ISO 20634:2015

Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin B12 by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)

ISO 20634:2015 specifies a method for the quantitative determination of vitamin B12 in infant and adult formula (powders, ready-to-feed liquids and liquid concentrates) by reversed phase high performance liquid chromatography.

Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes — Détermination de la teneur en vitamine B12 par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP-PI)

ISO 20634:2015 spécifie une méthode de dosage de la vitamine B12 présente dans les formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes (poudres, liquides prêts à servir et liquides concentrés) par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 08-Nov-2015
• ICS: 67.050 - General methods of tests and analysis for food products
• Technical Committee: ISO/TC 34 - Food products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/WG 14 - Vitamins, carotenoids and other nutrients
• Current Stage: 9093 - International Standard confirmed
• Completion Date: 23-Apr-2021

Relations

• Consolidated By: ISO 3381:2021 - Railway applications — Acoustics — Noise measurement inside railbound vehicles
• Effective Date: 06-Jun-2022

Standards Content (Sample)

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 20634
First edition
2015-11-01
Infant formula and adult
nutritionals — Determination of
vitamin B by reversed phase high
12
performance liquid chromatography
(RP-HPLC)
Formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en vitamine B par chromatographie
12
liquide haute performance en phase inverse (CLHP-PI)
Reference number
ISO 20634:2015(E)
©
ISO 2015

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ISO 20634:2015(E)

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ISO 20634:2015(E)

Contents Page
Foreword .iv
1 Scope . 1
2 Terms and definitions . 1
3 Principle . 1
4 Reagents and materials . 1
5 Apparatus . 4
6 Procedure. 5
6.1 General . 5
6.2 Sample preparation . 5
6.2.1 General. 5
6.2.2 Extraction . 6
6.2.3 Sample concentration . 6
6.3 HPLC analysis . 7
6.3.1 System setup and configuration . 7
6.3.2 Instrument operation conditions . 7
7 Calculations. 8
7.1 General . 8
7.2 Calculation of standard solution concentrations . 9
7.3 Preparation of standard curves . 9
7.4 Calculation of vitamin B concentrations in sample solutions . 9
12
Annex A (informative) Examples of chromatograms .10
Annex B (informative) Precision data .11
Annex C (informative) Example of SPE cartridge qualification procedure .13
Bibliography .14
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ISO 20634:2015(E)

Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www.iso.org/patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity
assessment, as well as information about ISO’s adherence to the WTO principles in the Technical
Barriers to Trade (TBT) see the following URL: Foreword - Supplementary information
The committee responsible for this document is ISO/TC 34, Food products in collaboration with AOAC
INTERNATIONAL. It is being published by ISO and separately by AOAC INTERNATIONAL. The method
described in the International Standard is equivalent to the AOAC Official Method 2011.10: Vitamin B
12
in infant and pediatric formulas and adult nutritionals.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 20634:2015(E)
Infant formula and adult nutritionals — Determination of
vitamin B by reversed phase high performance liquid
12
chromatography (RP-HPLC)
WARNING — The use of this International Standard can involve hazardous materials, operations
and equipment. This International Standard does not purport to address all the safety problems
associated with its use. It is the responsibility of the user of this International Standard to
establish appropriate safety and health practices and determine the applicability of regulatory
limitations prior to use.
1 Scope
This International Standard specifies a method for the quantitative determination of vitamin B in
12
infant and adult formula (powders, ready-to-feed liquids and liquid concentrates) by reversed phase
high performance liquid chromatography.
2 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
2.1
vitamin B
12
cyanocobalamin and other cobalt-containing corrinoids with vitamin B biological activity, such
12
as aquocobalamin, hydroxycobalamin, methylcobalamin and adenosylcobalamin, converted to
cyanocobalamin
2.2
adult nutritional
nutritionally complete, specially formulated food, consumed in liquid form, which may constitute the
sole source of nourishment, made from any combination of milk, soy, rice, whey, hydrolysed protein,
starch and amino acids, with and without intact protein
2.3
infant formula
breast-milk substitute specially manufactured to satisfy, by itself, the nutritional requirements of
infants during the first months of life up to the introduction of appropriate complementary feeding
[SOURCE: Codex Standard 72-1981]
3 Principle
Cyanocobalamin and other cobalt-containing corrinoids are extracted from the sample using sodium
acetate buffer (pH = 4,5) and the latter converted to cyanocobalamin using potassium cyanide at
105 °C. Extracts are purified and concentrated with C8 or C18 solid-phase extraction (SPE) cartridges
and analysed with size-exclusion and reversed-phase chromatography. Determination of vitamin B is
12
made by liquid chromatography with visible detection at 550 nm.
4 Reagents and materials
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and
distilled or demineralized water or water of equivalent purity.
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ISO 20634:2015(E)

4.1 Glacial acetic acid.
4.2 Acetonitrile, HPLC grade.
4.3 Drierite, desiccant, anhydrous calcium sulfate, 8 mesh.
4.4 Ethanol, denatured.
4.5 Formic acid, 88 %.
4.6 Potassium cyanide, 97 %.
4.7 Riboflavin, 98 % to 102 % purity.
4.8 Sodium acetate anhydrous or sodium acetate trihydrate, ACS.
1)
4.9 Taka-Diastase, Accurate Chemical Co. or equivalent.
4.10 Triethylamine, HPLC grade.
4.11 Vitamin B (cyanocobalamin) primary reference standard, e.g. USP Reference 1152009
12
1)
(approximately 10 µg/mg), Official lot . Store in a desiccator protected from white light.
4.12 Preparation of solutions and standard solutions
4.12.1 General
All solutions may be scaled up or down for convenience provided good laboratory practices are
observed. Solutions can be stored refrigerated or at ambient temperature in tight, inert containers
unless otherwise specified.
4.12.2 Preparation of solutions
4.12.2.1 HPLC mobile phase A. Dilute 4,0 ml of triethylamine with 1 000 ml of water. Adjust the pH to 5
to 7 with approximately 1,25 ml concentrated formic acid (4.5). Expiration: 1 week.
4.12.2.2 HPLC mobile phase B. Mix 4,0 ml of triethylamine and 250 ml of acetonitrile with 750 ml of
water. Adjust the pH to 5 to 7 with approximately 1,25 ml concentrated formic acid. Expiration: 1 week in
tightly stoppered container.
4.12.2.3 HPLC mobile phase C. Mix 4,0 ml of triethylamine and 750 ml of acetonitrile with 250 ml of
water. Adjust the pH to 5 to 7 with approximately 1,25 ml concentrated formic acid. Expiration: 1 week in
tightly stoppered container.
4.12.2.4 HPLC mobile phase D. Dilute 50 ml of acetonitrile to 2 000 ml with water. Expiration: 1 week
in tightly stoppered container.
4.12.2.5 Mixture of acetonitrile and water, volume fraction 10 %. Dilute 150 ml of acetonitrile to
1 500 ml with water. Expiration: 1 month in tightly stoppered container.

1) This is an example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience
of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of the product named. Equivalent products
may be used if they can be shown to lead to the same results.
2 © ISO 2015 – All rights reserved

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ISO 20634:2015(E)

4.12.2.6 Mixture of acetonitrile and water, SPE elution solvent, volume fraction 30 %. Dilute 30 ml of
acetonitrile to 100 ml with water. Expiration: 1 month in tightly stoppered container.
4.12.2.7 Mixture of acetonitrile and water, column cleaning and storage solution, volume fraction
50 %. Dilute 500 ml of acetonitrile to 1 000 ml with water in a volumetric flask. Expiration: 6 months.
4.12.2.8 Mixture of ethanol and water, volume fraction 25 %. Dilute 50 ml of ethanol to 200 ml with
water. Expiration: 1 year in tightly stoppered container.
4.12.2.9 Potassium cyanide solution, mass concentration ρ = 4 g/l. Dissolve 0,02 g of potassium cyanide
in and dilute to 5 ml with sodium acetate buffer (4.12.2.11) substance concentration c = 0,25 mol/l).
Prepare fresh immediately before use.
4.12.2.10 Potassium cyanide solution, ρ = 10 g/l. Dissolve 0,25 g of potassium cyanide in water
and dilute to 25 ml. Prepare fresh immediately before use.
4.12.2.11 Sodium acetate buffer, c = 0,25 mol/l. Dissolve 41,0 g of sodium acetate anhydrous
or 68,0 g of sodium acetate trihydrate in approximately 1 800 ml of water. Adjust the pH to 4,5 with
concentrated acetic acid (approximately 40 ml). Dilute to 2 000 ml with water. Expiration: 3 months.
4.12.2.12 Resolution test solution. Weigh approximately 0,005 g of riboflavin onto a weigh paper.
Transfer to a 100 ml volumetric flask and bring to volume with 10 % acetonitrile solution Stir to dissolve.
Mix equal amounts of solution with the highest concentration of vitamin B working standard solution.
12
Expiration: 1 week.
4.12.2.13 Taka-Diastase solution, ρ = 60 g/l. Dissolve 0,6 g of Taka-Diastase in 10 ml of water.
Prepare fresh daily before use.
4.12.3 Preparation of standard solutions
4.12.3.1 General. Prepare all standard solutions under UV shielded fluorescent lights and store at 2 °C
to 8 °C in tightly stoppered volumetric flasks.
4.12.3.2 Vitamin B stock standard solution, ρ = 10 000 µg/l. Accurately weigh the appropriate
12
amount of vitamin B standard (4.11) to give a stock standard concentration of 10 000 µg/l. Dissolve in
12
and dilute to 100 ml with 25 % ethanol (4.12.2.8). Expiration: 6 months.
Calculate the amount of vitamin B standard to be weighed, m , in milligrams using Formula (1):
12 w
1
m =×10000 01, × (1)
w
P
where
10 000 is the desired stock standard solution concentration, in µg/l;
0,1 is the dilution volume, in l;
P is the purity of the vitamin B standard (4.11) in µg of cyanocobalamin per mg of standard.
12
4.12.3.3 Vitamin B intermediate standard solution, ρ = 1 000 µg/l. Dilute 10 ml of stock standard
12
solution (4.12.3.2) to 100 ml with water. Expiration: 1 week.
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ISO 20634:2015(E)

4.12.3.4 Vitamin B calibration standard solutions, ρ = 2,5 µg/l to 25 µg/l. Into separate volumetric
12
flasks, dilute 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml and 5 ml of intermediate standard solution (4.12.3.3) to 200 ml
with 10 % acetonitrile (4.12.2.5). Expiration: 1 month.
5 Apparatus
Usual laboratory glassware and equipment and, in particular, the following.
5.1 HPLC system, consisting of a gradient pump, column switching valve and isocratic pump, UV-VIS
detector equipped with a tungsten lamp capable of monitoring at 550 nm and autosampler capable of
injecting 900 µl to 2 000 µl of sample.
5.2 HPLC column, analytical size exclusion column:
2)
— 4 µm particle size, 250 mm × 9,4 mm (e.g. Zorbax GF-250 P/N 884973-901);
2)
— 5 µm, 300 mm × 8 mm (Shodex Protein® KW-802.5 , P/N F6989000), or equivalent.
5.3 HPLC column, analytical C18 column:
2)
— 3 µm particle size, 100 mm × 4,6 mm (e.g. Thermo Scientific Aquasil™ P/N 77503-104630)
2)
with C18 drop-in guard cartridges 3 µm, 10 mm × 4,6 mm (e.g. Thermo Scientific Aquasil™
P/N 77503-014001);
2)
— Epic Phenyl Hexyl, 3 µm, 120 Å, 100 mm × 4,6 mm, (ES Industries 125191-EPHX) with appropriate
guard cartridge, or equivalent reversed-phase column compatible with 100 % aqueous mobile phase).
5.4 Oven, capable of maintaining temperatures of 95 °C ± 5 °C and 105 °C ± 5 °C.
5.5 pH-meter, with calibration buffer.
5.6 Analytical balance, accuracy to the nearest 0,000 01 g.
5.7 Beakers, glass, assorted sizes.
5.8 Bottle top dispenser, capable of dispensing 30 ml or equivalent.
5.9 Cylinders, graduated, glass, assorted sizes.
5.10 Desiccator.
5.11 Conical flasks,
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 20634
Première édition
2015-11-01
Formules infantiles et produits
nutritionnels pour adultes —
Détermination de la teneur en
vitamine B par chromatographie
12
liquide haute performance en phase
inverse (CLHP-PI)
Infant formula and adult nutritionals — Determination of vitamin B
12
by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)
Numéro de référence
ISO 20634:2015(F)
©
ISO 2015

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ISO 20634:2015(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 20634:2015(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
1 Domaine d’application . 1
2 Termes et définitions . 1
3 Principe . 1
4 Réactifs et matériaux . 2
5 Appareillage . 4
6 Mode opératoire. 5
6.1 Généralités . 5
6.2 Préparation de l’échantillon . 5
6.2.1 Généralités . 5
6.2.2 Extraction . 6
6.2.3 Concentration de l’échantillon . 6
6.3 Analyse par CLHP . 7
6.3.1 Réglage et configuration du système . 7
6.3.2 Conditions de fonctionnement de l’instrument . 8
7 Calculs . 9
7.1 Généralités . 9
7.2 Calcul des concentrations de la solution étalon . 9
7.3 Préparation des courbes d’étalonnage .10
7.4 Calcul des concentrations de vitamine B dans les solutions d’échantillon.10
12
Annexe A (informative) Exemples de chromatogrammes .11
Annexe B (informative) Données de fidélité .12
Annexe C (informative) Exemple de procédure de qualification de cartouche SPE .15
Bibliographie .16
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ISO 20634:2015(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, en
collaboration avec l’AOAC INTERNATIONAL. Le document est publié par l’ISO et séparément par
l’AOAC INTERNATIONAL. La méthode décrite dans la présente Norme internationale est équivalente
à la Méthode officielle de l’AOAC 2011.10: Vitamine B dans les formules infantiles et pédiatriques et les
12
produits nutritionnels pour adultes.
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NORME INTERNATIONALE ISO 20634:2015(F)
Formules infantiles et produits nutritionnels pour
adultes — Détermination de la teneur en vitamine B
12
par chromatographie liquide haute performance en phase
inverse (CLHP-PI)
AVERTISSEMENT — L’utilisation de la présente Norme internationale peut impliquer des
matériaux, des opérations et des équipements dangereux. La présente Norme internationale
n’a pas pour but d’aborder tous les problèmes de sécurité liés à son utilisation. Avant d’utiliser
la présente Norme internationale, il incombe à l’utilisateur d’établir des pratiques appropriées
de sécurité et de protection de la santé et de déterminer l’applicabilité des restrictions
réglementaires.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode de dosage de la vitamine B présente dans les
12
formules infantiles et produits nutritionnels pour adultes (poudres, liquides prêts à servir et liquides
concentrés) par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
2.1
vitamine B
12
cyanocobalamine et autres corrinoïdes contenant du cobalt possédant l’activité biologique
de la vitamine B , comme l’aquocobalamine, l’hydroxycobalamine, la méthylcobalamine et
12
l’adénosylcobalamine, convertis en cyanocobalamine
2.2
produit nutritionnel pour adultes
aliment complet sur le plan nutritionnel, spécialement formulé, consommé sous forme liquide, pouvant
constituer la seule source d’alimentation, constitué de n’importe quelle combinaison de lait, soja, riz,
lactosérum, protéine hydrolysée, amidon et acides aminés, avec et sans protéine intacte
2.3
formule infantile
substitut du lait maternel spécialement fabriqué pour satisfaire, par lui-même, les besoins nutritionnels
des nourrissons pendant les premiers mois de la vie jusqu’à l’introduction d’une alimentation
complémentaire appropriée
[SOURCE: Norme Codex 72-1981]
3 Principe
Extraction de la cyanocobalamine et autres corrinoïdes contenant du cobalt de l’échantillon au moyen
d’un tampon d’acétate de sodium (pH = 4,5) et conversion des derniers en cyanocobalamine au moyen de
cyanure de potassium à 105 °C. Purification et concentration des extraits avec des cartouches d’extraction
en phase solide (SPE) C8 ou C18 et analyse par chromatographie en exclusion de taille et en phase inverse.
Dosage de la vitamine B par chromatographie liquide avec détection dans le visible à 550 nm.
12
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ISO 20634:2015(F)

4 Réactifs et matériaux
Au cours de l’analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l’eau distillée ou déminéralisée ou de l’eau de pureté équivalente.
4.1 Acide acétique glacial.
4.2 Acétonitrile, qualité CLHP.
4.3 Driérite, dessiccatif, sulfate de calcium anhydre, 8 mesh.
4.4 Éthanol, dénaturé.
4.5 Acide formique, 88 %.
4.6 Cyanure de potassium, 97 %.
4.7 Riboflavine, pureté de 98 % à 102 %.
4.8 Acétate de sodium anhydre ou acétate de sodium trihydraté, ACS.
1)
4.9 Taka-Diastase, Accurate Chemical Co. ou l’équivalent.
4.10 Triéthylamine, qualité CLHP.
4.11 Étalon de référence primaire de vitamine B (cyanocobalamine), par exemple USP Référence
12
1)
1152009 (environ 10 µg/mg), lot officiel . Conserver dans un dessiccateur à l’abri de la lumière blanche.
4.12 Préparation des solutions et des solutions étalons
4.12.1 Généralités
Le volume de toutes les solutions peut être augmenté ou diminué selon les besoins, à condition de
respecter les bonnes pratiques de laboratoire. Les solutions peuvent être conservées au réfrigérateur
ou à température ambiante dans des récipients inertes étanches, sauf indication contraire.
4.12.2 Préparation des solutions
4.12.2.1 Phase mobile de CLHP A. Diluer 4,0 ml de triéthylamine avec 1 000 ml d’eau. Ajuster le
pH à une valeur comprise entre 5 et 7 avec environ 1,25 ml d’acide formique concentré (4.5). Délai
d’expiration: 1 semaine.
4.12.2.2 Phase mobile de CLHP B. Mélanger 4,0 ml de triéthylamine et 250 ml d’acétonitrile avec
750 ml d’eau. Ajuster le pH à une valeur comprise entre 5 et 7 avec environ 1,25 ml d’acide formique
concentré. Délai d’expiration: 1 semaine dans un récipient hermétiquement bouché.
4.12.2.3 Phase mobile de CLHP C. Mélanger 4,0 ml de triéthylamine et 750 ml d’acétonitrile avec
250 ml d’eau. Ajuster le pH à une valeur comprise entre 5 et 7 avec environ 1,25 ml d’acide formique
concentré. Délai d’expiration: 1 semaine dans un récipient hermétiquement bouché.
1) Ceci est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à
l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés

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ISO 20634:2015(F)

4.12.2.4 Phase mobile de CLHP D. Diluer 50 ml d’acétonitrile à 2 000 ml avec de l’eau. Délai
d’expiration: 1 semaine dans un récipient hermétiquement bouché.
4.12.2.5 Mélange d’acétonitrile et d’eau, fraction volumique 10 %. Diluer 150 ml d’acétonitrile à
1 500 ml avec de l’eau. Délai d’expiration: 1 mois dans un récipient hermétiquement bouché.
4.12.2.6 Mélange d’acétonitrile et d’eau, solvant d’élution pour SPE, fraction volumique 30 %.
Diluer 30 ml d’acétonitrile à 100 ml avec de l’eau. Délai d’expiration: 1 mois dans un récipient
hermétiquement bouché.
4.12.2.7 Mélange d’acétonitrile et d’eau, solution de nettoyage et de conservation de colonne, fraction
volumique 50 %. Diluer 500 ml d’acétonitrile à 1 000 ml avec de l’eau dans une fiole jaugée. Délai
d’expiration: 6 mois.
4.12.2.8 Mélange d’éthanol et d’eau, fraction volumique 25 %. Diluer 50 ml d’éthanol à 200 ml avec de
l’eau. Délai d’expiration: 1 an dans un récipient hermétiquement bouché.
4.12.2.9 Solution de cyanure de potassium, concentration massique ρ = 4 g/l. Dissoudre 0,02 g de
cyanure de potassium dans le tampon d’acétate de sodium (4.12.2.11) et compléter à 5 ml (concentration
de la substance c = 0,25 mol/l). Préparer une solution fraîche immédiatement avant utilisation.
4.12.2.10 Solution de cyanure de potassium, ρ = 10 g/l. Dissoudre 0,25 g de cyanure de potassium
dans de l’eau et compléter à 25 ml. Préparer une solution fraîche immédiatement avant utilisation.
4.12.2.11 Tampon d’acétate de sodium, c = 0,25 mol/l. Dissoudre 41,0 g d’acétate de sodium
anhydre ou 68,0 g d’acétate de sodium trihydraté dans environ 1 800 ml d’eau. Ajuster le pH à 4,5 avec de
l’acide acétique concentré (environ 40 ml). Diluer à 2 000 ml avec de l’eau. Délai d’expiration: 3 mois.
4.12.2.12 Solution pour essai de résolution. Peser environ 0,005 g de riboflavine sur un papier à
pesée. Transférer dans une fiole jaugée de 100 ml et compléter au volume avec une solution d’acétonitrile
à 10 %. Agiter pour dissoudre. Mélanger à volumes égaux avec la solution étalon de travail de vitamine
B présentant la concentration la plus élevée. Délai d’expiration: 1 semaine.
12
4.12.2.13 Solution Taka-Diastase, ρ = 60 g/l. Dissoudre 0,6 g de Taka-Diastase dans 10 ml d’eau.
Préparer une solution fraîche quotidiennement avant utilisation.
4.12.3 Préparation des solutions étalons
4.12.3.1 Généralités. Préparer toutes les solutions étalons sous un éclairage doté d’un écran anti-UV et les
conserver à une température comprise entre 2 °C et 8 °C dans des fioles jaugées hermétiquement bouchées.
4.12.3.2 Solution étalon mère de vitamine B , ρ = 10 000 µg/l. Peser avec précision la quantité
12
appropriée d’étalon de vitamine B (4.11) pour obtenir une concentration de la solution étalon mère de
12
10 000 µg/l. Dissoudre dans de l’éthanol à 25 % et compléter à 100 ml (4.12.2.8). Délai d’expiration: 6 mois.
Calculer la quantité d’étalon de vitamine B devant être pesée, m , en milligrammes, en utilisant
12 w
la Formule (1):
1
m =×10000 01, × (1)
w
P
où
10 000 est la concentration de la solution étalon mère souhaitée, en µg/l;
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0,1 est le volume de dilution, en l;
P est la pureté de l’étalon de vitamine B (4.11) en µg de cyanocobalamine par mg d’étalon.
12
4.12.3.3 Solution étalon intermédiaire de vitamine B , ρ = 1 000 µg/l. Diluer 10 ml de la solution
12
étalon mère (4.12.3.2) à 100 ml avec de l’eau. Délai d’expiration: 1 semaine.
4.12.3.4 Solutions d’étalonnage de vitamine B , ρ = 2,5 µg/l à 25 µg/l. Dans des fioles jaugées
12
séparées, diluer 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml et 5 ml de solution étalon intermédiaire (4.12.3.3) à 200 ml
avec de l’acétonitrile à 10 % (4.12.2.5). Délai d’expiration: 1 mois.
5 Appareillage
Verrerie et équipement de laboratoire habituels et, en particulier, les éléments suivants.
5.1 Système de CLHP, composé d’une pompe à gradient, d’une vanne de commutation de colonne et
d’une pompe isocratique, d’un détecteur UV-VIS équipé d’une lampe au tungstène permettant une lecture
à 550 nm et d’un injecteur automatique pouvant injecter entre 900 µl et 2 000 µl d’échantillon.
5.2 Colonne de CLHP, colonne analytique à exclusion de taille:
2)
— taille de particules 4 µm, 250 mm × 9,4 mm (par exemple, Zorbax GF-250 référence 884973-901);
2)
— 5 µm, 300 mm × 8 mm (Shodex Protein® KW-802.5 , référence F6989000) ou l’équivalent.
5.3 Colonne de CLHP, colonne analytique C18:
2)
— taille de particules 3 µm, 100 mm × 4,6 mm (par exemple, Thermo Scientific Aquasil™
référence 77503-104630) avec cartouches de garde enfichables C18 de 3 µm, 10 mm × 4,6 mm (par
2)
exemple, Thermo Scientific Aquasil™ référence 77503-014001);
2)
— Epic Phenyl Hexyl, 3 µm, 120 Å, 100 mm × 4,6 mm, (ES Industries 125191-EPHX) avec cartouche
de garde appropriée, ou colonne en phase inverse équivalente compatible avec une phase mobile
100 % aqueuse).
5.4 Four, capable de maintenir des températures de 95 °C ± 5 °C et de 105 °C ± 5 °C.
5.5 pH-mètre, avec tampon d’étalonnage.
5.6 Balance analytique, avec une précision de 0,000 01 g.
5.7 Béchers, verre, tailles assorties.
5.8 Distributeur à piston, pouvant distribuer 30 ml ou l’équivalent.
5.9 Éprouvettes, graduées, verre, tailles assorties.
5.10 Dessiccateur.
5.11 Fioles coniques (Erlenmeyer), capacité 125 ml ou verrerie équivalente.
2) Ceci est un exemple de produit approprié disponible dans le commerce. Cette information est donnée par souci
de commodité à l’intention des utilisateurs du présent document et ne saurait constituer un engagement de l’ISO à
l’égard de ces produits. Des produits équivalents peuvent être utilisés s’il est démontré qu’ils conduisent aux mêmes
résultats.
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2)
5.12 Papier filtre, Whatman 2V ou l’équivalent.
5.13 Entonnoirs, plastique, adaptés à une utilisation avec papier filtre.
5.14 Gants, jetables.
5.15 Dispositif de pipetage, volume variable, 100 µl à 1 000 µl.
5.16 Écrans de laboratoire, écrans jaunes ou transparents ayant un seuil de coupure à 385 nm.
5.17 Cartouches d’extraction en phase solide (SPE), C8, 900 mg (par exemple, Alltech/Grace
2) 2)
Davidson référence 20966 ), C18, 900 mg (par exemple, Alltech/Grace Davidson référence 20942 ) ou
l’équivalent. Un exemple de procédure de qualificatio
...