ISO 30024:2009

Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity

ISO 30024:2009 specifies the determination of phytase activity in feed samples. The method does not distinguish between phytase added as a feed additive and endogenous phytase already present in the feed materials. The method cannot be used to evaluate or compare the in vivo efficacy of the phytase product. It is not a predictive method of the in vivo efficacy of phytases present on the market as they can develop different in vivo efficacy per unit of activity. The method is suitable and validated exclusively for the determination of phytase activity and exclusively in complete feeds.

Aliments des animaux — Détermination de l'activité phytasique

L'ISO 30024:2009 spécifie la détermination de l'activité phytasique dans des échantillons d'aliments pour animaux. Le méthode ne fait pas la distinction entre la phytase ajoutée comme additif aux aliments pour animaux et la phytase endogène déjà présente dans les matières premières entrant dans la composition des aliments. La méthode ne peut pas être utilisée pour évaluer ou comparer l'efficacité in vivo des phytases. Il ne s'agit pas d'une méthode prédictive de l'efficacité in vivo des phytases disponibles sur le marché car celles-ci peuvent développer une efficacité in vivo différente par unité d'activité. La méthode est adaptée et validée exclusivement pour la détermination de l'activité phytasique dans les aliments complets pour animaux.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 01-Jul-2009
• ICS: 65.120 - Animal feeding stuffs
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 10 - Animal feeding stuffs
• Current Stage: 9092 - International Standard to be revised
• Completion Date: 08-Mar-2020

Relations

• Consolidates: ISO/IEC 8613-7:1994/Amd 1:1998 - Information technology — Open Document Architecture (ODA) and Interchange Format: Raster graphics content architectures — Part 7: — Amendment 1
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 30024
First edition
2009-07-15


Animal feeding stuffs — Determination of
phytase activity
Aliments des animaux — Détermination de l'activité phytasique





Reference number
ISO 30024:2009(E)
©
ISO 2009

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ISO 30024:2009(E)
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Published in Switzerland

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ISO 30024:2009(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Terms and definitions. 1
3 Principle. 1
4 Reagents. 2
5 Apparatus . 3
6 Sampling. 4
7 Sample preparation . 4
8 Procedure . 4
8.1 Blank solutions . 4
8.2 Standards . 4
8.3 Standard curve. 5
8.4 Phytase level control. 5
8.5 Feed test portions. 6
9 Calculations. 7
9.1 Formulation standard curve . 7
9.2 Calculation phytase activity . 8
9.3 Correction for phytic acid purity and water content . 9
9.4 Interference with blank values . 9
10 Precision. 9
10.1 Limit of detection and limit of quantification. 9
10.2 Interlaboratory test . 10
10.3 Repeatability. 10
10.4 Reproducibility. 10
11 Test report . 10
Annex A (informative) Interlaboratory study results . 11
Bibliography . 12

© ISO 2009 – All rights reserved iii

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ISO 30024:2009(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 30024 was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 327, Animal feeding stuffs — Methods of sampling and analysis, in collaboration with Technical
Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 10, Animal feeding stuffs, in accordance with the
Agreement on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
iv © ISO 2009 – All rights reserved

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ISO 30024:2009(E)
Introduction
This International Standard has been developed to quantify phytase products in feed samples to enable the
European Commission to control the phytase content of animal feed products. However, the method cannot
be used to evaluate the in vivo efficacy of the phytase products.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 30024:2009(E)

Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity
1 Scope
This International Standard specifies the determination of phytase activity in feed samples.
The method does not distinguish between phytase added as a feed additive and endogenous phytase already
present in the feed materials.
The method cannot be used to evaluate or compare the in vivo efficacy of the phytase product. It is not a
predictive method of the in vivo efficacy of phytases present on the market as they can develop different
in vivo efficacy per unit of activity.
The method is suitable and validated exclusively for the determination of phytase activity and exclusively in
complete feeds.
NOTE The harmonized method was developed on the basis of the presently existing phytase products
[E1600 (EC 3.1.3.8, 3-phytase), E1614 (EC 3.1.3.26, 4-phytase), and E1640 (EC 3.1.3.26, 4-phytase)]. Therefore, it might
not necessarily be suitable as such for phytase products that are developed in the future. The harmonized method is thus
a tool which is useful only to evaluate the total phytase activity in feed samples.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
phytase unit
U
amount of enzyme that releases 1 µmol of inorganic phosphate from phytate per minute under the reaction
conditions specified in this International Standard
3 Principle
Phytase releases phosphate from the substrate myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The released
inorganic phosphate is determined by forming a yellow complex with an acidic molybdate/vanadate reagent.
The optical density (OD) of the yellow complex is measured at a wavelength of 415 nm and the inorganic
phosphate released is quantified from a phosphate standard calibration curve.
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ISO 30024:2009(E)
4 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled or
demineralized water or water of equivalent purity.
WARNING — This method requires the handling of hazardous substances. Observe local regulations
for potentially hazardous chemicals to minimize risks to organizational, technical, and personal safety.
4.1 Ammonia solution, 25 % mass fraction; NH .
3
4.2 Ammonium heptamolybdate tetrahydrate, (NH ) Mo O ⋅4H O.
4 6 7 24 2
4.3 Ammonium monovanadate, NH VO .
4 3
4.4 Hydrochloric acid, 25 % mass fraction; HCl.
4.5 Nitric acid, 65 % mass fraction; HNO .
3
4.6 Potassium dihydrogenphosphate, KH PO .
2 4
1)
4.7 Phytate, phytic acid, dodecasodium salt, C H Na O P⋅xH O, from rice, Sigma® P0109 .
6 6 12 24 6 2
4.8 Sodium acetate trihydrate, CH COONa⋅3H O.
3 2
2)
4.9 Polysorbate 20 .
4.10 Dilute nitric acid. Dilute 1 volume nitric acid 65 % mass fraction (4.5) with 2 volumes water. Store at
room temperature. The maximum storage time is indefinite.
4.11 Ammonium heptamolybdate reagent. Dissolve 100,0 g ammonium heptamolybdate tetrahydrate (4.2)
in approximately 800 ml water. Add 10 ml 25 % mass fraction ammonia solution (4.1) and make up with water
to 1 000 ml. Store at room temperature in the dark. The maximum storage time is 2 months.
4.12 Ammonium vanadate reagent. Dissolve completely 2,35 g of ammonium monovanadate (4.3) in
approximately 400 ml water (50 °C to 60 °C). Add 20 ml dilute nitric acid (4.10) and make up with water to
1 000 ml. Store at room temperature in the dark. The maximum storage time is 2 months.
4.13 Molybdate/vanadate STOP reagent. Mix 1 volume ammonium vanadate reagent (4.12) with 1 volume
ammonium heptamolybdate reagent (4.11) and add 2 volumes dilute nitric acid (4.10). Mix and store at room
temperature. The maximum storage time is 1 day.
4.14 Polysorbate 20, 10 % mass fraction. Dissolve 10,0 g of polysorbate 20 (4.9) with water and make up
to 100 ml. Store at room temperature. The maximum storage time is 6 months.
4.15 Acetate buffer, pH 5,5; 0,25 mol/l. Dissolve 34,0 g of sodium acetate trihydrate (4.8) in approximately
900 ml water. Adjust the pH with 25 % mass fraction hydrochloric acid (4.4) to 5,50 ± 0,02 and make up to
1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is 2 weeks.
4.16 Acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20, pH 5,5; 0,25 mol/l. Dissolve 34,0 g of
sodium acetate trihydrate (4.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 % mass fraction
hydrochloric acid (4.4) to 5,50 ± 0,02. Add 1 ml 10 % mass fraction polysorbate 20 (4.14) and make up to
1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is 2 weeks.

1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this
International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
2) Tween 20 is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of
users of this International Standard and does not constitute an endorsement by ISO of this product.
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ISO 30024:2009(E)
4.17 Acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20, pH 5,5; 0,50 mol/l. Dissolve 68,0 g of
sodium acetate trihydrate (4.8) in approximately 900 ml water. Adjust the pH with 25 % mass fraction
hydrochloric acid (4.4) to 5,50 ± 0,02. Add 1 ml 10 % mass fraction polysorbate 20 (4.14) and make up to
1 000 ml with water. Store at room temperature. The maximum storage time is 2 weeks.
4.18 Phytate substrate solution, 7,5 mmol/l (5 mmol/l end-concentration in the reaction). Dissolve 2,00 g of
dodecasodium phytate (4.7) whose inorganic phosphorus content is u 0,1 % mass fraction (see 9.3) in
approximately 200 ml acetate buffer (4.15). Adjust the pH with 25 % mass fraction hydrochloric acid (4.4) to
5,50 ± 0,02 and make up with acetate buffer (4.15) to 250 ml. The maximum storage time is 2 weeks at 4 °C.
4.19 Phosphate stock standard solution, 50 mmol/l. Dry approximately 10 g of potassium
dihydrogenphosphate (4.6) at 105 °C for 2 h and store it in a dessicator. Weigh approximately 682 mg of dried
potassium dihydrogenphosphate, transfer it quantitatively to a 100 ml volumetric flask and make up to 100 ml
with 0,25 mol/l acetate buffer with 0,01 % mass fraction polysorbate 20 (4.16). Calculate the exact
concentration of the phosphate stock standard solution. Store at room temperature. The maximum storage
time is 2 weeks.
4.20 Phytase stock standard solution. Weigh 100,0 mg to 300,0 mg of a certified phytase standard,
transfer it quantitatively to a 100 ml volumetric flask and dissolve it in 100 ml 0,25 mol/l acetate buffer with
0,01 % mass fraction polysorbate 20 (4.16). Stir it for 15 min to 45 min. Store at room temperature. The
maximum storage time is 1 day.
5 Apparatus
Usual laboratory apparatus, in particular, the following.
5.1 Water bath, thermostatically controlled (with inserts for 2 ml tubes).
5.2 pH-meter, capable of being read to at least two places of decimals.
5.3 Magnetic stirrers (W 20 W power).
5.4 Egg-shaped stirring bars (40 mm × 20 mm).
5.5 Analytical balance, capable of being read to at least 0,1 mg.
5.6 Balance, capable of being read to at least 0,01 g.
5.7 Vortex mixer.
5.8 Centrifuge for microcentrifuge tubes (5.12), capable of 11 000g to 20 000g.
5.9 Electronic dispenser.
5.10 Pipettes (electronic and manual), in the range 10 µl to 2 000 µl.
5.11 Spectrophotometer double beam or microplate reader.
5.12 Microcentrifuge tubes, capacity 2 ml.
© ISO 2009 – All rights reserved 3

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ISO 30024:2009(E)
6 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling
[1]
procedure is given in ISO 6497 .
7 Sample preparation
Perform two weighings for each sample.
Weigh two portions of pellets or mash, of about 50 g each, into 500 ml conical flasks. Add 500 ml water and
0,5 ml of 10 % mass fraction polysorbate 20 (4.14) to the feed and mix vigorously for 45
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 30024
Première édition
2009-07-15



Aliments des animaux — Détermination
de l'activité phytasique
Animal feeding stuffs — Determination of phytase activity





Numéro de référence
ISO 30024:2009(F)
©
ISO 2009

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ISO 30024:2009(F)
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Publié en Suisse

ii © ISO 2009 – Tous droits réservés

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ISO 30024:2009(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application. 1
2 Termes et définitions. 1
3 Principe. 1
4 Réactifs . 2
5 Appareillage . 3
6 Échantillonnage . 4
7 Préparation de l'échantillon. 4
8 Mode opératoire . 4
8.1 Solutions à blanc . 4
8.2 Étalons . 4
8.3 Courbe d'étalonnage . 5
8.4 Témoin de niveau d'activité phytasique. 6
8.5 Prises d'essai d'aliments pour animaux. 6
9 Calculs . 7
9.1 Formule de la courbe d'étalonnage . 7
9.2 Calcul de l'activité phytasique. 8
9.3 Correction relative à la pureté et à la teneur en eau de l'acide phytique. 9
9.4 Interférence avec les valeurs de blanc. 10
10 Fidélité . 10
10.1 Limite de détection et limite de quantification . 10
10.2 Essai interlaboratoires . 10
10.3 Répétabilité. 10
10.4 Reproductibilité. 10
11 Rapport d'essai . 11
Annexe A (informative) Résultats de l'étude interlaboratoires. 12
Bibliographie . 13

© ISO 2009 – Tous droits réservés iii

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ISO 30024:2009(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 30024 a été élaborée par le comité technique CEN/TC 327, Aliments des animaux — Méthodes
d'échantillonnage et d'analyse, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 10, Aliments des animaux, conformément à
l'Accord de coopération technique entre l'ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2009 – Tous droits réservés

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ISO 30024:2009(F)
Introduction
La présente Norme internationale a été élaborée en vue de quantifier les préparations commerciales de
phytases incorporées dans les échantillons d'aliments pour animaux afin de permettre à la Commission
européenne de contrôler la teneur en phytase des produits d'alimentation animale. Toutefois, la méthode ne
peut pas être utilisée pour évaluer l'efficacité in vivo des phytases.

© ISO 2009 – Tous droits réservés v

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NORME INTERNATIONALE ISO 30024:2009(F)

Aliments des animaux — Détermination de l'activité phytasique
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie la détermination de l'activité phytasique dans des échantillons
d'aliments pour animaux.
Le méthode ne fait pas la distinction entre la phytase ajoutée comme additif aux aliments pour animaux et la
phytase endogène déjà présente dans les matières premières entrant dans la composition des aliments.
La méthode ne peut pas être utilisée pour évaluer ou comparer l'efficacité in vivo des phytases. Il ne s'agit pas
d'une méthode prédictive de l'efficacité in vivo des phytases disponibles sur le marché car celles-ci peuvent
développer une efficacité in vivo différente par unité d'activité.
La méthode est adaptée et validée exclusivement pour la détermination de l'activité phytasique dans les
aliments complets pour animaux.
NOTE La méthode harmonisée a été mise au point sur la base des phytases actuellement disponibles
[E1600 (EC 3.1.3.8, 3-phytase), E1614 (EC 3.1.3.26, 4-phytase), et E1640 (EC 3.1.3.26, 4-phytase)]. Par conséquent, elle
peut ne pas être nécessairement appropriée en tant que telle pour les phytases développées à l'avenir. La méthode
harmonisée constitue ainsi un outil qui sert uniquement à évaluer l'activité phytasique totale dans les échantillons
d'aliments pour animaux.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
unité de phytase
U
quantité d'enzyme qui libère 1 µmol de phosphate inorganique par minute à partir de phytate dans les
conditions de réaction spécifiées dans la présente Norme internationale
3 Principe
La phytase libère du phosphate à partir du substrat hexakisphosphate de myo-inositol (phytate). Le phosphate
inorganique libéré est révélé en formant un complexe jaune avec un réactif acide vanado-molybdique. La
densité optique du complexe jaune est mesurée à une longueur d'onde de 415 nm et le phosphate
inorganique libéré est quantifié à l'aide d'une courbe d'étalonnage de phosphate.
© ISO 2009 – Tous droits réservés 1

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ISO 30024:2009(F)
4 Réactifs
Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
AVERTISSEMENT — Cette méthode nécessite la manipulation de substances dangereuses. Respecter
les réglementations locales traitant de la manipulation des substances potentiellement dangereuses
afin de minimiser les risques sur le plan technique, organisationnel et de la sécurité du personnel.
4.1 Ammoniaque, solution à 25 % (fraction massique); NH .
3
4.2 Heptamolybdate d'ammonium tétrahydraté, (NH ) Mo O , 4H O.
4 6 7 24 2
4.3 Monovanadate d'ammonium, NH VO .
4 3
4.4 Acide chlorhydrique, 25 % (fraction massique); HCl.
4.5 Acide nitrique, 65 % (fraction massique); HNO .
3
4.6 Dihydrogénophosphate de potassium, KH PO .
2 4
1)
4.7 Phytate, acide phytique, hydrate de dodécasodium, C H Na O P , xH O, de riz, Sigma® P0109 .
6 6 12 24 6 2
4.8 Acétate de sodium trihydraté, CH COONa, 3H O.
3 2
2)
4.9 Polysorbate 20 .
4.10 Acide nitrique dilué. Diluer 1 volume d'acide nitrique à 65 % en fraction massique (4.5) avec
2 volumes d'eau. Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est illimitée.
4.11 Solution d'heptamolybdate d'ammonium. Dissoudre 100,0 g d'heptamolybdate d'ammonium
tétrahydraté (4.2) dans environ 800 ml d'eau. Ajouter 10 ml de solution d'ammoniaque à 25 % en fraction
massique (4.1) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante à l'abri de la lumière.
La durée de conservation maximale est de 2 mois.
4.12 Solution de vanadate d'ammonium. Dissoudre entièrement 2,35 g de monovanadate d'ammonium
(4.3) dans environ 400 ml d'eau (50 °C à 60 °C). Ajouter 20 ml d'acide nitrique dilué (4.10) et compléter à
1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante à l'abri de la lumière. La durée de conservation
maximale est de 2 mois.
4.13 Réactif d'arrêt vanado-molybdique. Mélanger 1 volume de solution de vanadate d'ammonium (4.12)
avec 1 volume de solution d'heptamolybdate d'ammonium (4.11) et ajouter 2 volumes d'acide nitrique
dilué (4.10). Mélanger et conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de une
journée.
4.14 Polysorbate 20, 10 % (fraction massique). Dissoudre 10,0 g de polysorbate 20 (4.9) avec de l'eau et
compléter à 100 ml. Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de 6 mois.

1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de
la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
2) Tween 20 est un exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention
des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie nullement que l'ISO approuve ou recommande l'emploi
exclusif du produit ainsi désigné.
2 © ISO 2009 – Tous droits réservés

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ISO 30024:2009(F)
4.15 Tampon acétate, pH 5,5; 0,25 mol/l. Dissoudre 34,0 g d'acétate de sodium trihydraté (4.8) dans
environ 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02 avec de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique
et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante. La durée de conservation
maximale est de 2 semaines.
4.16 Tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique, pH 5,5; 0,25 mol/l.
Dissoudre 34,0 g d'acétate de sodium trihydraté (4.8) dans environ 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02
avec de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (4.4). Ajouter 1 ml de polysorbate 20 à 10 % en
fraction massique (4.14) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante. La durée
de conservation maximale est de 2 semaines.
4.17 Tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique, pH 5,5; 0,50 mol/l.
Dissoudre 68,0 g d'acétate de sodium trihydraté (4.8) dans environ 900 ml d'eau. Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02
avec de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (4.4). Ajouter 1 ml de polysorbate 20 à 10 % en
fraction massique (4.14) et compléter à 1 000 ml avec de l'eau. Conserver à température ambiante. La durée
de conservation maximale est de 2 semaines.
4.18 Solution de substrat de phytate, 7,5 mmol/l (concentration finale 5 mmol/l dans la réaction).
Dissoudre 2,00 g de phytate de dodécasodium (4.7) avec une teneur en phosphore inorganique u 0,1 % en
fraction massique (voir 9.3) dans environ 200 ml de tampon acétate (4.15). Ajuster le pH à 5,50 ± 0,02 avec
de l'acide chlorhydrique à 25 % en fraction massique (4.4) et compléter à 250 ml avec du tampon acétate
(4.15). La durée de conservation maximale est de 2 semaines à 4 °C.
4.19 Solution mère étalon de phosphate, 50 mmol/l. Sécher environ 10 g de dihydrogénophosphate de
potassium (4.6) à 105 °C pendant 2 h et les conserver dans un dessiccateur. Peser environ 682 mg de
dihydrogénophosphate de potassium séché, les transférer dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter à
100 ml avec le tampon acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l
(4.16). Calculer la concentration exacte de la solution mère étalon de phosphate. Conserver à température
ambiante. La durée de conservation maximale est de 2 semaines.
4.20 Solution mère de phytase de référence. Peser 100,0 mg à 300,0 mg de phytase de référence
d'activité certifiée, les transférer dans une fiole jaugée de 100 ml et les dissoudre dans 100 ml de tampon
acétate additionné de polysorbate 20 à 0,01 % en fraction massique à 0,25 mol/l (4.16). Agiter pendant
15 min à 45 min. Conserver à température ambiante. La durée de conservation maximale est de une journée.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Bain marie, thermorégulé (muni d'inserts pour des tubes de 2 ml).
5.2 pH-mètre, pouvant être lu jusqu'à au moins deux décimales.
5.3 Agitateurs magnétiques (puissance W 20 W).
5.4 Barreaux d'agitateur de forme ovale (40 mm × 20 mm).
5.5 Balance analytique, avec une précision de lecture d'au moins 0,1 mg.
5.6 Balance, avec une précision de lecture d'au moins 0,01 g.
5.7 Agitateur Vortex.
5.8 Centrifugeuse, pour microtubes à centrifuger (5.12), capable d'une accélération de 11 000g à 20 000g.
5.9 Distributeur électronique.
5.10 Pipettes (électroniques et manuelles), de capacité 10 µl à 2 000 µl.
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ISO 30024:2009(F)
5.11 Spectrophotomètre, double faisceau ou lecteur de microplaque.
5.12 Microtubes à centrifuger, de capacité 2 ml.
6 Échantillonnage
Il convient qu'un échantillon représentatif ait été envoyé au laboratoire. Il convient qu'il n'ait été ni endommagé
ni modifié au cours du transport ou du stockage.
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale. Une
[1]
méthode d'échantillonnage recommandée figure dans l'ISO 6497 .
7 Préparation de l'échantillon
Effectuer deux pesées pour chaque échantillon.
Peser deux portions sous forme granulée ou non granulée (mash), chacune de 50 g environ, dans des fioles
coniques de 500 ml. Ajouter 500 ml d'eau et 0,5 ml de polysorbate 20 à 10 % en fraction massique (4.14) aux
aliments pour animaux et mélanger vigoureusement sur un agitateur magnétique (5.3) pendant 45 min avec
des barreaux d'agitateur de forme ovale (5.4). Transférer 2 ml de l'extrait d'aliment dans un microtube à
centrifuger (5.12) et centrifuger (5.8) pendant 3 min à une accélération de 11 000g à 20 000g.
L'hétérogénéité de l'échantillon peut conduire à des coefficients de variation (CV) élevés. En ce qui concerne
les échantillons d'aliments pour animaux présentant des CV > 15 %, une telle hétérogénéité peut provenir
d'une granulométrie non homogène des produits ou d'une préparation non homogène des aliments pour
animaux. Si les échantillons d'aliments présentent des CV élevés, broyer les échantillons d'aliments pour
3)
animaux au moyen d'un broy
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