ISO 17601:2025

Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from DNA directly extracted from soil

This document specifies the crucial steps of a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method to measure the abundance of selected microbial gene sequences from soil DNA extract. The number of microbial gene sequences quantified by qPCR provides an estimation of the abundance of selected microbial groups in soil.

Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences de gènes microbiens par amplification par réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) à partir d’ADN directement extrait du sol

Le présent document spécifie les étapes principales d’une méthode de réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) permettant de mesurer l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir d’un extrait d’ADN du sol. Le nombre de séquences de gènes microbiens quantifiées par qPCR fournit une estimation de l’abondance de groupes microbiens spécifiques dans le sol.

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 23-Oct-2025
• ICS: 13.080.30 - Biological properties of soils
• Technical Committee: ISO/TC 190/SC 4 - Biological characterization
• Drafting Committee: ISO/TC 190/SC 4/WG 4 - Effects on soil micro-organisms
• Current Stage: 6060 - International Standard published
• Start Date: 24-Oct-2025
• Due Date: 24-Oct-2025
• Completion Date: 24-Oct-2025

Relations

• Revises: ISO 17601:2016 - Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial gene sequences by quantitative PCR from DNA directly extracted from soil
• Effective Date: 28-Oct-2023

Standards Content (Sample)

International
Standard
ISO 17601
Second edition
Soil quality — Estimation of
2025-10
abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative
polymerase chain reaction (qPCR)
from DNA directly extracted from soil
Qualité du sol — Estimation de l’abondance de séquences
de gènes microbiens par amplification par réaction de
polymérisation en chaîne quantitative (qPCR) à partir d’ADN
directement extrait du sol
Reference number
© ISO 2025
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CH-1214 Vernier, Geneva
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Website: www.iso.org
Published in Switzerland
ii
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Test materials . 4
5.1 DNA .4
5.2 Bacteria .4
5.3 Plasmid .4
5.4 Enzymes .4
5.5 Chemicals .4
5.6 Products for bacterial culture medium .5
5.7 Buffers and reagents .5
6 Apparatus . 6
7 Procedure . 6
7.1 qPCR standard preparation and calibration of qPCR assay (task 1) .6
7.1.1 General .6
7.1.2 Amplicon design (task 1, step 1) .6
7.1.3 qPCR standard preparation (task 1, step 2) .7
7.1.4 Bacterial isolate DNA, environmental DNA, artificial DNA .7
7.1.5 Calibration of the qPCR (task 1, step 3) .9
7.2 Preparation of soil DNA template and inhibition test (task 2) .10
7.2.1 General .10
7.2.2 Soil DNA preparation (task 2, step 4) . .10
7.2.3 Inhibition test (task 2, step 5) .10
7.3 qPCR assay (task 3) . . . 12
7.3.1 General . 12
7.3.2 qPCR (task 3, step 6) . 12
7.4 Validation and analysis of qPCR assay (task 4) . 12
7.4.1 General . 12
7.4.2 Validation of the qPCR assay (task 4, step 7) . 12
7.4.3 Calculation of the copy number of the gene of interest in the soil DNA extract
(task 4, step 8) . 13
8 Examination of the critical steps of the qPCR assay .13
9 Expression of the results of the qPCR assay . 14
10 International ring test . 14
11 Test report . 14 ®
Annex A (informative) Description of principal steps of TaqMan qPCR assay .15
Annex B (informative) International ring test for evaluating qPCR to quantify the abundance of
selected microbial gene sequences from DNA directly extracted from soil . 17
Annex C (informative) Examples of well-established primer systems for a qPCR-based
quantification of marker genes in soil samples .30
Bibliography .33

iii
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee
has been established has the right to be represented on that committee. International organizations,
governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely
with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are described
in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the different types
of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the editorial rules of the
ISO/IEC Directives, Part 2 (see www.iso.org/directives).
ISO draws attention to the possibility that the implementation of this document may involve the use of (a)
patent(s). ISO takes no position concerning the evidence, validity or applicability of any claimed patent
rights in respect thereof. As of the date of publication of this document, ISO had not received notice of (a)
patent(s) which may be required to implement this document. However, implementers are cautioned that
this may not represent the latest information, which may be obtained from the patent database available at
www.iso.org/patents. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and expressions
related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the World Trade
Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT), see www.iso.org/iso/foreword.html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 190, Soil quality, Subcommittee SC 4, Biological
characterization, in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 444, Environmental characterization of solid matrices, in accordance with the Agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This second edition cancels and replaces the first edition (ISO 17601:2016), which has been technically
revised.
The main changes are as follows:
— Annex C has been expanded by adding examples of well-established qPCR systems to quantify certain
microbial groups or their function.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www.iso.org/members.html.

iv
Introduction
DNA (DNAs) is a major component of any living organism, coding for enzymes responsible for their biological
activities. The study of DNA sequences from DNA sources extracted from different environmental matrices,
by means of numerous molecular approaches, provides molecular markers that can be used to sharply
distinguish and identify different organisms (bacteria, archaea, and eukaryotes).
Up to now, most of the studies aiming to develop microbial quality indicators applicable to complex
environment such as soil were biased by the poor culturability of many microorganisms under laboratory
conditions and the lack of sensitivity of traditional microbiological methods. The recent development of a
large set of molecular biology methods based on amplification of soil-extracted nucleic acids have provided
a pertinent alternative to classical culture-based microbiological methods providing unique insight into the
[2][3][4][5][6]
composition, richness, and structure of microbial communities. DNA-based approaches are now
well established in soil ecology and serve as genotypic markers for determining microbial diversity. The
results of molecular analyses of soil microbial communities and populations rely on two main parameters:
a) the extraction of DNA representative of the indigenous bacterial community composition, and b) PCR bias
such as the choice of primers, the concentration of amplified DNA, errors in the PCR, or even the method
[7][4][8][9]
chosen for the analysis.
Numerous studies have investigated new methods to improve extraction, purification, amplification,
[10]
and quantification of DNA from soils. Recently, ISO 11063 reported “a method to extract nucleic acids
directly from soil samples” derived from Reference [10], opening a new window for developing standardized
[11]
molecular approaches to estimate soil quality.
The aim of this document is to describe the procedure used to set up and perform quantitative PCR to quantify
th
...

Norme
internationale
ISO 17601
Deuxième édition
Qualité du sol — Estimation de
2025-10
l’abondance de séquences de gènes
microbiens par amplification par
réaction de polymérisation en
chaîne quantitative (qPCR) à partir
d’ADN directement extrait du sol
Soil quality — Estimation of abundance of selected microbial
gene sequences by quantitative polymerase chain reaction (qPCR)
from DNA directly extracted from soil
Numéro de référence
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être demandée à l’ISO à l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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Case postale 401 • Ch. de Blandonnet 8
CH-1214 Vernier, Genève
Tél.: [phone]
E-mail: [e-mail]
Web: www.iso.org
Publié en Suisse
ii
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe. 2
5 Matériel d’essai . 4
5.1 ADN .4
5.2 Bactéries . .4
5.3 Plasmide .4
5.4 Enzymes .4
5.5 Produits chimiques .4
5.6 Produits pour le milieu de culture bactérienne .5
5.7 Tampons et réactifs .5
6 Appareillage . 6
7 Mode opératoire . 6
7.1 Préparation des étalons de qPCR et étalonnage de l’essai de qPCR (tâche 1) .6
7.1.1 Généralités .6
7.1.2 Création de l’amplicon (tâche 1, étape 1) .7
7.1.3 Préparation des étalons de qPCR (tâche 1, étape 2) .7
7.1.4 ADN d’isolat bactérien, ADN environnemental, ADN artificiel .7
7.1.5 Étalonnage de la qPCR (tâche 1, étape 3).9
7.2 Préparation d’une matrice d’ADN du sol et essai d’inhibition (tâche 2) .10
7.2.1 Généralités .10
7.2.2 Préparation de l’ADN du sol (tâche 2, étape 4) .10
7.2.3 Essai d’inhibition (tâche 2, étape 5) .11
7.3 Essai de qPCR (tâche 3) . 13
7.3.1 Généralités . 13
7.3.2 qPCR (tâche 3, étape 6) . 13
7.4 Validation et examen de l’essai de qPCR (tâche 4) . 13
7.4.1 Généralités . 13
7.4.2 Validation de l’essai de qPCR (tâche 4, étape 7) . 13
7.4.3 Calcul du nombre de copies du gène d’intérêt dans l’extrait d’ADN du sol
(tâche 4, étape 8) .14
8 Examen des étapes critiques de l’essai de qPCR. 14
9 Expression des résultats de l’essai de qPCR .15
10 Essai interlaboratoires international .15
11 Rapport d’essai .15 ®
Annexe A (informative) Description des principales étapes d’un essai de qPCR TaqMan .16
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires international relatif à l’évaluation de la qPCR
pour quantifier l’abondance de séquences spécifiques de gènes microbiens à partir
d’ADN extrait directement du sol .18
Annexe C (informative) Exemples de systèmes d’amorces bien établis pour une quantification
par qPCR de gènes marqueurs dans des échantillons de sol .31
Bibliographie .34

iii
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux. L’ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document
a été rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2
(voir www.iso.org/directives).
L’ISO attire l’attention sur le fait que la mise en application du présent document peut entraîner l’utilisation
d’un ou de plusieurs brevets. L’ISO ne prend pas position quant à la preuve, à la validité et à l’applicabilité
de tout droit de brevet revendiqué à cet égard. À la date de publication du présent document, l’ISO n’avait
pas reçu notification qu’un ou plusieurs brevets pouvaient être nécessaires à sa mise en application.
Toutefois, il y a lieu d’avertir les responsables de la mise en application du présent document que des
informations plus récentes sont susceptibles de figurer dans la base de données de brevets, disponible à
l’adresse www.iso.org/brevets. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne pas avoir identifié de tels
droits de propriété et averti de leur existence.
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données pour
information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de
l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles techniques au
commerce (OTC), voir www.iso.org/avant-propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 190, Qualité du sol, sous-comité SC 4,
Caractérisation biologique, en collaboration avec le comité technique CEN/TC 444, Méthodes d'essai pour
la caractérisation environnementale des matrices solides, du Comité européen de normalisation (CEN),
conformément à l’Accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette deuxième édition annule et remplace la première édition (ISO 17601:2016), qui a fait l’objet d’une
révision technique.
Les principales modifications sont les suivantes:
— l’Annexe C a été enrichie par des exemples de systèmes de qPCR bien établis permettant de quantifier
certains groupes microbiologiques ou leur fonction.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes se
trouve à l’adresse www.iso.org/fr/members.html.

iv
Introduction
L’ADN (acide désoxyribonucléique) est un constituant majeur de tous les organismes vivants codant pour
les enzymes responsables de leurs activités biologiques. L’étude des séquences d’ADN extrait de différentes
matrices environnementales, à l’aide d’approches moléculaires, permet de fournir des marqueurs
moléculaires qui peuvent être utilisés pour différencier et identifier clairement différents organismes
(bactéries, archées et eucaryotes).
Jusqu’à présent, la plupart des études visant à développer des indicateurs de la qualité microbienne
applicables aux milieux complexes, tels que le sol, étaient biaisées par la nature incultivable de nombreux
micro-organismes dans des conditions de laboratoire et par le manque de sensibilité des méthodes
microbiologiques classiques. Le développement récent de nombreuses méthodes de biologie moléculaire
reposant sur l’amplification des acides nucléiques extraits du sol a permis de proposer une alternative
pertinente à la microbiologie pasteurienne permettant de décrire en détail la composition, la richesse et
[2][3][4][5][6]
la structure des communautés microbiennes. Les approches reposant sur l’extraction de l’ADN
à partir d’échantillons environnementaux sont désormais bien établies dans le domaine de l’écologie des
sols et servent de marqueurs génotypiques pour la détermination de la diversité microbienne. Les résultats
d’analyses moléculaires des communautés et populations microbiennes du sol reposent sur deux paramètres
principaux: a) l’extraction d’ADN représentatif
...