phrase.
— 8.2.3 est reformulé.
— En 8.2.4, alinéa 2, «tampon TGBE (5.3.5) (pour les fruits rouges, ajouter 30 unités de pectinase d’A.
niger ou 1 140 unités de pectinase d’A. aculeatus au tampon)» remplace «tampon TGBE (pour les
fruits rouges, ajouter 30 unités de pectinase au tampon)».
— En 8.2.6, alinéa 2, «et que l’animal est soutenu à l’aide d’un bloc de caoutchouc» est ajouté.
— En 8.2.6, dernier alinéa, «(5,0 ± 0,5) min à température ambiante, décanter» remplace
«(5,0 ± 0,5) min, décanter».
— En 8.4.2.3, alinéa 1, «au moyen d’une machine PCR en temps réel (6.27)» est ajouté.
— En 9.4, Note 1, «une récupération du virus témoin de processus (égale à l’efficacité d’extraction dans
des matrices autres que des matrices BMS) de 100%. Pour une courbe étalon établie pour l’ARN
viral témoin de processus ayant une pente idéale de −3,32, si la valeur C d’un puits d’échantillon
q
d’ARN non dilué est <6,64 supérieure à la valeur C de l’ARN viral témoin de processus non dilué,
q
la récupération du virus témoin de processus pour cet échantillon est >1 % et donc acceptable»
remplace «une efficacité d’amplification de 100 %».
— Le titre de l’Annexe B a été développé sous la forme «Mélanges maîtres (MasterMix) de la technique
RT-PCR en temps réel et paramètres de cycles».
— Dans le Tableau B.1, note de bas de tableau a, «machines PCR en temps réel» remplace deux fois
«machines en temps réel».
— En C.1, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 173 bp correspondant aux nucléotides 68-240
de l’isolat VHA HM174 43c (numéro d’accès GenBank M59809)» est ajouté comme alinéa 2.
— En C2, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 86 bp correspondant aux nucléotides 5291-
5376 du virus Norwalk (numéro d’accès GenBank M87661)» est ajouté comme alinéa 2.
— En C.3, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 89 bp correspondant aux nucléotides 5012-
5100 du virus Lordsdale (numéro d’accès GenBank X86557)» est ajouté comme alinéa 2.
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
— En C.4, «Cette série d’amorces amplifie un produit de 100 bp correspondant aux nucléotides 110-
209 de la souche du virus Mengo MC deletant utilisée pour l’élaboration de la présente partie de
0
l’ISO/TS 15216. Cela correspond aux nucléotides 110-270 de l’isolat M du virus Mengo non deletant
(numéro d’accès GenBank L22089)» est ajouté comme alinéa 2.
— En G.5, «mélange maître non traité (si la différence entre les valeurs C de la préparation mère de l’ARN TE
q
soumis à essai avec un mélange maître traité par la chaleur et non traité est <10 pour une courbe étalon
établie pour l’ADNdb ayant une pente idéale de −3,32)» remplace «mélange maître non traité».
L’ISO/TS 15216 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments
par la technique RT-PCR en temps réel:
— Partie 1: Méthode de quantification
— Partie 2: Méthode de détection qualitative
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
Introduction
Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus (NoV) sont des agents importants de maladies virales
d’origine alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la culture desdits virus à
partir de matrices alimentaires. La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent une
transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que de
nombreuses matrices alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR, il est
nécessaire d’utiliser une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement pures et
prêtes à l’emploi. En ce qui concerne les surfaces alimentaires, les virus sont prélevés par écouvillonnage.
L’extraction de virus dans les fruits rouges et les salades s’effectue par élution sous agitation suivie
d’une précipitation au PEG/NaCI. Pour l’eau embouteillée, une adsorption et une élution utilisant des
membranes chargées positivement, suivie d’une étape de concentration par ultrafiltration est utilisée,
les virus des mollusques bivalves, sont eux extraits des tissus des glandes digestives par traitement avec
une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne sont couvertes par la présente Spécification
technique, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode d’extraction d’ARN, commune à toutes
les matrices, est basée sur la dislocation de la capside du virus par des réactifs chaotropiques, suivie
d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique de RT-PCR en temps réel permet de
suivre l’amplification tout au long des cycles de PCR en mesurant l’excitation de molécules marquées
par fluorescence. Lors d’une réaction RT-PCR en temps réel utilisant une nucléase marquée en 5’, les
composés fluorescents sont fixés à une sonde nucléotidique propre à une séquence (sonde d’hydrolyse),
ce qui permet aussi une confirmation simultanée de la présence de l’ADN initial ciblé. Ces modifications
augmentent la sensibilité et la spécificité de la méthode PCR, et rendent alors inutiles les étapes de
confirmation post PCR par amplifications supplémentaires. En raison de la complexité de la méthode, il
est nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La méthode décrite dans la présente partie de
l’ISO/TS 15216 permet la détection qualitative des niveaux d’ARN de virus dans l’échantillon pour essai.
L’Annexe A présente un diagramme de mode opératoire.
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SPÉCIFICATION TECHNIQUE ISO/TS 15216-2:2013(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour
la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les
aliments par la technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2:
Méthode de détection qualitative
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO/TS 15216 décrit une méthode de détection qualitative des VHA et NoV des
génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d’aliments ou sur des surfaces
alimentaires. Après libération des virus contenus dans l’échantillon pour essai, l’ARN viral est extrait
par lyse à l’aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l’ARN
viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel.
Cette approche est aussi applicable pour la détection desdits virus sur des matières contaminées, ou
d’autres virus humains dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou sur les matières contaminées
en suivant une validation appropriée et en utilisant des jeux d’amorces et de sondes propres à la cible.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables
à l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels
amendements) s’applique.
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 ainsi que les
suivants s’appliquent.
3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment
Note 1 à l’article: Pour les besoins de la présente partie de l’ISO/TS 15216, cette définition inclut l’eau embouteillée.
3.2
surface alimentaire
surface des aliments, surface de préparation des aliments ou surface en contact avec les alimentsts
3.3
matières contaminées
objets ou matériaux inanimés sur lesquels des agents infectieux peuvent être transportés
© ISO 2013 – Tous droits réservés 1
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
3.4
virus de l’hépatite A
VHA
membre de la famille des Picornaviridae responsable des hépatites infectieuses
Note 1 à l’article: Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de région VP1/2A (des
génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne). Il
n’existe qu’un sérotype.
Note 2 à l’article: La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments
contaminés, au contact avec de l’eau ou des surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact avec des
matières contaminées. Le virus de l’hépatite A est classé comme étant un agent biologique de groupe 2 par l’Union
européenne et un agent pathogène du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
3.5
norovirus
membre de la famille des Caliciviridae responsable des cas sporadiques et des épidémies de
gastroentérites aiguës
Note 1 à l’article: Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en cinq génogroupes distincts.
Note 2 à l’article: Trois de ces génogroupes, GI, GII et GIV ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux
chez l’homme. GI et GII sont responsables de la grande majorité des cas cliniques. La transmission se fait par
voie féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou
des surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact avec des matières contaminées. Les norovirus des
génogroupes I et II sont classés comme étant des agents biologiques de groupe 2 par l’Union européenne et des
agents pathogènes du groupe de risque 2 selon les United States National Institutes of Health.
3.6
détection du virus de l’hépatite A
détection de l’ARN du VHA dans un rapport masse ou volume prédéterminé d’aliments, ou sur une
superficie de surface alimentaire
3.7
détection des norovirus
détection de l’ARN du norovirus dans un rapport masse ou volume prédéterminé d’aliments, ou sur une
superficie de surface alimentaire
3.8
virus témoin de processus
virus ajouté à la prise d’échantillon, à la première occasion précédant l’extraction du virus, afin de
contrôler le rendement de l’extraction
3.9
ARN viral témoin de processus
ARN libéré par le virus témoin de processus permettant d’obtenir des données pour établir une courbe
étalon en vue de l’estimation du rendement de l’extraction
3.10
témoin négatif d’extraction d’ARN
témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection
permettant de s’assurer de l’absence de contamination croisée
3.11
témoin négatif de processus
échantillon de la matrice d’aliment sans agent pathogène cible soumis à toutes les étapes du
processus d’analyse
3.12
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente couplée à deux molécules fluorescentes qui sont séparées de façon stérique par
l’activité d’exonucléase en 5’-3’ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
2 © ISO 2013 – Tous droits réservés
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
3.13
témoin négatif de RT-PCR
aliquote d’eau très pure utilisée dans une réaction RT-PCR en temps réel permettant de s’assurer de la
non-contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
3.14
témoin externe d’ARN
ARN de référence pouvant servir de cible pour une réaction PCR en temps réel appropriée, par exemple
un ARN synthétisé par une transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gêne cible,
qui est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon selon une quantité donnée servant de témoin pour
l’amplification d’une réaction distincte
3.15
valeur C
q
cycle de quantification, cycle de réaction PCR durant lequel la cible est quantifiée au cours d’une réaction
donnée de PCR en temps réel
Note 1 à l’article: Cela correspond au point auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.
3.16
limite de détection théorique
LDDt
niveau qui constitue la plus petite quantité de cible pouvant, en théorie, être détectée
Note 1 à l’article: Cela correspond à une copie d’un génome par unité de volume d’ARN cible soumis à essai mais
qui varie en fonction de la matrice d’essai et de la quantité de matière disponible au départ.
3.17
limite de détection pratique
LDDp
plus petite concentration de cible dans un échantillon essai qui peut être détectée de façon reproductible
(intervalle de confiance de 95 %) dans les conditions expérimentales spécifiées dans la méthode, vérifiée
par un essai de reproductibilité interlaboratoires ou une autre validation
Note 1 à l’article: La LDDp dépend de la prise d’essai, de la qualité ou de la quantité d’ARN initial et de la LDDt
de la méthode.
4 Principe
4.1 Extraction de virus
Les aliments et les surfaces alimentaires couverts par la présente partie de l’ISO/TS 15216 sont souvent
des matrices hautement complexes et les virus cibles peuvent être présents à de petites concentrations.
Il est donc nécessaire d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice
afin de produire un substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode
dépend de la matrice.
4.2 Extraction d’ARN
Il est nécessaire d’extraire l’ARN en utilisant une méthode qui permette d’obtenir des préparations
d’ARN pures afin de réduire les effets des inhibiteurs de PCR. Dans la présente partie de l’ISO/TS 15216,
le thiocyanate de guanidine, réactif chaotropique, est utilisé pour la dislocation de la capside du virus.
L’ARN est ensuite adsorbé sur silice afin de faciliter la purification à travers plusieurs étapes de lavage.
L’ARN viral purifié est libéré de la silice dans un tampon avant la réaction RT-PCR en temps réel.
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ISO/TS 15216-2:2013(F)
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps
réel (RT-PCR en temps réel)
La présente Spécification technique se base sur la réaction RT-PCR en temps réel en une étape utilisant
des sondes d’hydrolyse. Dans la technique RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et
l’amplification par PCR sont effectuées consécutivement dans le même tube.
La réaction PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse emploie une sonde d’ADN courte marquée
par une molécule fluorescente à une extrémité et un quencher fluorescent à l’extrémité opposée. La
chimie de cette réaction PCR garantit qu’à mesure que la quantité de produit amplifié augmente, la
sonde d’ADN est coupée et le signal fluorescent provenant du marqueur augmente proportionnellement.
En raison des faibles concentrations de virus dans les aliments et de la diversité des souches dans les virus
ciblés, il est important de sélectionner de façon adéquate des réactifs pour RT-PCR en temps réel en une
étape, des amorces PCR et des sondes d’hydrolyse pour les virus ciblés. Pour cela, des rec
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 15216-2
Première édition
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour la
recherche des virus de l’hépatite A
et norovirus dans les aliments par la
technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2:
Méthode de détection qualitative
Microbiology of food and animal feed — Horizontal method for
determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-
time RT-PCR —
Part 2: Method for qualitative detection
TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet de Spécification technique a été élaboré dans le cadre du Comité européen de
normalisation (CEN) et soumis selon le mode de collaboration sous la direction du CEN, tel que défini
dans l’Accord de Vienne.
Le présent projet de Spécification technique est par conséquent soumis en parallèle aux membres (P) de
l’ISO/TC concerné pour un vote de trois mois et au CEN pour un vote de trois mois.
PROOF/ÉPREUVE
Numéro de référence
ISO 15216-2:2012(F)
©
ISO 2012
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ISO 15216-2:2012(F)
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Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans
l’accord écrit de l’ISO à l’adresse ci-après ou du comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 15216-2:2012(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 3
4.1 Extraction de virus . 3
4.2 Extraction d’ARN . 3
4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel
(RT-PCR en temps réel) . 4
4.4 Témoins . 4
4.5 Résultats des essais . 4
5 Réactifs . 5
5.1 Généralités . 5
5.2 Réactifs utilisés dans l’état . 5
5.3 Réactifs préparés . 6
6 Appareillage et matériaux . 7
7 Échantillonnage . 8
8 Mode opératoire. 8
8.1 Exigences de laboratoire générales . 8
8.2 Extraction de virus . 8
8.3 Extraction d’ARN .11
8.4 RT-PCR en temps réel .11
9 Interprétation des résultats .13
9.1 Généralités .13
9.2 Élaboration des courbes étalon d’ARN viral témoin de processus .13
9.3 Calcul de l’efficacité de l’amplification .13
9.4 Calcul du rendement d’extraction .14
9.5 Limite de détection théorique .14
10 Expression des résultats.14
11 Rapport d’essai .15
Annexe A (normative) Logigramme de mode opératoire .16
Annexe B (normative) Composition et préparation des réactifs et des tampons .18
®
Annexe C (informative) Extraction d’ARN par l’utilisation du système NucliSens de
chez BioMerieux .20
Annexe D (informative) Amorces et sondes d’hydrolyse de la technique RT-PCR en temps réel pour
la détection du VHA, du norovirus GI et GII et du virus Mengo(témoin de processus) .22
Annexe E (informative) Composition des mélanges maîtres (MasterMix) de la technique RT-PCR
TM
en temps réel en une étape (One-step qRT-PCR) utilisant le système RNA Ultrasense
one-step qRT-PCR de chez Invitrogen et paramètres de cycles .24
Annexe F (informative) Disposition de plaque optique type .25
Annexe G (informative) Croissance de la souche du virus Mengo MC utilisé comme témoin
0
de processus .27
Annexe H (informative) Préparations mères d’ARN témoin externe .28
Bibliographie .30
© ISO 2012 – Tous droits réservés PROOF/ÉPREUVE iii
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ISO 15216-2:2012(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne
la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives
ISO/CEI, Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d’élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote.
Leur publication comme Normes internationales requiert l’approbation de 75 % au moins des comités
membres votants.
Dans d’autres circonstances, en particulier lorsqu’il existe une demande urgente du marché, un comité
technique peut décider de publier d’autres types de documents:
— une Spécification publiquement disponible ISO (ISO/PAS) représente un accord entre les experts
dans un groupe de travail ISO et est acceptée pour publication si elle est approuvée par plus de 50 %
des membres votants du comité dont relève le groupe de travail;
— une Spécification technique ISO (ISO/TS) représente un accord entre les membres d’un comité technique
et est acceptée pour publication si elle est approuvée par 2/3 des membres votants du comité.
Une ISO/PAS ou ISO/TS fait l’objet d’un examen après trois ans afin de décider si elle est confirmée pour
trois nouvelles années, révisée pour devenir une Norme internationale, ou annulée. Lorsqu’une ISO/PAS
ou ISO/TS a été confirmée, elle fait l’objet d’un nouvel examen après trois ans qui décidera soit de sa
transformation en Norme internationale soit de son annulation.
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de
ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L’ISO/TS 15216-2 a été élaborée par le comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
L’ISO/TS 15216 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des
aliments — Méthode horizontale pour la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les aliments
par la technique RT-PCR en temps réel:
— Partie 1: Méthode de quantification
— Partie 2: Méthode de détection qualitative
iv PROOF/ÉPREUVE © ISO 2012 – Tous droits réservés
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ISO 15216-2:2012(F)
Introduction
Le virus de l’hépatite A (VHA) et les norovirus (NoV) sont des agents importants de maladies virales
d’origine alimentaire, chez l’humain. Aucune méthode de routine n’existe pour la culture desdits virus à
partir de matrices alimentaires. La détection dépend ainsi des méthodes moléculaires qui utilisent une
transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR). Étant donné que de
nombreuses matrices alimentaires contiennent des substances inhibitrices de la technique RT-PCR, il est
nécessaire d’utiliser une méthode d’extraction produisant des préparations d’ARN extrêmement pures et
prêtes à l’emploi. En ce qui concerne les surfaces alimentaires, les virus sont prélevés par écouvillonnage.
L’extraction de virus dans les fruits rouges et les salades s’effectue par élution sous agitation suivie
d’une précipitation au PEG/NaCI. Pour l’eau embouteillée, une adsorption et une élution utilisant des
membranes chargées positivement, suivie d’une étape de concentration par ultrafiltration est utilisée,
les virus des mollusques bivalves, sont eux extraits des tissus des glandes digestives par traitement avec
une solution de protéinase K. Pour toutes les matrices qui ne sont couvertes par la présente Spécification
technique, il est nécessaire de valider cette méthode. La méthode d’extraction d’ARN, commune à toutes
les matrices, est basée sur la dislocation de la capside du virus par des réactifs chaotropiques, suivie
d’une adsorption de l’ARN sur des particules de silice. La technique de RT-PCR en temps réel permet de
suivre l’amplification tout au long des cycles de PCR en mesurant l’excitation de molécules marquées
par fluorescence. Lors d’une réaction RT-PCR en temps réel utilisant une nucléase marquée en 5’, les
composés fluorescents sont fixés à une sonde nucléotidique propre à une séquence (sonde d’hydrolyse),
ce qui permet aussi une confirmation simultanée de la présence de l’ADN initial ciblé. Ces modifications
augmentent la sensibilité et la spécificité de la méthode PCR, et rendent alors inutiles les étapes de
confirmation post PCR par amplifications supplémentaires. En raison de la complexité de la méthode, il
est nécessaire d’inclure une série exhaustive de témoins. La méthode décrite dans la présente partie de
l’ISO/TS 15216 permet la détection qualitative des niveaux d’ARN de virus dans l’échantillon pour essai.
© ISO 2012 – Tous droits réservés PROOF/ÉPREUVE v
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NORME INTERNATIONALE ISO 15216-2:2012(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour
la recherche des virus de l’hépatite A et norovirus dans les
aliments par la technique RT-PCR en temps réel —
Partie 2:
Méthode de détection qualitative
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO/TS 15216 décrit une méthode de détection qualitative des VHA et NoV des
génogroupes I (GI) et II (GII) présents dans des échantillons pour essai d’aliments ou sur des surfaces
alimentaires. Après libération des virus contenus dans l’échantillon pour essai, l’ARN viral est extrait
par lyse à l’aide de thiocyanate de guanidine et par adsorption sur silice. Les séquences cibles de l’ARN
viral sont amplifiées et détectées par la technique RT-PCR en temps réel.
Cette approche est aussi applicable pour la détection desdits virus sur des matières contaminées, ou
d’autres virus humains dans les aliments, sur les surfaces alimentaires ou sur les matières contaminées
en suivant une validation appropriée et en utilisant des jeux d’amorces et de sondes propres à la cible.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables
à l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence (y compris les éventuels
amendements) s’applique.
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions donnés dans l’ISO 22174 ainsi que les
suivants s’appliquent.
3.1
aliment
substance utilisée ou préparée pour être utilisée comme aliment
NOTE Pour les besoins de la présente partie de l’ISO/TS 15216, cette définition inclut l’eau embouteillée.
3.2
surface alimentaire
<1> surface des aliments
3.3
surface alimentaire
<2> surface de préparation des aliments
3.4
matières contaminées
objets ou matériaux inanimés sur lesquels des agents infectieux peuvent être transportés
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ISO 15216-2:2012(F)
3.5
virus de l’hépatite A
VHA
membre de la famille des Picornaviridae responsable des hépatites infectieuses
NOTE 1 Génétiquement, le VHA peut être subdivisé en six génotypes sur la base de région VP1/2A (des
génotypes 1, 2 et 3 ont été trouvés chez les humains alors que les génotypes 4, 5 et 6 sont d’origine simienne).
NOTE 2 Il n’existe qu’un sérotype. La transmission se fait par voie féco-orale de personne à personne, par la
consommation d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou des surfaces alimentaires contaminées, ou bien
par le contact avec des matières contaminées. Le virus de l’hépatite A est classé comme étant un agent pathogène
du groupe de risque 2 selon l’ACDP (Advisory Committee on Dangerous Pathogens, Royaume-Uni).
3.6
norovirus
membre de la famille des Caliciviridae responsable des cas sporadiques et des épidémies de
gastroentérites aiguës
NOTE 1 Génétiquement, les norovirus peuvent être subdivisés en cinq génogroupes distincts.
NOTE 2 Trois de ces génogroupes, GI, GII et GIV ont été impliqués dans des troubles gastro-intestinaux chez
l’homme. GI et GII sont responsables de la grande majorité des cas cliniques. La transmission se fait par voie
féco-orale de personne à personne, par la consommation d’aliments contaminés, au contact avec de l’eau ou des
surfaces alimentaires contaminées, ou bien par le contact avec des matières contaminées. Les norovirus des
génogroupes I et II sont classés comme étant des agents pathogènes du groupe de risque 2 selon l’ACDP.
3.7
détection du virus de l’hépatite A
détection de l’ARN du VHA dans un rapport masse ou volume prédéterminé d’aliments, ou sur une
superficie de surface alimentaire
3.8
détection des norovirus
détection de l’ARN du norovirus dans un rapport masse ou volume prédéterminé d’aliments, ou sur une
superficie de surface alimentaire
3.9
virus témoin de processus
virus ajouté à la prise d’échantillon, à la première occasion précédant l’extraction du virus, afin de
contrôler le rendement de l’extraction
3.10
ARN viral témoin de processus
ARN libéré par le virus témoin de processus permettant d’obtenir des données pour établir une courbe
étalon en vue de l’estimation du rendement de l’extraction
3.11
témoin négatif d’extraction d’ARN
témoin sans ARN cible soumis à toutes les étapes du mode opératoire d’extraction d’ARN et de détection
permettant de s’assurer de l’absence de contamination croisée
3.12
témoin négatif de processus
échantillon de la matrice d’aliment sans agent pathogène cible soumis à toutes les étapes du
processus d’analyse
3.13
sonde d’hydrolyse
sonde fluorescente couplée à deux molécules fluorescentes qui sont séparées de façon stérique par
l’activité d’exonucléase en 5’-3’ de l’enzyme pendant le processus d’amplification
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3.14
témoin négatif de RT-PCR
aliquote d’eau très pure utilisée à la place de l’ADN initial dans une réaction RT-PCR en temps réel
permettant de s’assurer de la non-contamination des réactifs de RT-PCR en temps réel
3.15
témoin externe d’ARN
ARN de référence pouvant servir de cible pour une réaction PCR en temps réel appropriée, par exemple
un ARN synthétisé par une transcription in vitro à partir d’un plasmide portant une copie du gêne cible,
qui est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon selon une quantité donnée servant de témoin pour
l’amplification d’une réaction distincte
3.16
valeur C
q
cycle de quantification, cycle de réaction PCR durant lequel la cible est quantifiée au cours d’une réaction
donnée de PCR en temps réel
NOTE Cela correspond au point auquel la réaction de fluorescence dépasse un niveau seuil.
3.17
limite de détection théorique
LDDt
niveau qui constitue la plus petite quantité de cible pouvant, en théorie, être détectée
NOTE Cela correspond à une copie d’un génome par unité de volume d’ARN cible soumis à essai mais qui varie
en fonction de la matrice d’essai et de la quantité de matière disponible au départ.
3.18
limite de détection pratique
LDDp
plus petite concentration de cible dans un échantillon essai qui peut être détectée de façon reproductible
(intervalle de confiance de 95 %) dans les conditions expérimentales spécifiées dans la méthode, vérifiée
par un essai de reproductibilité interlaboratoires ou une autre validation
NOTE La LDDp dépend de la prise d’essai, de la qualité ou de la quantité d’ARN initial et de la LDDt de la méthode.
4 Principe
4.1 Extraction de virus
Les aliments et les surfaces alimentaires couverts par la présente partie de l’ISO/TS 15216 sont souvent
des matrices hautement complexes et les virus cibles peuvent être présents à de petites concentrations.
Il est donc nécessaire d’effectuer une extraction et/ou une concentration du virus propre à la matrice
afin de produire un substrat pour les parties communes ultérieures du processus. Le choix de la méthode
dépend de la matrice.
4.2 Extraction d’ARN
Il est nécessaire d’extraire l’ARN en utilisant une méthode qui permette d’obtenir des préparations
d’ARN pures afin de réduire les effets des inhibiteurs de PCR. Dans la présente partie de l’ISO/TS 15216,
le thiocyanate de guanidine, réactif chaotropique, est utilisé pour la dislocation de la capside du virus.
L’ARN est ensuite adsorbé sur silice afin de faciliter la purification à travers plusieurs étapes de lavage.
L’ARN viral purifié est libéré de la silice dans un tampon avant la réaction RT-PCR en temps réel.
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4.3 Transcription inverse suivie d’une réaction de polymérisation en chaîne en temps
réel (RT-PCR en temps réel)
La présente Spécification technique se base sur la réaction RT-PCR en temps réel en une étape utilisant
des sondes d’hydrolyse. Dans la technique RT-PCR en temps réel en une étape, la transcription inverse et
l’amplification par PCR sont effectuées consécutivement dans le même tube.
La réaction PCR en temps réel utilisant des sondes d’hydrolyse emploie une sonde d’ADN courte marquée
par une molécule fluorescente à une extrémité et un quencher fluorescent à l’extrémité opposée. La
chimie de cette réaction PCR garantit qu’à mesure que la quantité de produit amplifié augmente, la
sonde d’ADN est coupée et le signal fluorescent provenant du marqueur augmente proportionnellement.
En raison des faibles concentrations de virus dans les aliments et de la diversité des souches dans les virus
ciblés, il est important de sélectionner de façon adéquate des réactifs pour RT-PCR en temps réel en une
étape, des amorces PCR et des sondes d’hydrolyse pour les virus ciblés. Pour cela, des recommandations
sont données en 5.2.17 et en 5.2.18. Des exemples détaillés de réactifs, d’amorces et de sondes (utilisés
lors de l’élaboration de la présente partie de l’ISO/TS 15216) sont fournis dans les Annexe D et E.
4.4 Témoins
4.4.1 Virus témoin de processus
Des pertes de virus témoins peuvent se produire à différentes étapes lors de l’extraction de virus dans
l’échantillon et de l’extraction de l’ARN. Afin de contrôler ces pertes, les échantillons sont contaminés
artificiellement avant le processus avec une quantité définie de virus témoin de processus. Le niveau de
récupération du virus témoin de processus doit être déterminé pour chaque échantillon.
Le virus sélectionné en tant que témoin de processus doit être un virus cultivable, sans enveloppe, à
ARNsb (simple brin) de polarité positive, de taille similaire aux virus cibles afin de fournir un modèle
morphologique et physico-chimique correct. Le virus témoin de processus doit montrer une persistance
dans l’environnement semblable aux virus cibles. Le virus doit être suffisamment différent sur le plan
génétique par rapport aux virus cibles afin de ne pas avoir de réactions PCR croisées entre virus cibles
et virus témoins, et sa présence dans les aliments à l’état naturel ne doit normalement pas être attendue.
Un exemple de préparation du virus témoin de processus (utilisé lors de l’élaboration de la présente
partie de l’ISO/TS 15216) est fourni à l’Annexe G.
4.4.2 ARN témoin positif externe (TE)
Des substances inhibitrices de la réaction RT-PCR sont contenues dans de nombreux aliments, mais
peuvent également provenir d’une contamination due à un traitement effectué en amont. Afin de vérifier
l’éventuelle inhibition de la RT PCR dans un échantillon individuel, un ARN témoin positif externe (une
espèce à ARN portant la séquence cible d’intérêt, 5.3.8) est ajouté à une aliquote d’ARN de l’échantillon
et soumis à essai en utilisant la méthode RT-PCR. Une comparaison des résultats de cet essai avec les
résultats d’un ARN témoin positif externe en l’absence d’ARN de l’échantillon permet la détermination
du niveau d’inhibition de la réaction RT-PCR dans chaque échantillon soumis à essai. De plus, dans cette
méthode, l’ARN témoin positif externe agit comme un témoin positif de la réaction RT-PCR.
Il est permis d’appliquer des approches différentes pour le contrôle de l’inhibition de la réaction RT-PCR
sous réserve de faire la démonstration de l’équivalence de leurs performances par rapport à celles de la
méthode utilisant l’ARN témoin externe.
4.5 Résultats des essais
En ce qui concerne les surfaces alimentaires, cette méthode fournit un résultat exprimé par «génome de
virus détecté» ou par «génome de virus non détecté», pour les autres types d’échantillons, les résultats
sont exprimés par «génome de virus détecté» ou par «génome de virus non détecté» suivi de «dans x ml»
ou «dans x g», où x est la quantité d’échantillon soumis à essai.
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5 Réactifs
5.1 Généralités
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
[10]
En ce qui concerne les pratiques de laboratoires en vigueur, voir l’ISO 7218 .
5.2 Réactifs utilisés dans l’état
5.2.1 Eau de qualité biologie moléculaire.
5.2.2 Polyéthylène glycol (PEG), de masse moléculaire relative moyenne 8 000.
5.2.3 Chlorure de sodium (NaCl).
5.2.4 Chlorure de potassium (KCl).
5.2.5 Hydrogénophosphate de sodium (Na HPO ).
2 4
5.2.6 Dihydrogénophosphate de potassium (KH PO ).
2 4
5.2.7 Tris base.
5.2.8 Glycine.
5.2.9 Extrait de viande de bœuf en poudre.
5.2.10 Protéinase K (30 U/mg).
5.2.11 Pectinase.
5.2.12 Chloroforme.
5.2.13 Butanol.
5.2.14 Hydroxyde de sodium (NaOH).
5.2.15 Acide chlorhydrique (HCl).
5.2.16 Silice, tampons de lyse, de lavage et d’élution pour l’extraction de l’ARN viral. Les réactifs
doivent permettre d’obtenir 500 μl de virus extrait, par réaction de lyse dans un tampon chaotropique
contenant du thiocyanate de guanidine (Référence [1]) et en utilisant la silice comme matrice liant l’ARN.
Après traitement de l’ARN lié à la silice par un ou des tampons de lavage éliminant les impuretés, l’ARN
doit être élué dans 100 µl de tampon d’élution.
La préparation d’ARN doit être d’une qualité et d’une concentration adaptée aux fins prévues. Voir
l’Annexe C pour les détails d’un exemple de réactifs d’extraction d’ARN (utilisés lors de l’élaboration de
la méthode décrite dans la présente partie de l’ISO/TS 15216).
5.2.17 Réactifs pour la réaction RT-PCR en temps réel en une étape. Les réactifs doivent permettre
le traitement de 5 µl d’ARN dans un volume total de 25 µl. Ils doivent être adaptés à la réaction de RT-
PCR en une étape en utilisant des sondes d’hydrolyses (l’ADN polymérase utilisée doit posséder une
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activité exonucléasique en 5’-3’) et ils doivent présenter une sensibilité suffisante pour la détection de
concentrations d’ARN viraux, habituellement rencontrées dans les aliments contaminés en virus. Voir
l’Annexe E pour les détails d’un e
...
Questions, Comments and Discussion
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