ISO 10253:2006

Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum

ISO 10253:2006 specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the unicellular marine algae Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum by substances and mixtures contained in sea water.The method can be used for testing substances that are readily soluble in water and are not significantly degraded or eliminated in any other way from the test medium.

Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues marines avec Skeletonema costatum et Phaeodactylum tricornutum

L'ISO 10253:2006 spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des algues marines unicellulaires Skeletonema costatum et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des substances et des mélanges présents dans l'eau de mer. Cette méthode peut être utilisée pour soumettre à l'essai des substances facilement solubles dans l'eau et qui ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d'autre manière du milieu d'essai.

General Information

• Status: Withdrawn
• Publication Date: 09-Apr-2006
• Withdrawal Date: 09-Apr-2006
• ICS: 13.060.70 - Examination of biological properties of water
• Technical Committee: ISO/TC 147/SC 5 - Biological methods
• Drafting Committee: ISO/TC 147/SC 5/WG 5 - Toxicity - Algae and aquatic plants
• Current Stage: 9599 - Withdrawal of International Standard
• Completion Date: 04-Nov-2016

Relations

• Revised: ISO 10253:2016 - Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema sp. and Phaeodactylum tricornutum
• Effective Date: 31-May-2014
• Revises: ISO 10253:1995 - Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum
• Effective Date: 15-Apr-2008

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10253
Second edition
2006-04-15

Water quality — Marine algal growth
inhibition test with Skeletonema
costatum and Phaeodactylum
tricornutum
Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des algues
marines avec Skeletonema costatum et Phaeodactylum tricornutum




Reference number
ISO 10253:2006(E)
©
ISO 2006

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ISO 10253:2006(E)
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Published in Switzerland

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ISO 10253:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions. 1
4 Principle. 2
5 Materials . 2
5.1 Test organisms . 2
5.2 Water . 3
5.3 Sea water . 3
5.4 Nutrients . 4
6 Apparatus . 5
7 Procedure . 5
7.1 Preparation of growth medium. 5
7.2 Preparation of pre-culture and inoculum . 5
7.3 Choice of test concentrations . 6
7.4 Preparation of test substance stock solutions. 6
7.5 Preparation of test and control batches. 6
7.6 Incubation. 7
7.7 Measurements. 7
8 Validity criteria . 7
9 Interpretation of data. 8
9.1 Plotting growth curves. 8
9.2 Calculation of percentage inhibition. 8
9.3 Determination of EC(r) . 9
x
10 Expression of results . 9
11 Interpretation of results. 9
12 Reproducibility. 9
13 Test report . 10
Annex A (informative) Preparation of dilution series of mixtures in sea water (effluents
or elutriates) . 11
Bibliography . 12

© ISO 2006 – All rights reserved iii

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ISO 10253:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10253 was prepared by Technical Committee ISO/TC 147, Water quality, Subcommittee SC 5, Biological
methods.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 10253:1995), which has been technically
revised.

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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10253:2006(E)

Water quality — Marine algal growth inhibition test with
Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum
WARNING — Persons using this International Standard should be familiar with normal laboratory
practice. This International Standard does not purport to address all of the safety problems, if any,
associated with its use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health
practices and to ensure compliance with any national regulatory conditions.
IMPORTANT — It is absolutely essential that tests conducted according to this International Standard
be carried out by suitably trained staff.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the determination of the inhibition of growth of the
unicellular marine algae Skeletonema costatum and Phaeodactylum tricornutum by substances and mixtures
contained in sea water.
The method can be used for testing substances that are readily soluble in water and are not significantly
degraded or eliminated in any other way from the test medium.
NOTE With modifications, as described in ISO 14442 and ISO 5667-16, the inhibitory effects of poorly soluble
organic and inorganic materials, volatile compounds, metal compounds, effluents, marine water samples and elutriates of
sediments can be tested.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 5667-16, Water quality — Sampling — Part 16: Guidance on biotesting of samples
ISO 14442, Water quality — Guidelines for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile
compounds, metals and waste water
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
cell density
number of cells per unit volume of medium (x cells/ml)
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ISO 10253:2006(E)
3.2
specific growth rate
µ
proportional rate of increase in cell density per unit of time:
1dx
µ=× (1/day)
xtd
3.3
growth medium
mixture of sea water and nutrients which is used for pre-cultures and controls
3.4
test medium
mixture of sea water, nutrients (growth medium 3.3) and test material in which algal cells are incubated
3.5
test batch
mixture of sea water, nutrients and test material (test medium 3.4) inoculated with algae
3.6
control
mixture of sea water, nutrients (growth medium 3.3) without test material, inoculated with algae
3.7
effective concentration
EC(r)
x
concentration of test substance which results in an x % reduction in specific growth rate relative to the controls
4 Principle
Mono-specific algal strains are cultured for several generations in a defined medium containing a range of
concentrations of the test substance, prepared by mixing appropriate quantities of nutrient concentrate, sea
water, stock solutions of the test substance, and an inoculum of exponentially growing algal cells. The test
solutions are incubated for a period of 72 h ± 2 h, during which the cell density in each is measured at
intervals of at least every 24 h ± 2 h. Inhibition is measured as a reduction in specific growth rate, relative to
control cultures grown under identical conditions.
5 Materials
5.1 Test organisms
Use either of the following marine algae:
a) Skeletonema costatum (Greville) Cleve (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1); or
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SAG 1090-1a, NIVA BAC 2).
These algae are important and widely distributed phytoplankton species (phylum Bacillariophyta) in estuarine
and coastal areas.
The strains recommended are available in unialgal, non-axenic cultures from the following sources.
2 © ISO 2006 – All rights reserved

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ISO 10253:2006(E)
NIVA Norwegian Institute for Water Research
P.O Box 173 Kjelsås
N-0411 Oslo
Norway
CCAP Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
United Kingdom
SAG Collection of Algal Cultures
University of Göttingen
Albrecht-von-Haller Institute for Plant Science
Untere Karspüle 2
37073 Göttingen
Germany
Stock cultures may be maintained in the medium described in 7.1. Regular subculturing is necessary. Weekly
intervals may be necessary for Skeletonema; every two or three weeks may be sufficient for Phaeodactylum.
The stock cultures may also be maintained for extended periods on richer algal media such as those
recommended by the culture collection. It is recommended to keep the stock culture in the medium described
in 7.1 and in an exponential growth phase immediately before preparing the pre-culture for testing as
described in 7.2.
NOTE Like many freshwater algae, the diatom Phaeodactylum tricornutum can also be stored for several months in
[1]
alginate beads, without losing its viability . The algae can be liberated from the algal beads when needed to perform the
1)
toxicity tests .
5.2 Water
All water used in the preparation of the synthetic sea water, growth medium and test substance solutions shall
be deionized or of equivalent purity. Take special care to avoid contamination of the water by inorganic or
organic substances during preparation and storage. Equipment made of copper shall not be used.
5.3 Sea water
For culturing and testing Phaeodactylum, the growth medium (7.1) is made up by adding nutrients to either
natural [salinity = (30 ± 5) g/kg] or synthetic sea water (approximate salinity = 33 g/kg). For Skeletonema, the
use of natural sea water may be necessary for the long-term maintenance of cultures and may also be
necessary for the test medium, because a synthetic sea water medium may not always support sufficient
growth to meet the test quality criteria. If natural sea water is used, care shall be taken to ensure that it is not
polluted.
Prepare synthetic sea water with the composition given in Table 1 (approximate salinity = 33 g/kg). All the
chemicals used shall be of analytical grade.


1) The algae beads supplied by MICROBIOTESTS Inc., Venecoweg 19, 9810 Nazareth, Belgium, Tel [phone],
Fax [phone], Email [e-mail], are an example of a suitable commercially available product. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of this
product. Equivalent products may be used if they can be shown to lead to the same results.
© ISO 2006 – All rights reserved 3

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ISO 10253:2006(E)
Table 1 — Synthetic sea water
Concentration of salt in synthetic sea water
Salt
g/l
NaCI 22
MgCI⋅6HO 9,7
2 2
Na SO (anhydrous) 3,7
2 4
CaCI (anhydrous) 1,0
2
KCI 0,65
NaHCO 0,20
3
H BO 0,023
3 3

Filter the sea water through a 0,45 µm membrane filter in order to remove particulate material and algae.
5.4 Nutrients
Prepare three nutrient stock solutions in water, with the compositions given in Table 2.
Table 2 — Nutrient stock solutions
Nutrient Concentration in stock solution Final concentration in test solution
Stock solution 1
FeCI⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCI⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO⋅5H O 0,157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCI⋅6H O 0,404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
2
Stock solution 2
Thiamin hydrochloride 50 mg/l 25 µg/l
Biotin 0,01 mg/l 0,005 µg/l
Vitamin B (cyanocobalamin) 0,10 mg/l 0,05 µg/l
12
Stock solution 3
K PO 3,0 g/l 3,0 mg/l; 0,438 mg/l P
3 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l; 8,24 mg/l N
3
Na SiO⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l; 1,97 mg/l Si
2 3 2

NOTE These stock solutions are eventually diluted (see 7.1 and Annex A) to obtain the final nutrient concentrations
in the test solutions.
All the chemicals used shall be of reagent grade quality.
4 © ISO 2006 – All rights reserved

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ISO 10253:2006(E)
Sterilize stock solutions by filtration through a 0,2 µm membrane filter. Stock solutions 1 and 3 may also be
sterilized by autoclaving at 120 °C for at least 15 min.
Store the stock solutions in the dark at 4 °C.
6 Apparatus
All equipment which comes into contact with the test medium shall be made of glass or a chemically inert
material.
Use normal laboratory apparatus and in addition the following.
6.1 Temperature-controlled cabinet or room, with a white fluorescent light providing continuous even
illumination, suitable for the lighting requirements specified for the test in 7.6.
6.2 Apparatus for measuring algal cell density, preferably a particle counter or a microscope with a
counting chamber.
Alternatively, determine the state of growth of the algal cultures by an indirect procedure using for instance a
[2]
fluorimeter (e.g. in vitro fluorescence ), when sufficiently sensitive and if shown to be sufficiently well
correlated with the cell density. The apparatus used shall be capable of accurately measuring cell densities as
low as the inoculum cell density and to distinguish between algal growth and disturbing effects, for example,
the presence of particulate matter and colour of the sample. Spectrophotometers may be suffici
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 10253
Deuxième édition
2006-04-15

Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la
croissance des algues marines avec
Skeletonema costatum et Phaeodactylum
tricornutum
Water quality — Marine algal growth inhibition test with Skeletonema
costatum and Phaeodactylum tricornutum




Numéro de référence
ISO 10253:2006(F)
©
ISO 2006

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ISO 10253:2006(F)
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peut être imprimé ou visualisé, mais ne doit pas être modifié à moins que l'ordinateur employé à cet effet ne bénéficie d'une licence
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Publié en Suisse

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ISO 10253:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
1 Domaine d'application. 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions. 1
4 Principe. 2
5 Matériels . 2
5.1 Organismes d'essai . 2
5.2 Eau. 3
5.3 Eau de mer. 3
5.4 Nutriments . 4
6 Appareillage . 5
7 Mode opératoire . 5
7.1 Préparation du milieu de croissance. 5
7.2 Préparation de la préculture et de l'inoculum. 5
7.3 Sélection des concentrations de l'essai. 6
7.4 Préparation des solutions mères de substance d'essai. 6
7.5 Préparation des lots d'essai et des témoins. 6
7.6 Incubation. 7
7.7 Mesurages . 7
8 Critères de validité. 7
9 Interprétation des données. 8
9.1 Tracé des courbes de croissance. 8
9.2 Calcul du pourcentage d'inhibition. 8
9.3 Détermination des valeurs de EC(r) . 9
x
10 Expression des résultats . 9
11 Interprétation des résultats . 9
12 Reproductibilité. 9
13 Rapport d'essai . 10
Annexe A (informative) Préparation des gammes de dilution des mélanges en eau de mer
(effluents ou élutriats) . 11
Bibliographie . 12

© ISO 2006 – Tous droits réservés iii

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ISO 10253:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10253 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 147, Qualité de l'eau, sous-comité SC 5,
Méthodes biologiques.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 10253:1995), dont elle constitue une
révision technique.

iv © ISO 2006 – Tous droits réservés

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NORME INTERNATIONALE ISO 10253:2006(F)

Qualité de l'eau — Essai d'inhibition de la croissance des
algues marines avec Skeletonema costatum et Phaeodactylum
tricornutum
ATTENTION — Il convient que les personnes utilisant la présente Norme internationale soient
familiarisées avec les pratiques de laboratoire normales. La présente Norme internationale ne prétend
pas couvrir tous les problèmes de sécurité potentiels associés à son utilisation. Il est de la
responsabilité de l'utilisateur de mettre en place des pratiques d'hygiène et de sécurité adéquates et
de s'assurer de la conformité avec toutes les dispositions réglementaires nationales.
IMPORTANT — Il est absolument essentiel que les essais requis dans la présente Norme
internationale soient menés par du personnel expérimenté.
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de détermination de l'inhibition de la croissance des
algues marines unicellulaires Skeletonema costatum et Phaeodactylum tricornutum provoquée par des
substances et des mélanges présents dans l'eau de mer.
Cette méthode peut être utilisée pour soumettre à essai des substances facilement solubles dans l'eau et qui
ne sont pas sensiblement dégradées ou éliminées d'une autre manière du milieu d'essai.
NOTE Avec les modifications décrites dans l'ISO 14442 et dans l'ISO 5667-16, il est possible de soumettre à essai
les effets inhibiteurs de matières organiques et inorganiques peu solubles, de composés volatils, de composés
métalliques, d'effluents, d'échantillons d'eaux marines et d'élutriats de sédiments.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 5667-16, Qualité de l'eau — Échantillonnage — Partie 16: Lignes directrices pour les essais biologiques
des échantillons
ISO 14442, Qualité de l'eau — Lignes directrices pour essais d'inhibition de la croissance algale avec des
matières peu solubles, des composés volatils, des métaux et des eaux résiduaires
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
densité cellulaire
nombre de cellules par unité de volume du milieu (x cellules/ml)
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1

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ISO 10253:2006(F)
3.2
taux de croissance spécifique
µ
taux proportionnel de l'augmentation de la densité cellulaire par unité de temps:
1dx
µ=× (1/jour)
xtd
3.3
milieu de croissance
mélange d'eau de mer et de nutriments utilisé pour les précultures et les témoins
3.4
milieu d'essai
mélange d'eau de mer, de nutriments (milieu de croissance 3.3) et de matériel d'essai dans lequel sont
incubées les cellules algales
3.5
lot d'essai
mélange d'eau de mer, de nutriments et de matériel d'essai (milieu d'essai 3.4) inoculé avec les algues
3.6
témoin
mélange d'eau de mer, de nutriments (milieu de croissance 3.3) sans matériel d'essai, inoculé avec les algues
3.7
concentration efficace
EC(r)
x
concentration de la substance d'essai qui entraîne une réduction de x % du taux de croissance spécifique par
rapport à celui des témoins
4 Principe
Des souches monospécifiques d'algues sont cultivées pendant plusieurs générations dans un milieu défini
contenant une plage de concentrations de la substance d'essai, préparées en mélangeant des quantités
adéquates de concentré de nutriments, d'eau de mer et de solutions mères de la substance d'essai avec un
inoculum de cellules algales à croissance exponentielle. Les solutions d'essai sont incubées pendant une
période de (72 ± 2) h, pendant laquelle la densité cellulaire est mesurée dans chacune des solutions à
intervalles réguliers, au moins toutes les (24 ± 2) h. L'inhibition est mesurée en tant que réduction du taux de
croissance spécifique, par rapport aux cultures témoins cultivées dans des conditions identiques.
5 Matériels
5.1 Organismes d'essai
Utiliser l'une quelconque des algues marines suivantes:
a) Skeletonema costatum (Greville) Cleve (CCAP 1077/1C, NIVA BAC 1); ou
b) Phaeodactylum tricornutum Bohlin (CCAP 1052/1A, SAG 1090-1a, NIVA BAC 2).
Ces algues sont des espèces importantes et largement représentées du phytoplancton (phylum
Bacillariophyta) dans les zones estuariennes et côtières.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés

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ISO 10253:2006(F)
Les souches recommandées sont disponibles sous la forme de cultures algales monospécifiques, non
axéniques auprès des sources suivantes:
NIVA Norwegian Institute for Water Research
P.O Box 173 Kjelsås
N-0411 Oslo
Norvège
CCAP Dunstaffnage Marine Laboratory
P O Box 3 Oban
Argyll PA37 1QA
Royaume-Uni
SAG Collection of Algal Cultures
University of Göttingen
Albrecht-von-Haller Institute for Plant Science
Untere Karspüle 2
37073 Göttingen
Allemagne
Les cultures mères peuvent être conservées dans le milieu décrit en 7.1. Il est nécessaire de procéder à des
repiquages réguliers. Des intervalles hebdomadaires peuvent s'avérer nécessaires dans le cas de
Skeletonema, alors que des intervalles de deux ou de trois semaines peuvent suffire dans le cas de
Phaeodactylum. Les cultures mères peuvent aussi être conservées pendant des périodes plus longues dans
des milieux algaux plus riches tels que ceux recommandés par la collection de souches. Il est recommandé
de conserver la culture mère dans le milieu décrit en 7.1 et dans une phase de croissance exponentielle, juste
avant de préparer la préculture pour essai comme décrit en 7.2.
NOTE Comme pour un grand nombre d'algues d'eau douce, il est aussi possible de conserver la diatomée
[1]
Phaeodactylum tricornutum pendant plusieurs mois dans des billes d'alginate, sans qu'elle perde sa viabilité . Les algues
1)
peuvent être libérées des billes algales au moment voulu de réalisation des essais de toxicité .
5.2 Eau
Toute l'eau utilisée pour la préparation de l'eau de mer synthétique, du milieu de croissance et des solutions
de substance d'essai doit être déionisée ou d'une pureté équivalente. Veiller tout particulièrement à éviter la
contamination de l'eau par des substances inorganiques ou organiques pendant la préparation et la
conservation. Il ne faut pas utiliser de matériel fabriqué avec du cuivre.
5.3 Eau de mer
Pour la culture et l'essai de Phaeodactylum, le milieu de croissance (7.1) est obtenu en ajoutant des
nutriments à de l'eau de mer naturelle [salinité = (30 ± 5) g/kg] ou synthétique (salinité approximative
= 33 g/kg). Dans le cas de Skeletonema, l'utilisation d'eau de mer naturelle peut s'avérer nécessaire pour la
perpétuation des souches à long terme et peut aussi s'avérer nécessaire pour le milieu d'essai, car un milieu
d'eau de mer synthétique peut ne pas toujours supporter la croissance minimale satisfaisant aux critères de
qualité de l'essai. Si de l'eau de mer naturelle est utilisée, il faut faire attention à garantir qu'elle n'est pas
polluée.

1) Les billes d'algues fournies par MICROBIOTESTS Inc., Venecoweg 19, 9810 Nazareth, Belgique, Tél. (32) 9 380
8545, Fax [phone], courriel [e-mail], sont un exemple convenable de produit disponible dans le
commerce. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs de la présente Norme internationale et ne signifie
nullement que l'ISO approuve ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s'il peut être démontré qu'ils
permettent d'obtenir les mêmes résultats.
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ISO 10253:2006(F)
Préparer l'eau de mer synthétique d'après la composition indiquée dans le Tableau 1 (salinité
approximative = 33 g/kg). Tous les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.
Tableau 1 — Eau de mer synthétique
Concentration de sel dans l'eau de mer synthétique
Sel
g/l
NaCI 22
MgCI⋅6HO 9,7
2 2
Na SO (anhydre) 3,7
2 4
CaCI (anhydre) 1,0
2
KCI 0,65
NaHCO 0,20
3
H BO 0,023
3 3

Filtrer l'eau de mer sur une membrane filtrante de 0,45 µm pour éliminer les particules et les algues.
5.4 Nutriments
Préparer trois solutions mères nutritives avec de l'eau, selon les compositions indiquées dans le Tableau 2.
NOTE Ces solutions mères sont éventuellement diluées (voir 7.1 et l'Annexe A), afin d'obtenir les concentrations
finales des nutriments dans les solutions d'essai.
Tous les produits chimiques utilisés doivent être des réactifs de qualité reconnue.
Stériliser les solutions mères par filtration sur membrane de 0,2 µm. Il est aussi possible de stériliser les
solutions mères 1 et 3 en autoclave à 120 °C pendant au moins 15 min.
Conserver les solutions mères à l'abri de la lumière à 4 °C.
Tableau 2 — Solutions mères nutritives
Concentration Concentration finale
Nutriment
dans la solution mère dans la solution d'essai
Solution mère 1
FeCI⋅6H O 48 mg/l 149 µg/l (Fe)
3 2
MnCI⋅4H O 144 mg/l 605 µg/l (Mn)
2 2
ZnSO⋅7H O 45 mg/l 150 µg/l (Zn)
4 2
CuSO⋅5H O 0,157 mg/l 0,6 µg/l (Cu)
4 2
CoCI⋅6H O 0,404 mg/l 1,5 µg/l (Co)
2 2
H BO 1 140 mg/l 3,0 mg/l (B)
3 3
Na EDTA 1 000 mg/l 15,0 mg/l
2
Solution mère 2
Chlorhydrate de thiamine 50 mg/l 25 µg/l
Biotine 0,01 mg/l 0,005 µg/l
Vitamine B (cyanocobalamine) 0,10 mg/l 0,05 µg/l
12
Solution mère 3
K PO 3,0 g/l 3,0 mg/l; 0,438 mg/l P
3 4
NaNO 50,0 g/l 50,0 mg/l; 8,24 mg/l N
3
Na SiO⋅5H O 14,9 g/l 14,9 mg/l; 1,97 mg/l Si
2 3 2
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6 Appareillage
Tout le matériel entrant en contact avec le milieu d'essai doit être fabriqué en verre ou à partir d'un matériau
chimiquement inerte.
Utiliser l'appareillage normal de laboratoire en sus de ce qui suit.
6.1 Caisson ou pièce à température contrôlée, avec un tube fluorescent blanc fournissant un éclairage
uniforme continu, convenant aux exigences de luminosité spécifiées pour l'essai en 7.6.
6.2 Appareillage pour le mesurage de la densité cellulaire des algues, de préférence un compteur de
particules ou un microscope sur cellule de comptage.
Sinon, déterminer l'état de croissance des cultures algales par un mode opératoire indirect, en utilisant par
[2]
exemple un fluorimètre (par exemple fluorescence in vitro ), lorsqu'il est suffisamment sensible et s'il est
démontré que sa corrélation avec la densité cellulaire est suffisamment élevée. L'appareillage utilisé doit être
capable de mesurer exactement des densités cellulaires aussi faibles que la densité cellulaire de l'inoculum et
de faire la distinction entre la croissance algale et les effets perturbateurs, par exemple présence de particules
et couleur de l'échantillon. Des spectrophotomètres peuvent être suffisamment sensibles pour mesurer
4
10 cellules/ml à condition qu'une longueur de trajet suffisante (jusqu'à 10 cm) puisse être utilisée. Cependant,
cette technique est particulièrement sensible aux interférences des matières en suspension et des substances
colorées à de faibles densités cellulaires.
6.3 Flacons de culture, par exemple des flacons coniques d'une capacité de 250 ml avec bouchon
perméable à l'air.
6.4 Appareillage pour filtration sur membrane, filtres de diamètre moyen de pore de 0,2 µm e
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