ISO 11702:2016

Animal and vegetable fats and oils - Enzymatic determination of total sterols content

ISO 11702:2016 specifies a method for the quantitative determination of the total sterols content by means of an enzymatic staining test. The method is applicable to free and esterified sterols in animal and vegetable fats and oils, fatty foods and related products. The determination is applicable to sample quantities of 1 g to 2 g of fat. The method is not applicable to dark coloured fats and oils. The enzyme is not specific for cholesterol, but also oxidizes other 3-hydroxysterols. The method has not been tested for products fortified with sterols at higher levels. Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of ISO 11702:2016.

Corps gras d'origines animale et végétale — Détermination enzymatique de la teneur en stérols totaux

L'ISO 11702 :2016 spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur en stérols totaux à l'aide d'un essai de coloration enzymatique. La méthode s'applique aux stérols libres et estérifiés, contenus dans les corps gras d'origines animale et végétale, dans les aliments gras et les produits connexes. La détermination s'applique aux quantités d'échantillon de 1 g à 2 g de matière grasse. Cette méthode ne s'applique pas aux corps gras de couleur sombre. L'enzyme n'est pas spécifique du cholestérol et oxyde également d'autres 3-hydroxystérols. La méthode n'a pas été testée pour des produits enrichis avec des stérols à des niveaux plus élevés. Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du domaine d'application de l'ISO 11702 :2016.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 13-Jul-2016
• ICS: 67.200.10 - Animal and vegetable fats and oils
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 11 - Animal and vegetable fats and oils
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Start Date: 24-Jan-2022
• Completion Date: 13-Dec-2025

Relations

• Revises: ISO 11702:2009 - Animal and vegetable fats and oils - Enzymatic determination of total sterols content
• Effective Date: 05-Nov-2015

Overview

ISO 11702:2016 specifies an enzymatic staining test for the quantitative determination of total sterols in animal and vegetable fats and oils, fatty foods and related products. The method measures both free and esterified sterols on sample quantities of 1 g to 2 g of fat. Results are reported as cholesterol for animal fats and β‑sitosterol for vegetable fats. The procedure is spectrophotometric and based on oxidation of 3‑hydroxysterols by cholesterol oxidase and formation of a coloured lutidine dye measured at 405 nm.

Note: ISO 11702:2016 is not applicable to dark‑coloured fats and oils, milk and milk products (or fat derived from them), nor has it been validated for products fortified with high levels of added sterols. The enzyme oxidizes several 3‑hydroxysterols and is therefore not cholesterol‑specific.

Key topics and requirements

• Principle: saponification → isolation of unsaponifiable fraction → enzymatic oxidation (cholesterol oxidase) → dye formation (acetylacetone/formaldehyde chemistry) → spectrophotometric measurement at 405 nm.
• Sample size: 1–2 g of fat; ensure final test solution sterol concentration is within method range.
• Quantification: dye absorbance converted to sterol mass concentration and expressed as mg sterols per 100 g of fat (cholesterol basis for animal, β‑sitosterol basis for vegetable).
• Reagents and apparatus: specified enzyme preparations (cholesterol oxidase, catalase), methanolic KOH for saponification, buffer systems, and a spectrophotometer with 1 cm cuvette.
• Limitations: not suitable for dark coloured matrices or milk fats; enzyme reacts with other 3β‑hydroxysterols; not validated for sterol‑fortified products.
• Performance: includes interlaboratory precision data and definitions for repeatability and reproducibility limits.

Practical applications

• Quality control and compositional analysis in edible oils and fats manufacturing.
• Routine testing in food testing laboratories for sterol profiling of vegetable and animal fat products.
• Regulatory and labeling compliance where total sterol content is required.
• Research applications measuring total phytosterols in plant oils (expressed as β‑sitosterol).

Who uses ISO 11702:2016

• Food and oil industry laboratories (QC/QA teams)
• Third‑party testing and certification bodies
• Regulatory laboratories and inspectors
• Academic and industrial researchers analyzing sterol content in fats and oils

Related standards

• ISO 661 - Preparation of test sample (referenced for sample prep)
• ISO 3696 - Water for analytical laboratory use
• ISO 5555 - Recommended sampling (sampling not part of ISO 11702)
• Method equivalence noted to IUPAC method 2.404 and DGF F‑III 2 (91)

Keywords: ISO 11702:2016, sterols, enzymatic determination, animal and vegetable fats and oils, cholesterol oxidase, spectrophotometric assay, total sterol content.

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11702
Second edition
2016-07-15
Animal and vegetable fats and oils —
Enzymatic determination of total
sterols content
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination
enzymatique de la teneur en stérols totaux
Reference number
©
ISO 2016
© ISO 2016, Published in Switzerland
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Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of the test sample . 3
9 Procedure. 3
10 Result of the determination . 4
11 Precision of the method . 5
11.1 Interlaboratory test. 5
11.2 Repeatability limit . 5
11.3 Reproducibility limit . 5
12 Test report . 6
Annex A (informative) Results of an interlaboratory test . 7
Bibliography . 8
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www.iso.org/iso/foreword.html.
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 11, Animal
and vegetable fats and oils.
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 11702:2009), of which it constitutes a
minor revision. The scope has been revised to state that the document is not applicable to milk and milk
fat products.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 11702:2016(E)
Animal and vegetable fats and oils — Enzymatic
determination of total sterols content
1 Scope
This International Standard specifies a method for the quantitative determination of the total sterols
content by means of an enzymatic staining test. The method is applicable to free and esterified sterols
in animal and vegetable fats and oils, fatty foods and related products. The determination is applicable
to sample quantities of 1 g to 2 g of fat.
The method is not applicable to dark coloured fats and oils. The enzyme is not specific for cholesterol,
but also oxidizes other 3-hydroxysterols. The method has not been tested for products fortified with
sterols at higher levels.
Milk and milk products (or fat coming from milk and milk products) are excluded from the scope of this
International Standard.
[8] [7]
NOTE The method is technically equivalent to IUPAC method 2.404 and DGF standard method F-III 2 (91).
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated
references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 661, Animal and vegetable fats and oils — Preparation of test sample
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
total sterols content
w
sterols
mass fraction of sterols determined by the method specified in this International Standard
Note 1 to entry: For vegetable fats and oils, the sterols content is expressed as β-sitosterol; for animal fats, as
cholesterol.
Note 2 to entry: The total sterols content is expressed in milligrams per 100 g of fat.
4 Principle
The test sample is saponified and the sterols in the unsaponifiable matter are determined enzymatically.
Cholesterol is oxidized by cholesterol oxidase to cholestenone. The equimolar amount of hydrogen
peroxide produced in the process oxidizes in the presence of catalase methanol to formaldehyde. In
the presence of ammonium ions, with acetylacetone, it forms a yellow lutidine dye (3,5-diacetyl-1,4-
dihydrolutidine). The latter is determined spectrophotometrically in the visible range at 405 nm. The
concentration of the dye is equivalent to the amount of sterols.
NOTE Cholesterol oxidase oxidizes cholesterol and other sterols having a hydroxy group in the 3β-position.
Therefore, phytosterols like stigmasterol and sitosterol are also determined.
5 Reagents
WARNING — Attention is drawn to the regulations which specify the handling of hazardous
substances. Technical, organizational and personal safety measures shall be followed.
Unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade.
5.1 Water, complying with ISO 3696, grade 3 or better.
5.2 Isopropanol.
5.3 Acetone.
5.4 Acetylacetone.
1)
5.5 Suspension of cholesterol oxidase, (EC 1.1.3.6) from Nocardia erythropolis, 15 U/ml.
1)
5.6 Suspension of catalase, (hydrogen peroxide oxido-reductase) (EC 1.11.1.6) from bovine liver.
5.7 Hydrochloric acid, c(HCl) = 8 mol/l.
5.8 Methanolic potassium hydroxide solution, c(KOH) = 0,5 mol/l.
Dissolve 2,8 g potassium hydroxide in a small amount of hot methanol, cool, and dilute with methanol
to 100 ml.
5.9 Ammonium phosphate buffer solution, adjusted to pH 7.
5.10 Solution 1.
Add 19,1 ml acetone (5.3) and 230 000 U catalase (5.6) to 50 ml buffer solution (5.9) in a 100 ml one-
mark volumetric flask (6.4), and make up to the mark with water (5.1).
5.11 Solution 2.
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 11702
Deuxième édition
2016-07-15
Corps gras d’origines animale
et végétale — Détermination
enzymatique de la teneur en stérols
totaux
Animal and vegetable fats and oils — Enzymatic determination of
total sterols content
Numéro de référence
©
ISO 2016
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 3
9 Mode opératoire. 4
10 Résultat de la détermination . 4
11 Fidélité de la méthode . 5
11.1 Essai interlaboratoires . 5
11.2 Limite de répétabilité . 5
11.3 Limite de reproductibilité . 6
12 Rapport d’essai . 6
Annexe A (informative) Résultats d’un essai interlaboratoires . 7
Bibliographie . 8
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires,
Sous-comité SC 11, Corps gras d’origines animale et végétale.
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 11702:2009), dont elle constitue
une révision mineure. Le domaine d’application a été révisé pour indiquer que le document n’est pas
applicable au lait et aux produits laitiers.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

NORME INTERNATIONALE ISO 11702:2016(F)
Corps gras d’origines animale et végétale — Détermination
enzymatique de la teneur en stérols totaux
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode pour la détermination quantitative de la teneur
en stérols totaux à l’aide d’un essai de coloration enzymatique. La méthode s’applique aux stérols libres
et estérifiés, contenus dans les corps gras d’origines animale et végétale, dans les aliments gras et les
produits connexes. La détermination s’applique aux quantités d’échantillon de 1 g à 2 g de matière grasse.
Cette méthode ne s’applique pas aux corps gras de couleur sombre. L’enzyme n’est pas spécifique du
cholestérol et oxyde également d’autres 3-hydroxystérols. La méthode n’a pas été testée pour des
produits enrichis avec des stérols à des niveaux plus élevés.
Le lait et les produits laitiers (ou les corps gras issus du lait et des produits laitiers) sont exclus du
domaine d’application de la présente Norme internationale.
[8]
NOTE Cette méthode est techniquement équivalente à la méthode IUPAC 2.404 et à la méthode normalisée
[7]
DGF F-III 2 (91) .
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 661, Corps gras d’origines animale et végétale — Préparation de l’échantillon pour essai
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
teneur en stérols totaux
w
sterols
fraction massique de stérols déterminée par la méthode spécifiée dans la présente Norme internationale
Note 1 à l’article: Pour les corps gras d’origine végétale, la teneur en stérols est exprimée sous forme de
ß-sitostérol; pour les matières grasses d’origine animale, elle est exprimée sous forme de cholestérol.
Note 2 à l’article: La teneur en stérols totaux est exprimée en milligrammes par 100 g de matière grasse.
4 Principe
L’échantillon est saponifié et les stérols présents dans la matière insaponifiable sont déterminés
par voie enzymatique. La cholestérol est oxydés par le cholestérol oxydase en cholesténone. La
quantité équimolaire de peroxyde d’hydrogène produite au cours du processus oxyde le méthanol en
formaldéhyde en présence d’une catalase. Le formaldéhyde réagit avec l’acétylacétone en présence
des ions ammonium, pour former un dérivé de la lutidine de couleur jaune (3,5-diacétyl-1,4-
dihydrolutidine). Ce composé coloré est déterminé par spectrophotométrie dans le domaine visible à
405 nm. La concentration en composé coloré est équivalente à la quantité de stérols.
NOTE La cholestérol oxydase oxyde le cholestérol ainsi que d’autres stérols ayant un groupe hydroxyle à la
position 3β. Par conséquent, les phytostérols comme le stigmastérol et le sitostérol sont également déterminés.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — L’attention est attirée sur les règlements qui régissent la manipulation des
substances dangereuses. Les mesures de sécurité sur les plans technique, organisationnel et du
personnel doivent être suivies.
Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau, conforme à l’ISO 3696, de qualité 3 ou mieux.
5.2 Isopropanol.
5.3 Acétone.
5.4 Acétylacétone.
1)
5.5 Cholestérol oxydase en suspension, (EC 1.1.3.6) de Nocardia erythropolis, 15 U/ml.
1)
5.6 Catalase en suspension, (peroxyde d’hydrogène oxydo-réductase) (EC 1.11.1.6) de foie de boeuf.
5.7 Acide chlorhydrique, c(HCl) = 8 mol/l.
5.8 Solution méthanolique d’hydroxyde de potassium, de concentration c(KOH) = 0,5 mol/l.
Dissoudre 2,8 g d’hydroxyde de potassium dans une petite quantité de méthanol chaud, laisser refroidir
et diluer avec du méthanol à 100 ml.
5.9 Solution tampon de phosphate d’ammonium, ajustée à pH 7.
5.10 Solution 1.
Ajouter 19,1 ml d’acétone (5.3) et 230 000 U de catalase (5.6) à 50 ml de la solution tampon (5.9) dans
une fiole jaugée de 100 ml (6.4), et compléter au trait avec de l’eau (5.1).
5.11 Solution 2.
Ajouter 0,26 ml d’acétylacétone (5.4) et 1,10 ml d’acétone (5.3) à 25 ml d’eau (5.1) dans une fiole jaugée
à un tra
...