ISO 11866-2:2005

Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using membranes

ISO 11866-2|IDF 170-2:2005 specifies a method for the enumeration of presumptive Escherichia coli by means of a colony-count technique at 44 °C. The method is applicable to milk, liquid milk products, dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, lactose, acid casein, lactic casein and rennet casein, caseinate and dried acid whey, cheese and processed cheese, butter, frozen milk products (including edible ices), and custard, desserts and cream. The method specified in ISO 11866-2|IDF 170-2:2005 is the preferred method for samples in which comparatively large numbers of presumptive Escherichia coli (more than 100 per gram or 10 per millilitre) are suspected.

Lait et produits laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli présumés — Partie 2: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 degrés C

L'ISO 11866-2|FIL 170-2:2005 spécifie une méthode pour le dénombrement d'Escherichia coli présumés, au moyen de la technique de comptage des colonies à 44 °C. Cette méthode est applicable au lait et aux produits laitiers liquides, au lait sec, au lactosérum sucré sec, au babeurre sec et au lactose, à la caséine acide, la caséine lactique et la caséine présure, aux caséinates et au lactosérum acide sec, au fromage et aux fromages fondus, au beurre, aux produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation), à la crème anglaise, aux desserts et à la crème. La méthode spécifiée dans l'ISO 11866-2|FIL 170-2:2005 est la méthode recommandée pour les échantillons supposés contenir un nombre relativement important d'Escherichia coli présumés (plus de 100 par gramme ou 10 par millilitre).

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 22-Nov-2005
• ICS: 07.100.30 - Food microbiology
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 23-Sep-2020

Relations

• Revises: ISO 11866-3:1997 - Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli — Part 3: Colony-count technique at 44 degrees C using membranes
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11866-2
IDF
170-2
Second edition
2005-12-01

Milk and milk products — Enumeration
of presumptive Escherichia coli —
Part 2:
Colony-count technique at 44 °C using
membranes
Lait et produits laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli présumés —
Partie 2: Technique par comptage des colonies obtenues sur
membranes à 44 °C





Reference numbers
ISO 11866-2:2005(E)
IDF 170-2:2005(E)
©
ISO and IDF 2005

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ISO 11866-2:2005(E)
IDF 170-2:2005(E)
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Published in Switzerland

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ISO 11866-2:2005(E)
IDF 170-2:2005(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11866-2⎪IDF 170-2 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee
SC 5, Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO
and IDF.
This edition of ISO 11866-2⎪IDF 170-2 cancels and replaces ISO 11866-3:1997, of which it constitutes a
minor revision.
ISO 11866-1:1997 has been cancelled and replaced by ISO 7251:2005, Microbiology of food and animal
feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli — Most
probable number technique.
ISO 11866⎪IDF 170 consists of the following parts, under the general title Milk and milk products —
Enumeration of presumptive Escherichia coli:
⎯ Part 1: Most probable number technique using 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)
⎯ Part 2: Colony-count technique at 44 °C using membranes

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ISO 11866-2:2005(E)
IDF 170-2:2005(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
Draft International Standards adopted by the Action Teams and Standing Committees are circulated to the
National Committees for voting. Publication as an International Standard requires approval by at least 50 % of
the IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 11866-2⎪IDF 170-2 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the Joint ISO/IDF/AOAC Group of Experts on Pathogenic contaminants (E102),
under the aegis of its chairman, Mrs R. Lodi (IT).
This edition of ISO 11866-2⎪IDF 170-2 cancels and replaces the former part 3 of IDF 170A:1999, while the
former part 1 has been replaced by ISO 7251:2005.
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ISO 11866-2:2005(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 170-2:2005(E)

Milk and milk products — Enumeration of presumptive
Escherichia coli —
Part 2:
Colony-count technique at 44 °C using membranes
1 Scope
This part of ISO 11866⎪IDF 170 specifies a method for the enumeration of presumptive Escherichia coli by
means of a colony-count technique at 44 °C.
The method is applicable to
⎯ milk, liquid milk products,
⎯ dried milk, dried sweet whey, dried buttermilk, lactose,
⎯ acid casein, lactic casein and rennet casein,
⎯ caseinate and dried acid whey,
⎯ cheese and processed cheese,
⎯ butter,
⎯ frozen milk products (including edible ices), and
⎯ custard, desserts and cream.
The method specified in this part of ISO 11866⎪IDF 170 is the preferred method for samples in which
comparatively large numbers of presumptive Escherichia coli (more than 100 per gram or 10 per millilitre) are
suspected.
CAUTION — Some pathogenic strains of Escherichia coli do not grow at 44 °C.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 8261⎪IDF 122, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial
suspensions and decimal dilutions for microbiological examination
© ISO and IDF 2005 – All rights reserved 1

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ISO 11866-2:2005(E)
IDF 170-2:2005(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
presumptive Escherichia coli
bacteria which at 44 °C form indole-positive (pink) colonies on cellulose acetate membranes overlaid on
tryptone-bile agar, under the conditions specified in this part of ISO 11866⎪IDF 170
4 Principle
4.1 Resuscitation
A specified quantity of the test sample or initial suspension is inoculated onto cellulose acetate membranes
overlaid on mineral-modified glutamate agar, then they are incubated at 37 °C for 4 h.
NOTE This procedure enables the presumptive Escherichia coli damaged by storage under frozen, dried or chill
conditions, or damaged by heat or chemical processes, to be resuscitated. It also permits the diffusion of high
concentrations of any fermentable carbohydrate present in the test sample which would otherwise interfere with indole
production during the subsequent isolation stage.
4.2 Isolation
The membranes from the resuscitation stage on the mineral-modified glutamate agar are transferred to
tryptone-bile agar. They are incubated at 44 °C for 18 h to 24 h.
4.3 Detection
The presence of presumptive Escherichia coli on the membrane is demonstrated by the production of indole
by each colony.
4.4 Calculation
The number of colony-forming units (CFU) of presumptive Escherichia coli per gram or per millilitre of sample
is calculated from the number of indole-positive colonies obtained on membranes at dilution levels chosen so
as to give a significant result.
5 Dilution fluid, culture media and reagent
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218 and ISO 8261.
If the prepared culture media and reagents are not used immediately, they shall, unless otherwise stated, be
stored in the dark at a temperature between 0 °C and +5 °C for no longer than 1 month, under conditions
which do not produce any change in their composition.
5.2 Dilution fluid
See ISO 8261⎪IDF 122.
2 © ISO and IDF 2005 – All rights reserved

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ISO 11866-2:2005(E)
IDF 170-2:2005(E)
5.3 Culture media and reagent
5.3.1 Resuscitation medium: Mineral-modified glutamate agar
5.3.1.1 Composition
Sodium glutamate 6,35 g
Lactose 10,0 g
Sodium formate 0,25 g
L(–)Cystine 0,02 g
L(–)Aspartic acid 0,02 g
L(+)Arginine 0,024 g
Thiamine 0,001 g
Nicotinic acid 0,001 g
Pantothenic acid 0,001 g
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO⋅7H O) 0,100 g
4 2
a
Ammonium iron(III) citrate 0,010 g
Calcium chloride dihydrate (CaCl⋅2H O) 0,010 g
2 2
Dipotassium hydrogen phosphate (K HPO ) 0,90 g
2 4
Ammonium chloride 2,5 g
b
Agar 12 g to 18 g
Water 1 000 ml
a
Iron content of at least 15 % (mass fraction).
b
Depending on the gel strength of the agar.
5.3.1.2 Preparation
Dissolve the ammonium chloride in the water. Add the other components and heat to boiling.
Adjust the pH, if necessary, so that after sterilization it is 6,7 at 25 °C.
Transfer 100 ml volumes of the medium to suitable containers.
Sterilize in the autoclave (6.1) set at 115 °C for 10 min.
5.3.1.3 Preparation of agar plates
Pour into sterile Petri dishes (6.12), 12 ml to 15 ml of the medium cooled to approximately 45 °C, and allow it
to solidify. The plates may be stored at 0 °C to +5 °C for up to 4 days.
Immediately before use, dry the plates, preferably with the lids removed and the agar surfaces facing
downwards, in the drying cabinet or the oven (6.3) set at 50 °C for 30 min or until the droplets have
disappeared from the surface of the medium.
The agar should be dry enough not to allow excess moisture to appear within 15 min
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11866-2
FIL
170-2
Deuxième édition
2005-12-01

Lait et produits laitiers — Dénombrement
d'Escherichia coli présumés —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies
obtenues sur membranes à 44 °C
Milk and milk products — Enumeration of presumptive Escherichia coli —
Part 2: Colony-count technique at 44 °C using membranes





Numéros de référence
ISO 11866-2:2005(F)
FIL 170-2:2005(F)
©
ISO et FIL 2005

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ISO 11866-2:2005(F)
FIL 170-2:2005(F)
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Le présent fichier PDF peut contenir des polices de caractères intégrées. Conformément aux conditions de licence d'Adobe, ce fichier
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déclinent toute responsabilité en la matière.
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surviendrait un problème d'utilisation, veuillez en informer le Secrétariat central de l'ISO à l'adresse donnée ci-dessous.


©  ISO et FIL 2005
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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord écrit
soit de l'ISO soit de la FIL à l'adresse respective ci-après.
ISO copyright office Fédération Internationale de Laiterie
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E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Publié en Suisse

ii © ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés

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ISO 11866-2:2005(F)
FIL 170-2:2005(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11866-2⎪FIL 170-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.
Cette édition de l'ISO 11866-2⎪FIL 170-2 annule et remplace l'ISO 11866-3:1997, dont elle constitue une
révision mineure.
L'ISO 11866-1:1997 a été annulée et remplacée par l'ISO 7251:2005, Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche et le dénombrement d'Escherichia coli présumés — Technique du nombre le
plus probable.
L'ISO 11866⎪FIL 170 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Lait et produits
laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli présumés:
⎯ Partie 1: Technique du nombre le plus probable avec utilisation de 4-méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide
(MUG)
⎯ Partie 2: Technique par comptage des colonies obtenues sur membranes à 44 °C
© ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés iii

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ISO 11866-2:2005(F)
FIL 170-2:2005(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération internationale de laiterie) est une fédération mondiale du secteur laitier avec un Comité
National dans chacun de ses pays membres. Chaque Comité National a le droit de faire partie des Comités
permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux techniques. La FIL collabore avec l'ISO et pour
l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
Les projets de Normes internationales adoptés par les Équipes d'Action et les Comités permanents sont
soumis aux Comités Nationaux pour vote. Leur publication comme Normes internationales requiert
l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux votants de la FIL.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 11866-2⎪FIL 170-2 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires,
sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers, et la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.
L'ensemble des travaux a été confié au groupe d'experts mixte ISO/FIL/AOAC chargé des Contaminants
pathogènes (E102), sous la conduite de sa présidente, Mme R. Lodi (IT).
Cette édition de l'ISO 11866-2⎪FIL 170-2 annule et remplace l'ancienne partie 3 de la FIL 170A:1999, dont
l'ancienne partie 1 a été remplacée par l'ISO 7251:2005.

iv © ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés

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ISO 11866-2:2005(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 170-2:2005(F)

Lait et produits laitiers — Dénombrement d'Escherichia coli
présumés —
Partie 2:
Technique par comptage des colonies obtenues sur
membranes à 44 °C
1 Domaine d'application
La présente partie de l'ISO 11866⎪FIL 170 spécifie une méthode pour le dénombrement d'Escherichia coli
présumés, au moyen de la technique de comptage des colonies à 44 °C.
Cette méthode est applicable aux:
⎯ lait et produits laitiers liquides;
⎯ lait sec, lactosérum sucré sec, babeurre sec et lactose;
⎯ caséine acide, caséine lactique et caséine présure;
⎯ caséinates et lactosérum acide sec;
⎯ fromage et fromages fondus;
⎯ beurre;
⎯ produits laitiers congelés (y compris les glaces de consommation);
⎯ crème anglaise, desserts et crème.
La méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 11866|FIL 170 est la méthode recommandée pour les
échantillons supposés contenir un nombre relativement important d'Escherichia coli présumés (plus de 100
par gramme ou 10 par millilitre).
ATTENTION — Certaines souches pathogènes d'Escherichia coli ne se développent pas à 44 °C.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Recommandations et règles générales pour les examens
microbiologiques
ISO 8261⎪FIL 122, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons
pour essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
© ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés 1

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ISO 11866-2:2005(F)
FIL 170-2:2005(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Escherichia coli présumés
bactéries qui, à 44 °C, forment des colonies indole-positives (roses) caractéristiques sur membranes en
acétate de cellulose appliquées sur gélose tryptonée biliée, dans les conditions spécifiées dans la présente
partie de l'ISO 11866⎪FIL 170
4 Principe
4.1 Revivification
Ensemencement des membranes en acétate de cellulose appliquées sur gélose au glutamate modifiée avec
une quantité déterminée de l'échantillon pour essai ou de la suspension mère puis incubation à 37 °C pendant
4 h.
NOTE Ce mode opératoire permet la revivification d'Escherichia coli présumés ayant été endommagés au cours d'un
stockage dans des conditions de gel, de sécheresse ou de froid, ou endommagés par l'action de la chaleur ou par un
traitement chimique. Il permet également la diffusion de concentrations élevées d'hydrates de carbone fermentescibles
présents dans l'échantillon pour essai, ce qui évite leur interférence avec la formation d'indole au moment de l'isolement.
4.2 Isolement
Après la revivification, transfert des membranes de la gélose au glutamate modifiée sur la gélose tryptonée
biliée. Incubation à 44 °C pendant 18 h à 24 h.
4.3 Recherche
Mise en évidence de la présence sur la membrane d'Escherichia coli présumés par la formation d'indole à
partir de chaque colonie.
4.4 Calcul
Calcul du nombre d'unités formant colonies (UFC) d'Escherichia coli présumés par gramme ou par millilitre
d'échantillon à partir du nombre de colonies indole-positives obtenues sur les membranes à des niveaux de
dilutions choisis afin de donner un résultat significatif.
5 Diluant, milieux de culture et réactif
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoires, voir l'ISO 7218 et l'ISO 8261.
Si les milieux de culture et les réactifs préparés ne sont pas utilisés extemporanément, ils doivent, sauf
indications contraires, être conservés à l'obscurité à une température située entre 0 °C et +5 °C pendant
1 mois au maximum, dans des conditions évitant toute modification de leur composition.
5.2 Diluant
Voir l'ISO 8261.
2 © ISO et FIL 2005 – Tous droits réservés

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ISO 11866-2:2005(F)
FIL 170-2:2005(F)
5.3 Milieux de culture et réactif
5.3.1 Milieu de revivification: gélose au glutamate modifiée
5.3.1.1 Composition
Glutamate de sodium 6,35 g
Lactose 10,0 g
Formiate de sodium 0,25 g
L(–)Cystine 0,02 g
L(–)Acide aspartique 0,02 g
L(+)Arginine 0,024 g
Thiamine 0,001 g
Acide nicotinique 0,001 g
Acide pantothénique 0,001 g
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO ,7HO) 0,100 g
4 2
a
Citrate ammoniacal de fer(III) 0,010 g
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl ,2HO) 0,010 g
2 2
Hydrogénophosphate dipotassique (K HPO) 0,90 g
2 4
Chlorure d'ammonium 2,5 g
b
Agar-agar 12 g à 18 g
Eau 1 000 ml
a
Teneur en fer au moins égale à 15 % (fraction massique).
b
Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.
5.3.1.2 Préparation
Dissoudre le chlorure d'ammonium dans l'eau. Ajouter les autres composants et porter à ébullition.
Si nécessaire, ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation, il soit de 6,7 à 25 °C.
Répartir le milieu, par quantités de 100 ml, dans des récipients appropriés.
Stériliser à l'autoclave (6.1) réglé à 115 °C pendant 10 min.
5.3.1.3 Préparation des boîtes de gélose
Couler 12 ml à 15 ml de milieu refroidi à environ 45 °C dans les boîtes de Petri stériles (6.12) et laisser se
solidifier. Les boîtes peuvent être conservées entre 0 °C et +5 °C pendant 4 jours.
Juste avant l'emploi, sécher soigneusement les boîtes, de préférence avec le couvercle enlevé et avec la
surface de la gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3) réglée à 50 °C pendant 30 min ou jusqu'à
disparition des gouttelettes à la surface du milieu.
Il convient que la gélose soit suffisamment sèche pour éviter un excès d
...