Microbiology of the food chain — Detection and quantification of histamine in fish and fishery products — HPLC method

ISO 19343:2017 specifies a high performance liquid chromatography (HPLC) method to analyse histamine in fish and fishery products (fish sauces, fish maturated by enzyme in brine, etc.) intended for human consumption.

Microbiologie de la chaîne alimentaire — Détection et quantification de l'histamine dans le poisson et les produits de la pêche — Méthode CLHP

L'ISO 19343:2017 spécifie une méthode de chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP) pour analyser l'histamine dans le poisson et les produits de la pêche (sauces au poisson, poissons ayant subi un traitement de maturation enzymatique dans la saumure, etc.) destinés à la consommation humaine.

General Information

Status
Published
Publication Date
27-Jun-2017
Technical Committee
Current Stage
6060 - International Standard published
Start Date
08-May-2017
Completion Date
28-Jun-2017
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ISO 19343:2017 - Microbiology of the food chain -- Detection and quantification of histamine in fish and fishery products -- HPLC method
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ISO 19343:2017 - Microbiologie de la chaîne alimentaire -- Détection et quantification de l'histamine dans le poisson et les produits de la peche -- Méthode CLHP
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Standards Content (sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19343
First edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Detection and quantification of
histamine in fish and fishery products
— HPLC method
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Détection et quantification de
l’histamine dans le poisson et les produits de la pêche — Méthode CLHP
Reference number
ISO 19343:2017(E)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 19343:2017(E)
COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT
© ISO 2017, Published in Switzerland

All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized otherwise in any form

or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior

written permission. Permission can be requested from either ISO at the address below or ISO’s member body in the country of

the requester.
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ISO 19343:2017(E)
Contents Page

Foreword ........................................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Scope ................................................................................................................................................................................................................................. 1

2 Normative references ...................................................................................................................................................................................... 1

3 Terms and definitions ..................................................................................................................................................................................... 1

4 Principle ........................................................................................................................................................................................................................ 1

5 Reagents and materials ................................................................................................................................................................................. 1

6 Apparatus ..................................................................................................................................................................................................................... 2

7 Procedure..................................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Sample preparation ............................................................................................................................................................................ 3

7.2 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 3

7.3 Derivatization ........................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Purification ................................................................................................................................................................................................. 3

7.5 LC condition ............................................................................................................................................................................................... 4

7.6 Range of standard sample ............................................................................................................................................................. 4

8 Calculation .................................................................................................................................................................................................................. 4

8.1 Calibration line (curve) .................................................................................................................................................................... 4

8.2 Histamine quantification ................................................................................................................................................................ 5

9 Precision ....................................................................................................................................................................................................................... 5

9.1 Interlaboratory study ........................................................................................................................................................................ 5

9.2 Repeatability limit ................................................................................................................................................................................ 5

9.3 Reproducibility limit .......................................................................................................................................................................... 5

Annex A (informative) Recommendations for HPLC separation ............................................................................................. 7

Annex B (informative) Performance characteristics of the method .................................................................................... 9

Bibliography .............................................................................................................................................................................................................................14

© ISO 2017 – All rights reserved iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 19343:2017(E)
Foreword

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards

bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out

through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical

committee has been established has the right to be represented on that committee. International

organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.

ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of

electrotechnical standardization.

The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are

described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the

different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the

editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).

Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of

patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of

any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or

on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).

Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not

constitute an endorsement.

For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and

expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the

World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following

URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.

This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical

Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical

Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement

on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
iv © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 19343:2017(E)
Introduction

Histamine is a causative agent of scombroid poisoning or histamine fish poisoning. Histamine can

be present mainly in Scombridae (tuna, mackerel) and Clupeidae (herring, sardine), species which

contain a high level of free histidine. Histamine is formed through the decarboxylation of histidine by

microbiological histidine decarboxylase.

Histamine [2-(1H-imidazol-5-yl)ethanamine] is defined as a biologically active low molecular weight

basic nitrogenous molecule. The consumption of food containing significant concentration of histamine

can cause symptoms similar to those associated to food allergies.

This document was developed in response to the need to standardize a method for histamine detection

[1]

and quantification in fish and fishery products, in particular for European Regulation 2073/2005 on

microbiological criteria for foodstuffs.
© ISO 2017 – All rights reserved v
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 19343:2017(E)
Microbiology of the food chain — Detection and
quantification of histamine in fish and fishery products —
HPLC method

WARNING — Persons using this document should be familiar with normal laboratory practice.

This document does not purport to address all of the safety problems, if any, associated with its

use. It is the responsibility of the user to establish appropriate safety and health practices.

1 Scope

This document specifies a high performance liquid chromatography (HPLC) method to analyse

histamine in fish and fishery products (fish sauces, fish maturated by enzyme in brine, etc.) intended

for human consumption.
2 Normative references

The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content

constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For

undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.

ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
3 Terms and definitions
No terms and definitions are listed in this document.

ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:

— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
4 Principle

This method enables the separation of histamine among biogenic amines in fish and fishery products.

The sample is extracted by mixing with perchloric acid. Precolumn derivatization is performed using

dansyl chloride. The biogenic amines and the components in the solution are separated by HPLC with

an appropriate column, using UV detection. Histamine mass concentration is calculated from the peak

area ratio of histamine and internal standard with a calibration curve.
5 Reagents and materials

Use only reagents of recognized analytical grade and water complying with grade 1 of ISO 3696, unless

otherwise specified. Solvents shall be of quality for HPLC analysis, unless otherwise specified.

5.1 Acetone, CH COCH .
3 3
5.2 Acetonitrile, CH CN.
5.3 Toluene, C H .
7 8
© ISO 2017 – All rights reserved 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 19343:2017(E)
5.4 Water, HPLC grade.
5.5 Water, distilled or equivalent.
5.6 Nitrogen, gas.
5.7 Perchloric acid, c(HClO ) = 0,2 mol/l (recommended).

Dilute 19,5 ml of HClO 65 % or 17,2 ml of HClO 70 % to 1 000 ml of water (5.5). The solution is stable

4 4
for six months if stored at room temperature (15°C to 25°C).
5.8 Saturated sodium carbonate solution, Na CO .
2 3

Dissolve 110 g of sodium carbonate in about 150 ml of water (5.5). The solution is in excess and stable

for three months if stored at 5 °C ± 3°C.
5.9 Dansyl chloride solution, ρ(C H ClNO S) = 7,5 mg/ml.
12 12 2

Dissolve 0,375 g of dansyl chloride in 50 ml of acetone (5.1). The solution is stable for three weeks if

stored in the dark at a temperature lower than < −18 °C.
5.10 L-proline solution, ρ(C H NO ) = 100 mg/ml.
5 9 2

Dissolve 1 g of L-proline in 10 ml of water (5.5). The solution is stable for three weeks if stored at

5 °C ± 3°C.
5.11 Histamine stock solution, ρ(C H N ) = 12,5 mg/ml.
5 9 3

Dissolve 1,034 g of histamine dihydrochloride in 50 ml of water (5.5). The solution is stable for one year

if stored at < −18 °C.

5.12 Internal standard (IS) 1,7-diaminoheptane stock solution, ρ(C H N ) = 6,4 mg/ml.

7 18 2
(recommended).

Dissolve 0,320 g of 1,7-diaminoheptane in 50 ml of water (5.5). The solution is stable for three weeks if

stored at 5 °C ± 3°C.
6 Apparatus
6.1 Grinder, e.g. mixer, blender.
6.2 Balances, (precisions 0,1 g and 0,001 g).
6.3 Crusher, (homogenizer) with metallic rods.
6.4 Centrifuge, refrigerated, capable of a centrifugal force of 8 000g.
6.5 Centrifuge tubes, (plastic) with closing caps.
6.6 Pipettes, ranges 20 µl to 200 µl and 100 µl to 1 000 μl.
6.7 Tubes, (temperature resistant glass) with closing caps.
6.8 Vortex.
2 © ISO 2017 – All rights reserved
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 19343:2017(E)
6.9 Water bath, 60 °C ± 1 °C with dark cover or equivalent.
6.10 Refrigerator, capable of temperatures 5°C ± 3 °C.
6.11 Freezer, capable of temperatures < −18°C.
6.12 Nitrogen evaporator.
6.13 Needles, 20G 0,9 mm disposable.

6.14 Filters, 0,2 μm disposable [Polytetrafluoroethylene (PTFE)/Polypropylene (PP)].

6.15 Syringes, 2 ml disposable.

6.16 LC system, pump, refrigerated autosampler, column oven (25 °C ± 2°C), UV detector λ = 254 nm (UV).

6.17 LC column, Kromasil® C18 5 μm 100 Å (25 cm × 4,6 mm) or equivalent.
6.18 Glass autosampler vial, 2 ml with insert (200 μl) and cap.
7 Procedure
7.1 Sample preparation

Homogenize the sample (fish flesh) by grinding in a mixer (6.1). Transfer a test portion of 5 g ± 0,1 g of

fish homogenate to a centrifuge tube (6.5).
7.2 Extraction

Add 10 ml of perchloric acid (5.7) and 100 μl of 1,7-diaminoheptane (5.12) to 5 g of fish in the centrifuge

tube and mix (6.3). After complete homogenization, centrifuge (6.4) at 8 000g for 5 min at 4 °C.

7.3 Derivatization

Transfer 100 μl of the supernatant into a tube (6.7), add 300 μl of sodium carbonate solution (5.8) and

400 μl of Dansyl chloride solution (5.9).
Vortex (6.8) and incubate (6.9) for 5 min in the dark at 60 °C.
Cool the tube under cold tap water and add 100 μl of L-proline solution (5.10).
Vortex (6.8) and place the tube in the dark for 15 min.
NOTE Supernatant can be stored at < −18 °C for one week.
7.4 Purification
Add 500 μl of toluene (5.3) and vortex (6.8).

NOTE 1 Manipulation can be stopped at this step with storage at < −18 °C for one week ma

...

NORME ISO
INTERNATIONALE 19343
Première édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Détection et
quantification de l’histamine dans le
poisson et les produits de la pêche —
Méthode CLHP
Microbiology of the food chain — Detection and quantification of
histamine in fish and fishery products — HPLC method
Numéro de référence
ISO 19343:2017(F)
ISO 2017
---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 19343:2017(F)
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2017, Publié en Suisse

Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée

sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur

l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à

l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ii © ISO 2017 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 19343:2017(F)
Sommaire Page

Avant-propos ..............................................................................................................................................................................................................................iv

Introduction ..................................................................................................................................................................................................................................v

1 Domaine d’application ................................................................................................................................................................................... 1

2 Références normatives ................................................................................................................................................................................... 1

3 Termes et définitions ....................................................................................................................................................................................... 1

4 Principe .......................................................................................................................................................................................................................... 1

5 Réactifs et matériaux ....................................................................................................................................................................................... 1

6 Appareillage .............................................................................................................................................................................................................. 2

7 Mode opératoire.................................................................................................................................................................................................... 3

7.1 Préparation de l’échantillon ........................................................................................................................................................ 3

7.2 Extraction .................................................................................................................................................................................................... 3

7.3 Dérivation .................................................................................................................................................................................................... 3

7.4 Purification ................................................................................................................................................................................................. 4

7.5 Conditions de CPL ................................................................................................................................................................................ 4

7.6 Gamme d’échantillons de référence ..................................................................................................................................... 4

8 Calcul ................................................................................................................................................................................................................................ 5

8.1 Droite (courbe) d’étalonnage ..................................................................................................................................................... 5

8.2 Quantification de l’histamine ..................................................................................................................................................... 5

9 Fidélité ............................................................................................................................................................................................................................ 5

9.1 Essai interlaboratoires ..................................................................................................................................................................... 5

9.2 Limite de répétabilité ........................................................................................................................................................................ 6

9.3 Limite de reproductibilité ............................................................................................................................................................. 6

Annexe A (informative) Recommandations relatives à la séparation par CLHP .....................................................7

Annexe B (informative) Caractéristiques de performance de la méthode ....................................................................9

Bibliographie ...........................................................................................................................................................................................................................14

© ISO 2017 – Tous droits réservés iii
---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 19343:2017(F)
Avant-propos

L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes

nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est

en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude

a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,

gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.

L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui

concerne la normalisation électrotechnique.

Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont

décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents

critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été

rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www

.iso .org/ directives).

L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de

droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable

de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant

les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de

l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de

brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).

Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données

pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un

engagement.

Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions

spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion

de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles

techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.

Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits

alimentaires — Méthodes, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité

technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément

à l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 19343:2017(F)
Introduction

L’histamine est un agent causal de la scombroïdose ou de la réaction pseudo-allergique dans le poisson.

Elle peut être présente principalement chez les scombridés (thon, maquereau) et les clupéidés (hareng,

sardine), espèces contenant un taux élevé d’histidine libre. L’histamine est formée par décarboxylation

de l’histidine par l’histidine décarboxylase d’origine microbienne.

L’histamine [2-(1H-imidazol-5-yl)éthanamine] est définie comme étant une molécule azotée basique

biologiquement active et de faible poids moléculaire. La consommation d’aliments riches en histamine

peut provoquer des symptômes similaires à ceux associés aux allergies alimentaires.

Le présent document a été élaboré pour répondre à la nécessité de normaliser une méthode de détection

et de quantification de l’histamine dans le poisson et les produits de la pêche, en regard du Règlement

[1]

européen 2073/2005 concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires.

© ISO 2017 – Tous droits réservés v
---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 19343:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Détection
et quantification de l’histamine dans le poisson et les
produits de la pêche — Méthode CLHP

AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur du présent document connaisse bien les

pratiques courantes de laboratoire. Le présent document n’a pas pour but de traiter de tous les

problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l’utilisateur de

la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et de sécurité.

1 Domaine d’application

Le présent document spécifie une méthode de chromatographie en phase liquide à haute performance

(CLHP) pour analyser l’histamine dans le poisson et les produits de la pêche (sauces au poisson, poissons

ayant subi un traitement de maturation enzymatique dans la saumure, etc.) destinés à la consommation

humaine.
2 Références normatives

Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des

exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les

références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels

amendements).

ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai

3 Termes et définitions
Le présent document ne contient aucun terme ni aucune définition.

L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en

normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/

— ISO Online Browsing Platform (OBP): disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp

4 Principe

Cette méthode permet de séparer l’histamine des amines biogènes du poisson et des produits de la

pêche. L’échantillon est extrait en le mélangeant avec de l’acide perchlorique. La dérivation pré-colonne

est effectuée à l’aide de chlorure de dansyl. Les amines biogènes et les composants présents dans la

solution sont séparés par CLHP avec une colonne appropriée, par détection UV. La concentration

massique en histamine est calculée d’après le rapport de surface des pics de l’histamine et de l’étalon

interne, avec une courbe d’étalonnage.
5 Réactifs et matériaux

Sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue, et de l’eau de

qualité 1, conformément à l’ISO 3696. Sauf indication contraire, les solvants doivent être de qualité CLHP.

5.1 Acétone, CH COCH .
3 3
© ISO 2017 – Tous droits réservés 1
---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 19343:2017(F)
5.2 Acétonitrile, CH CN.
5.3 Toluène, C H .
7 8
5.4 Eau, de qualité CLHP.
5.5 Eau, distillée ou équivalente.
5.6 Azote, gaz.
5.7 Acide perchlorique, c(HClO ) = 0,2 mol/l (valeur recommandée).

Diluer 19,5 ml de HClO 65 % ou 17,2 ml de HClO 70 % dans 1 000 ml d’eau (5.5). La solution est stable

4 4

pendant six mois si elle est conservée à température ambiante (entre 15 °C et 25 °C).

5.8 Solution saturée de carbonate de sodium, Na CO .
2 3

Dissoudre 110 g de carbonate de sodium dans environ 150 ml d’eau (5.5). La solution est en excès et est

stable pendant trois mois si elle est conservée à 5 °C ± 3°C.
5.9 Solution de chlorure de dansyl, ρ(C H ClNO S) = 7,5 mg/ml.
12 12 2

Dissoudre 0,375 g de chlorure de dansyl dans 50 ml d’acétone (5.1). La solution est stable pendant trois

semaines si elle est conservée à l’abri de la lumière et à une température inférieure à −18 °C.

5.10 Solution de L-proline, ρ(C H NO ) = 100 mg/ml.
5 9 2

Dissoudre 1 g de L-proline dans 10 ml d’eau (5.5). La solution est stable pendant trois semaines si elle

est conservée à 5 °C ± 3 °C.
5.11 Solution mère d’histamine, ρ(C H N ) = 12,5 mg/ml.
5 9 3

Dissoudre 1,034 g de dichlorhydrate d’histamine dans 50 ml d’eau (5.5). La solution est stable pendant

un an si elle est conservée à une température inférieure à −18 °C.

5.12 Solution mère d’étalon interne (IS) 1,7-diaminoheptane, ρ(C H N ) = 6,4 mg/ml. (valeur

7 18 2
recommandée).

Dissoudre 0,320 g de 1,7-diaminoheptane dans 50 ml d’eau (5.5). La solution est stable pendant trois

semaines si elle est conservée à 5 °C ± 3 °C.
6 Appareillage
6.1 Broyeur, par exemple mixeur, mélangeur.
6.2 Balances, précises à 0,1 g et 0,001 g près.
6.3 Homogénéiseur, à tiges métalliques.
6.4 Centrifugeuse, réfrigérée, capable de centrifuger à 8 000g.
6.5 Tubes à centrifuger, en plastique, avec bouchons.
6.6 Pipettes, graduations de 20 µl à 200 µl et de 100 µl à 1 000 μl.
2 © ISO 2017 – Tous droits réservés
---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 19343:2017(F)
6.7 Tubes, en verre résistant à la chaleur, avec bouchons.
6.8 Vortex.
6.9 Bain-marie, 60 °C ± 1 °C avec couvercle foncé ou équivalent.

6.10 Réfrigérateur, capable de maintenir des températures comprises de 5 °C ± 3 °C.

6.11 Congélateur, capable de maintenir des températures inférieures à −18 °C.
6.12 Évaporateur à azote.
6.13 Aiguilles, 20G, 0,9 mm, à usage unique.

6.14 Filtres, 0,2 μm, à usage unique [polytétrafluoroéthylène (PTFE)/polypropylène (PP)].

6.15 Seringues, 2 ml, à usage unique.

6.16 Système CPL, pompe, passeur d’échantillons automatique réfrigéré, four (25 °C ± 2°C), détecteur

UV λ = 254 nm (UV).
6.17 Colonne CPL, Kromasil® C18 5 μm 100 Å (25 cm × 4,6 mm) ou équivalente.

6.18 Flacon en verre pour passeur d’échantillons automatique, 2 ml, avec insert (200 µl) et bouchon.

7 Mode opératoire
7.1 Préparation de l’échantillon

Homogénéiser l’échantillon (chair de poisson) en le broyant dans un mélangeur (6.1). Transférer une

prise d’essai de 5 g ± 0,1 g d’homogénat de poisson dans un tube à centrifuger (6.5).

7.2 Extraction

Ajouter 10 ml d’acide perchlorique (5.7) et 100 µl de 1,7-diaminoheptane (5.12) à 5 g de poisson dans

le tube à centrifuger et mélanger (6.3). Après homogénéisation complète, centrifuger (6.4) à 8 000g

pendant 5 min à 4 °C.
7.3 Dérivation

Transférer 100 µl du surnageant dans un tube (6.7) puis ajouter 300 µl de solution de carbonate de

sodium (5.8) et 400 µl de chlorure de dansyl (5.9).

Agiter au vortex (6.8) et incuber (6.9) pendant 5 min à l’abri de la lumière et à 60 °C.

Refroidir le tube à l’eau froide du robinet et ajouter 100 µl de solution de L-proline (5.10).

Agiter au vortex (6.8) et placer le tube à l’abri de la lumière pendant 15 min.

NOTE Le surnageant peut être conservé à une température inférieure à −18 °C pendant une semaine.

1) Kromasil® est l’appellation commerciale d’un produit fourni par Sigma-Aldrich Co. LLC. Cette information

est donnée par souci de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un

engagement de l’ISO à l’égard de ce produit. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu

...

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