Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity

ISO 30024:2009 specifies the determination of phytase activity in feed samples. The method does not distinguish between phytase added as a feed additive and endogenous phytase already present in the feed materials. The method cannot be used to evaluate or compare the in vivo efficacy of the phytase product. It is not a predictive method of the in vivo efficacy of phytases present on the market as they can develop different in vivo efficacy per unit of activity. The method is suitable and validated exclusively for the determination of phytase activity and exclusively in complete feeds.

Aliments des animaux — Détermination de l'activité phytasique

L'ISO 30024:2009 spécifie la détermination de l'activité phytasique dans des échantillons d'aliments pour animaux. Le méthode ne fait pas la distinction entre la phytase ajoutée comme additif aux aliments pour animaux et la phytase endogène déjà présente dans les matières premières entrant dans la composition des aliments. La méthode ne peut pas être utilisée pour évaluer ou comparer l'efficacité in vivo des phytases. Il ne s'agit pas d'une méthode prédictive de l'efficacité in vivo des phytases disponibles sur le marché car celles-ci peuvent développer une efficacité in vivo différente par unité d'activité. La méthode est adaptée et validée exclusivement pour la détermination de l'activité phytasique dans les aliments complets pour animaux.

General Information

Status
Published
Publication Date
01-Jul-2009
Current Stage
9092 - International Standard to be revised
Start Date
08-Mar-2020
Completion Date
08-Mar-2020
Ref Project

RELATIONS

Buy Standard

Standard
ISO 30024:2009 - Animal feeding stuffs -- Determination of phytase activity
English language
12 pages
sale 15% off
Preview
sale 15% off
Preview
Standard
ISO 30024:2009 - Aliments des animaux -- Détermination de l'activité phytasique
French language
13 pages
sale 15% off
Preview
sale 15% off
Preview

Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 30024
First edition
2009-07-15
Animal feeding stuffs — Determination of
phytase activity
Aliments des animaux — Détermination de l'activité phytasique
Reference number
ISO 30024:2009(E)
ISO 2009
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 30024:2009(E)
PDF disclaimer

This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but

shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In

downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. The ISO Central Secretariat

accepts no liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.

Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation

parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies. In

the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the Central Secretariat at the address given below.

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2009

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,

electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO at the address below or

ISO's member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Published in Switzerland
ii © ISO 2009 – All rights reserved
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 30024:2009(E)
Contents Page

Foreword............................................................................................................................................................ iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Scope ..................................................................................................................................................... 1

2 Terms and definitions........................................................................................................................... 1

3 Principle................................................................................................................................................. 1

4 Reagents................................................................................................................................................ 2

5 Apparatus .............................................................................................................................................. 3

6 Sampling................................................................................................................................................ 4

7 Sample preparation .............................................................................................................................. 4

8 Procedure .............................................................................................................................................. 4

8.1 Blank solutions ..................................................................................................................................... 4

8.2 Standards .............................................................................................................................................. 4

8.3 Standard curve...................................................................................................................................... 5

8.4 Phytase level control............................................................................................................................ 5

8.5 Feed test portions................................................................................................................................. 6

9 Calculations........................................................................................................................................... 7

9.1 Formulation standard curve ................................................................................................................ 7

9.2 Calculation phytase activity ................................................................................................................ 8

9.3 Correction for phytic acid purity and water content ......................................................................... 9

9.4 Interference with blank values ............................................................................................................ 9

10 Precision................................................................................................................................................ 9

10.1 Limit of detection and limit of quantification..................................................................................... 9

10.2 Interlaboratory test ............................................................................................................................. 10

10.3 Repeatability........................................................................................................................................ 10

10.4 Reproducibility.................................................................................................................................... 10

11 Test report ........................................................................................................................................... 10

Annex A (informative) Interlaboratory study results .................................................................................... 11

Bibliography ..................................................................................................................................................... 12

© ISO 2009 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 30024:2009(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies

(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO

technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been

established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and

non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the

International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.

International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.

The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards

adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an

International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent

rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.

ISO 30024 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee

CEN/TC 327, Animal feeding stuffs — Methods of sampling and analysis, in collaboration with Technical

Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal feeding stuffs, in accordance with the

Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
iv © ISO 2009 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 30024:2009(E)
Introduction

This International Standard has been developed to quantify phytase products in feed samples to enable the

European Commission to control the phytase content of animal feed products. However, the method cannot

be used to evaluate the in vivo efficacy of the phytase products.
© ISO 2009 – All rights reserved v
---------------------- Page: 5 ----------------------
INTERNATIONAL STANDARD ISO 30024:2009(E)
Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
1 Scope

This International Standard specifies the determination of phytase activity in feed samples.

The method does not distinguish between phytase added as a feed additive and endogenous phytase already

present in the feed materials.

The method cannot be used to evaluate or compare the in vivo efficacy of the phytase product. It is not a

predictive method of the in vivo efficacy of phytases present on the market as they can develop different

in vivo efficacy per unit of activity.

The method is suitable and validated exclusively for the determination of phytase activity and exclusively in

complete feeds.

NOTE The harmonized method was developed on the basis of the presently existing phytase products

[E1600 (EC 3.1.3.8, 3-phytase), E1614 (EC 3.1.3.26, 4-phytase), and E1640 (EC 3.1.3.26, 4-phytase)]. Therefore, it might

not necessarily be suitable as such for phytase products that are developed in the future. The harmonized method is thus

a tool which is useful only to evaluate the total phytase activity in feed samples.

2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
phytase unit

amount of enzyme that releases 1 µmol of inorganic phosphate from phytate per minute under the reaction

conditions specified in this International Standard
3 Principle

Phytase releases phosphate from the substrate myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The released

inorganic phosphate is determined by forming a yellow complex with an acidic molybdate/vanadate reagent.

The optical density (OD) of the yellow complex is measured at a wavelength of 415 nm and the inorganic

phosphate released is quantified from a phosphate standard calibration curve.
© ISO 2009 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 30024:2009(E)
4 Reagents

During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled or

demineralized water or water of equivalent purity.

WARNING — This method requires the handling of hazardous substances. Observe local regulations

for potentially hazardous chemicals to minimize risks to organizational, technical, and personal safety.

4.1 Ammonia solution, 25 % mass fraction; NH .
4.2 Ammonium heptamolybdate tetrahydrate, (NH ) Mo O ⋅4H O.
4 6 7 24 2
4.3 Ammonium monovanadate, NH VO .
4 3
4.4 Hydrochloric acid, 25 % mass fraction; HCl.
4.5 Nitric acid, 65 % mass fraction; HNO .
4.6 Potassium dihydrogenphosphate, KH PO .
2 4

4.7 Phytate, phytic acid, dodecasodium salt, C H Na O P⋅xH O, from rice, Sigma® P0109 .

6 6 12 24 6 2
4.8 Sodium acetate trihydrate, CH COONa⋅3H O.
3 2
4.9 Polysorbate 20 .

4.10 Dilute nitric acid. Dilute 1 volume nitric acid 65 % mass fraction (4.5) with 2 volumes water. Store at

room temperature. The maximum storage time is indefinite.

4.11 Ammonium heptamolybdate reagent. Dissolve 100,0 g ammonium heptamolybdate tetrahydrate (4.2)

in approximately 800 ml water. Add 10 ml 25 % mass fraction ammonia solution (4.1) and make up with water

to 1 000 ml. Store at room temperature in the dark. The maximum storage time is 2 months.

4.12 Ammonium vanadate reagent. Dissolve completely 2,35 g of ammonium monovanadate (4.3) in

approximately 400 ml water (50 °C to 60 °C). Add 20 ml dilute nitric acid (4.10) and make up with water to

1 000 ml. Store at room temperature in the dark. The maximum storage time is 2 months.

4.13 Molybdate/vanadate STOP reagent. Mix 1 volume ammonium vanadate reagent (4.12) with 1 volume

ammonium heptamolybdate reagent (4.11) and add 2 volumes dilute nitric acid (4.10). Mix and store at room

temperature. The maximum storage time is 1 day.

4.14 Polysorbate 20, 10 % mass fraction. Dissolve 10,0 g of polysorbate 20 (4.9) with water and make up

to 100 ml. Store at room temperature. The maximum storage time is 6 months.

4.15 Acetate buffer, pH 5,5; 0,25 mol/l. Dissolve 34,0 g of sodium acetate trihydrate (4.8) in approximately

900 ml water. Adjust the pH with 25 % mass fraction hydrochloric acid (4.4) to 5,50 ± 0,02 and make up to

1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is 2 weeks.

4.16 Acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20, pH 5,5; 0,25 mol/l. Dissolve 34,0 g of

sodium acetate trihydrate (4.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 % mass fraction

hydrochloric acid (4.4) to 5,50 ± 0,02. Add 1 ml 10 % mass fraction polysorbate 20 (4.14) and make up to

1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is 2 weeks.

1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this

International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

2) Tween 20 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of

users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.

2 © ISO 2009 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 30024:2009(E)

4.17 Acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20, pH 5,5; 0,50 mol/l. Dissolve 68,0 g of

sodium acetate trihydrate (4.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 % mass fraction

hydrochloric acid (4.4) to 5,50 ± 0,02. Add 1 ml 10 % mass fraction polysorbate 20 (4.14) and make up to

1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is 2 weeks.

4.18 Phytate substrate solution, 7,5 mmol/l (5 mmol/l end-concentration in the reaction). Dissolve 2,00 g of

dodecasodium phytate (4.7) whose inorganic phosphorus content is u 0,1 % mass fraction (see 9.3) in

approximately 200 ml acetate buffer (4.15). Adjust the pH with 25 % mass fraction hydrochloric acid (4.4) to

5,50 ± 0,02 and make up with acetate buffer (4.15) to 250 ml. The maximum storage time is 2 weeks at 4 °C.

4.19 Phosphate stock standard solution, 50 mmol/l. Dry approximately 10 g of potassium

dihydrogenphosphate (4.6) at 105 °C for 2 h and store it in a dessicator. Weigh approximately 682 mg of dried

potassium dihydrogenphosphate, transfer it quantitatively to a 100 ml volumetric flask and make up to 100 ml

with 0,25 mol/l acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20 (4.16). Calculate the exact

concentration of the phosphate stock standard solution. Store at room temperature. The maximum storage

time is 2 weeks.

4.20 Phytase stock standard solution. Weigh 100,0 mg to 300,0 mg of a certified phytase standard,

transfer it quantitatively to a 100 ml volumetric flask and dissolve it in 100 ml 0,25 mol/l acetate buffer with

0,01 % mass fraction polysorbate 20 (4.16). Stir it for 15 min to 45 min. Store at room temperature. The

maximum storage time is 1 day.
5 Apparatus
Usual laboratory apparatus, in particular, the following.
5.1 Water bath, thermostatically controlled (with inserts for 2 ml tubes).
5.2 pH-meter, capable of being read to at least two places of decimals.
5.3 Magnetic stirrers (W 20 W power).
5.4 Egg-shaped stirring bars (40 mm × 20 mm).
5.5 Analytical balance, capable of being read to at least 0,1 mg.
5.6 Balance, capable of being read to at least 0,01 g.
5.7 Vortex mixer.
5.8 Centrifuge for microcentrifuge tubes (5.12), capable of 11 000g to 20 000g.
5.9 Electronic dispenser.
5.10 Pipettes (electronic and manual), in the range 10 µl to 2 000 µl.
5.11 Spectrophotometer double beam or microplate reader.
5.12 Microcentrifuge tubes, capacity 2 ml.
© ISO 2009 – All rights reserved 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 30024:2009(E)
6 Sampling

A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or

changed during transport or storage.

Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling

[1]
procedure is given in ISO 6497 .
7 Sample preparation
Perform two weighings for each sample.

Weigh two portions of pellets or mash, of about 50 g each, into 500 ml conical flasks. Add 500 ml water and

0,5 ml of 10 % mass fraction polysorbate 20 (4.14) to the feed and mix vigorously for 45

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 30024
Première édition
2009-07-15
Aliments des animaux — Détermination
de l'activité phytasique
Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
Numéro de référence
ISO 30024:2009(F)
ISO 2009
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 30024:2009(F)
PDF – Exonération de responsabilité

Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier

peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence

autorisant l'utilisation de ces polices et que celles-ci y soient installées. Lors du téléchargement de ce fichier, les parties concernées

acceptent de fait la responsabilité de ne pas enfreindre les conditions de licence d'Adobe. Le Secrétariat central de l'ISO décline toute

responsabilité en la matière.
Adobe est une marque déposée d'Adobe Systems Incorporated.

Les détails relatifs aux produits logiciels utilisés pour la création du présent fichier PDF sont disponibles dans la rubrique General Info

du fichier; les paramètres de création PDF ont été optimisés pour l'impression. Toutes les mesures ont été prises pour garantir

l'exploitation de ce fichier par les comités membres de l'ISO. Dans le cas peu probable où surviendrait un problème d'utilisation,

veuillez en informer le Secrétariat central à l'adresse donnée ci-dessous.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2009

Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée sous

quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit

de l'ISO à l'adresse ci-après ou du comité membre de l'ISO dans le pays du demandeur.

ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Publié en Suisse
ii © ISO 2009 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 30024:2009(F)
Sommaire Page

Avant-propos..................................................................................................................................................... iv

Introduction ........................................................................................................................................................ v

1 Domaine d'application.......................................................................................................................... 1

2 Termes et définitions............................................................................................................................ 1

3 Principe.................................................................................................................................................. 1

4 Réactifs .................................................................................................................................................. 2

5 Appareillage .......................................................................................................................................... 3

6 Échantillonnage .................................................................................................................................... 4

7 Préparation de l'échantillon................................................................................................................. 4

8 Mode opératoire .................................................................................................................................... 4

8.1 Solutions à blanc .................................................................................................................................. 4

8.2 Étalons ................................................................................................................................................... 4

8.3 Courbe d'étalonnage ............................................................................................................................ 5

8.4 Témoin de niveau d'activité phytasique............................................................................................. 6

8.5 Prises d'essai d'aliments pour animaux............................................................................................. 6

9 Calculs ................................................................................................................................................... 7

9.1 Formule de la courbe d'étalonnage .................................................................................................... 7

9.2 Calcul de l'activité phytasique............................................................................................................. 8

9.3 Correction relative à la pureté et à la teneur en eau de l'acide phytique........................................ 9

9.4 Interférence avec les valeurs de blanc............................................................................................. 10

10 Fidélité ................................................................................................................................................. 10

10.1 Limite de détection et limite de quantification ................................................................................ 10

10.2 Essai interlaboratoires ....................................................................................................................... 10

10.3 Répétabilité.......................................................................................................................................... 10

10.4 Reproductibilité................................................................................................................................... 10

11 Rapport d'essai ................................................................................................................................... 11

Annexe A (informative) Résultats de l'étude interlaboratoires.................................................................... 12

Bibliographie .................................................................................................................................................... 13

© ISO 2009 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 30024:2009(F)
Avant-propos

L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de

normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée

aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du

comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non

gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec

la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.

Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,

Partie 2.

La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes

internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur

publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres

votants.

L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne

pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.

L'ISO 30024 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 327, Aliments des animaux — Méthodes

d'échantillonnage et d'analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité

technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10, Aliments des animaux, conformément à

l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2009 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 30024:2009(F)
Introduction

La présente Norme internationale a été élaborée en vue de quantifier les préparations commerciales de

phytases incorporées dans les échantillons d'aliments pour animaux afin de permettre à la Commission

européenne de contrôler la teneur en phytase des produits d'alimentation animale. Toutefois, la méthode ne

peut pas être utilisée pour évaluer l'efficacité in vivo des phytases.
© ISO 2009 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 30024:2009(F)
Aliments des animaux — Détermination de l'activité phytasique
1 Domaine d'application

La présente Norme internationale spécifie la détermination de l'activité phytasique dans des échantillons

d'aliments pour animaux.

Le méthode ne fait pas la distinction entre la phytase ajoutée comme additif aux aliments pour animaux et la

phytase endogène déjà présente dans les matières premières entrant dans la composition des aliments.

La méthode ne peut pas être utilisée pour évaluer ou comparer l'efficacité in vivo des phytases. Il ne s'agit pas

d'une méthode prédictive de l'efficacité in vivo des phytases disponibles sur le marché car celles-ci peuvent

développer une efficacité in vivo différente par unité d'activité.

La méthode est adaptée et validée exclusivement pour la détermination de l'activité phytasique dans les

aliments complets pour animaux.

NOTE La méthode harmonisée a été mise au point sur la base des phytases actuellement disponibles

[E1600 (EC 3.1.3.8, 3-phytase), E1614 (EC 3.1.3.26, 4-phytase), et E1640 (EC 3.1.3.26, 4-phytase)]. Par conséquent, elle

peut ne pas être nécessairement appropriée en tant que telle pour les phytases développées à l'avenir. La méthode

harmonisée constitue ainsi un outil qui sert uniquement à évaluer l'activité phytasique totale dans les échantillons

d'aliments pour animaux.
2 Termes et définitions

Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.

2.1
unité de phytase

quantité d'enzyme qui libère 1 µmol de phosphate inorganique par minute à partir de phytate dans les

conditions de réaction spécifiées dans la présente Norme internationale
3 Principe

La phytase libère du phosphate à partir du substrat hexakisphosphate de myo-inositol (phytate). Le phosphate

inorganique libéré est révélé en formant un complexe jaune avec un réactif acide vanado-molybdique. La

densité optique du complexe jaune est mesurée à une longueur d'onde de 415 nm et le phosphate

inorganique libéré est quantifié à l'aide d'une courbe d'étalonnage de phosphate.

© ISO 2009 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 30024:2009(F)
4 Réactifs

Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique

reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.

AVERTISSEMENT — Cette méthode nécessite la manipulation de substances dangereuses. Respecter

les réglementations locales traitant de la manipulation des substances potentiellement dangereuses

afin de minimiser les risques sur le plan technique, organisationnel et de la sécurité du personnel.

4.1 Ammoniaque, solution à 25 % (fraction massique); NH .
4.2 Heptamolybdate d'ammonium tétrahydraté, (NH ) Mo O , 4H O.
4 6 7 24 2
4.3 Monovanadate d'ammonium, NH VO .
4 3
4.4 Acide chlorhydrique, 25 % (fraction massique); HCl.
4.5 Acide nitrique, 65 % (fraction massique); HNO .
4.6 Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO .
2 4

4.7 Phytate, acide phytique, hydrate de dodécasodium, C H Na O P , xH O, de riz, Sigma® P0109 .

6 6 12 24 6 2
4.8 Acétate de sodium trihydraté, CH COONa, 3H O.
3 2
4.9 Polysorbate 20 .

4.10 Acide nitrique dilué. Diluer 1 volume d'acide nitrique à 65 % en fraction massique (4.5) avec

2 volumes d'eau. Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est illimitée.

4.11 Solution d'heptamolybdate d'ammonium. Dissoudre 100,0 g d'heptamolybdate d'ammonium

tétrahydraté (4.2) dans environ 800 ml d'eau. Ajouter 10 ml de solution d'ammoniaque à 25 % en fraction

massique (4.1) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante à l'abri de la lumière.

La durée de conservation maximale est de 2 mois.

4.12 Solution de vanadate d'ammonium. Dissoudre entièrement 2,35 g de monovanadate d'ammonium

(4.3) dans environ 400 ml d'eau (50 °C à 60 °C). Ajouter 20 ml d'acide nitrique dilué (4.10) et compléter à

1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante à l'abri de la lumière. La durée de conservation

maximale est de 2 mois.

4.13 Réactif d'arrêt vanado-molybdique. Mélanger 1 volume de solution de vanadate d'ammonium (4.12)

avec 1 volume de solution d'heptamolybdate d'ammonium (4.11) et ajouter 2 volumes d'acide nitrique

dilué (4.10). Mélanger et conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de une

journée.

4.14 Polysorbate 20, 10 % (fraction massique). Dissoudre 10,0 g de polysorbate 20 (4.9) avec de l'eau et

compléter à 100 ml. Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de 6 mois.

1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de

la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit

ainsi désigné.

2) Tween 20 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention

des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi

exclusif du produit ainsi désigné.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 30024:2009(F)

4.15 Tampon acétate, pH 5,5; 0,25 mol/l. Dissoudre 34,0 g d'acétate de sodium trihydraté (4.8) dans

environ 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02 avec de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique

et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante. La durée de conservation

maximale est de 2 semaines.

4.16 Tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique, pH 5,5; 0,25 mol/l.

Dissoudre 34,0 g d'acétate de sodium trihydraté (4.8) dans environ 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02

avec de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (4.4). Ajouter 1 ml de polysorbate 20 à 10 % en

fraction massique (4.14) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante. La durée

de conservation maximale est de 2 semaines.

4.17 Tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique, pH 5,5; 0,50 mol/l.

Dissoudre 68,0 g d'acétate de sodium trihydraté (4.8) dans environ 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02

avec de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (4.4). Ajouter 1 ml de polysorbate 20 à 10 % en

fraction massique (4.14) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante. La durée

de conservation maximale est de 2 semaines.

4.18 Solution de substrat de phytate, 7,5 mmol/l (concentration finale 5 mmol/l dans la réaction).

Dissoudre 2,00 g de phytate de dodécasodium (4.7) avec une teneur en phosphore inorganique u 0,1 % en

fraction massique (voir 9.3) dans environ 200 ml de tampon acétate (4.15). Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02 avec

de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (4.4) et compléter à 250 ml avec du tampon acétate

(4.15). La durée de conservation maximale est de 2 semaines à 4 °C.

4.19 Solution mère étalon de phosphate, 50 mmol/l. Sécher environ 10 g de dihydrogénophosphate de

potassium (4.6) à 105 °C pendant 2 h et les conserver dans un dessiccateur. Peser environ 682 mg de

dihydrogénophosphate de potassium séché, les transférer dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter à

100 ml avec le tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l

(4.16). Calculer la concentration exacte de la solution mère étalon de phosphate. Conserver à température

ambiante. La durée de conservation maximale est de 2 semaines.

4.20 Solution mère de phytase de référence. Peser 100,0 mg à 300,0 mg de phytase de référence

d'activité certifiée, les transférer dans une fiole jaugée de 100 ml et les dissoudre dans 100 ml de tampon

acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (4.16). Agiter pendant

15 min à 45 min. Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de une journée.

5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Bain marie, thermorégulé (muni d'inserts pour des tubes de 2 ml).
5.2 pH-mètre, pouvant être lu jusqu'à au moins deux décimales.
5.3 Agitateurs magnétiques (puissance W 20 W).
5.4 Barreaux d'agitateur de forme ovale (40 mm × 20 mm).
5.5 Balance analytique, avec une précision de lecture d'au moins 0,1 mg.
5.6 Balance, avec une précision de lecture d'au moins 0,01 g.
5.7 Agitateur Vortex.

5.8 Centrifugeuse, pour microtubes à centrifuger (5.12), capable d'une accélération de 11 000g à 20 000g.

5.9 Distributeur électronique.
5.10 Pipettes (électroniques et manuelles), de capacité 10 µl à 2 000 µl.
© ISO 2009 – Tous droits réservés 3
---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 30024:2009(F)
5.11 Spectrophotomètre, double faisceau ou lecteur de microplaque.
5.12 Microtubes à centrifuger, de capacité 2 ml.
6 Échantillonnage

Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu'il n'ait été ni endommagé

ni modifié au cours du transport ou du stockage.

L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une

[1]
méthode d'échantillonnage recommandée figure dans l'ISO 6497 .
7 Préparation de l'échantillon
Effectuer deux pesées pour chaque échantillon.

Peser deux portions sous forme granulée ou non granulée (mash), chacune de 50 g environ, dans des fioles

coniques de 500 ml. Ajouter 500 ml d'eau et 0,5 ml de polysorbate 20 à 10 % en fraction massique (4.14) aux

aliments pour animaux et mélanger vigoureusement sur un agitateur magnétique (5.3) pendant 45 min avec

des barreaux d'agitateur de forme ovale (5.4). Transférer 2 ml de l'extrait d'aliment dans un microtube à

centrifuger (5.12) et centrifuger (5.8) pendant 3 min à une accélération de 11 000g à 20 000g.

L'hétérogénéité de l'échantillon peut conduire à des coefficients de variation (CV) élevés. En ce qui concerne

les échantillons d'aliments pour animaux présentant des CV > 15 %, une telle hétérogénéité peut provenir

d'une granulométrie non homogène des produits ou d'une préparation non homogène des aliments pour

animaux. Si les échantillons d'aliments présentent des CV élevés, broyer les échantillons d'aliments pour

animaux au moyen d'un broy
...

Questions, Comments and Discussion

Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.