ISO 29981:2010

Milk products — Enumeration of presumptive bifidobacteria — Colony count technique at 37 degrees C

ISO 29981|IDF 220:2010 specifies a method for the selective enumeration of presumptive bifidobacteria in milk products by using a colony count technique at 37 °C under anaerobic conditions. The method is applicable to milk products such as fermented and non-fermented milks, milk powders, infant formulae, and starter cultures where these microorganisms are present and viable, and in combination with other lactic acid bacteria. Bifidobacteria used in milk products usually belong to the species: Bifidobacterium adolescentis; B. animalis subsp. animalis; B. animalis subsp. lactis; B. bifidum; B. breve; B. infantis; B. longum.

Produits laitiers — Dénombrement des bifidobacteria présumés — Technique par comptage des colonies à 37 degrés C

General Information

• Status: Published
• Publication Date: 18-Jan-2010
• ICS: 67.100.01 - Milk and milk products in general
• Technical Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Drafting Committee: ISO/TC 34/SC 5 - Milk and milk products
• Current Stage: 9092 - International Standard to be revised
• Completion Date: 24-Jun-2019

Standards Content (Sample)

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ISO
СТАНДАРТ 29981
IDF
220
Первое издание
2010-02-01


Молоко и молочные продукты.
Подсчет презумптивных
бифидобактерий. Техника подсчета
колоний при 37 С
Milk products — Enumeration of presumptive bifidobacteria — Colony
count technique at 37 C



Ответственность за подготовку русской версии несѐт GOST R
(Российская Федерация) в соответствии со статьѐй 18.1 Устава ISO

Ссылочные номера
ISO 29981:2010(R)

IDF 220:2010(R)
©
 ISO и IDF 2010

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
Отказ от ответственности при работе в PDF
Настоящий файл PDF может содержать интегрированные шрифты. В соответствии с условиями лицензирования, принятыми
фирмой Adobe, этот файл можно распечатать или смотреть на экране, но его нельзя изменить, пока не будет получена
лицензия на установку интегрированных шрифтов в компьютере, на котором ведется редактирование. В случае загрузки
настоящего файла заинтересованные стороны принимают на себя ответственность за соблюдение лицензионных условий
фирмы Adobe. Центральный секретариат ISO не несет никакой ответственности в этом отношении.
Adobe – торговый знак фирмы Adobe Systems Incorporated.
Подробности, относящиеся к программным продуктам, использованным для создания настоящего файла PDF, можно найти в
рубрике General Info файла; параметры создания PDF были оптимизированы для печати. Были приняты во внимание все
меры предосторожности с тем, чтобы обеспечить пригодность настоящего файла для использования комитетами-членами
ISO. В редких случаях возникновения проблемы, связанной со сказанным выше, просьба проинформировать Центральный
секретариат по адресу, приведенному ниже.


ДОКУМЕНТ ЗАЩИЩЕН АВТОРСКИМ ПРАВОМ


© ISO и IDF 2010
Все права сохраняются. Если не указано иное, никакую часть настоящей публикации нельзя копировать или использовать в
какой-либо форме или каким-либо электронным или механическим способом, включая фотокопии и микрофильмы, без
разрешения в письменной форме от ISO или IDF, которое должно быть получено после запроса о разрешении, направленного
по адресу, приведенному ниже.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56  CH-1211 Geneva 20 Diamant Building  Boulevard Auguste Reyers 80  B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Опубликовано в Швейцарии

ii © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
Содержание Страница
Предисловие .iv
Предисловие .v
1 Область применения .1
2 Нормативные ссылки .1
3 Термины и определения .2
4 Сущность метода .2
5 Питательные среды, разбавители и реактивы .3
5.1 Основные материалы .3
5.2 Разбавитель(и) .3
5.3 Питательная среда (среда TOS-MUP) .3
6 Аппаратура .5
7 Отбор проб .6
8 Проведение анализа .6
8.1 Общие положения .6
8.2 Подготовка пробы для анализа и первичное разведение .7
8.3 Исследование под микроскопом .8
8.4 Приготовление десятичных разведений .8
8.5 Посев .8
8.6 Продолжительность опыта .9
8.7 Инкубирование .9
8.8 Подсчет колоний.9
8.9 Считывание чашек Петри — подтверждение .9
9 Расчет и обработка результатов .9
9.1 Расчет .9
9.2 Обработка результатов . 10
10 Прецизионность. 11
10.1 Межлабораторное испытание . 11
10.2 Повторяемость (сходимость) . 11
10.3 Воспроизводимость . 12
10.4 Показатели прецизионности, совместно определенные для молочных продуктов. 12
11 Квалификация при применении данного метода . 14
12 Протокол испытания . 14
Приложение A (информативное) Межлабораторное испытание. Испытания 'бифидо' по
круговой системе . 16
Библиография . 18

© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
Предисловие
Международная организация по стандартизации (ISO) является всемирной федерацией
национальных организаций по стандартизации (комитетов-членов ISO). Разработка международных
стандартов обычно осуществляется техническими комитетами ISO. Каждый комитет-член,
заинтересованный в деятельности, для которой был создан технический комитет, имеет право быть
представленным в этом комитете. Международные правительственные и неправительственные
организации, имеющие связи с ISO, также принимают участие в работах. ISO работает в тесном
сотрудничестве с Международной электротехнической комиссией (IEC) по всем вопросам
стандартизации в области электротехники.
Международные стандарты разрабатываются в соответствии с правилами, установленными в
Директивах ISO/IEC, Часть 2.
Основная задача технических комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, одобренные техническими комитетами, рассылаются комитетам-членам
на голосование. Их опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения, по
меньшей мере, 75 % комитетов-членов, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы данной части ISO 16065 могут быть объектом
патентных прав. Организация ISO не должна нести ответственность за идентификацию какого-либо
одного или всех патентных прав.
ISO 29981|IDF 220 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной молочной федерацией (IDF).
Стандарт публикуется совместно ISO и IDF.
iv © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
Предисловие
Международная молочная федерация (IDF) является некоммерческой организацией,
представляющей всемирное молочное животноводство. Членами IDF являются Национальные
комитеты каждой страны-члена, а также региональные ассоциации по молочному животноводству,
которые имеют подписанное официальное соглашение о совместной деятельности с IDF. Каждый член
IDF имеет право быть представленным в Постоянных комитетах IDF, осуществляющих техническую
работу. IDF сотрудничает с ISO по вопросам разработки стандартных методов анализа и отбора проб
молока и молочных продуктов.
Основная задача Постоянных комитетов состоит в подготовке международных стандартов. Проекты
международных стандартов, принятые Постоянными комитетами, рассылаются Национальным
комитетам для утверждения до опубликования в качестве международных стандартов. Их
опубликование в качестве международных стандартов требует одобрения не менее 50 %
Национальных комитетов IDF, принимающих участие в голосовании.
Следует иметь в виду, что некоторые элементы настоящего документа могут быть объектом патентных
прав. IDF не должен нести ответственность за идентификацию какого-либо одного или всех патентных
прав.
ISO 29981|IDF 220 был подготовлен Техническим комитетом ISO/TC 34, Пищевые продукты,
Подкомитетом SC 5, Молоко и молочные продукты, и Международной молочной федерацией (IDF).
Стандарт публикуется совместно ISO и IDF
Вся работа была выполнена совместной рабочей группой ISO-IDF по Молочнокислым бактериям и
стартовым культурам при Постоянном комитете по Микробиологическим методам анализа под
руководством лидеров проекта, проф. В. Кнейфеля (W. Kneifel) (Австрия) и д-ра У.Зитца (U. Zitz)
(Австрия).
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются v

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
МЕЖДУНАРОДНЫЙ СТАНДАРТ
IDF 220:2010(R)

Молоко и молочные продукты. Подсчет презумптивных
бифидобактерий. Техника подсчета колоний при 37 С
1 Область применения
Настоящий международный стандарт устанавливает метод селективного подсчета презумптивных
бифидобактерий в молочных продуктах, используя технику подсчета колоний при температуре 37 °C в
анаэробных условиях.
Этот метод применим к молочным продуктам, например, к ферментированным и
неферментированным продуктам, сухому молоку, детским молочным смесям и закваскам, там где
рассматриваемые микроорганизмы присутствуют наряду с другими молочнокислыми бактериями и
жизнеспособны. (Для предлагаемых критериев качества молочных продуктов, см., например, стандарт
[6]
Codex Stan 243:2003 .)
Бифидобактерии, используемые в молочных продуктах, обычно относятся к следующим видам
(например, см. Ссылки [7], [8], [16]):
a) Bifidobacterium adolescentis;
b) B. animalis subsp. animalis;
c) B. animalis subsp. lactis;
d) B. bifidum;
e) B. breve;
f) B. infantis;
g) B. longum.
2 Нормативные ссылки
Следующие нормативные документы являются обязательными для применения с настоящим
международным стандартом. Для жестких ссылок применяются только указанное по тексту издание.
Для плавающих ссылок необходимо использовать самое последнее издание нормативного ссылочного
документа (включая любые изменения).
ISO 6887-1, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для
испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований.
Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений
ISO 6887-5, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для
испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований.
Часть 5. Специальные правила для приготовления молока и молочных продуктов
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
ISO 7218, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и
рекомендации по микробиологическим исследованиях
ISO 7889|IDF 117, Йогурт. Подсчет характеристических микроорганизмов. Метод определения
количества колоний при 37 °C
ISO/TS 11133-1, Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания
по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по
обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории
ISO 14461-1|IDF 169-1, Молоко и молочные продукты. Контроль качества в микробиологических
лабораториях. Часть 1. Оценка работы аналитика при подсчете числа колоний
ISO 14461-2|IDF 169-2, Молоко и молочные продукты. Контроль качества в микробиологических
лабораториях. Часть 2. Определение достоверности подсчета числа колоний при посеве на
параллельных чашках Петри с последующими стадиями разведений
3 Термины и определения
Применительно к данному документу используются следующие термины и определения.
3.1
бифидобактерии
bifidobacteria
анаэробные микроорганизмы, которые образуют колонии двояковыпуклой или круглой формы
белесого цвета, частично в форме звездочки или трехлопасной формы диаметром от 1 мм до 4 мм на
питательной среде, приготовленной на основе олигосахаридов, обработанных трансгалактозой с
добавлением литиевой соли мупироцина (TOS-MUP), в условиях, установленных в данном
международном стандарте
4 Сущность метода
4.1 Антибиотик, литиевая соль мупироцина (MUP), подавляет рост большинства молочнокислых
бактерий, обычно используемых в ферментированных и неферментированных молочных продуктах.
Благодаря доказанной избирательности антибиотика MUP при добавлении его в питательную среду
обычно не происходит роста типичных йогуртовых бактерий (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus), мезофильных культур (например, Lactococcus lactis), Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus casei и Lactobacillus rhamnosus на установленной среде.
Это свойство протестировано на репрезентативном количестве контрольных штаммов и выделенных
культур.
Кроме того, среда TOS-на агаре способствует росту бифидобактерий, используемых в молочных
продуктах (см. Ссылку [17]).
ПРИМЕЧАНИЕ 1 Фазово-контрастная микроскопия с применением 100-кратного увеличения и масляной
иммерсии показывает палочки очень разнообразных форм, обычно искривленные и с утолщениями, зачастую
ветвистые, растущие по отдельности, парами, группами, располагающимися клином (V-образная форма
расположения колоний), цепочками, столбиками из параллельно расположенных клеток, или розетками, порою
демонстрирующими форму набухшей сферы (кокка).
ПРИМЕЧАНИЕ 2 Бифидобактерии не являются кислотоустойчивыми, спорообразующими микроорганизмами,
они – грамм-положительные, немобильные и каталаза-отрицательные хемоорганотрофы, которые выделяют
уксусную кислоту м молочную кислоту. Глюкоза разлагается полностью и характерным образом посредством
фруктоза-6-фосфатного шунта, в котором фруктоза-6-фосфат-фосфокетолаза (F6PPK, EC 4.1.2.22) расщепляет
фруктоза-6-фосфат на ацетилфосфат и эритроза-4 фосфат.
2 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
ПРИМЕЧАНИЕ 3 Температура оптимального роста находится в интервале от 37 °C до 41 °C. Для
дополнительной информации см. Ссылку [9].
4.2 Посев десятичных разведений гомогенизированной пробы в TOS-агар с добавлением MUP,
пользуясь чашечным методом, с последующей анаэробной инкубацией при температуре 37 °C в
течение 72 ч.
4.3 Подсчет колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ Как вариант, выбранные культуры из чашек можно подтвердить соответствующими тестами
(например, анализом F6PPK, см. Ссылки [14][15]).
4.4 Количество бифидобактерий в грамме пробы рассчитывают по числу колоний, полученных в
чашках с разведениями такой концентрации, чтобы получить значимый результат.
5 Питательные среды, разбавители и реактивы
Используют реактивы только признанной аналитической чистоты, если нет иных указаний, и
дистиллированную или деминерализованную воду или воду равноценной чистоты.
5.1 Основные материалы
См. ISO 6887-5 и ISO/TS 11133-1 в отношении основных материалов.
5.2 Разбавитель(и)
См. ISO 6887-5 в отношении приготовления разбавителей.
Чтобы обеспечить сопоставимость результатов в установленных колониеобразующих единицах
(КОЕ = CFU), соблюдают следующие правила.
a) Используют раствор Рингера (Ringer's) с ¼ концентрации или любой другой подходящий
разбавитель, установленный в ISO 6887-5 и подтвержденный как эквивалентный.
b) Стерилизуют в массе и используют подходящий стерильный дозатор.
c) Доводят разбавитель до комнатной температуры. Переносят разбавитель стеканием каплями, не
захватывая воздух.
d) Неопределенность измерения используемых объемов должна соответствовать требованиям
ISO 6887-1.
5.3 Питательная среда (среда TOS-MUP)
Используют свежеприготовленную среду на основе обработанных трансгалактозой олигосахаридов с
добавлением литиевой соли мупироцина (TOS-MUP), защищенную от прямого солнечного света.
5.3.1 Основная среда (среда TOS-пропионат на агаре, см. Ссылку [10])
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
5.3.1.1 Состав
Пептон триптиказа 10,0 г
Дрожжевой экстракт 1,0 г
KH PO 3,0 г
2 4
K HPO 4,8 г

2 4
(NH ) SO 3,0 г

4 2 4
MgSO ·7H O 0,2 г
4 2
(R)-Цистеин·HCl·H O 0,5 г
2
Пропионат натрия 15,0 г
TOS (см. 5.3.1.2) 10,0 г

Агар-агар 15,0 г
Вода 950 мл
5.3.1.2 Смесь олигосахаридов-- трансгалактозы
Смесь TOS получают ферментативным гидролизом лактозы, используя β-галактозидазу Aspergillus
oryceae. Смесь TOS содержит галактозу (Gal) и глюкозу (Glc), вычисляемых по формулам
x y
[ ]
Gal Gal Glc
n
где
n  1 … 4;
x  -1,6  -1,4 and -1,3;
y  -1,4 ≫ -1,3 and -1,6.
Смесь TOS очищают с помощью хроматографии в определенных условиях (см. Ссылки [18][19Общее
содержание сахара ( 97 % по массе) включает определенную часть три-, тетра-, пента- и
гексасахоридов. (Изменение соотношения олигосахаридов не имеет заметного влияния на потенциал
среды.)
5.3.1.3 Приготовление
Суспендируют ингредиенты в 950 мл воды при осторожном нагревании (например, на нагревательной
плитке или водяной бане) при частом помешивании до полного растворения.
Распределяют по склянкам вместимостью. 250 мл по 190 мл в каждую. Регулируют pH (6.6), при
необходимости, так чтобы после обработки в автоклаве установился pH на уровне 6,3  0,2 единиц при
температуре 25 °C.
Обрабатывают в автоклаве основную среду при температуре 115 °C в течение 15 мин.
4 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
Если среду не используют сразу, то ее охлаждают, если нет иных указаний. Хранят среду при
температуре от 2 °C до 4 °C не более 1 недели в условиях, не вызывающих изменений состава среды.
Среда TOS чувствительна к теплу, поэтому избыточная тепловая обработка может отрицательно
сказаться на свойствах среды. Полные среды TOS-пропионат имеются в продаже и имеют состав,
соответствующий данному международному стандарту. Однако, если среду готовят в лаборатории, то
результаты могут существенно отличаться для сред, приготовленных в разное время. Поэтому среды
рекомендуется подтверждать, чтобы убедиться, что рост бифидобактерий, указанный в единицах КОЕ,
остается на сопоставимом уровне (см. также ISO/TS 11133-1).
5.3.2 Вспомогательный раствор MUP (см. Ссылку [11])
Непосредственно перед применением, растворяют, например, 50 мг MUP в 50 мл воды, или другие
количества в тех же пропорциях. Стерилизуют полученный раствор фильтрацией через мембрану
(размер пор 0,22 мкм) в соответствии с 5.3.3.
5.3.3 Полная среда
Непосредственно перед применением расплавляют порции по 190 мл приготовленной основной среды
(5.3.1) с помощью пара или аналогичным способом. Охлаждают на водяной бане (6.5) до температуры
48 °C  1 °C. Добавляют 10 мл вспомогательного раствора MUP (5.3.2) в каждую склянку шприцем,
оснащенным стерильным фильтром с размером пор 0,22 мкм (6.11) незадолго до разливки. Тщательно
перемешивают, без образования пузырьков воздуха.
Снова помещают полную среду на водяную баню (6.5) при температуре 48 °C и держат, пока она не
будет готова к разливке.
Полная среда TOS-MUP должна иметь конечную концентрацию MUP равную 50 мг/л.
6 Аппаратура
Стерилизация оборудования, которое контактирует с анализируемой пробой, разбавителем,
разведениями или питательной средой, должна осуществляться в соответствии с требованиями
ISO 6887-5, а также ISO/TS 11133-1. Стеклянная посуда должна выдерживать многократную
стерилизацию.
Используют обычное оборудование микробиологических лабораторий (см. ISO 7218) для
приготовления проб для анализа и разведений, в соответствии с требованиями ISO 6887-5. В
частности, требуется следующее оборудование.
6.1 Оборудование для инкубирования (термостатирования), обычно применяемые сосуды, или,
как вариант, анаэробный инкубатор.
6.1.1 Инкубатор (термостат), обеспечивающий поддержание температуры 37 °C  1 °C.
6.1.2 Анаэробные культуральные склянки, обеспечивающие поддержание анаэробной
атмосферы, содержащей от 10 % до 20 % диоксида углерода по массе; приблизительно от 70 % до
90 % азота по объему и приблизительно 10 % водорода по объему (необязательно). Газовая смесь не
должна содержать более 1 % кислорода по объему.
Можно использовать другие подходящие и безопасные низкотемпературные каталитические системы.
6.1.3 Анаэробный инкубатор, поддерживающий температуру на уровне 37 °C  1 °C, обеспечивая
анаэробную атмосферу (см. 6.1.2).
6.2 Механическая мешалка, обеспечивающая перемешивание содержимого пробирок, например,
вихревой смеситель.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
6.3 Оборудование для подсчета колоний, в соответствии с ISO 7218.
6.4 Лупа, от 8 – до 10 –кратного увеличения.
6.5 Водяные бани, обеспечивающие поддержание температур 20 °C  1 °C, 45 °C  1 °C,
48 °C  1 °C.
6.6 pH метр, с температурной компенсацией, точностью до  0,1 pH при температуре 25 °C.
6.7 Колбы и склянки, вместимостью 250 мл с плотными пробками или крышками (для помещения
питательной среды и приготовления начального разведения анализируемой пробы).
6.8 Пробирки, высотой порядка 150 мм и диаметром примерно 15 мм с подходящими крышками.
6.9 Мерные пипетки, для бактериологических исследований, стерилизованные и калиброванные до
кончика, обеспечивающие подачу 1 мл  0,02 мл и 10 мл  0,2 мл (см. ISO 6887-1), соответственно, по
[20]
ISO 835 класс A.
6.10 Чашки Петри, из прозрачного неокрашенного стекла или пластика, диаметром 90 мм и
минимальной внутренней глубины 10 мм. На дне не должно быть неровностей, которые могли бы
помешать подсчету колоний.
6.11 Стерилизационная аппаратура, для стерилизации фильтрованием, 10 –мл шприц, оснащенный
стерильным фильтром с размером пор 0,22 мкм.
6.12 Автоклав, обеспечивающий поддержание температуры на уровне 115 °C  3 °С с короткими
циклами нагревания-охлаждения.
7 Отбор проб
В лабораторию необходимо посылать представительную пробу. Она не должна претерпевать
повреждения или изменения в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не входит в метод, установленный в данном международном стандарте. Рекомендованные
[1]
метод отбора проб описывается в ISO 707|IDF 50 .
8 Проведение анализа
8.1 Общие положения
Следующие процедуры основаны на соответствующих стандартах с учетом рекомендаций,
приведенных, например, в Ссылках [8], [12].
Выполняют процедуры, описанные в 8.2 – 8.5, при осторожно помешивании, избегая образования или
захвата воздушных пузырьков, и защищая от прямого солнечного света.
Прежде чем открыть контейнер с пробой необходимо очистить поверхность вокруг зоны, в которой
будут извлекать пробу, чтобы удалить материал, который может загрязнить пробу. Например,
протирают стол 70 %-ным (по объему) этанолом, чтобы предотвратить загрязнение. Контейнер
открывают, соблюдая правила асептики.
6 © ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
8.2 Подготовка пробы для анализа и первичное разведение
8.2.1 Сухие молочные продукты, например, сухие молочные смеси для детского питания
Выполняют a) – i) (см. также ISO 6887-5).
e) Тщательно перемешивают содержимое закрытой упаковки, встряхивая и переворачивая ее
несколько раз.
f) Открывают упаковку, извлекают требуемую порцию стерильным шпателем и переходят к
следующему. Сразу же закрывают пакет. Рекомендуется использовать воздухонепроницаемый
зажим и помещать пакет внутрь герметично закрывающегося стеклянного сосуда для хранения
при 4 °C.
g) Берут навеску 90 г  0,1 г разбавителя и помещают в каждую из предварительно стерилизованных
склянок вместимостью 250 мл (6.7). Склянки закрывают.
h) Нагревают склянки вместимостью 250 мл, содержащие 90 г разбавителя на водяной бане (6.5) при
температуре 45 °C.
е) Берут навеску пробы с точностью 0,05 г массой 10 г  0,1 г. Добавляют навеску в разбавитель в
каждую склянку при температуре 45 °C. В другом варианте, берут навеску пробы массой 10 г
непосредственно в склянку с разбавителем при температуре 45 °C.
f) Чтобы растворить пробу для анализа, медленно помешивают склянку круговыми движениями,
чтобы смочить порошок. Затем встряхивают склянку 10 раз движением с амплитудой 300 мм
приблизительно за 7 с.
g) Помещают склянки на водяную баню (6.5) при температуре 45 °C в течение 5 мин, периодически их
встряхивая.
h) Сразу же охлаждают склянки в струе водопроводной воды, встряхивая в течение 2 мин. Быстро
доводят до комнатной температуры, Например, на водяной бане (6.5) при температуре 20 °C.
i) Исследование начинают, по возможности, быстро (см. также 8.5).
ВНИМАНИЕ! — Чтобы получить приемлемую повторяемость (сходимость) метода, необходимо
строго следовать процедурам, установленным в a) – i).
8.2.2 Прибиотический йогурт или аналогичные йогуртам продукты
Переходят к процедурам a) – g) (см. также ISO 7889|IDF 117).
a) Доводят разбавитель до комнатной температуры.
b) Берут навеску разбавителя массой 90 г  0,1 г в каждую из предварительно стерилизованных
склянок (6.7) вместимостью 250 мл. Склянки закрывают.
c) Тщательно перемешивают содержимое закрытой упаковки пробы многократным встряхиванием и
переворачиванием (предпочтительно 10 раз движением амплитудой 300 мм в течение
приблизительно 7 с) — или, если это невозможно, тщательно перемешивают содержимое
стерильным шпателем или чем-либо подобным после того, как упаковка открыта, чтобы получить
гомогенную пробу.
d) Открывают упаковку, извлекают требуемое количество пробы стерильным шпателем или пипеткой
и переходят к следующему.
© ISO и IDF 2010 – Все права сохраняются 7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 29981:2010(R)
IDF 220:2010(R)
e) Берут навеску пробы с точностью 0,05 г массой, 10 г  0,1 г. Добавляют навеску к разбавителю в
каждую склянку.
f) Встряхивают склянку 10 раз движением с амплитудой 300 мм, в течение приблизительно 7 с.
g) Исследование начинают, как можно, быстрее (см. также 8.5).
После приготовления первичного разведения (суспензия пробы  1-ое десятичное разведение,
D1; 100 мл) немедленно готовят следующие разведения.
8.3 Исследование под микроскопом
Выполняют предварительное исследование под микроскопом в нескольких полях мазка жидкости
первичного разведения (8.2) высушенных и твердых проб, чтобы выбрать нужный диапазон разведений
для использования, особенно в тех случаях, когда изготовитель не дает информации о продукте.
Альтернативно можно использовать фазово-контрастную микроскопию без выполнения мазков.
8.4 Приготовление десятичных разведений
Общие требования приведены в ISO 6887-1. Специальные требования к выращиванию
бифидобактерий учитывают следующее.
Описанную операцию требуется выполнять путем осторожного перемешивания в стандартизованных
условиях, установленных ниже.
Разведения готовят следующим образом.
a) Встряхивают первичное разведение (8.2) предпочтительно 10 раз движением рукой с амплитудой
примерно 300 мм приблизительно в течение 7 с для достижения гомогенности.
b) Пипеткой (6.9) переносят 1 мл первичного разведения (исходная бактериальная суспензия) в
пробирку (6.8), содержащую 9 мл стерильного разбавителя при соответствующей температуре (см.
также 5.2).
c) Тщательно перемешивают разведение в течение 3 с с помощью вихревого смесителя (6.2). Для
последующих разведений поступают аналогичным образом, пока не будет получена требуемая
рабочая плотность от 200
...

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 29981
IDF
220
First edition
2010-02-01


Milk products — Enumeration of
presumptive bifidobacteria — Colony
count technique at 37 °C
Produits laitiers — Dénombrement des bifidobacteria présumés —
Technique par comptage des colonies à 37 °C




Reference numbers
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
©
ISO and IDF 2010

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
PDF disclaimer
This PDF file may contain embedded typefaces. In accordance with Adobe's licensing policy, this file may be printed or viewed but
shall not be edited unless the typefaces which are embedded are licensed to and installed on the computer performing the editing. In
downloading this file, parties accept therein the responsibility of not infringing Adobe's licensing policy. Neither the ISO Central
Secretariat nor the IDF accepts any liability in this area.
Adobe is a trademark of Adobe Systems Incorporated.
Details of the software products used to create this PDF file can be found in the General Info relative to the file; the PDF-creation
parameters were optimized for printing. Every care has been taken to ensure that the file is suitable for use by ISO member bodies
and IDF national committees. In the unlikely event that a problem relating to it is found, please inform the ISO Central Secretariat at the
address given below.


COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT


©  ISO and IDF 2010
All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced or utilized in any form or by any means,
electronic or mechanical, including photocopying and microfilm, without permission in writing from either ISO or IDF at the respective
address below.
ISO copyright office International Dairy Federation
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20 Diamant Building • Boulevard Auguste Reyers 80 • B-1030 Brussels
Tel. + 41 22 749 01 11 Tel. + 32 2 733 98 88
Fax + 41 22 749 09 47 Fax + 32 2 733 04 13
E-mail [e-mail] E-mail [e-mail]
Web www.iso.org Web www.fil-idf.org
Published in Switzerland

ii © ISO and IDF 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
Contents Page
Foreword .iv
Foreword .v
1 Scope.1
2 Normative references.1
3 Terms and definitions .2
4 Principle.2
5 Culture media, diluents and reagents .3
5.1 Basic materials .3
5.2 Diluent(s) .3
5.3 Culture medium (TOS-MUP medium) .3
6 Apparatus.5
7 Sampling.5
8 Procedure.6
8.1 General .6
8.2 Preparation of the test portion and primary dilution .6
8.3 Microscopic examination.7
8.4 Preparation of decimal dilutions.7
8.5 Inoculation .7
8.6 Duration of the procedure .8
8.7 Incubation.8
8.8 Counting of the colonies .8
8.9 Reading of the Petri dishes — confirmation.8
9 Calculation and expression of results .8
9.1 Calculation .8
9.2 Expression of results.9
10 Precision.10
10.1 Interlaboratory test.10
10.2 Repeatability .10
10.3 Reproducibility .10
10.4 Precision data collectively defined for dairy products.11
11 Knowledge of use of the method.13
12 Test report.13
Annex A (informative) Interlaboratory trial – A 'bifido' ring trial .14
Bibliography.16

© ISO and IDF 2010 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 29981|IDF 220 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
iv © ISO and IDF 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a worldwide federation of the dairy sector with a National
Committee in every member country. Every National Committee has the right to be represented on the IDF
Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in the development of
standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to
publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least
50 % of IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this International Standard may be the
subject of patent rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 29981|IDF 220 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.
All work was carried out by the Joint ISO-IDF Action Team on Lactic acid bacteria and starters of the Standing
Committee on Microbiology methods of analysis under the aegis of its project leaders, Prof. W. Kneifel (AT)
and Dr. U. Zitz (AT).

© ISO and IDF 2010 – All rights reserved v

---------------------- Page: 5 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
INTERNATIONAL STANDARD
IDF 220:2010(E)

Milk products — Enumeration of presumptive bifidobacteria —
Colony count technique at 37 °C
1 Scope
This International Standard specifies a method for the selective enumeration of presumptive bifidobacteria in
milk products by using a colony count technique at 37 °C under anaerobic conditions.
The method is applicable to milk products such as fermented and non-fermented milks, milk powders, infant
formulae, and starter cultures where these microorganisms are present and viable, and in combination with
other lactic acid bacteria. (For proposed quality criteria of dairy products, see, for example, Codex Stan
[6]
243:2003 .)
Bifidobacteria used in milk products usually belong to the species (e.g. see References [7][8][16]):
a) Bifidobacterium adolescentis;
b) B. animalis subsp. animalis;
c) B. animalis subsp. lactis;
d) B. bifidum;
e) B. breve;
f) B. infantis;
g) B. longum.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cites applies. For undated references, the latest edition of the referenced
documents (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 6887-5, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the preparation of milk and
milk products
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 7889|IDF 117, Yogurt — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at
37 °C
© ISO and IDF 2010 – All rights reserved 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO 14461-1|IDF 169-1, Milk and milk products — Quality control in microbiological laboratories — Part 1:
Analyst performance assessment for colony counts
ISO 14461-2|IDF 169-2, Milk and milk products — Quality control in microbiological laboratories — Part 2:
Determination of the reliability of colony counts of parallel plates and subsequent dilution steps
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
bifidobacteria
anaerobic microorganisms that form lenticular or round whitish colonies, partially star shaped or trilobate of
diameter 1 mm to 4 mm on transgalactosylated oligosaccharides-mupirocin lithium salt (TOS-MUP) medium
under the conditions specified in this International Standard
4 Principle
4.1 The antibiotic, mupirocin lithium salt (MUP), inhibits the growth of most lactic acid bacteria commonly
used in fermented and non-fermented dairy products.
Owing to the proven selectivity of the MUP antibiotic when added to the medium, usually there is no growth of
typical yogurt bacteria (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus), mesophilic
cultures (e.g. Lactococcus lactis), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Lactobacillus rhamnosus
on the medium specified.
This property has been tested with a representative number of reference strains and isolates.
Additionally, TOS-agar enhances the growth of bifidobacteria used in dairy products (see Reference [17]).
NOTE 1 Examination under a microscope at a magnification of 100 times and oil immersion in contrast phase
illumination shows rods of very varied shapes, usually curved and clubbed, often branched, arranged singly, in pairs, in V-
shaped arrangements, in chains, in palisades of parallel cells, or in rosettes occasionally exhibiting swollen coccoid forms.
NOTE 2 Bifidobacteria are non-acid-fast, non-spore-forming, gram-positive, non-motile and catalase-negative
chemoorganotrophs, which produce acetic acid and lactic acid. Glucose is degraded exclusively and characteristically by
the fructose-6-phosphate shunt in which fructose-6-phosphate phosphoketolase (F6PPK, EC 4.1.2.22) cleaves fructose-6-
phosphate into acetyl phosphate and erythrose-4-phosphate.
NOTE 3 The optimum growth temperature is between 37 °C and 41 °C. For further details, see Reference [9].
4.2 Inoculation of appropriate decimal dilutions of the homogenized sample into TOS-agar containing MUP
using the pour plate technique, is followed by anaerobic incubation at 37 °C for 72 h.
4.3 The colonies are counted.
NOTE Optionally, selected isolates from the plates can be confirmed by means of appropriate tests (e.g. F6PPK
assay, see References [14][15]).
4.4 The number of bifidobacteria per gram of sample is calculated from the number of colonies obtained on
plates at dilution levels so as to give a significant result.
2 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
5 Culture media, diluents and reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified, and distilled or demineralized
water or water of equivalent purity.
5.1 Basic materials
See ISO 6887-5 and ISO/TS 11133-1 for basic materials.
5.2 Diluent(s)
See ISO 6887-5 for the preparation of diluents.
To ensure comparability of the specified colony-forming unit (CFU) results, observe the following requirements.
a) Use quarter-strength Ringer's solution, or any other suitable diluent which is specified in ISO 6887-5 and
proven to be equivalent.
b) Sterilize in bulk and use an adequate sterile dispenser unit.
c) Adjust the diluent to room temperature. Transfer the diluent by dripping, without incorporating air.
d) The uncertainty of measurement of volumes used shall be in accordance with the requirements of
ISO 6887-1.
5.3 Culture medium (TOS-MUP medium)
Use freshly prepared transgalactosylated oligosaccharides-mupirocin lithium salt (TOS-MUP) culture medium,
which has not been exposed to direct sunlight.
5.3.1 Basic medium (TOS-propionate agar medium, see Reference [10])
5.3.1.1 Composition
Trypticase peptone 10,0 g
Yeast extract 1,0 g
KH PO 3,0 g
2 4
K HPO 4,8 g

2 4
(NH ) SO 3,0 g

4 2 4
MgSO ·7HO 0,2 g
4 2
(R)-Cysteine·HCl·HO 0,5 g
2
Sodium propionate 15,0 g
TOS (see 5.3.1.2) 10,0 g

Agar 15,0 g
Water 950 ml
© ISO and IDF 2010 – All rights reserved 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
5.3.1.2 Transgalactosylated oligosaccharide mixture
A TOS mixture is obtained by enzymatic hydrolysis of lactose using Aspergillus oryceae β-galactosidase. The
TOS mixture contains galactose (Gal) and glucose (Glc) units in accordance with the formula
x y
[ Gal Gal Glc ]
()
n
where
n = 1 … 4;
x = β-1,6 > β-1,4 and β-1,3;
y = β-1,4 ≫ β-1,3 and β-1,6.
The TOS mixture is purified by chromatography under defined conditions (see References [18][19]). The total
sugar content (> 97 % mass fraction) includes a certain proportion of tri-, tetra-, penta- and hexasaccharides.
(Modification of the ratio of oligosaccharides has no significant effect on the potential of the medium.)
5.3.1.3 Preparation
Suspend the ingredients in 950 ml water while heating carefully (e.g. using a hotplate or a water bath) with
frequent agitation until completely dissolved.
Distribute in portions of 190 ml into bottles of 250 ml capacity. Adjust the pH (6.6), if necessary, so that after
autoclaving a final pH of 6,3 ± 0,2 pH-units is obtained at 25 °C.
Autoclave the basic medium at 115 °C for 15 min.
If not used immediately, cool the prepared basic medium, unless otherwise specified. Store the medium
between 2 °C and 4 °C for a maximum of 1 week under conditions not producing any change in its
composition.
TOS-medium is sensitive to heat, thus excessive heat treatment can negatively influence the properties of the
medium. Complete TOS-propionate media are commercially available and have a composition in accordance
with this International Standard. However, if the medium is made up in the laboratory, the results can differ
significantly from one preparation to another. Therefore media should be validated to ensure that growth
performance of bifidobacteria, indicated by CFU results, are on a comparable level (see also ISO/TS 11133-1).
5.3.2 MUP supplement solution (see Reference [11])
Immediately before use, dissolve, for example, 50 mg MUP in 50 ml of water, or other amounts in the same
proportion. Sterilize the solution obtained by filtration through a membrane (pore size 0,22 µm) as specified in
5.3.3.
5.3.3 Complete medium
Immediately before use, melt 190 ml portions of the prepared basic medium (5.3.1) under steam or equivalent.
Cool it in a water bath (6.5) to 48 °C ± 1 °C. Add 10 ml of MUP supplement solution (5.3.2) to each portion by
using a syringe equipped with a sterile filter unit of pore size 0,22 µm (6.11) shortly before pouring. Mix
carefully while avoiding formation of air bubbles.
Put the completed medium back in the water bath (6.5) at 48 °C until it is ready to be poured.
The complete TOS-MUP medium shall have a final MUP concentration of 50 mg/l.
4 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
6 Apparatus
Sterilization of equipment that comes into contact with the test sample, the diluent, the dilutions or the culture
medium shall be carried out in accordance with the requirements of ISO 6887-5 as well as ISO/TS 11133-1.
The glassware shall be resistant to repeated sterilization.
Use usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) for the preparation of test samples and
dilutions, as specified in ISO 6887-5. In particular, the following equipment is required.
6.1 Incubation equipment, conventional jars, or, alternatively, an anaerobic incubator.
6.1.1 Incubator, capable of maintaining a temperature of 37 °C ± 1 °C.
6.1.2 Anaerobic culture jars, providing an anaerobic atmosphere of volume fraction 10 % to 20 % of
carbon dioxide; a volume fraction of approximately 70 % to 90 % of nitrogen; with a volume fraction of
approximately 10 % of hydrogen (not obligatory). The gas mixture should not contain more than a volume
fraction of 1 % of oxygen.
Other suitable and safety-proven low-temperature catalyst systems may be used.
6.1.3 Anaerobic incubator, capable of maintaining a temperature of 37 °C ± 1 °C, providing an anaerobic
atmosphere (see 6.1.2).
6.2 Mechanical stirrer, capable of mixing or agitating the contents of test tubes, e.g. a vortex mixer.
6.3 Colony-counting equipment, as specified in ISO 7218.
6.4 Magnifying lens, of magnification 8 times to 10 times.
6.5 Water baths, capable of maintaining temperatures of 20 °C ± 1 °C, 45 °C ± 1 °C, 48 °C ± 1 °C.
6.6 pH meter, with temperature compensation, accurate to ± 0,1 pH unit at 25 °C.
6.7 Flasks or bottles, of capacity 250 ml with suitable sealing caps or stoppers (to hold the culture medium
as well as to prepare the initial dilution of the test sample).
6.8 Test tubes, of height about 150 mm and of diameter about 15 mm, equipped with suitable caps.
6.9 Graduated pipettes, for bacteriological use, sterilized and calibrated to the tip, capable of delivering
[20]
1 ml ± 0,02 ml and 10 ml ± 0,2 ml (see ISO 6887-1), respectively, ISO 835 class A.
6.10 Petri dishes, made of clear uncoloured glass or plastics, of diameter 90 mm and of minimum internal
depth 10 mm. The bottom shall have no irregularities that may interfere with counting colonies.
6.11 Sterilization apparatus, for sterilization by filtration, 10 ml syringe equipped with a sterile filter unit of
pore size 0,22 µm.
6.12 Autoclave, capable of maintaining a temperature of 115 °C ± 3 °C and equipped with short heating and
cooling cycles.
7 Sampling
A representative sample should have been sent to the laboratory. It should not have been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this International Standard. A recommended sampling method
[1]
is given in ISO 707|IDF 50 .
© ISO and IDF 2010 – All rights reserved 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
8 Procedure
8.1 General
The following procedures are based on corresponding standards taking into account the recommendations
given, for example, in References [8][12].
Perform the procedures specified in 8.2 to 8.5 by gentle mixing, avoiding air formation or inclusion of gas
bubbles, and not under direct sunlight.
Before opening the sample container, clean the external surface surrounding of the area from which the test
sample is to be taken, in order to remove any material that might contaminate the sample. Swab the area with
70 % (volume fraction) ethanol, for example, to prevent further contamination. Open the container aseptically.
8.2 Preparation of the test portion and primary dilution
8.2.1 Dried milk products, e.g. infant milk formulae
Proceed as described in steps a) to i) (see also ISO 6887-5).
a) Thoroughly mix the content of the closed packaging by repeatedly shaking and inverting it.
b) Open the packaging, withdraw the test sample required with a sterile spatula and proceed as indicated in
the following. Immediately reclose the bag. It is recommended to use an airtight clip and to put the bag
inside a tight glass jar to enable storage at 4 °C.
c) Weigh 90 g ± 0,1 g of diluent in each of the 250 ml pre-sterilized bottles (6.7). Close the bottles.
d) Warm the 250 ml bottles containing the 90 g of diluent in the water bath (6.5) at 45 °C.
e) Weigh, to the nearest 0,05 g, 10 g ± 0,1 g of test sample. Add the weighed test portion to the diluent in
each bottle at 45 °C. Alternatively, weigh 10 g of the test sample directly into the bottle with the diluent at
45 °C.
f) To dissolve the test portion, swirl slowly to wet the powder. Then shake the bottle 10 times, with a
movement of about 300 mm, for approximately 7 s.
g) Place the bottles in the water bath (6.5) at 45 °C for 5 min while shaking occasionally.
h) Immediately cool under running tap water while shaking for 2 min. Rapidly adjust to room temperature,
e.g. by using a water bath (6.5) at 20 °C.
i) Start the examination as quickly as possible (see also 8.5).
IMPORTANT — To obtain acceptable repeatability of the method, observe strictly the procedures
specified in steps a) to i).
8.2.2 Probiotic yogurt or yogurt-like products
Proceed as described in the following steps a) to g) (see also ISO 7889|IDF 117).
a) Adjust the diluent to room temperature.
b) Weigh 90 g ± 0,1 g of the diluent in each of the 250 ml pre-sterilized bottles (6.7). Close the bottles.
6 © ISO and IDF 2010 – All rights reserved

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
c) Thoroughly mix the contents of the closed sample package by repeatedly shaking and inverting it
(preferably 10 times, with a movement of about 300 mm, for approximately 7 s) — or, if not possible,
thoroughly mix the content with a sterile spatula or similar after opening the packaging to get
homogeneous samples.
d) Open the packaging, withdraw the test sample required using a sterile spatula or a pipette and proceed
as indicated in the following.
e) Weigh, to the nearest 0,05 g, 10 g ± 0,1 g, of test sample. Add the weighed sample to the diluent in each
bottle.
f) Shake the bottle 10 times, with a movement of about 300 mm, for approximately 7 s.
g) Start the examination as quickly as possible (see also 8.5).
After the preparation of the primary dilution (sample suspension = 1st decimal dilution, D1; 100 ml), prepare
the dilution steps immediately.
8.3 Microscopic examination
Carry out a preliminary microscopic examination of several fields of a smear of the liquid or the primary
dilution (8.2) of the dried and solid samples to select the proper range of dilutions to be used, especially in
those cases where the manufacturer gives no product information.
Alternatively, phase contrast microscopy can be applied without staining.
8.4 Preparation of decimal dilutions
For general requirements, see ISO 6887-1. For special requirements of bifidobacterial growth, take into
account the following.
The described operation shall be carried out by gentle mixing under the standardized conditions specified
below.
Prepare the dilutions as follows.
a) Shake the primary dilution (8.2) preferably 10 times, with a manual movement of about 300 mm for
approximately 7 s to obtain homogeneity.
b) Pipette (6.9) 1 ml of the primary dilution (bacterial initial suspension) into a test tube (6.8) containing 9 ml
of the sterile diluent at the appropriate temperature (see also 5.2).
c) Thoroughly mix the dilution for 3 s by using a vortex mixer (6.2). For further dilution steps proceed in the
same manner until the required working density of 200 CFU/ml to 500 CFU/ml is obtained. Always mix in
the same manner, e.g. one period of 3 s. For each dilution step use a fresh sterile pipette (6.9).
Avoid filling the pipette with air bubbles. Take care to drain the pipettes completely, especially at higher
sample concentrations.
8.5 Inoculation
Transfer by dripping, 1 ml of each of the appropriate dilution steps (4 decimal dilution steps within the
countable area are recommended) into each empty Petri dish with two replicate plates per dilution. Pour 12 ml
to 15 ml of the medium (5.3.3) into the Petri dishes. Mix the medium gently with the diluent by moving the Petri
dishes in circular movements without incorporating air.
© ISO and IDF 2010 – All rights reserved 7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO 29981:2010(E)
IDF 220:2010(E)
NOTE In order to restrict the range of enumeration to a given interval, especially if high numbers of microorganisms
[6]
are foreseen (see Codex Stan 243:2003 ), it is possible to inoculate only the necessary decimal dilutions (at least two
successive dilutions) needed to facilitate proper enumeration (see 9.1 and ISO 7218).
Alternatively, apply automated spread preparation techniques, if validated with reference to this International
Standard.
8.6 Duration of the procedure
The time between ending the preparation of the primary dilution (initial dilution ready-made) until addition of
culture medium shall not exceed 15 min (see Reference [8]).
8.7 Incubation
Immediately after solidification of the medium, invert all Petri dishes in the anaerobic culture jar or anaerobic
incubator (6.1) and incubate at 37 °C for 72 h ± 3 h.
8.8 Counting of the colonies
Count the colonies after incubation by considering only the dilution steps within the c
...