ISO 23970:2021

Milk, milk products and infant formula — Determination of melamine and cyanuric acid by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)

This document specifies a method for the determination of melamine and cyanuric acid with liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method has been validated in an interlaboratory study via the analysis of spiked samples of milk-based infant formula, soy-based infant formula, milk powder, whole milk, soy drink and milk chocolate ranging from 0,71 mg/kg to 1,43 mg/kg for melamine and 0,57 mg/kg to 1,45 mg/kg for cyanuric acid. The limits of quantification (LOQ) for melamine and cyanuric acid in food are 0,05 mg/kg and 0,25 mg/kg, respectively. The upper limit of the working range is up to 10 mg/kg for melamine and up to 25 mg/kg for cyanuric acid.

Lait, produits laitiers et formule infantile — Détermination de la teneur en mélamine et en acide cyanurique par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)

Le présent document spécifie une méthode de détermination de la teneur en mélamine et en acide cyanurique par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM). La méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires par l’analyse d’échantillons dopés de formule infantile à base de lait, de formule infantile au soja, de lait en poudre, de lait entier, de boisson au soja et de chocolat au lait de teneur en mélamine comprise entre 0,71 mg/kg et 1,43 mg/kg et de teneur en acide cyanurique comprise entre 0,57 mg/kg et 1,45 mg/kg. La limite de quantification (LQ) de la mélamine et de l’acide cyanurique dans les produits alimentaires est respectivement de 0,05 mg/kg et de 0,25 mg/kg. La limite supérieure de la gamme de travail est au maximum de 10 mg/kg pour la mélamine et de 25 mg/kg pour l’acide cyanurique.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 15-Sep-2021
• ICS: 67.100.10 - Milk and processed milk products
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 16-Sep-2021
• Due Date: 06-Mar-2022
• Completion Date: 16-Sep-2021

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23970
IDF 252
First edition
2021-09
Milk, milk products and infant
formula — Determination of
melamine and cyanuric acid by liquid
chromatography and tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS)
Lait, produits laitiers et formule infantile — Détermination de la
teneur en mélamine et en acide cyanurique par chromatographie en
phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/
SM)
Reference numbers
ISO 23970:2021(E)
IDF 252:2021(E)
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IDF 252:2021(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
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Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
5.1 List of reagents . 1
5.2 Preparation of stock solutions . . 2
5.3 Preparation of standard solutions . 3
5.4 Preparation of calibration solutions . 4
6 Apparatus . 5
7 Procedure .6
7.1 Sample preparation . 6
7.2 Extraction . 6
7.2.1 General . 6
7.2.2 Extraction procedure . 6
7.3 Determination . 6
8 System settings . 7
8.1 HPLC parameters . 7
8.2 HPLC-MS/MS parameters . 7
8.3 UHPLC parameters . 9
8.4 UHPLC-MS/MS parameters . 9
8.5 Preparation of the LC-MS/MS system and samples . 10
8.5.1 Tuning of the LC-MS/MS system. 10
8.5.2 Checking of the instrument settings . 10
8.5.3 Checking of the sensitivity of the system . 10
8.5.4 Sample list . 11
9 Calculation and expression of results .11
9.1 General . 11
9.2 Calibration criteria . 11
9.3 Identification criteria . 11
9.4 Recovery .12
9.5 Calculation of results .13
10 Precision data .14
10.1 General . 14
10.2 Repeatability . 14
10.3 Reproducibility . . 14
11 Test report .15
Annex A (informative) Precision data .16
Bibliography .18
iii
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IDF 252:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to
the World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see
www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
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IDF 252:2021(E)
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products. It is being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the ISO/IDF Action Team A05 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leader, Dr S. Holroyd.
v
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INTERNATIONAL STANDARD
IDF 252:2021(E)
Milk, milk products and infant formula — Determination of
melamine and cyanuric acid by liquid chromatography and
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
1 Scope
This document specifies a method for the determination of melamine and cyanuric acid with liquid
chromatography in combination with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method has
been validated in an interlaboratory study via the analysis of spiked samples of milk-based infant
formula, soy-based infant formula, milk powder, whole milk, soy drink and milk chocolate ranging
from 0,71 mg/kg to 1,43 mg/kg for melamine and 0,57 mg/kg to 1,45 mg/kg for cyanuric acid. The
limits of quantification (LOQ) for melamine and cyanuric acid in food are 0,05 mg/kg and 0,25 mg/kg,
respectively. The upper limit of the working range is up to 10 mg/kg for melamine and up to 25 mg/kg
for cyanuric acid.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
4 Principle
13
A test portion of the homogenous food sample is fortified with C labelled internal standards (melamine
and cyanuric acid). After incubation for at least 1 h, water is added to the sample and, after shaking, the
slurry is dissolved in a mixture of acetonitrile and water. The sample is shaken and centrifuged. After
the separation of supernatant from sediments, benzoguanamine is added as a recovery standard. An
aliquot of the aqueous supernatant is injected into a LC-MS/MS system. The triple quadrupole mass
spectrometer is coupled either to high performance liquid chromatography (HPLC) or to ultra high
performance liquid chromatography (UHPLC). Chromatography is based on hydrophilic interaction
liquid chromatography (HILIC). Ionization is achieved by electrospray ionization (ESI) in multiple
reaction monitoring (MRM).
5 Reagents
5.1 List of reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water conforming to grade 1 of ISO 3696, unless
otherwise specified. Use only reagents with purity suitable for melamine and cyanuric acid analysis.
1
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IDF 252:2021(E)
Check the purity of the reagents and reference materials (e.g. standard solutions) by performing a
blank test under the same conditions as used in the method. The chromatogram shall not show any
interfering impurity at the retention time of compounds of interest.
1)
5.1.1 Formic acid, mass fraction of 98 % to 100 % (CAS RN® 64-18-6).
5.1.2 Acetonitrile, HPLC gradient grade (CAS RN® 75-05-8).
5.1.3 Ammonium acetate, mass fraction of approximately 98 % (CAS RN® 631-61-8).
5.1.4 Methanol, Ultra LC-MS grade (CAS RN® 67-56-1).
5.1.5 Melamine, mass fraction ≥99 %, solid (CAS RN® 108-78-1).
5.1.6 Cyanuric acid, solid (CAS RN® 108-80-5).
5.1.7 Benzoguanamine, solid (CAS RN® 91-76-9).
13 13 15
5.1.8 C melamine, C (99 %), Amino- N (98 %), solution with mass concentration ρ = 1 000 µg/
3 3
ml. Other isotope marked melamine/cyanuric acid solutions can be used if they lead to similar results;
this would need to be appropriately validated.
EXAMPLE 1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine-13C3 (melamine), 1,3,5-Triazine-2,4,6-triol-13C3, 2,4,6-Trihydroxy-
1,3,5-triazine-13C (cyanuric acid).
13 13 15
5.1.9 C cyanuric acid, C (99 %), N (98 %), solution with ρ = 1 000 µg/ml.
3 3
NOTE Alternatives can be used as per 5.1.8.
5.2 Preparation of stock solutions
5.2.1 Melamine stock solution, ρ = 1 000 µg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 100 mg of melamine (5.1.5) into a 100 ml glass flask (6.2)
and add by weighing an amount of water to achieve a concentration of 1 000 µg/ml. Store the solution in
a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during at least 1 year.
5.2.2 Cyanuric acid stock solution, ρ = 1 000 µg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 100 mg of cyanuric acid (5.1.6) into a 100 ml glass flask
(6.2) and add by weighing an amount of water to achieve a concentration of 1 000 µg/ml. Store the
solution in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during at least 1
year.
5.2.3 Benzoguanamine stock solution, ρ = 1 000 µg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 100 mg of benzoguanamine (5.1.7) into a 100 ml glass flask
(6.2) and add by weighing an amount of methanol (5.1.4) to achieve a concentration of 1 000 µg/ml.
Store the solution in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during
at least 1 year.
1) CAS Registry Number® (CAS RN®) is the trademark of a product supplied by CAS corporation. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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13
5.2.4 C melamine stock solution, ρ = 20 µg/ml.
13
Pipette 1,0 ml of C melamine (5.1.8) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up to the mark with
water and mix. The final concentration is 20 µg/ml. Transfer this solution into a 100 ml glass flask (6.2).
The solution is stable under these conditions during at least 1 year.
13
5.2.5 C cyanuric acid stock solution, ρ = 20 µg/ml.
13
Pipette 1,0 ml of C cyanuric acid (5.1.9) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up to the mark with
water and mix. The final concentration is 20 µg/ml. Transfer this solution into a 100 ml glass flask (6.2).
The solution is stable under these conditions during at least 1 year.
5.3 Preparation of standard solutions
5.3.1 Melamine standard solution I, ρ = 20 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the melamine stock solution (5.2.1) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up to the
mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 20 µg/ml. Transfer this solution
into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under
these conditions during at least 1 month.
5.3.2 Cyanuric acid standard solution I, ρ = 20 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the cyanuric acid stock solution (5.2.2) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up
to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 20 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.3 Melamine standard solution II, ρ = 0,2 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the melamine standard solution I (5.3.1) into a 100 ml volumetric flask (6.3). Make
up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 0,2 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.4 Cyanuric acid standard solution II, ρ = 0,2 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the cyanuric acid standard solution I (5.3.2) into a 100 ml volumetric flask (6.3). Make
up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 0,2 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.5 Benzoguanamine standard solution I, ρ = 20 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the benzoguanamine stock solution (5.2.3) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make
up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 20 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.6 Benzoguanamine standard solution II, ρ = 2 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the benzoguanamine standard solution I (5.3.5) into a 10 ml volumetric flask (6.3).
Make up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 2 µg/ml. Transfer
this solution into a 20 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is
stable under these conditions during at least 1 month.
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IDF 252:2021(E)
13 13
5.3.7 C melamine and C cyanuric acid standard solution, ρ = 2 µg/ml.
13 13
Pipette 0,5 ml of the C melamine stock solution (5.2.4) and 0,5 ml of the C cyanuric acid stock solution
(5.2.5) into a 5 ml volumetric flask (6.3). Make up to the mark with water and mix. The concentration
for both compounds is 2 µg/ml. Transfer this solution into a 20 ml glass flask (6.2) and store it in a
refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during at least 1 month if the
mass is carefully monitored.
5.4 Preparation of calibration solutions
5.4.1 Pipette the volumes given in Table 1 into a 10 ml volumetric flask (6.3) and make up to the mark
with the dilution solution (5.4.6).
Table 1 — Preparation of the calibration solutions
Calibration solution number
Calibration solution
1 2 3 4 5 6 7
Melamine standard solution I (5.3.1), in ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Cyanuric acid standard solution I (5.3.2), in ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Melamine standard solution II (5.3.3), in ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Cyanuric acid standard solution II (5.3.4), in ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Benzoguanamine standard solution II (5.3.6), in ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
13 13
C melamine and C cyanuric acid standard solu-
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
tion (5.3.7), in ml
13 13
Concentration C melamine – C cyanuric acid, in
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
µg/ml
Concentration native melamine – cyanuric acid, in
0 0,001 0,005 0,025 0,05 0,1 0,5
µg/ml
5.4.2 Mobile phase A for HPLC, substance concentration c(ammonium acetate) = 10 mmol/l.
Dissolve 0,77 g of ammonium acetate (5.1.3) in 1 000 ml of water.
5.4.3 Mobile phase B for HPLC.
Acetonitrile (5.1.2).
5.4.4 Mobile phase A for UHPLC.
Mix 3 parts per volume of formic acid (5.1.1) with 97 parts per volume of water.
5.4.5 Mobile phase B for UHPLC, c(ammonium acetate) = 20 mmol/l in a mixture of 3 parts per
volume of water and 97 parts per volume of acetonitrile.
Dissolve 1,54 g of ammonium acetate (5.1.3) in 30 ml of water. Add 970 ml of acetonitrile (5.1.2) to the
mixture and shake firmly. The turbid mixture will clear overnight.
The optimal choice for the mobile phases A and B can depend on the instrument configuration (see 6.10
to 6.12), particularly the type of column used. Equivalent products may be used if they can be shown to
lead to the same results.
5.4.6 Dilution solution.
Transfer, using measuring cylinders, 70 ml of acetonitrile (5.1.2) and 30 ml of water into a 100 ml
volumetric flask (6.3) and mix. Store at room temperature for no longer than 1 month.
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IDF 252:2021(E)
6 Apparatus
All technical descriptions are examples of possible system setups and parameters and shall be scaled or
adopted to the user's equipment.
Usual laboratory glassware and equipment and, in particular, the following shall be used.
6.1 Disposable polypropylene carbonate tube, of approximately 50 ml.
6.2 Glass flask, with volume of 20 ml and 100 ml.
6.3 One-mark volumetric flask, with volumes of 5 ml, 10 ml, 50 ml and 100 ml.
6.4 Shaking machine, adjustable from 0 strokes/min to 300 strokes/min.
6.5 Ultra sonication bath.
6.6 Centrifuge, with the capability to centrifuge 50 ml tubes (6.1) and a maximum g force of at least
4 000g.
6.7 Centrifuge, with the capability to centrifuge standard micro test tubes (6.8), chilled and a
maximum g force of at least 6 000g.
6.8 Standard micro test tubes, 1,5 ml.
6.9 Vials, for LC.
6.10 Liquid chromatograph triple quadrupole mass spectrometer consisting of:
a) a pump system, capable of delivering a gradient at the required flow;
b) an injector, capable of injecting 5 µl.
2)
6.11 TSKgel® Amide-80 HILIC column, length of 100 mm, internal diameter of 3,0 mm and particle
size of 3 µm.
TM 3)
6.12 UHPLC BEH (bridged ethyl hybrid) HILIC column, length of 150 mm, internal diameter of
2,1 mm and particle size of 1,7 µm.
6.13 Liquid nitrogen.
6.14 Milling equipment, capable of milling to a final particle size of <300 µm.
2) TSKgel is the trademark of a product supplied by Tosoh Corporation. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
3) BEH is the trademark of a product supplied by Waters Corporation. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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ISO 23970:2021(E)
IDF 252:2021(E)
7 Procedure
7.1 Sample preparation
Warm all milk-based liquid products, e.g. full fat milk, skimmed milk, raw milk and chocolate milk, to
40 °C and shake gently.
If necessary, mill all dry products based on milk, soy or wheat, e.g. milk powder, infant formula and
biscuits, to a particle size of <1 mm.
Mill all milk- or cocoa-based products, e.g. chocolate, candy and sweets (toffee), cryogenically using, for
example, liquid nitrogen after cutting in small cubes of ≤1 cm.
7.2 Extraction
7.2.1 General
The following samples shall be included in each series:
— calibration solutions;
— procedure blank (n = 1);
— (certified) reference material at an appropriate level or a home-made reference sample;
— all samples;
— calibration solution number 3, 4 or 5 (see Table 1).
The procedure blank shall be free of contaminants at or above the limits of quantification. A sample
matrix can be used where previous analysis showed that no cyanuric acid (CYA) and melamine (MEL)
were present in the sample above the LOQ. The sample amount used for extraction is 1 g of blank
sample. Deviations in sample mass shall be taken into account in Formula (5) (m = sample mass in g).
The calibration curve is used for identification and quantification. Calibration solution 3, 4 or 5 after
the series is used for control of the stability. The areas of melamine and cyanuric acid obtained with
this standard shall be equal to the areas obtained with the same standard in the calibration curve with
a maximum deviation of 10 %.
7.2.2 Extraction procedure
13
Weigh, to the nearest 0,01 g, 1 g of sample into a disposable tube (6.1). Add 250 µl of C melamine
13
stock solution (5.2.4) and 250 µl of C cyanuric acid stock solution (5.2.5). Incubate for at least 1 h at
ambient temperature. Add 5 ml of hot water (96 °C to 100 °C) and shake manually for 30 s to obtain a
slurry. Add 5 ml of acetonitrile (5.1.2) and shake again. Mix the slurry with 30 ml of acetonitrile (5.1.2)
and 10 ml of water. Shake well for 5 min and centrifuge for 10 min at 3 400g. Transfer 1,5 ml of the
extract into a standard micro test tube (6.8) and centrifuge for 10 min at 7
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 23970
FIL 252
Première édition
2021-09
Lait, produits laitiers et formule
infantile — Détermination de la
teneur en mélamine et en acide
cyanurique par chromatographie
en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse en tandem
(CL-SM/SM)
Milk, milk products and infant formula — Determination of melamine
and cyanuric acid by liquid chromatography and tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS)
Numéros de référence
ISO 23970:2021(F)
FIL 252:2021(F)
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ISO et FIL 2021

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publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
5.1 Liste de réactifs . 2
5.2 Préparation des solutions mères . 2
5.3 Préparation des solutions étalons . 3
5.4 Préparation des solutions d’étalonnage . 4
6 Appareillage . 5
7 Mode opératoire. 6
7.1 Préparation des échantillons . 6
7.2 Extraction . 6
7.2.1 Généralités . 6
7.2.2 Mode opératoire d’extraction . 7
7.3 Détermination . 7
8 Paramètres du système . 7
8.1 Paramètres de CLHP . 7
8.2 Paramètres de CLHP-SM/SM. 8
8.3 Paramètres de CLUHP . 9
8.4 Paramètres de CLUHP-SM/SM .10
8.5 Préparation du système CL-SM/SM et des échantillons.11
8.5.1 Réglage du système CL-SM/SM .11
8.5.2 Vérification des réglages de l’appareil.11
8.5.3 Contrôle de la sensibilité du système.11
8.5.4 Liste d’échantillons .11
9 Calcul et expression des résultats .12
9.1 Généralités .12
9.2 Critères d’étalonnage.12
9.3 Critères d’identification.12
9.4 Taux de récupération .13
9.5 Calcul des résultats .14
10 Données de fidélité .15
10.1 Généralités .15
10.2 Répétabilité .15
10.3 Reproductibilité .15
11 Rapport d’essai .16
Annexe A (informative) Données de fidélité .17
Bibliographie .19
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Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux.
L'ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d'approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L'attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l'ISO liés à l'évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l'adhésion
de l'ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers et la Fédération internationale du lait (FIL). Il est publié conjointement par
l'ISO et la FIL.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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FIL 252:2021(F)
La FIL (Fédération internationale du lait) est une organisation privée à but non lucratif qui représente
les intérêts des divers acteurs de la filière laitière au niveau international. Les membres de la FIL sont
organisés en comités nationaux, qui sont des associations nationales composées de représentants de
groupes d’intérêt nationaux dans le secteur des produits laitiers, incluant des producteurs laitiers, des
acteurs de l'industrie de transformation des produits laitiers, des fournisseurs de produits laitiers, des
universitaires et des représentants des gouvernements/autorités chargées du contrôle des aliments.
L’ISO et la FIL collaborent étroitement sur toutes les activités de normalisation concernant les méthodes
d'analyse et d'échantillonnage du lait et des produits laitiers. Depuis 2001, l’ISO et la FIL publient
conjointement leurs Normes internationales en utilisant les logos et les numéros de référence des deux
organisations.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire
l'objet de droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour
responsable de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails
concernant les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés
lors de l'élaboration du document sont indiqués dans l'Introduction et/ou dans la liste des déclarations
de brevets reçues par l'ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Le présent document a été élaboré par le Comité permanent de la FIL chargé des [titre] de la Fédération
internationale du lait (FIL) et le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5,
Lait et produits laitiers. Il est publié conjointement par l'ISO et la FIL.
L'ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO/FIL A05 du Comité permanent chargé
des Méthodes d’analyse des additifs et contaminants, sous la conduite de son chef de projet, Dr S. Holroyd.
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NORME INTERNATIONALE
FIL 252:2021(F)
Lait, produits laitiers et formule infantile — Détermination
de la teneur en mélamine et en acide cyanurique
par chromatographie en phase liquide couplée à la
spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/SM)
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode de détermination de la teneur en mélamine et en acide
cyanurique par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem
(CL-SM/SM). La méthode a été validée dans le cadre d’une étude interlaboratoires par l’analyse
d’échantillons dopés de formule infantile à base de lait, de formule infantile au soja, de lait en poudre,
de lait entier, de boisson au soja et de chocolat au lait de teneur en mélamine comprise entre 0,71 mg/
kg et 1,43 mg/kg et de teneur en acide cyanurique comprise entre 0,57 mg/kg et 1,45 mg/kg. La limite
de quantification (LQ) de la mélamine et de l’acide cyanurique dans les produits alimentaires est
respectivement de 0,05 mg/kg et de 0,25 mg/kg. La limite supérieure de la gamme de travail est au
maximum de 10 mg/kg pour la mélamine et de 25 mg/kg pour l’acide cyanurique.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s'applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d'essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
4 Principe
Une prise d’essai de l’échantillon de produit alimentaire homogène est dopée par des étalons
13
internes (mélamine et acide cyanurique) marqués au C. Après incubation pendant au moins 1 h,
de l’eau est ajoutée à l’échantillon et après agitation, la suspension obtenue est dissoute dans un
mélange d’acétonitrile et d’eau. L’échantillon est homogénéisé par agitation, puis est soumis à une
centrifugation. Après séparation du surnageant des dépôts, de la benzoguanamine est ajoutée à titre
d’étalon de récupération. Une aliquote du surnageant aqueux est injectée dans un système CL-SM/
SM. Le spectromètre de masse à triple quadripôle est couplé soit à une chromatographie en phase
liquide à haute performance (CLHP), soit à une chromatographie en phase liquide à ultra haute
performance (CLUHP). La chromatographie repose sur la technique de chromatographie en phase
liquide à interaction hydrophile (HILIC, de l’anglais «hydrophilic interaction liquid chromatography »).
L’ionisation est réalisée par ionisation électrospray (ESI, de l’anglais «electrospray ionization ») en
mode MRM (de l’anglais, «multiple reaction monitoring »).
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5 Réactifs
5.1 Liste de réactifs
Utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue et de l’eau de qualité 1 conformément
à l’ISO 3696, sauf indication contraire. Utiliser uniquement des réactifs de pureté adéquate vis-à-vis
de l’analyse de mélamine et d’acide cyanurique. Vérifier la pureté des réactifs et des matériaux de
référence (par exemple, solutions étalons) en effectuant un essai à blanc dans les mêmes conditions
que celles utilisées dans le cadre de la méthode. Le chromatogramme ne doit révéler aucune impureté
interférente aux temps de rétention des composés étudiés.
1)
5.1.1 Acide formique, de fraction massique comprise entre 98 % et 100 % (CAS RN® 64-18-6).
5.1.2 Acétonitrile, de qualité pour gradient de CLHP (CAS RN® 75-05-8).
5.1.3 Acétate d’ammonium, d’une fraction massique d’environ 98 % (CAS RN® 631-61-8).
5.1.4 Méthanol, de qualité CLUHP-SM (CAS RN® 67-56-1).
5.1.5 Mélamine, de fraction massique ≥ 99 %, sous forme solide (CAS RN® 108-78-1).
5.1.6 Acide cyanurique, sous forme solide (CAS RN® 108-80-5).
5.1.7 Benzoguanamine, sous forme solide (CAS RN® 91-76-9).
13 13 15
5.1.8 Mélamine marquée au C, C (99 %), amino- N (98 %), solution d’une concentration
3 3
massique de ρ = 1 000 µg/ml. Des solutions de mélamine/d’acide cyanurique marquées avec un autre
isotope peuvent être utilisées, si elles conduisent à des résultats similaires, ce point nécessitant d’être
validé de manière appropriée.
EXEMPLE 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine-13C3 (mélamine), 1,3,5-triazine-2,4,6-triol-13C3, 2,4,6-trihydroxy-
1,3,5-triazine-13C (acide cyanurique).
13 13 15
5.1.9 Acide cyanurique marqué au C, C (99 %), N (98 %), solution à ρ = 1 000 µg/ml.
3 3
NOTE D’autres solutions peuvent être utilisées conformément à 5.1.8.
5.2 Préparation des solutions mères
5.2.1 Solution mère de mélamine, ρ = 1 000 µg/ml.
Peser, à 0,1 mg près, environ 100 mg de mélamine (5.1.5) dans un flacon en verre de 100 ml (6.2) et
ajouter une quantité d’eau de masse déterminée par pesée de sorte à obtenir une concentration
de 1 000 µg/ml. Conserver la solution au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces
conditions pendant au moins 1 an.
5.2.2 Solution mère d’acide cyanurique, ρ = 1 000 µg/ml.
Peser, à 0,1 mg près, environ 100 mg d’acide cyanurique (5.1.6) dans un flacon en verre de 100 ml (6.2)
et ajouter une quantité d’eau de masse déterminée par pesée de sorte à obtenir une concentration
1) CAS Registry Number® (CAS RN®) est la marque déposée d’un produit fourni par la société CAS. Cette
information est donnée pour des raisons pratiques aux utilisateurs du présent document et ne signifie nullement
que l’ISO ou la FIL recommande l’emploi exclusif du produit cité. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il
peut être démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
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FIL 252:2021(F)
de 1 000 µg/ml. Conserver la solution au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces
conditions pendant au moins 1 an.
5.2.3 Solution mère de benzoguanamine, ρ = 1 000 µg/ml.
Peser, à 0,1 mg près, environ 100 mg de benzoguanamine (5.1.7) dans un flacon en verre de 100 ml
(6.2) et ajouter une quantité de méthanol (5.1.4) de masse déterminée par pesée de sorte à obtenir
une concentration de 1 000 µg/ml. Conserver la solution au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est
stable sous ces conditions pendant au moins 1 an.
13
5.2.4 Solution mère de mélamine marquée au C, ρ = 20 µg/ml.
13
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de mélamine marquée au C (5.1.8) dans une fiole jaugée
de 50 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec de l’eau et mélanger. La concentration finale est de 20 µg/l.
Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2). La solution est stable sous ces
conditions pendant au moins 1 an.
13
5.2.5 Solution mère d’acide cyanurique marqué au C, ρ = 20 µg/ml.
13
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml d’acide cyanurique marqué au C (5.1.9) dans une fiole jaugée
de 50 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec de l’eau et mélanger. La concentration finale est de 20 µg/l.
Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2). La solution est stable sous ces
conditions pendant au moins 1 an.
5.3 Préparation des solutions étalons
5.3.1 Solution étalon de mélamine I, ρ = 20 µg/ml.
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de la solution mère de mélamine (5.2.1) dans une fiole jaugée de
50 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6) et mélanger. La concentration
est de 20 µg/ml. Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2) et la conserver au
réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins 1 mois.
5.3.2 Solution étalon d’acide cyanurique I, ρ = 20 µg/ml.
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de la solution mère d’acide cyanurique (5.2.2) dans une fiole
jaugée de 50 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6) et mélanger. La
concentration est de 20 µg/ml. Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2) et la
conserver au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins
1 mois.
5.3.3 Solution étalon de mélamine II, ρ = 0,2 µg/ml.
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de la solution étalon de mélamine I (5.3.1) dans une fiole jaugée
de 100 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6) et mélanger. La concentration
est de 0,2 µg/ml. Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2) et la conserver au
réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins 1 mois.
5.3.4 Solution étalon d’acide cyanurique II, ρ = 0,2 µg/ml.
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de la solution étalon d’acide cyanurique I (5.3.2) dans une fiole
jaugée de 100 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6) et mélanger. La
concentration est de 0,2 µg/ml. Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2) et la
conserver au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins
1 mois.
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ISO 23970:2021(F)
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5.3.5 Solution étalon de benzoguanamine I, ρ = 20 µg/ml.
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de la solution mère de benzoguanamine (5.2.3) dans une
fiole jaugée de 50 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6) et mélanger. La
concentration est de 20 µg/ml. Transférer cette solution dans un flacon en verre de 100 ml (6.2) et la
conserver au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins
1 mois.
5.3.6 Solution étalon de benzoguanamine II, ρ = 2 µg/ml.
À l’aide d’une pipette, introduire 1,0 ml de la solution étalon de benzoguanamine I (5.3.5) dans une
fiole jaugée de 10 ml (6.3). Compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6) et mélanger. La
concentration est de 2 µg/ml. Transférer cette solution dans un flacon en verre de 20 ml (6.2) et la
conserver au réfrigérateur à 4 °C (±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins
1 mois.
13 13
5.3.7 Solution étalon de mélamine marquée au C et d’acide cyanurique marqué au C,
ρ = 2 µg/ml.
13
À l’aide d’une pipette, introduire 0,5 ml de la solution mère de mélamine marquée au C (5.2.4) et 0,5 ml
13
de la solution mère d’acide cyanurique marqué au C (5.2.5) dans une fiole jaugée de 5 ml (6.3).
Compléter jusqu’au trait avec de l’eau et mélanger. La concentration des deux composés est de 2 µg/ml.
Transférer cette solution dans un flacon en verre de 20 ml (6.2) et la conserver au réfrigérateur à 4 °C
(±3 °C). La solution est stable sous ces conditions pendant au moins 1 mois si la masse est soigneusement
contrôlée.
5.4 Préparation des solutions d’étalonnage
5.4.1 À l’aide d’une pipette, introduire les volumes indiqués dans le Tableau 1 dans une fiole jaugée
de 10 ml (6.3) et compléter jusqu’au trait avec la solution de dilution (5.4.6).
Tableau 1 — Préparation des solutions d’étalonnage
Solution d’étalonnage numéro
Solution d’étalonnage
1 2 3 4 5 6 7
Solution étalon de mélamine I (5.3.1), en ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Solution étalon d’acide cyanurique I (5.3.2), en ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Solution étalon de mélamine II (5.3.3), en ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Solution étalon d’acide cyanurique II (5.3.4), en ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Solution étalon de benzoguanamine II (5.3.6), en ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
13
Solution étalon de mélamine marquée au C et
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
13
d’acide cyanurique marqué au C (5.3.7), en ml
13
Concentration en mélamine marquée au C – en
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
13
acide cyanurique marqué au C, en µg/ml
Concentration en mélamine native – en acide cyanu-
0 0,001 0,005 0,025 0,05 0,1 0,5
rique natif, en µg/ml
5.4.2 Phase mobile A pour CLHP, concentration en substance de c (acétate d’ammonium) = 10 mmol/l.
Dissoudre 0,77 g d’acétate d’ammonium (5.1.3) dans 1 000 ml d’eau.
5.4.3 Phase mobile B pour CLHP
Acétonitrile (5.1.2).
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5.4.4 Phase mobile A pour CLUHP
Mélanger 3 volumes d’acide formique (5.1.1) à 97 volumes d’eau.
5.4.5 Phase mobile B pour CLUHP, c(acétate d’ammonium) = 20 mmol/l selon un mélange de
3 volumes d’eau et de 97 volumes d’acétonitrile.
Dissoudre 1,54 g d’acétate d’ammonium (5.1.3) dans 30 ml d’eau. Ajouter 970 ml d’acétonitrile (5.1.2)
au mélange et agiter vigoureusement. Le mélange trouble deviendra limpide pendant la nuit.
Le choix des meilleures phases mobiles A et B peut dépendre de la configuration instrumentale
(voir 6.10 à 6.12), et notamment du type de colonne utilisée. Des produits équivalents peuvent être
utilisés s’il peut être démontré qu’ils conduisent aux mêmes résultats.
5.4.6 Solution de dilution
À l’aide d’éprouvettes graduées, introduire 70 ml d’acétonitrile (5.1.2) et 30 ml d’eau dans une fiole
jaugée de 100 ml (6.3) et mélanger. Conserver à température ambiante pendant 1 mois au maximum.
6 Appareillage
Toutes les descriptions techniques sont des exemples de configurations et de paramètres système
possibles et elles doivent être proportionnées ou adaptées en fonction de l’équipement de l’utilisateur.
Matériel et verrerie courants de laboratoire et en particulier les éléments cités ci-après doivent être
utilisés.
6.1 Tube en polycarbonate de propylène, d’environ 50 ml.
6.2 Flacon en verre, de 20 ml et de 100 ml.
6.3 Fiole jaugée, de 5 ml, de 10 ml, de 50 ml et de 100 ml.
6.4 Instrument d’agitation, avec un nombre de courses par minute réglable entre 0 et 300.
6.5 Bain à ultrasons
6.6 Centrifugeuse, pouvant accueillir des tubes de 50 ml (6.1) et en mesure d’appliquer une force g
maximale d’au moins 4 000 g.
6.7 Centrifugeuse, pouvant accueillir des micro-tubes à essai classiques (6.8), réfrigérée et en mesure
d’appliquer une force g maximale d’au moins 6 000 g.
6.8 Micro-tubes à essai classiques, 1,5 ml.
6.9 Flacons, pour CL.
6.10 Chromatographe en phase liquide couplé à un spectromètre de masse à triple quadripôle,
comprenant:
a) un système de pompe, en mesure d’appliquer un gradient au débit exigé;
b) un injecteur, en mesure d’injecter 5 µl.
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2)
6.11 Colonne HILIC TSKgel® amide-80 , de 100 mm de longueur, de 3,0 mm de diamètre interne et
de 3 µm de granulométrie.
TM 3)
6.12 Colonne HILIC UHPLC BEH (« bridged eth
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 23970
IDF 252
First edition
Milk, milk products and infant
formula — Determination of
melamine and cyanuric acid by liquid
chromatography and tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS)
Lait, produits laitiers et formule infantile — Détermination de la
teneur en mélamine et en acide cyanurique par chromatographie en
phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CL-SM/
SM)
PROOF/ÉPREUVE
Reference numbers
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ISO 23970:2021(E)
IDF 252:2021(E)
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 1
5.1 List of reagents . 1
5.2 Preparation of stock solutions . 2
5.3 Preparation of standard solutions . 3
5.4 Preparation of calibration solutions . 4
6 Apparatus . 5
7 Procedure. 6
7.1 Sample preparation . 6
7.2 Extraction . 6
7.2.1 General. 6
7.2.2 Extraction procedure . 6
7.3 Determination . 6
8 System settings . 7
8.1 HPLC parameters . 7
8.2 HPLC-MS/MS parameters . 7
8.3 UHPLC parameters . 9
8.4 UHPLC-MS/MS parameters . 9
8.5 Preparation of the LC-MS/MS system and samples .10
8.5.1 Tuning of the LC-MS/MS system .10
8.5.2 Checking of the instrument settings .10
8.5.3 Checking of the sensitivity of the system .10
8.5.4 Sample list .11
9 Calculation and expression of results .11
9.1 General .11
9.2 Calibration criteria .11
9.3 Identification criteria .11
9.4 Recovery .12
9.5 Calculation of results .13
10 Precision data .14
10.1 General .14
10.2 Repeatability .14
10.3 Reproducibility .14
11 Test report .15
Annex A (informative) Precision data .16
Bibliography .18
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ISO 23970:2021(E)
IDF 252:2021(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national
standards bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally
carried out through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented on that committee.
International organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part
in the work. ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all
matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO's adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit private sector organization representing the
interests of various stakeholders in dairying at the global level. IDF members are organized in National
Committees, which are national associations composed of representatives of dairy-related national
interest groups including dairy farmers, dairy processing industry, dairy suppliers, academics and
governments/food control authorities.
ISO and IDF collaborate closely on all matters of standardization relating to methods of analysis
and sampling for milk and milk products. Since 2001, ISO and IDF jointly publish their International
Standards using the logos and reference numbers of both organizations.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
This document was prepared by the IDF Standing Committee on Analytical Methods for Additives and
Contaminants and ISO Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk
products. It is being published jointly by ISO and IDF.
The work was carried out by the ISO/IDF Action Team A05 of the Standing Committee on Analytical
Methods for Additives and Contaminants under the aegis of its project leader, Dr S. Holroyd.
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INTERNATIONAL STANDARD
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Milk, milk products and infant formula — Determination of
melamine and cyanuric acid by liquid chromatography and
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
1 Scope
This document specifies a method for the determination of melamine and cyanuric acid with liquid
chromatography in combination with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method has
been validated in an interlaboratory study via the analysis of spiked samples of milk-based infant
formula, soy-based infant formula, milk powder, whole milk, soy drink and milk chocolate ranging
from 0,71 mg/kg to 1,43 mg/kg for melamine and 0,57 mg/kg to 1,45 mg/kg for cyanuric acid. The
limits of quantification (LOQ) for melamine and cyanuric acid in food are 0,05 mg/kg and 0,25 mg/kg,
respectively. The upper limit of the working range is up to 10 mg/kg for melamine and up to 25 mg/kg
for cyanuric acid.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
4 Principle
13
A test portion of the homogenous food sample is fortified with C labelled internal standards (melamine
and cyanuric acid). After incubation for at least 1 h, water is added to the sample and, after shaking, the
slurry is dissolved in a mixture of acetonitrile and water. The sample is shaken and centrifuged. After
the separation of supernatant from sediments, benzoguanamine is added as a recovery standard. An
aliquot of the aqueous supernatant is injected into a LC-MS/MS system. The triple quadrupole mass
spectrometer is coupled either to high performance liquid chromatography (HPLC) or to ultra high
performance liquid chromatography (UHPLC). Chromatography is based on hydrophilic interaction
liquid chromatography (HILIC). Ionization is achieved by electrospray ionization (ESI) in multiple
reaction monitoring (MRM).
5 Reagents
5.1 List of reagents
Use only reagents of recognized analytical grade and water conforming to grade 1 of ISO 3696, unless
otherwise specified. Use only reagents with purity suitable for melamine and cyanuric acid analysis.
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Check the purity of the reagents and reference materials (e.g. standard solutions) by performing a
blank test under the same conditions as used in the method. The chromatogram shall not show any
interfering impurity at the retention time of compounds of interest.
1)
5.1.1 Formic acid, mass fraction of 98 % to 100 % (CAS RN® 64-18-6).
5.1.2 Acetonitrile, HPLC gradient grade (CAS RN® 75-05-8).
5.1.3 Ammonium acetate, mass fraction of approximately 98 % (CAS RN® 631-61-8).
5.1.4 Methanol, Ultra LC-MS grade (CAS RN® 67-56-1).
5.1.5 Melamine, mass fraction ≥99 %, solid (CAS RN® 108-78-1).
5.1.6 Cyanuric acid, solid (CAS RN® 108-80-5).
5.1.7 Benzoguanamine, solid (CAS RN® 91-76-9).
13 13 15
5.1.8 C melamine, C (99 %), Amino- N (98 %), solution with mass concentration ρ = 1 000 µg/
3 3
ml. Other isotope marked melamine/cyanuric acid solutions can be used if they lead to similar results;
this would need to be appropriately validated.
EXAMPLE 1,3,5-Triazine-2,4,6-triamine-13C3 (melamine), 1,3,5-Triazine-2,4,6-triol-13C3, 2,4,6-Trihydroxy-
1,3,5-triazine-13C (cyanuric acid).
13 13 15
5.1.9 C cyanuric acid, C (99 %), N (98 %), solution with ρ = 1 000 µg/ml.
3 3
NOTE Alternatives can be used as per 5.1.8.
5.2 Preparation of stock solutions
5.2.1 Melamine stock solution, ρ = 1 000 µg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 100 mg of melamine (5.1.5) into a 100 ml glass flask (6.2)
and add by weighing an amount of water to achieve a concentration of 1 000 µg/ml. Store the solution in
a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during at least 1 year.
5.2.2 Cyanuric acid stock solution, ρ = 1 000 µg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 100 mg of cyanuric acid (5.1.6) into a 100 ml glass flask
(6.2) and add by weighing an amount of water to achieve a concentration of 1 000 µg/ml. Store the
solution in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during at least 1
year.
5.2.3 Benzoguanamine stock solution, ρ = 1 000 µg/ml.
Weigh, to the nearest 0,1 mg, approximately 100 mg of benzoguanamine (5.1.7) into a 100 ml glass flask
(6.2) and add by weighing an amount of methanol (5.1.4) to achieve a concentration of 1 000 µg/ml.
Store the solution in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during
at least 1 year.
1) CAS Registry Number® (CAS RN®) is the trademark of a product supplied by CAS corporation. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the
product named. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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13
5.2.4 C melamine stock solution, ρ = 20 µg/ml.
13
Pipette 1,0 ml of C melamine (5.1.8) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up to the mark with
water and mix. The final concentration is 20 µg/ml. Transfer this solution into a 100 ml glass flask (6.2).
The solution is stable under these conditions during at least 1 year.
13
5.2.5 C cyanuric acid stock solution, ρ = 20 µg/ml.
13
Pipette 1,0 ml of C cyanuric acid (5.1.9) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up to the mark with
water and mix. The final concentration is 20 µg/ml. Transfer this solution into a 100 ml glass flask (6.2).
The solution is stable under these conditions during at least 1 year.
5.3 Preparation of standard solutions
5.3.1 Melamine standard solution I, ρ = 20 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the melamine stock solution (5.2.1) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up to the
mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 20 µg/ml. Transfer this solution
into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under
these conditions during at least 1 month.
5.3.2 Cyanuric acid standard solution I, ρ = 20 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the cyanuric acid stock solution (5.2.2) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make up
to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 20 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.3 Melamine standard solution II, ρ = 0,2 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the melamine standard solution I (5.3.1) into a 100 ml volumetric flask (6.3). Make
up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 0,2 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.4 Cyanuric acid standard solution II, ρ = 0,2 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the cyanuric acid standard solution I (5.3.2) into a 100 ml volumetric flask (6.3). Make
up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 0,2 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.5 Benzoguanamine standard solution I, ρ = 20 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the benzoguanamine stock solution (5.2.3) into a 50 ml volumetric flask (6.3). Make
up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 20 µg/ml. Transfer this
solution into a 100 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable
under these conditions during at least 1 month.
5.3.6 Benzoguanamine standard solution II, ρ = 2 µg/ml.
Pipette 1,0 ml of the benzoguanamine standard solution I (5.3.5) into a 10 ml volumetric flask (6.3).
Make up to the mark with the dilution solution (5.4.6) and mix. The concentration is 2 µg/ml. Transfer
this solution into a 20 ml glass flask (6.2) and store it in a refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is
stable under these conditions during at least 1 month.
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13 13
5.3.7 C melamine and C cyanuric acid standard solution, ρ = 2 µg/ml.
13 13
Pipette 0,5 ml of the C melamine stock solution (5.2.4) and 0,5 ml of the C cyanuric acid stock solution
(5.2.5) into a 5 ml volumetric flask (6.3). Make up to the mark with water and mix. The concentration
for both compounds is 2 µg/ml. Transfer this solution into a 20 ml glass flask (6.2) and store it in a
refrigerator at 4 °C (±3 °C). The solution is stable under these conditions during at least 1 month if the
mass is carefully monitored.
5.4 Preparation of calibration solutions
5.4.1 Pipette the volumes given in Table 1 into a 10 ml volumetric flask (6.3) and make up to the mark
with the dilution solution (5.4.6).
Table 1 — Preparation of the calibration solutions
Calibration solution number
Calibration solution
1 2 3 4 5 6 7
Melamine standard solution I (5.3.1), in ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Cyanuric acid standard solution I (5.3.2), in ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Melamine standard solution II (5.3.3), in ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Cyanuric acid standard solution II (5.3.4), in ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Benzoguanamine standard solution II (5.3.6), in ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
13 13
C melamine and C cyanuric acid standard solu-
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
tion (5.3.7), in ml
13 13
Concentration C melamine – C cyanuric acid, in
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
µg/ml
Concentration native melamine – cyanuric acid, in
0 0,001 0,005 0,025 0,05 0,1 0,5
µg/ml
5.4.2 Mobile phase A for HPLC, substance concentration c(ammonium acetate) = 10 mmol/l.
Dissolve 0,77 g of ammonium acetate (5.1.3) in 1 000 ml of water.
5.4.3 Mobile phase B for HPLC.
Acetonitrile (5.1.2).
5.4.4 Mobile phase A for UHPLC.
Mix 3 parts per volume of formic acid (5.1.1) with 97 parts per volume of water.
5.4.5 Mobile phase B for UHPLC, c(ammonium acetate) = 20 mmol/l in a mixture of 3 parts per
volume of water and 97 parts per volume of acetonitrile.
Dissolve 1,54 g of ammonium acetate (5.1.3) in 30 ml of water. Add 970 ml of acetonitrile (5.1.2) to the
mixture and shake firmly. The turbid mixture will clear overnight.
The optimal choice for the mobile phases A and B can depend on the instrument configuration (see 6.10
to 6.12), particularly the type of column used. Equivalent products may be used if they can be shown to
lead to the same results.
5.4.6 Dilution solution.
Transfer, using measuring cylinders, 70 ml of acetonitrile (5.1.2) and 30 ml of water into a 100 ml
volumetric flask (6.3) and mix. Store at room temperature for no longer than 1 month.
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6 Apparatus
All technical descriptions are examples of possible system setups and parameters and shall be scaled or
adopted to the user's equipment.
Usual laboratory glassware and equipment and, in particular, the following shall be used.
6.1 Disposable polypropylene carbonate tube, of approximately 50 ml.
6.2 Glass flask, with volume of 20 ml and 100 ml.
6.3 One-mark volumetric flask, with volumes of 5 ml, 10 ml, 50 ml and 100 ml.
6.4 Shaking machine, adjustable from 0 strokes/min to 300 strokes/min.
6.5 Ultra sonication bath.
6.6 Centrifuge, with the capability to centrifuge 50 ml tubes (6.1) and a maximum g force of at least
4 000g.
6.7 Centrifuge, with the capability to centrifuge standard micro test tubes (6.8), chilled and a
maximum g force of at least 6 000g.
6.8 Standard micro test tubes, 1,5 ml.
6.9 Vials, for LC.
6.10 Liquid chromatograph triple quadrupole mass spectrometer consisting of:
a) a pump system, capable of delivering a gradient at the required flow;
b) an injector, capable of injecting 5 µl.
2)
6.11 TSKgel® Amide-80 HILIC column, length of 100 mm, internal diameter of 3,0 mm and particle
size of 3 µm.
TM 3)
6.12 UHPLC BEH (bridged ethyl hybrid) HILIC column, length of 150 mm, internal diameter of
2,1 mm and particle size of 1,7 µm.
6.13 Liquid nitrogen.
6.14 Milling equipment, capable of milling to a final particle size of <300 µm.
2) TSKgel is the trademark of a product supplied by Tosoh Corporation. This information is given for the
convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named.
Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
3) BEH is the trademark of a product supplied by Waters Corporation. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of the product named. Equivalent
products may be used if they can be shown to lead to the same results.
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7 Procedure
7.1 Sample preparation
Warm all milk-based liquid products, e.g. full fat milk, skimmed milk, raw milk and chocolate milk, to
40 °C and shake gently.
If necessary, mill all dry products based on milk, soy or wheat, e.g. milk powder, infant formula and
biscuits, to a particle size of <1 mm.
Mill all milk- or cocoa-based products, e.g. chocolate, candy and sweets (toffee), cryogenically using, for
example, liquid nitrogen after cutting in small cubes of ≤1 cm.
7.2 Extraction
7.2.1 General
The following samples shall be included in each series:
— calibration solutions;
— procedure blank (n = 1);
— (certified) reference material at an appropriate level or a home-made reference sample;
— all samples;
— calibration solution number 3, 4 or 5 (see Table 1).
The procedure blank shall be free of contaminants at or above the limits of quantification. A sample
matrix can be used where previous analysis showed that no cyanuric acid (CYA) and melamine (MEL)
were present in the sample above the LOQ. The sample amount used for extraction is 1 g of blank
sample. Deviations in sample mass shall be taken into account in Formula (5) (m = sample mass in g).
The calibration curve is used for identification and quantification. Calibration solution 3, 4 or 5 after
the series is used for control of the stability. The areas of melamine and cyanuric acid obtained with
this standard shall be equal to the areas obtained with the same standard in the calibration curve with
a maximum deviation of 10 %.
7.2.2 Extraction procedure
13
Weigh, to the nearest 0,01 g, 1 g of sample into a disposable tube (6.1). Add 250 µl of C melamine
13
stock solution (5.2.4) and 250 µl of C cyanuric acid stock solution (5.2.5). Incubate for at least 1 h at
ambient temperature. Add 5 ml of hot water (96 °C to 100 °C) and shake manually for 30 s to obtain a
slurry. Add 5 ml of acetonitrile (5.1.2) and shake again. Mix the slurry with 30 ml of acetonitrile (5.1.2)
and 10 ml of water. Shake well for 5 min a
...