ISO 18862:2025
(Main)Coffee and coffee products — Determination of acrylamide — Methods using high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS) and gas chromatography with mass spectrometric detection (GC-MS) after derivatization
Coffee and coffee products — Determination of acrylamide — Methods using high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS) and gas chromatography with mass spectrometric detection (GC-MS) after derivatization
This document specifies methods for the determination of acrylamide in coffee and coffee products by extraction with water, clean-up by solid-phase extraction (SPE) and determination by high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS) and gas chromatography with mass spectrometric detection (GC-MS) after derivatization. The methods were validated in a validation study for roasted coffee, soluble coffee, coffee substitutes and coffee products with ranges from 53 μg/kg to 612,1 μg/kg.
Café et dérivés du café — Dosage de l’acrylamide — Méthodes par chromatographie liquide à haute performance avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CLHP–SM/SM) et chromatographie en phase gazeuse avec détection par spectrométrie de masse (CG–SM) après dérivation
Le présent document spécifie des méthodes de dosage de l’acrylamide dans le café et les dérivés du café par extraction à l’eau, purification par extraction en phase solide (SPE) et dosage par chromatographie liquide à haute performance avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CLHP-SM/SM) et chromatographie en phase gazeuse avec détection par spectrométrie de masse (CG-SM) après dérivation. Les méthodes ont été validées au cours d’une étude de la méthode réalisée sur du café torréfié, du café soluble, des substituts de café et des dérivés du café dans des plages de concentration allant de 53 μg/kg à 612,1 μg/kg.
General Information
Relations
Standards Content (Sample)
International
Standard
ISO 18862
Second edition
Coffee and coffee products —
2025-11
Determination of acrylamide —
Methods using high-performance
liquid chromatography with
tandem mass spectrometric
detection (HPLC-MS/MS) and
gas chromatography with mass
spectrometric detection (GC-MS)
after derivatization
Café et dérivés du café — Dosage de l’acrylamide — Méthodes
par chromatographie liquide à haute performance avec
détection par spectrométrie de masse en tandem (CLHP–SM/
SM) et chromatographie en phase gazeuse avec détection par
spectrométrie de masse (CG–SM) après dérivation
Reference number
© ISO 2025
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CH-1214 Vernier, Geneva
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 1
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 3
7 Sampling . 4
8 Procedure . 4
8.1 General .4
8.2 Preparation of the sample extract .4
8.3 Clean-up of the extracts .5
8.3.1 Carrez precipitation .5
8.3.2 Solid-phase extraction.5
8.4 HPLC-MS/MS measurement . .5
8.4.1 High-performance liquid chromatography (HPLC) .5
8.4.2 Identification and quantification by mass spectrometry (HPLC-MS/MS) .6
8.5 Measurement with GC-MS .6
8.5.1 Derivatization and sample preparation for gas chromatography .6
8.5.2 Gas chromatography .7
8.5.3 Identification and quantification by mass spectrometry .7
9 Calibration . 7
9.1 General advice .7
9.2 Determination of linearity and definition of the working range .7
9.3 Calibration with internal standard solution .7
9.4 Determination of the laboratory specific recovery .8
10 Evaluation . 8
10.1 Criteria for identification .8
10.2 Calculation and final results .8
11 Precision data . 9
11.1 General .9
11.2 Repeatability .9
11.3 Reproducibility .9
11.4 Recovery .9
12 Measurement uncertainty . 9
13 Test report . 9
Annex A (informative) Performance characteristics .11
Annex B (informative) Examples of absorber materials .12
Annex C (informative) Examples of columns and analysis conditions.13
Annex D (informative) Examples for sample preparation and chromatographic conditions
using HPLC-MS/MS . 19
Bibliography .25
iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO document should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 15, Coffee, in
collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee CEN/TC 275,
Food analysis - Horizontal methods, in accordance with the Agreement on technical cooperation between ISO
and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 18862:2016), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— Annex D with examples for sample preparation and chromatographic conditions using HPLC-MS/MS has
been added.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.
iv
International Standard ISO 18862:2025(en)
Coffee and coffee products — Determination of acrylamide —
Methods using high-performance liquid chromatography with
tandem mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS) and gas
chromatography with mass spectrometric detection (GC-MS)
after derivatization
WARNING — The use of this document can involve hazardous materials, operations and equipment.
This document does not purport to address all the safety problems associated with its use. It is the
responsibility of the user of this document to take appropriate measures for ensuring the safety and
health of the personnel prior to application of this document and to fulfil statutory requirements for
this purpose.
1 Scope
This document specifies methods for the determination of acrylamide in coffee and coffee products by
extraction with water, clean-up by solid-phase extraction (SPE) and determination by high-performance
liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS) and gas chromatography
with mass spectrometric detection (GC-MS) after derivatization. The methods were validated in a validation
study for roasted coffee, soluble coffee, coffee substitutes and coffee products with ranges from 53 μg/kg to
612,1 μg/kg.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content constitutes
requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.
ISO and IEC maintain terminology databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at https:// www .electropedia .org/
4 Principle
The coffee sample is extracted with water or, in the case of soluble products, dissolved in water. A clean-up
by SPE is employed to remove interfering matrix compounds. Two alternative methods can be used for the
determination: HPLC-MS/MS or, after a bromination of the acrylamide, GC-MS. In both cases, solutions of
isotopic labelled internal standard are used.
5 Reagents
WARNING — In view of health risks when working with acrylamide, appropriate preventive and
protection measures shall be taken, such as using a fume cupboard, aspirating acrylamide-containing
solutions only with a pipette, and avoiding skin and eye contact or inhalation of acrylamide-
containing vapour.
If available, reagents of “residue analysis grade” or “analytical reagent grade” shall be used. The level of
impurities in the reagents that contribute to the blank should be negligibly small. The blank shall be checked
regularly.
For HPLC-MS/MS, the solutions according to 5.4.1 to 5.5.2 can be prepared using the HPLC eluent as a solvent.
The stability of these solutions depends on the mobile phase used and shall be validated.
When using GC-MS, all standard solutions according to 5.4.2 and 5.5.2 shall be subjected to the derivatization
step according to 8.5.1.
Instead of D3-acrylamide, it is also possible to use C acrylamide for the preparation of the internal standard
solution. However, in Clauses 8 and 9, the procedure and calculation are described for D3-acrylamide only.
5.1 Water, of grade 1 according to ISO 3696
5.2 Operating gases of high purity, suitable for gas chromatography and mass spectrometry according
to the instructions of the manufacturer of the apparatus.
5.3 Solvents, such as methanol, ethyl acetate, acetonitrile and n-hexane. MS-grade.
5.4 Acrylamide, C H NO, purity > 98 %, reference substance.
3 5
5.4.1 Acrylamide stock solution, mass concentration ρ = 1 000 μg/ml.
Weigh (0,10 ± 0,001) g of acrylamide into a 100 ml one-mark volumetric flask and swirl it in 30 ml of water in
order to dissolve the acrylamide. Fill up to the mark with water and mix well. The stock solution is stable for
at least three months when stored protected from light at a maximum of 6 °C.
Alternatively, a commercially available solution with a mass concentration of ρ = 1 000 µg/ml may be used.
The information of the manufacturer regarding the stability of the solution shall be observed.
5.4.2 Acrylamide calibration solution, ρ = 10 μg/ml.
Using a pipette, transfer (1,0 ± 0,001) ml of the acrylamide stock solution (5.4.1) into a 100 ml one-mark
volumetric flask and fill up to the mark with water. This solution shall be stored protected from light at a
maximum of 6 °C and shall be freshly prepared every working day. Depending on the working range, more
dilution steps can be necessary.
5.5 D3-acrylamide (acrylamide-2,3,3-d3) internal standard solution, C H D NO, purity > 98 %,
3 2 3
reference substance.
5.5.1 D3-acrylamide stock solution (internal standard solution).
Weigh (0,10 ± 0,001) g of D3-acrylamide into a 100 ml one-mark volumetric flask and swirl it in 30 ml of
water in order to dissolve the D3-acrylamide. Fill up to the mark with water and mix well. The stock solution
is stable for at least three months when stored protected from light at a maximum of 6 °C.
Alternatively, a commercially available solution with a mass concentration of ρ = 1 000 µg/ml may be used.
The information of the manufacturer regarding the stability of the solution shall be observed.
5.5.2 D3-acrylamide internal standard solution.
Using a pipette, transfer (1,0 ± 0,001) ml of the D3-acrylamide stock solution (5.5.1) into a 100 ml one-mark
volumetric flask and fill up to the mark with water. This solution shall be stored protected from light at a
maximum of 6 °C and shall be freshly prepared every working day. Depending on the working range, more
dilution steps can be necessary.
5.6 Saturated bromine water.
Saturate distilled water with bromine in a 100 ml one-mark volumetric flask (with a glass stopper) until a
phase of bromine is formed at the bottom of the flask (around 3,5 % of bromine at 4 °C). Acidify the bromine
water to a pH of about 1 using concentrated hydrobromic acid (ρ(HBr) = 1,48 g/cm ).
If stored at 4 °C and protected from light, the solution can be used for about four weeks.
5.7 Potassium bromide, KBr.
5.8 Sodium thiosulfate (pentahydrate), Na S O · 5 H O.
2 2 3 2
5.9 Triethylamine, (C H ) N.
2 5 3
5.10 Sodium sulfate, Na SO anhydrous, granular.
2 4,
5.11 Carrez solution I.
Dissolve 10,6 g of potassium hexacyanoferrate trihydrate (II) K [Fe(CN) ] · 3 H O in 100 ml of water. If
4 6 2
stored at 4 °C and protected from light, the solution is stable for six months.
5.12 Carrez solution II.
Dissolve 21,9 g of zinc acetate dihydrate Zn(CH COO) · 2 H O in 100 ml of water. If stored at 4 °C and
3 2 2
protected from light, the solution is stable for six months.
5.13 Borate buffer, pH 8,6.
Mix 68 ml of a 0,1 molar sodium borate solution (20,12 g Na B O per litre of water) and 32 ml of 0,1 molar
2 4 7
hydrochloric acid, c(HCl) = 0,1 mol/l, in a 100 ml one-mark volumetric flask.
6 Apparatus
The usual laboratory apparatus and, in particular, the following shall be used.
Apparatus and parts of the apparatus which come into contact with the sample and extract shall be
free of residues which can cause blank values. Glassware or equipment made of stainless steel or PTFE
(polytetrafluoroethylene) shall be used.
6.1 Analytical balance, capable of weighing to an accuracy of 0,1 mg.
6.2 Coffee mill, suitable for grinding roasted coffee beans.
6.3 Glassware, for collecting and storing the extracts, preferably made of amber glass, as sample vials for
manual or automatic use, equipped with an inert seal (e.g. vials with PTFE-coated septum).
6.4 Ultrasonic bath, capable of being maintained at 40 °C.
6.5 Laboratory centrifuge, suitable for 15 ml and 50 ml centrifugal tubes and with a minimum g-force
of 2 000g.
6.6 Centrifuge tubes, of 15 ml and 50 ml.
6.7 One-mark volumetric flask, of 20 ml and 100 ml.
6.8 Pipettes, glass or automatic, suitable for measuring volume ranges of standard solutions and sample
extract dilutions.
6.9 Glass or polypropylene cartridges, with sorbents for the SPE, and for the clean-up of extracts in
8.3.2 and 8.5.1 (examples are given in Table B.1).
6.10 High performance liquid chromatograph (for the test procedure according to 8.4), equipped with
electrospray ionization (ESI) and a mass spectrometric detector (HPLC-MS/MS), and with a gas supply as
specified by the manufacturer.
6.11 HPLC column (for the test procedure according to 8.4), suitable for acrylamide chromatography
(examples are given in Table C.1).
6.12 Gas chromatograph, (for the test procedure according to 8.5) with mass spectrometric detector (GC-
MS) and operating gas supply (5.2) as specified by the manufacturer.
6.13 GC column, (for the test procedure according to 8.5) capillary column, suitable for acrylamide
chromatography (examples are given in Table C.2).
6.14 Membrane filter units, syringe filter (e.g. cellulose acetate filters 0,45 µm pore size) suitable for
filtration of sample eluate obtained by SPE before injection into the chromatographic system.
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document. The sampling procedure shall be subject to
agreement by the interested parties. A representative, thoroughly mixed sample shall be used, which has
not been damaged or adulterated during transport or storage.
In order to exclude changes in the acrylamide levels, the analysis shall be performed shortly after reception
of the sample. When stored for more than two weeks, samples should be kept at a temperature below 6 °C.
The date of receipt of the sample, as well as the date of roasting or the best-before date, shall be documented
along with the date of analysis.
8 Procedure
8.1 General
To avoid losses of the analyte, the samples shall be protected from light during extraction and further
preparation. For this reason, amber glassware shall always be used. Otherwise, the content of the vessels
and flasks shall be protected from incident light using aluminium foil.
Examples for sample preparation and chromatographic conditions using HPLC-MS/MS are given in Annex D.
8.2 Preparation of the sample extract
If necessary, grind the sample in a coffee mill (6.2) and homogenize thoroughly.
Weigh 2 g of the homogenized sample of roasted coffee, soluble coffee or coffee substitute or 5 g of liquid
coffee beverage to the nearest 1 mg using an analytical balance (6.1) and transfer it into a 50 ml centrifuge
tube (6.6).
Add 2 ml of n-hexane to the test sample and shake briefly. Then spike the test sample with the internal
standard solution of D3-acrylamide in a concentration corresponding to the expected acrylamide level of the
sample.
EXAMPLE Weigh 2 g of coffee and add 100 µl internal standard solution (ρ = 10 µg/ml), which is equivalent to an
acrylamide mass fraction of 500 µg/kg in the coffee sample.
Add 20 ml of distilled water, shake briefly but vigorously, and sonicate (6.4) for 15 min at approximately 40 °C.
Allow a few minutes for precipitation. In the case of non-sedimenting samples. centrifuge (6.5) for 15 min
at 2 000g to separate suspended solids. Before liquid chromatography (8.4.1) or derivatization and gas
chromatographic separation (8.5), take 10 ml from the lower aqueous phase and use it for a further clean-
up according to 8.3. Take the lower aqueous phase through the upper hexane phase using a pipette without
removing the hexane phase. If necessary, the hexane phase may also be removed cautiously using a Pasteur
pipette.
8.3 Clean-up of the extracts
8.3.1 Carrez precipitation
Clean-up the sample extract prepared according to 8.2 by Carrez precipitation. Add 1 000 µl of Carrez
solution I (5.11) and shake. Add 1 000 µl of Carrez solution II (5.12) and shake again. After a short exposure
time, centrifuge for 4 min at 2 000g. Decant the supernatant, wash the residue with 2 ml to 3 ml of water,
centrifuge and decant again. Combine both aqueous solutions.
8.3.2 Solid-phase extraction
Clean-up the sample extract after Carrez precipitation (8.3.1) by SPE using two sequential cartridges with
adsorber material (examples are given in Tables B.1 and D.2). The first cartridge contains 500 mg of C18
material, the second cartridge 500 mg of ion exchanger. The cartridges can be used in a serial alignment. If
appropriate, a combined cartridge can be used (examples are given in Tables B.1 and D.4).
Condition both SPE columns according to the manufacturer’s instructions successively with methanol and
distilled water. Place the complete sample extract (8.3.1) on top of the upper (first) SPE column, allow to
soak and add 2 ml to 3 ml of water. Collect the eluate until the cartridge is dry. Place the eluate on top of
the second or lower conditioned ion exchange column, add 2 ml to 3 ml of water and collect the eluate. A
complete elution can be achieved by using a light vacuum or pressure. Collect the eluate including washing
water in a 20 ml one-mark volumetric flask and fill up to 20 ml with water.
8.4 HPLC-MS/MS measurement
8.4.1 High-performance liquid chromatography (HPLC)
Prior to the HPLC-MS/MS analysis, add organic solvent to the cleaned-up extract (8.3.2) in order to make up
the desired eluent composition and filter through a membrane filter (6.14) before injecting a suitable volume
(e.g. 10 µl to 100 µl depending on the column used) onto the HPLC column.
Optimize the device parameters of the HPLC system in accordance with the manufacturer’s instructions. The
chromatographic conditions shall be adjusted to suit the selected column (examples are given in Table C.1).
The clean-up stages according to 8.3.1 and 8.3.2 are essential for the chromatographic separation of the
analyte peaks from the interfering peaks. An example of chromatogram is given in Figures C.1 and C.2.
8.4.2 Identific
...
Norme
internationale
ISO 18862
Deuxième édition
Café et dérivés du café — Dosage
2025-11
de l’acrylamide — Méthodes par
chromatographie liquide à haute
performance avec détection par
spectrométrie de masse en tandem
(CLHP–SM/SM) et chromatographie
en phase gazeuse avec détection par
spectrométrie de masse (CG–SM)
après dérivation
Coffee and coffee products — Determination of acrylamide —
Methods using high-performance liquid chromatography with
tandem mass spectrometric detection (HPLC-MS/MS) and gas
chromatography with mass spectrometric detection (GC-MS)
after derivatization
Numéro de référence
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2025
Tous droits réservés. Sauf prescription différente ou nécessité dans le contexte de sa mise en œuvre, aucune partie de cette
publication ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique,
y compris la photocopie, ou la diffusion sur l’internet ou sur un intranet, sans autorisation écrite préalable. Une autorisation peut
être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: +41 22 749 01 11
E-mail: copyright@iso.org
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 1
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage . 4
8 Mode opératoire . 5
8.1 Généralités .5
8.2 Préparation de l’extrait d’échantillon .5
8.3 Purification des extraits .5
8.3.1 Précipitation de Carrez.5
8.3.2 Extraction en phase solide .5
8.4 Analyse par CLHP-SM/SM .6
8.4.1 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP) . .6
8.4.2 Identification et quantification par spectrométrie de masse (CLHP-SM/SM) .6
8.5 Analyse par CG-SM .6
8.5.1 Dérivation et préparation de l’échantillon pour la chromatographie en phase
gazeuse .6
8.5.2 Chromatographie en phase gazeuse .7
8.5.3 Identification et quantification par spectrométrie de masse .7
9 Étalonnage . 8
9.1 Conseil d’ordre général .8
9.2 Détermination de la linéarité et définition de la plage de travail .8
9.3 Étalonnage avec une solution d’étalon interne .8
9.4 Détermination du taux de récupération spécifique du laboratoire .8
10 Évaluation . 8
10.1 Critères d’identification . .8
10.2 Calcul et résultats finaux . . .8
11 Résultats de fidélité . 9
11.1 Généralités .9
11.2 Répétabilité .9
11.3 Reproductibilité . .10
11.4 Taux de récupération .10
12 Incertitude de mesure. 10
13 Rapport d’essai . 10
Annexe A (informative) Caractéristiques de performance .11
Annexe B (informative) Exemples de matériaux absorbants .12
Annexe C (informative) Exemples de colonnes et de conditions d’analyse .13
Annexe D (informative) Exemples de préparation des échantillons et de conditions
chromatographiques utilisant la CLHP-SM/SM . 19
Bibliographie .25
iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a
été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir
www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité de
tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait pas
reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application. Toutefois,
il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des informations
plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à l’adresse
www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié tout ou partie de
tels droits de propriété.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 15, Café,en collaboration avec le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits alimentaires —
Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) conformément à l’Accord de coopération
technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 18862:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— L’Annexe D, comportant des exemples de préparation des échantillons et de conditions chromatographiques
utilisant la CLHP-SM/SM, a été ajoutée.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.
iv
Norme internationale ISO 18862:2025(fr)
Café et dérivés du café — Dosage de l’acrylamide — Méthodes
par chromatographie liquide à haute performance avec
détection par spectrométrie de masse en tandem (CLHP–SM/
SM) et chromatographie en phase gazeuse avec détection par
spectrométrie de masse (CG–SM) après dérivation
AVERTISSEMENT — L’application du présent document peut impliquer l’utilisation de produits et
la mise en œuvre de modes opératoires et d’appareillages à caractère dangereux. Ce document ne
prétend pas couvrir tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur
du présent document de prendre les mesures appropriées pour assurer l’hygiène et la sécurité du
personnel avant l’application du présent document et de satisfaire aux exigences réglementaires
correspondantes.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie des méthodes de dosage de l’acrylamide dans le café et les dérivés du café
par extraction à l’eau, purification par extraction en phase solide (SPE) et dosage par chromatographie
liquide à haute performance avec détection par spectrométrie de masse en tandem (CLHP-SM/SM) et
chromatographie en phase gazeuse avec détection par spectrométrie de masse (CG-SM) après dérivation.
Les méthodes ont été validées au cours d’une étude de la méthode réalisée sur du café torréfié, du café
soluble, des substituts de café et des dérivés du café dans des plages de concentration allant de 53 μg/kg
à 612,1 μg/kg.
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour
les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
3 Termes et définitions
Aucun terme n’est défini dans le présent document.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en normalisation,
consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse https:// www .electropedia .org/
4 Principe
L’échantillon de café est extrait à l’eau ou, dans le cas de produits solubles, est dissous dans l’eau. Une
purification par extraction en phase solide est utilisée pour éliminer les composés interférents de la matrice.
Deux méthodes alternatives peuvent être utilisées pour le dosage: la CLHP-SM/SM ou, après une bromation
de l’acrylamide, la CG-SM. Dans les deux cas, des solutions d’étalons internes marqués par un isotope sont
utilisées.
5 Réactifs
AVERTISSEMENT — Étant donné les risques pour la santé liés à l’utilisation de l’acrylamide, des
mesures préventives et de protection appropriées doivent être prises, comme l’utilisation d’une
hotte aspirante, l’aspiration des solutions contenant de l’acrylamide uniquement avec une pipette
et l’absence de contact avec la peau et les yeux ou de toute inhalation de vapeur contenant de
l’acrylamide.
S’ils sont disponibles, des réactifs de «qualité pour analyse de résidus» ou de «qualité réactif analytique»
doivent être utilisés. Il convient que le niveau d’impuretés dans les réactifs contribuant au blanc soit
négligeable. Le blanc doit être contrôlé régulièrement.
Dans le cas de la CLHP-SM/SM, les solutions selon 5.4.1 à 5.5.2 peuvent être préparées en utilisant la phase
mobile de CLHP comme solvant. La stabilité de ces solutions dépend de la phase mobile utilisée et doit être
validée.
En cas d’utilisation de la CG-SM, toutes les solutions étalons selon 5.4.2 et 5.5.2 doivent être soumises à une
étape de dérivation conformément à 8.5.1.
À la place du D3-acrylamide, il est également possible d’utiliser de l’acrylamide C pour la préparation
de la solution d’étalon interne. Toutefois, dans les Articles 8 et 9, le mode opératoire et le calcul décrits
s’appliquent uniquement au D3-acrylamide.
5.1 Eau, de qualité 1 selon l’ISO 3696.
5.2 Gaz opératoires de grande pureté, adaptés pour la chromatographie en phase gazeuse et la
spectrométrie de masse selon les instructions du fabricant de l’appareil.
5.3 Solvants, tels que le méthanol, l’acétate d’éthyle, l’acétonitrile et le n-hexane. Qualité SM.
5.4 Acrylamide, C H NO, d’une pureté > 98 %, substance de référence.
3 5
5.4.1 Solution mère d’acrylamide, concentration massique ρ = 1 000 μg/ml.
Peser (0,10 ± 0,001) g d’acrylamide dans une fiole jaugée de 100 ml et agiter dans 30 ml d’eau pour dissoudre
l’acrylamide. Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau et bien mélanger. La solution mère est stable
pendant au moins 3 mois lorsqu’elle est conservée à l’abri de la lumière à une température maximale de 6 °C.
En variante, une solution disponible dans le commerce ayant une concentration massique de ρ = 1 000 µg/
ml peut être utilisée. Les informations fournies par le fabricant en ce qui concerne la stabilité de la solution
doivent être suivies.
5.4.2 Solution d’étalonnage d’acrylamide, ρ = 10 μg/ml.
À l’aide d’une pipette, transférer (1,0 ± 0,001) ml de la solution mère d’acrylamide (5.4.1) dans une fiole
jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau. Cette solution doit être conservée à l’abri
de la lumière à une température maximale de 6 °C et elle doit être renouvelée tous les jours. En fonction de la
plage de travail, des étapes de dilution supplémentaires peuvent être nécessaires.
5.5 Solution d’étalon interne de D3-acrylamide (acrylamide-2,3,3-d3), C H DNO, d’une
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pureté > 98 %, substance de référence.
5.5.1 Solution mère de D3-acrylamide (solution d’étalon interne).
Peser (0,10 ± 0,001) g de D3-acrylamide dans une fiole jaugée de 100 ml et agiter dans 30 ml d’eau pour
dissoudre le D3-acrylamide. Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau et bien mélanger. La solution
mère est stable pendant au moins 3 mois lorsqu’elle est conservée à l’abri de la lumière à une température
maximale de 6 °C.
En variante, une solution disponible dans le commerce ayant une concentration massique de ρ = 1 000 µg/
ml peut être utilisée. Les informations fournies par le fabricant en ce qui concerne la stabilité de la solution
doivent être suivies.
5.5.2 Solution d’étalon interne de D3-acrylamide.
À l’aide d’une pipette, transférer (1,0 ± 0,001) ml de la solution mère de D3-acrylamide (5.5.1) dans une fiole
jaugée de 100 ml et compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau. Cette solution doit être conservée à l’abri
de la lumière à une température maximale de 6 °C et elle doit être renouvelée tous les jours. En fonction de la
plage de travail, des étapes de dilution supplémentaires peuvent être nécessaires.
5.6 Eau de brome saturée.
Saturer de l’eau distillée avec du brome dans une fiole jaugée de 100 ml (munie d’un bouchon en verre),
jusqu’à ce qu’une phase de brome se forme au fond de la fiole (environ 3,5 % de brome à 4 °C). Acidifier l’eau
de brome à un pH d’environ 1 en utilisant de l’acide bromhydrique concentré (ρ(HBr) = 1,48 g/cm ).
Conservée à 4 °C et à l’abri de la lumière, cette solution peut être utilisée pendant environ 4 semaines.
5.7 Bromure de potassium, KBr.
5.8 Thiosulfate de sodium (pentahydraté), Na S O · 5 H O.
2 2 3 2
5.9 Triéthylamine, (C H ) N.
2 5 3
5.10 Sulfate de sodium, Na SO anhydre, granulaire.
2 4,
5.11 Solution de Carrez I.
Dissoudre 10,6 g d’hexacyanoferrate de potassium trihydraté (II) K [Fe(CN) ] · 3 H O dans 100 ml d’eau.
4 6 2
Conservée à 4 °C et à l’abri de la lumière, cette solution est stable pendant 6 mois.
5.12 Solution de Carrez II.
Dissoudre 21,9 g d’acétate de zinc dihydraté Zn(CH COO) · 2 H O dans 100 ml d’eau. Conservée à 4 °C et à
3 2 2
l’abri de la lumière, cette solution est stable pendant 6 mois.
5.13 Tampon de borate, pH 8,6.
Mélanger 68 ml d’une solution de borate de sodium à 0,1 mol/l (20,12 g de Na B O par litre d’eau) et 32 ml
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d’acide chlorhydrique à 0,1 mol/l, c(HCl) = 0,1 mol/l, dans une fiole jaugée de 100 ml.
6 Appareillage
Utiliser le matériel courant de laboratoire et, en particulier, les éléments suivants.
Le matériel et les parties du matériel qui entrent en contact avec l’échantillon et l’extrait doivent être
exempts de résidus pouvant causer des valeurs à blanc. De la verrerie ou du matériel en acier inoxydable ou
en PTFE (polytétrafluoroéthylène) doivent être utilisés.
6.1 Balance analytique, réalisant des pesées à 0,1 mg près.
6.2 Moulin à café, pouvant moudre des grains de café torréfié.
6.3 Verrerie, pour recueillir et stocker les extraits, de préférence en verre brun, telle que des flacons pour
échantillons à usage manuel ou automatique munis d’un bouchon inerte (par exemple bouchon avec septum
revêtu de PTFE).
6.4 Bain à ultrasons, pouvant être maintenu à 40 °C.
6.5 Centrifugeuse de laboratoire, convenant pour des tubes à centrifuger de 15 ml et 50 ml et avec une
vitesse de centrifugation minimale de 2 000g.
6.6 Tubes à centrifuger, de 15 ml et 50 ml.
6.7 Fioles jaugées, de 20 ml et 100 ml.
6.8 Pipettes, en verre ou automatiques, convenant pour mesurer les plages de volume des solutions
étalons et des dilutions d’extrait d’échantillon.
6.9 Cartouches en verre ou en polypropylène, avec des adsorbants pour l’extraction en phase solide
(SPE), et pour la purification des extraits en 8.3.2 et 8.5.1 (des exemples sont donnés dans le Tableau B.1).
6.10 Chromatographe liquide haute performance (pour le mode opératoire d’essai selon 8.4), muni d’une
source d’ionisation par électronébulisation (ESI) et d’une détection par spectrométrie de masse (CLHP-SM/
SM), et avec une alimentation en gaz comme spécifié par le fabricant.
6.11 Colonne de CLHP (pour le mode opératoire d’essai selon 8.4), adaptée pour la chromatographie de
l’acrylamide (des exemples sont donnés dans le Tableau C.1).
6.12 Chromatographe en phase gazeuse, (pour le mode opératoire d’essai selon 8.5) avec détection par
spectrométrie de masse (CG-SM) et alimentation en gaz opératoires (5.2) comme spécifié par le fabricant.
6.13 Colonne de CG, (pour le mode opératoire d’essai selon 8.5), colonne capillaire adaptée pour la
chromatographie de l’acrylamide (des exemples sont donnés dans le Tableau C.2).
6.14 Filtres à membrane, filtres à seringues (par exemple, filtres en acétate de cellulose à 0,45 µm de taille
de pore), adaptés pour la filtration de l’éluat d’échantillon issu de la SPE avant l’injection dans le système
chromatographique.
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document. Le mode opératoire
d’échantillonnage doit faire l’objet d’un accord entre les parties intéressées. Un échantillon représentatif
bien homogénéisé, qui n’a pas été endommagé ou altéré lors du transport ou du stockage, doit être utilisé.
Afin d’éviter des changements de concentration en acrylamide, l’analyse doit être effectuée peu après la
réception de l’échantillon. Lorsqu’ils sont conservés pendant plus de deux semaines, il convient de maintenir
les échantillons à une température inférieure à 6 °C.
La date de réception de l’échantillon, ainsi que la date de torréfaction ou la date limite de conservation,
doivent être documentées avec la date d’analyse.
8 Mode opératoire
8.1 Généralités
Pour éviter les pertes d’analyte, les échantillons doivent être protégés de la lumière pendant l’extraction
et les autres étapes de préparation. C’est pourquoi du verre brun doit toujours être utilisé. Autrement, le
contenu des récipients et des fioles doit être protégé de la lumière incidente par une feuille d’aluminium.
Des exemples de préparation des échantillons et de conditions chromatographiques en utilisant la CLHP-
SM/SM sont donnés en Annexe D.
8.2 Préparation de l’extrait d’échantillon
Si nécessaire, moudre l’échantillon dans un moulin à café (6.2) et bien homogénéiser.
Peser 2 g d’échantillon homogénéisé de café torréfié, de café soluble ou de substitut de café ou 5 g de
boisson à base de café liquide à 1 mg près à l’aide d’une balance analytique (6.1) et transférer dans un tube à
centrifuger (6.6) de 50 ml.
Ajouter 2 ml de n-hexane dans le tube à centrifuger et agiter brièvement. Doper ensuite l’échantillon avec
une solution d’étalon interne de D3-acrylamide à une concentration correspondant au niveau d’acrylamide
attendu dans l’échantillon.
EXEMPLE Peser 2 g de café et ajouter 100 µl de solution d’étalon interne (ρ = 10 µg/ml), ce qui équivaut à une
concentration massique d’acrylamide de 500 µg/kg dans l’échantillon de café.
Ajouter 20 ml d’eau distillée, agiter brièvement mais vigoureusement, puis soumettre aux ultrasons (6.4)
pendant 15 min à environ 40 °C.
Attendre quelques minutes pour que la précipitation se produise. En cas de non-sédimentation des
échantillons, centrifuger (6.5) pendant 15 min à 2 000g pour séparer les matières solides en suspension.
Avant la chromatographie liquide (8.4.1) ou la dérivation et la séparation par chromatographie en phase
gazeuse (8.5), prélever 10 ml de la phase aqueuse inférieure et la soumettre à une purification supplémentaire
selon 8.3. Prélever la phase aqueuse inférieure à l’aide d’une pipette en faisant passer cette dernière dans la
phase supérieure d’hexane sans retirer la phase d’hexane. Si nécessaire, la phase d’hexane peut également
être retirée avec précaution à l’aide d’une pipette Pasteur.
8.3 Purification des extraits
8.3.1 Précipitation de Carrez
Purifier l’extrait d’échantillon selon 8.2 par précipitation de Carrez. Ajouter 1 000 µl de solution
de Carrez I (5.11) et agiter. Ajouter 1 000 µl de solution de Carrez II (5.12) et agiter à nouveau. Après un
court temps d’exposition, centrifuger pendant 4 min à 2 000g. Décanter le surnageant, laver le résidu avec
2 ml à 3 ml d’eau, centrifuger et décanter à nouveau. Combiner les deux solutions aqueuses.
8.3.2 Extraction en phase solide
Purifier l’extrait d’échantillon après précipitation de Carrez (8.3.1) par SPE en utilisant successivement deux
cartouches d’adsorbants différents (des exemples sont donnés dans les Tableaux B.1 et D.2). La première
cartouche contient 500 mg de phase C18 et la seconde 500 mg de phase échangeuse d’ions. Les cartouches
peuvent être utilisées en série. Si appropriée, une cartouche mixte peut être utilisée (des exemples sont
donnés dans les Tableaux B.1 et D.4).
Conditionner les deux colonnes SPE selon les instructions du fabricant, successivement avec du méthanol et
de l’eau distillée. Placer la totalité de l’extrait d’échantillon (8.3.1) au sommet de la colonne SPE supérieure
(première colonne), laisser pénétrer et ajouter 2 ml à 3 ml d’eau. Recueillir l’éluat jusqu’à assèchement
de la cartouche. Placer l’éluat au sommet de la seconde colonne échangeuse d’ions conditionnée (colonne
inférieure), ajouter 2 ml à 3 ml d’eau et recueillir l’éluat. Une élution complète peut être obtenue en appliquant
un léger vide ou une légère pression. Recueillir l’éluat, y compris l’eau de lavage, dans une fiole jaugée de
20 ml et compléter jusqu’au trait de jauge avec 20 ml d’eau.
8.4 Analyse par CLHP-SM/SM
8.4.1 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)
Avant l’analyse par CLHP-SM/SM, ajouter du solvant organique dans l’extrait purifié (8.3.2) afin d’obtenir
la composition de phase mobile souhaitée et filtrer sur un filtre à membrane (6.14) avant l’injection d’un
volume approprié (par exemple 10 µl à 100 µl en fonction de la colonne utilisée) dans la colonne de CLHP.
Optimiser les paramètres du système CLHP selon les instructions du fabricant. Les conditions
chromatographiques doivent être ajustées en fonction de la colonne choisie (des exemples sont donnés dans
le Tableau C.1).
Les étapes de purification selon 8.3.1 et 8.3.2 sont essentielles pour la séparation chromatographique des pics
d’analyte et des pics d’interférences. Un exemple de chromatogramme est donné dans les Figures C.1 et C.2.
8.4.2 Identification et quantification par spectrométrie de masse (CLHP-SM/SM)
Détecter l’acrylamide par SM/SM en mode d’ionisation positive (ESI).
Pour l’identification, utiliser la transition de masse m/z = 72 → 55. L’acrylamide est identifié comme présent si
le signal de l’ion fils (m/z 55) est détecté sur le chromatogramme SM/SM et si l’écart du temps de rétention, par
rapport à celui de la substance de référence analysée dans les mêmes conditions de CLHP, est inférieur à 5
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.